DE69434335T2 - Synthetische peptidinhibitoren der hiv-übertragung - Google Patents

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Description

  • 1. EINLEITUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DP-178 (SEQ ID: 1), ein Peptid, das den Aminosäuren 638 bis 673 des Tansmembranproteins (TM) gp41 von HIV-1LAI entspricht, und Teile, Analoge und Homologe von DP-178 (SEQ ID: 1), die sämtlich eine antivirale Aktivität bzw. Wirksamkeit aufweisen. Eine derartige antivirale Aktivität schließt die Inhibition bzw. Hemmung der Übertragung von HIV auf nicht-infizierte CD-4+-Zellen ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-178-Fragmente und/oder -Analoge oder -Homologe können als Inhibitoren der humanen und nicht-humanen retroviralen, insbesondere HIV-, Übertragung auf nicht-infizierte Zellen verwendet werden. Ebenfalls offenbart werden: (i) die Verwendung von DP-178 als HIV-subtypspezifisches Diagnostikum, (ii) antivirale Peptid-Analoge von DP-107, einem Peptid, das den Aminosäuren 558 bis 595 des Transmembranproteins (TM) gp41 von HIV-1LAI entspricht, die in anderen umhüllten Viren vorhanden sind, und (iii) Verfahren zur Identifizierung antiviraler Verbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen DP-178 und DP-107 und/oder zwischen DP-107-ähnlichen und DP-178-ähnlichen Peptiden spalten. Die Erfindung wird durch ein Arbeitsbeispiel veranschaulicht, in welchen gezeigt wird, dass DP-178 (SEQ ID: 1) und ein Peptid, dessen Sequenz zu DP-178 homolog ist, jeweils wirksame, nicht-toxische Inhibitoren der Übertragung von HIV-1 auf nicht-infizierte CD-4+-Zellen sind. Es werden ebenfalls Beispiele offenbart, in denen Peptide mit antiviraler und/oder struktureller Ähnlichkeit mit DP-107 und DP-178 identifiziert werden.
  • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 2.1. DER HUMANE IMMUNDEFIZIENZVIRUS
  • Der humane Immundefizienzvirus (HIV) wurde als primärer Erreger mit der langsam degenerativen Immunsystemerkrankung, die als erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS) bezeichnet wird, in Zusammenhang gebracht (Barre-Sinoussi, F. et al., 1983, Science 220: 868–870; Gallo, R. et al., 1984, Science 224: 500–503). Es gibt mindestens zwei verschiedene HIV-Typen: HIV-1 (Barre-Sinoussi, F. et al., 1983, Science 220: 868–870; Gallo R. et al., 1984, Science 224: 500–503) und HIV-2 (Clavel, F. et al., 1986, Science 233: 343–396; Guyader, M. et al., 1987, Nature 326: 662–669). Des Weiteren besteht innerhalb der Populationen von jedem dieser Typen eine große genetische Heterogenität. Die Infektion humaner CD-4+-T- Lymphozyten mit einem HIV-Virus führt zur Verarmung dieses Zelltyps und schließlich zu opportunistischen Infektionen, neurologischen Dysfunktionen, neoplastischem Wachstum und am Ende zum Tod.
  • HIV ist ein Mitglied der Lentivirus-Familie von Retroviren (Teich, N. et al., 1984, RNA Tumor Viruses, Weiss, R. et al., Hsg., CSH-Press, Seiten 949–956). Retroviren sind kleine, mit einer Hülle umgebene Viren, die ein diploides, einzelsträngiges RNA-Genom enthalten und sich über ein DNA-Intermediat, das durch eine viral kodierte reverse Transkriptase, einer RNA-abhängige DNA-Polymerase, hergestellt wird (Varmus, H., 1988, Science 240: 1427–1439) replizieren. Andere Retroviren schließen beispielsweise onkogene Viren wie humane T-Zell-Leukämieviren (HTLV-I, -II, -III) und den Katzenleukämievirus ein.
  • Das virale HIV-Partikel besteht aus einem aus Capsid-Proteinen zusammengesetzten viralen Kern, der das virale RNA-Genom und diejenigen Enzyme enthält, die für die frühen Replikationsschritte erforderlich sind. Das myristylierte Gag-Protein bildet eine äußere Virushülle, um den viralen Kern, die wiederum von einer Lipidmembranhülle umgeben ist, die aus der infizierten Zellmembran stammt. Die Oberflächenglycoproteine von HIV werden als einzelnes Vorläuferprotein von 160 kDa synthetisiert, das während der viralen Ausknospung durch eine zelluläre Protease in zwei Glycoproteine, gp41 und gp120, gespalten wird. gp41 ist ein Transmembranprotein und gp120 ist ein extrazelluläres Protein, das, möglicherweise in einer trimeren oder multimeren Form, mit gp41 nicht-kovalent assoziiert bleibt (Hammarskjold, M. und Rekosh, D., 1989, Biochem. Biophys. Acta 989: 269–280).
  • HIV richtet sich gegen CD-4+-Zellen, da das CD-4-Zelloberflächenprotein als zellulärer Rezeptor für das HIV-1-Virus wirkt (Dalgleish, A. et al., 1984, Nature 312: 763–767; Klatzmann et al., 1989, Nature 312: 767–768; Maddon et al., 1986, Cell 47: 333–348). Der Eintritt des Virus in die Zellen ist von der Bindung von gp120 an die zellulären CD-4+-Rezeptormoleküle abhängig (McDougal, J. S. et al., 1986, Science 231: 382–385; Maddon, P. J. et al., 1986, Cell 47: 333–348) und erklärt daher die Tropie von HIV gegenüber CD-4+-Zellen, während gp41 den Hüllglycoproteinkomplex in der viralen Membran verankert.
  • 2.2 HIV-BEHANDLUNG
  • Die HIV-Infektion ist pandemisch, und HIV-assoziierte Erkrankungen stellen ein wesentliches weltweites Gesundheitsproblem dar. Obwohl beträchtliche Anstrengungen für eine erfolgreiche Entwicklung wirksamer Therapeutika unternommen werden, existiert derzeit kein heilender anti-retroviraler Wirkstoff gegen AIDS. Bei den Versuchen, derartige Wirkstoffe zu entwickeln, wurden einige Schritte des Lebenszyklus von HIV als Ziele für einen therapeutischen Eingriff in Betracht gezogen (Mitsuya, H. et al., 1991, FASEB J. 5: 2369–2381). Beispielsweise ist die viral kodierte Reverse Transkriptase ein Fokus der Wirkstoffentwicklung gewesen. Es ist eine Anzahl gegen die Reverse Transkriptase gerichteter Wirkstoffe, einschließlich 2',3'-Didesoxynukleosidanaloga, wie AZT, ddI, ddC und d4T, entwickelt worden, von denen gezeigt wurde, dass sie gegen HIV wirksam sind (Mitsuya, H. et al., 1991, Science 249: 1533–1544). Obwohl sie vorteilhaft, sind diese Nukleosid-Analoge nicht heilend, was wahrscheinlich auf das schnelle Auftauchen von wirkstoffresistenten HIV-Mutanten zurückzuführen ist (Lander, B. et al., 1989, Science 243: 1731–1734). Außerdem weisen diese Wirkstoffe oftmals toxische Nebenwirkungen, wie Knochenmarkssuppression, Erbrechen und Leberfunktionsabnormalitäten, auf.
  • Es werden ebenfalls Versuche unternommen, Wirkstoffe zu entwickeln, die den Eintritt des Virus in die Zelle, den frühesten Schritt der HIV-Infektion, inhibieren können. Hierbei wurde bis jetzt das Hauptaugenmerk auf CD4, den Zelloberflächenrezeptor für HIV, gelegt. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass rekombinantes lösliches CD4 die Infektion von CD-4+-T-Zellen durch einige HIV-1-Stämme inhibiert (Smith, D. H. et al., 1987, Science 238: 1704–1707). Gewisse primäre HIV-1-Isolate sind jedoch vergleichsweise weniger empfindlich gegenüber der Inhibition durch rekombinantes CD-4 (Daar, E. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6574–6579). Des Weiteren ergaben klinische Versuche mit rekombinantem löslichem CD-4 keine schlüssigen Ergebnisse (Schooley, R. et al., 1990, Ann. Int. Med. 112: 247–253; Kahn, J. O. et al., 1990, Ann. Int. Med. 112: 254–261; Yarchoan, R. et al., 1989, Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, Seite 564, MCP 137).
  • Die späten Schritte der HIV-Replikation, welche die entscheidende virusspezifische sekundäre Prozessierung viraler Proteine einschließt, wurden ebenfalls als mögliche Anti-HIV-Wirkstoff ziele vorgeschlagen. Die Prozessierung während der späten Stufen ist von der Aktivität einer viralen Protease abhängig, und es werden Wirkstoffe entwickelt, welche diese Protease inhibieren (Erickson, J., 1990, Science 249: 527–533). Die klinischen Ergebnisse dieser Kandidatenwirkstoffe sind jedoch noch immer fraglich.
  • Die Aufmerksamkeit wird ebenfalls auf die Entwicklung von Vakzinen zur Behandlung der HIV-Infektion gelegt. Es wurde gezeigt, dass die HIV-1-Hüllproteine (gp160, gp120, gp91) die Hauptantigene von in AIDS-Patienten vorliegenden Anti-HIV-Antikörpern sind (Barin, et al., 1985, Science 228: 1094–1096). Bis jetzt scheinen daher diese Proteine die viel versprechendsten Kandidaten zur Wirkung als Antigene für die Entwicklung eines Anti-HIV-Vakzins zu sein. Zu diesem Zweck haben einige Gruppen begonnen, verschiedene Teile von gp160, gp120 und/oder gp41 als immunogene Ziele für das Wirtsimmunsystem zu verwenden. Siehe beispielsweise Ivanoff, L. et al., U.S.-Pat. Nr. 5,141,867; Saith, G. et al., WO 92/22,654; Shafferman, A., WO 91/09,872; Formoso, C. et al., WO 90/07,119. Klinische Ergebnisse in Bezug auf diese Kandidatenvakzine liegen jedoch in ferner Zukunft.
  • Obwohl somit große Anstrengungen in Bezug auf das Design und das Testen antiretroviraler Wirkstoffe unternommen werden, wird weiterhin eine tatsächlich wirksame, nicht-toxische Behandlung benötigt.
  • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DP-178 (SEQ ID: 1), ein synthetisches Peptid mit 36 Aminosäuren, welches den Aminosäuren 638 bis 673 des Transmembranproteins (TM) gp91 aus dem HIV-1-Isolat LAI entspricht, das eine wirksame Anti-HIV-1-Aktivität aufweist. Wie durch das nachstehend im Abschnitt 6 gezeigte Beispiel belegt wird, ist die antivirale Aktivität von DP-178 (SEQ ID: 1) derart hoch, dass auf Gewichtsbasis kein anderes bekanntes Anti-HIV-Mittel bei derart niedrigen Konzentrationen wirksam ist, bei denen DP-178 (SEQ ID: 1) seine inhibitorischen Wirkungen entfaltet. Die Erfindung betrifft weiter diejenigen Teile, Analoge und Homologe von DP-178, die ebenfalls eine derartige antivirale Aktivität zeigen. Die antivirale Aktivität derartiger Teile, Analoge und Homologe von DP-178 schließt die Inhibition der Übertragung von HIV auf nicht-infizierte CD-4+-Zellen ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Erfindung betrifft die Verwendung von DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-178-Fragmenten und/oder -Analogen oder -Homologen. Die Peptide können als Inhibitoren der humanen und nicht-humanen retroviralen Übertragung, insbesondere von HIV, auf nicht-infizierte Zellen und als typ- und/oder subtypspezifische diagnostische Werkzeuge verwendet werden.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung wird nachstehend veranschaulicht, wobei gezeigt wird, dass eine extrem niedrige Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1) und sehr niedrige Konzentrationen eines DP-178-Homologen (SEQ ID: 3) wirksame Inhibitoren der durch HIV-1-vermittelten CD-4+-Zell-Zellfusion (d.h. Syncytien-Bildung) und der Infektion von CD-4+-Zellen durch zellfreie Viren. Des Weiteren wird gezeigt, dass DP-178 (SEQ ID: 1) selbst bei Konzentrationen, die um drei Größenordnungen höher sind als die inhibitorische Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1), gegenüber Zellen nicht-toxisch ist.
  • Es werden ebenfalls zu DP-178 analoge Peptide in anderen Viren mit Hüllen offenbart, die ähnliche antivirale Eigenschaften zeigen.
  • Es werden vorliegend ebenfalls zu DP-107, einem Peptid, das den Aminosäuren 558–595 des Transmembranproteins (TM) gp41 von HIV-1LAI entspricht, analog sind, die in anderen Viren mit Hüllen vorliegen und antivirale Eigenschaften aufweisen. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der überraschenden Erkenntnis, dass die DP-107- und DP-178-Domänen des gp41-Proteins nicht-kovalent miteinander komplexieren und dass ihre Wechselwirkung für die normale Aktivität des Virus erforderlich ist. Es werden vorliegend auch Verfahren zur Identifizierung antiviraler Verbindungen offenbart, welche die Wechselwirkung zwischen DP-107 und DP-178 und/oder zwischen DP-107-ähnlichen und DP-178-ähnlichen Peptiden zerstören.
  • Es werden nachstehend Beispiele bereitgestellt, in denen Peptide mit struktureller und/oder Ähnlichkeit mit DP-107 und DP-178 identifiziert werden.
  • 3.1 DEFINITIONEN
  • Peptide werden vorliegend als organische Verbindungen definiert, die zwei oder mehrere durch Peptid-Bindungen kovalent miteinander verbundene Aminosäuren umfassen. Peptide können mit Bezug auf die Anzahl der sie aufbauenden Aminosäuren bezeichnet werden, d.h. ein Dipeptid enthält zwei Aminosäurereste, ein Tripeptid enthält drei usw. Peptide, die 10 oder weniger Aminosäuren enthalten, können als Oligopeptide bezeichnet werden, während diejenigen mit mehr als 10 Aminosäureresten Polypeptide sind.
  • Vorliegend definierte Peptid-Sequenzen werden durch Ein-Buchstaben-Symbole für Aminosäurereste wie folgt dargestellt:
    • A
    (Alanin)
    R
    (Arginin)
    N
    (Asparagin)
    D
    (Asparaginsäure)
    C
    (Cystein)
    Q
    (Glutamin)
    E
    (Glutaminsäure)
    G
    (Glycin)
    H
    (Histidin)
    I
    (Isoleucin)
    L
    (Leucin)
    K
    (Lysin)
    M
    (Methionin)
    F
    (Phenylalanin)
    P
    (Prolin)
    S
    (Serin)
    T
    (Threonin)
    W
    (Tryptophan)
    Y
    (Tyrosin)
    V
    (Valin)
  • 4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1. Von HIVLAI abgeleitete Aminosäuresequenz von DP-178 (SEQ ID: 1); DP-178-Homologe, die von HIV-1SP2 (DP-185; SEQ ID: 3), HIV-1RF (SEQ ID: 4) und HIV-1MN (SEQ ID: 5) abgeleitet sind; DP-178-Homologe, die von den Aminosäuresequenzen zweier prototypischer HIV-2-Isolate, nämlich HIF-2rod (SEQ ID: 6) und HIV-2NIHZ (SEQ ID: 7), abgeleitet sind, Kontroll-Peptide: DP-180 (SEQ ID: 2), ein Peptid, das die Aminosäurereste von DP-178 als Zufallssequenz enthält; DP-118 (SEQ ID: 10), nicht mit DP-178 verwandt, das die HIV-1-Infektion durch zellfreie Viren inhibiert; es wurde gezeigt, dass DP-125 (SEQ ID: 8), das nicht mit DP-178 verwandt ist, die HIV-1-Infektion durch zellfreie Viren inhibiert (Wild et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537–10,541), es wurde zuvor gezeigt, dass DP-116 (SEQ ID: 9), das mit DP-178 nicht verwandt ist, hinsichtlich der Inhibition der HIV-1-Infektion negativ ist, wobei der zellfreie Virusinfektionstest verwendet wurde (Wild et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537–10,541). In allen Figuren wird der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren verwendet.
  • 2. Inhibition der zellfreien HIV-1-Virusinfektion durch synthetische Peptide. IC50 bezeichnet die Konzentration des Peptids, welche die RT-Produktion aus infizierten Zellen um 50% im Vergleich zur nicht-behandelten Kontrolle inhibiert. Kontrolle: Die von nicht-behandelten Zellkulturen, die mit der gleichen Menge von Viren wie bei behandelten Kulturen infiziert wurden, hergestellte RT-Menge.
  • 3. Inhibition der zellfreien HIV-1- und HIV-2-Virusinfektion durch das synthetische Peptid DP-178 (SEQ ID: 1). IC50: Konzentration des Peptids, welche die RT-Produktion um 50% im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle inhibiert. Kontrolle: Von unbehandelten Zellkulturen, die mit der gleichen Virusmenge wie die behandelten Kulturen infiziert wurden, hergestellte RT-Menge.
  • 4A. Fusionsinhibitionstest. Inhibition der HIV-1-prototypischen, Isolatvermittelten Syncytien-Bildung durch DP-178 (SEQ ID: 1). Die Daten stellen die Anzahl Virus-induzierter Syncytien pro Zelle dar.
  • 4B. Fusionsinhibitionstest. DP-180 (SEQ ID: 2): Zufallskontrollpeptid. DP-185 (SEQ ID: 3): DP-178-Homologes, abgeleitet vom HIV-ISP2-Isolat. Kontrolle: Anzahl von in Abwesenheit des Peptids produzierten Syncytien.
  • 5. Fusionsinhibitionstest: HIV-1 vs. HIV-2. Die Daten stellen die Anzahl Virus-induzierter Syncytien pro Vertiefung dar. ND: nicht bestimmt.
  • 6. Zytotoxizitätsuntersuchung von DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-116 (SEQ ID: 9) bei CEM-Zellen. Es sind die Zellproliferationsdaten gezeigt.
  • 7. Schematische Darstellung von Fusionsproteinen von HIV-gp41- und dem Maltosebindungsprotein (MBP)-gp41. DP-107 und DP-178 sind synthetische Peptide auf Basis der zwei mutmaßlichen Helices von gp41. Der Buchstabe P in den DP-107-Boxen bezeichnet eine Mutation von Ile zu Pro bei der Aminosäurenummer 578. Aminosäurereste werden gemäß Meyers et al., Human Retroviruses and AIDS, 1991, Theoret. Biol. and Biophys. Group, Los Alamos Natl. Lab., Los Alamos, NM, nummeriert.
  • 8. Eine Punktmutation ändert die Konformation und Anti-HIV-Aktivität von M41.
  • 9. Aufhebung der Anti-HIV-Aktivität von DP-178. Es wurden Zellfusionstests in Gegenwart von 10 nM DP-178 und verschiedenen Konzentrationen von M41Δ178 oder M41PΔ178 durchgeführt.
  • 10. Bindung von DP-178 an den Leucin-Zipper bzw. -Reißverschluss, analysiert durch ELISA.
  • 11A–B. Modelle für einen strukturellen Übergang im HIV-1-TM-Protein. Es werden zwei Modelle vorgeschlagen, die einen strukturellen Übergang aus einem nativen Oligomer- in einen fusiogenen Zustand nach einem Auslösungsereignis (möglicherweise die Bindung von gp120 an CD4) anzeigen. Gemeinsame Merkmale beider Modelle enthalten: (1) Der native Zustand wird durch nicht-kovalente Prote in-Protein-Wechselwirkungen zur Bildung des Heterodimers aus gp120/41 und anderen Wechselwirkungen, hauptsächlich über wechselwirkende Stellen in gp41, zur Bildung von Homooligomeren der gp120/41-Komplexe auf der Virusoberfläche zusammengehalten, (2) Abschirmung hydrophober fusiongener Peptide am N-Terminus (F) im nativen Zustand und (3) die Leucin-Zipper-Domäne (DP-107) existiert als homooligomeres Coiled-Coil nur im fusiogenen Zustand. Die wesentlichen Unterschiede zwischen den zwei Modellen schließen den strukturellen Zustand (nativ oder fusiogen) ein, in welchem die DP-107- und DP-178-Domänen miteinander komplexiert sind. Im ersten Modell (A; 11A) tritt diese Wechselwirkung im nativen Zustand und in B während des fusiogenen Zustands auf. Im Falle der Auslösung bildet sich der Fusionskomplex im Modell, das in (A) gezeigt wird, durch Bildung von Coiled-Coil-Wechselwirkungen in zu DP-107 homologen Domänen, was in einer gestreckten α-Helix resultiert. Diese Konformationsänderung bringt das Fusionspeptid zur Wechselwirkung mit der Zellmembran in Stellung. Im zweiten Modell (B; 11B) wird der fusiogene Komplex durch die Assoziation der DP-178-Domne mit dem DP-107-Coiled-Coil stabilisiert.
  • 12. Motiv-Design unter Verwendung der heptadischen Wiederholungspositionierung von Aminosäuren in bekannten Coiled-Coils.
  • 13. Motiv-Design unter Verwendung einer vorgeschlagenen heptadischen Wiederholungspositionierung von Aminosäuren in DP-107 und DP-178.
  • 14. Hybridmotiv-Design, das GCN4 mit DP-107 kreuzt.
  • 15. Hybridmotiv-Design, das GCN4 mit DP-178 kreuzt.
  • 16. Hybridmotiv-Design 107 × 178 × 4, das DP-107 mit DP-178 kreuzt. Es wurde festgestellt, dass dieses Motiv bei der Identifizierung relevanter DP-107-ähnlicher und DP-178-ähnlicher Peptidregionen am einheitlichsten bzw. am beständigsten ist.
  • 17. Hybridmotiv-Design ALLMOTI5, das GCN4, DP-107 und DP-178 kreuzt.
  • 18. Hybridmotiv-Design, das GCN4, DP-107, DP-178, c-Fos c-Jun, c-Myc und Flu Loop 36 kreuzt.
  • 19. Motive, die zur Identifizierung N-terminaler Prolin-Leucin-Zipper-Motive entworfen wurden.
  • 20. Suchergebnisse zum Hüllprotein gp41 von HIV-1-(BRU-Isolat). Sequenzsuchmotivbezeichnungen: Pik (♠): 107 × 178 × 4; Herz (♥) ALLMOTI5; Kreuz (♣): PLZIP; Karo (♦): Transmembranregion (die vermutlichen Transmembrandomänen wurden unter Verwendung eines PC/Gene-Programms, das zur Suche nach derartigen Peptidregionen ausgelegt ist, identifiziert). Stern (*): Lupas-Verfahren. Die durch jedes Motiv identifizierten Aminosäuresequenzen sind durch die jeweiligen Schriftzeichen in Klammern angegeben. Repräsentative Sequenzen, die auf Basis aller Suchverfahren ausgewählt wurden, sind unterstrichen und fett gezeigt. Die DP-107- und DP-178-Sequenzen sind markiert und zusätzlich doppelt unterstrichen und kursiv dargestellt.
  • 21. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 des humanen Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) vom Stamm A2. Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 22. Suchergebnisse für das Hüllprotein gp41 des Affenimmundefiziensvirus (SIV) (AGM3-Isolat). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 23. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein 1 des Kaninchen-Distemper-Virus (Stamm Onderstepoort). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 24. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 des Newcastle-Disease-Virus (Stamm Australia-Victoria/32). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 25. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 des humanen Parainfluenza-3-Virus (Stamm NIH 47885). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 26. Suchergebnisse für den Hämagglutinin-Vorläufer HA2 des Influenza-A-Virus (Stamm A/AICHI/2/68). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 27. Strukturelle Coiled-Coil-Ähnlichkeit und antivirale Anti-RSV-Aktivität von 36-meren Peptiden, die unter Verwendung der Sequenz eines RSV-F2-Peptids mit 48 Aminosäuren synthetisiert wurden, das Sequenzen umspannt, die unter Verwendung der vorliegend beschriebenen, Computer-unterstützten Suchen identifiziert wurden. Hinsichtlich der exakten Lokalisierung und der verwendeten Motive siehe 21. „+"-Symbole sind relative Indikatoren für entweder eine strukturelle Ähnlichkeit oder eine antivirale Aktivität, wobei eine größere Anzahl an „+"-Symbolen eine höhere relative Ähnlichkeit oder antivirale Aktivität anzeigt.
  • 28. Strukturelle Coiled-Coil-Ähnlichkeit und antivirale Anti-RSV-Aktivität von 35-meren Peptiden, die unter Verwendung der Sequenz eines RSV-F1-Peptids mit 53 Aminosäuren synthetisiert wurden, das Sequenzen umspannt, die unter Verwendung der vorliegend beschriebenen, Computer-unterstützten Suchen identifiziert wurden. Hinsichtlich der exakten Lokalisierung und verwendeten Motive siehe 21. „+"-Symbole sind wie in 27 beschrieben.
  • 29. Strukturelle Coiled-Coil-Ähnlichkeit und antivirale Aktivität gegen das humane Parainfluenza-3-Virus (HPF3) von 35-meren Peptiden, die unter Verwendung der Sequenz eines HPF3-Peptids mit 56 Aminosäuren synthetisiert wurden, das Sequenzen umspannt, die unter Verwendung der vorliegend beschriebenen, Computerunterstützten Suchen identifiziert wurden. Hinsichtlich der exakten Lokalisierung und der verwendeten Motive siehe 25. „+"-Symbole sind wie in 27 beschrieben.
  • 30. Strukturelle Coiled-Coil-Ähnlichkeit und antivirale Anti-HPF3-Aktivität von 35-meren Peptiden, die unter Verwendung der Sequenz eines HPF3-Peptids mit 70 Aminosäuren synthetisiert wurden, das Sequenzen umspannt, die unter Verwendung der vorliegend beschriebenen, Computer-unterstützten Suchen identifiziert wurden. Hinsichtlich der exakten Lokalisierung und der verwendeten Motive siehe 25. „+"-Symbole sind wie in 27 beschrieben.
  • 5. BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
  • Unter verschiedenen Gesichtspunkten stellt die Erfindung bereit: Ein Peptid mit einer Formel, die aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00100001
    ausgewählt sind, in welchen die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden,
    X eine Amino-Gruppe, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist,
    Z eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonyl-Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglycol oder eine Kohlenhydrat-Einheit ist.
  • Ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz
    X-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (SEQ ID NO: 3),
    in welcher Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden,
    X eine Amino-Gruppe, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist,
    Z eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonyl-Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglycol oder eine Kohlenhydrat-Einheit ist.
  • Ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz
    X-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-Z (SEQ ID NO: 4),
    in welcher die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden,
    X eine Amino-Gruppe, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist,
    Z eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonyl-Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglycol oder eine Kohlenhydrat-Einheit ist.
  • Ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz
    X-YTSLIYSLLEKSQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (SEQ ID NO: 5),
    in welcher die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden,
    X eine Amino-Gruppe, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist,
    Z eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonyl-Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt,
    worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglycol oder eine Kohlenhydrat-Einheit ist.
  • Ein Peptid mit der Aminosäuresequenz
    X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 1),
    in welcher Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden.
  • Jedes der vorstehend genannten Peptide zur Verwendung als antivirales Mittel in der Behandlung von HIV-1.
    Die Verwendung beliebiger der vorstehend genannten Peptide zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als antivirales Mittel in der Behandlung einer HIV-1-Infektion.
    Und
    Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend beliebige der vorstehend genannten Peptide und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Es werden allerdings vorliegend Peptide allgemein beschrieben, die eine wirksame antivirale Aktivität aufweisen. Dieses Peptide schließen DP-178 (SEQ ID: 1), ein von gp41 abgeleitetes Peptid mit 36 Aminosäuren, Fragmente und/oder Analoge von DP-178 und Peptide, die zu DP-178 homolog sind, ein. Zusätzlich können diese Peptide solche einschließen, die eine antivirale Aktivität aufweisen und zu DP-107, einem Peptid von 38 Aminosäuren, das den Resten 558 bis 595 des Transmembran(TM)-Proteins gp41 von HIV-1LAI entspricht, analog sind und die in anderen Proteinen umhüllter Viren vorkommen. Ebenfalls werden vorliegend Tests zum Testen der antiviralen Aktivitäten derartiger Peptide beschrieben. Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass die DP-107- und DP-178-Domänen des gp41-Proteins miteinander über nicht-kovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen, die für die normale Aktivität des Virus erforderlich sind, einen Komplex bilden. Per se werden Verfahren zur Identifizierung antiviraler Verbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen DP-107- und DP-178-Peptiden und zwischen DP-107-ähnlichen und DP-178-ähnlichen Peptiden zerstören, beschrieben. Schließlich wird die Verwendung der Peptide als Inhibitoren der nicht-humanen und humanen viralen und retroviralen, insbesondere HIV-, Übertragung sowie die Verwendung der Peptide als diagnostische Indikatoren des Vorliegens spezifischer Viren, insbesondere Retroviren, dargelegt.
  • Ohne auf eine beliebige Theorie der Wirkungsweise festgelegt zu sein, wird das folgende Modell zur Erklärung der wirksamen Anti-HIV-Aktivität von DP178 vorgeschlagen, das teilweise auf den nachstehend in den Arbeitsbeispielen beschriebenen Experimenten beruht. In dem viralen Protein gp41 entspricht DP178 einer vermuteten α-Helix-Region, die sich am C-terminalen Ende der Ektodomäne von gp41 befindet und sich mit einer distalen Stelle von gp41 zu assoziieren scheint, dessen wechselwirkende Struktur durch das Leucin-Zipper-Motiv, einer Coiled-Coil-Struktur, mit DP107 bezeichnet, beeinflusst wird. Die Assoziierung könnte eine molekulare Verknüpfung oder „molekulare Klammer" darstellen, die eng am Fusionsprozess beteiligt ist. Es ist von Interesse, dass Mutationen im C-terminalen α-Helix-Motiv von gp41 (d.h. die D178-Domäne) dazu neigen, die Fusionsfähigkeit von gp41 zu verstärken, während Mutationen in der Leucin-Zipper-Region (d.h. die DP107-Domäne) die Fusionsfähigkeit des viralen Proteins herabsetzen oder aufheben. Es ist möglich, dass das Leucin-Zipper-Motiv an der Membranfusion beteiligt ist, während das C-terminale α-Helix-Motiv als molekulare Sicherung dient, um die Verfügbarkeit des Leucin-Zippers während der Virusinduzierten Membranfusion zu regulieren.
  • Aufgrund des Vorangehenden werden zwei Modelle der gp41-vermittelten Membranfusion vorgeschlagen, die schematisch in 11A–B gezeigt sind. Der Grund für das Vorschlagen von zwei Modellen ist, dass die temporale Natur der Wechselwirkung zwischen den durch DP107 und DP178 definierten Regionen bis jetzt nicht festgemacht werden kann. Jedes Modell sieht zwei Konformationen für gp41 – eine in einem „nativen" Zustand, wie er bei einem ruhenden Virion bzw. Virus zu finden sein könnte – vor. Der andere ist ein „fusiogener" Zustand, um Konformationsänderungen zu reflektieren, die nach der Bindung von gp120 an CD4 und direkt vor der Fusion mit der Zielzellmembran ausgelöst werden. Die starke Bindungsaffinität zwischen gp120 und CD4 könnte tatsächlich der Auslöser für den Fusionsprozess sein, was das Erfordernis einer pH-Änderung, wie sie bei Viren auftritt, die innerhalb intrazellulärer Vesikel fusionieren, aus dem Weg räumt. Die zwei Hauptmerkmale beider Modelle sind: (1) Die Leucin-Zipper-Sequenzen (DP107) in jeder Kette der oligomeren Hülle werden im nativen Zustand auseinandergehalten und ihr Ineinandergreifen wird nur im fusiongenen Zustand erlaubt, was die Bildung extrem stabiler Coiled-Coils erlaubt, und (2) die Assoziierung der DP178- und DP107-Stellen, wie sie in gp41 vorliegen, tritt entweder im nativen oder fusiogenen Zustand auf. Die 11A stellt die DP178/DP107-Wechselwirkung im nativen Zustand als molekulare Klasse dar. Falls man andererseits annimmt, dass die stabilste Form der Hülle im fusiogenem Zustand auftritt, kommt das Modell in 11B in Betracht.
  • Wenn sie als Peptide synthetisiert werden, sind sowohl DP107 als auch DP178 wirksame Inhibitoren der HIV-Infektion und -Fusion, was wahrscheinlich auf ihre Befähigung zur Bildung von Komplexen mit viralem gp41 zurückzuführen ist, und sie stören seinen fusiogenen Prozess, z.B. während des strukturellen Übergangs des viralen Proteins von der nativen Struktur in den fusiogenen Zustand könnten die DP178- und DP107-Peptide Zugang zu ihren jeweiligen Bindungsstellen im viralen gp41 gewinnen und einen trennenden Einfluss ausüben. DP107-Peptide, die eine Anti-HIV-Wirksamkeit zeigen, sind in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/927,532, angemeldet am 7. August 1992, der Anmelderin beschrieben.
  • Wie in den nachstehenden Arbeitsbeispielen gezeigt, inhibierte ein trunkiertes bzw. verkürztes rekombinantes, der Ektodomäne von gp41 entsprechendes gp41-Protein, dass sowohl DP107- als auch DP178-Domänen (ohne das Fusionspeptid, die Transmembranregion und die zytoplasmatische Domäne von gp41) enthält, die HIV-1-induzierte Fusion nicht. Wenn jedoch eine einzelne Mutation eingeführt wurde, um die Coiled-Coil-Struktur der DP107-Domäne zu zerstören –– eine Mutation, die in einem vollständigen Verlust der biologischen Aktivität von DP107-Peptiden resultiert ––, wurde das inaktive rekombinante Protein in einen aktiven bzw. wirksamen Inhibitor der HIV-1-induzierten Fusion umgewandelt. Diese Umwandlung könnte aus einer Freisetzung der wirksamen DP178-Domäne aus der molekularen Klammer mit der Leucin-Zipper-DP107-Domäne resultieren.
  • Es wird klargestellt, dass die vorstehenden Prinzipien in Bezug auf die DP178-Peptidinhibitoren von HIV beschrieben werden. Die Prinzipien können jedoch in analoger Weise auf andere fusiogene umhüllte Viren angewandt werden, die diejenigen Viren, welche die in den nachstehenden Tabellen V bis X angegebenen Peptide enthalten, einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind.
  • 5.1 DP-178 UND DP-178-ÄHNLICHE PEPTIDE
  • Das erfindungsgemäße Peptid DP-178 (SEQ ID: 1) entspricht den Aminosäureresten 638 bis 673 des Transmembranproteins gp41 aus dem Isolat HIV-1LAI und weist die 36 Aminosäuren umfassende Sequenz (vom Amino- zum Carboxy-Terminus):
    NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (SEQ ID: 1)
    auf.
  • Zusätzlich zum vollständigen DP-178-36-mer (SEQ ID: 1) schließen verwendbare Peptide Verkürzungen des DP-178-Peptids (SEQ ID: 1) ein, die eine antivirale Aktivität entfalten. Derartige verkürzte DP-178-(SEQ ID: 1)-Peptide können Peptide zwischen 3 und 36 Aminosäureresten (d.h. Peptide, deren Größe von einem Tripeptid bis zu einem 36-meren Polypeptid reicht) umfassen und können diejenigen, die in den nachstehenden Tabellen I und II angegeben sind, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Peptidsequenzen in diesen Tabellen sind vom Amino-(links) zum Carboxy-Terminus (rechts) angegeben. „X" kann eine Amino-Gruppe (-NH2) darstellen, und „Z" kann eine Carboxyl(-COOH)-Gruppe darstellen.
  • In anderen Ausführungsformen können „X" und/oder „Z", wie nachstehend beschrieben, eine hydrophobe Gruppe, eine Acetyl-Gruppe, eine FMOC-Gruppe, eine Amido-Gruppe oder ein kovalent angefügtes Makromolekül darstellen. TABELLE I DP-178 (SEQ ID: 1) CARBOXY-VERKÜRZUNGEN
    Figure 00150001
    Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Amino-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine T-Butyloxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen. TABELLE II DP-178 (SEQ ID: 1) AMINO-VERKÜRZUNGEN
    Figure 00160001
    Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Amino-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine T-Butyloxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • Andere verwendbare antivirale Peptide schließen Analoge von DP-178 und/oder DP-178-Verkürzungen ein, die Peptide, welche die DP-178(SEQ ID: 1)-Sequenz oder eine verkürzte DP-178-Sequenz umfassen, welche ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen enthalten, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Analoge von DP-178-Homologen sind nachstehend beschrieben. DP-178-Analoge der Erfindung entfalten eine antivirale Aktivität und können des Weiteren zusätzliche vorteilhafte Merkmale, wie beispielsweise eine erhöhte Bioverfügbarkeit und/oder Stabilität oder eine verminderte Wirtsimmunerkennung aufweisen.
  • HIV-1- und HIV-2-Hüllproteine sind strukturell verschieden, es besteht jedoch eine auffallende Aminosäurekonservierung innerhalb der DP-178-entsprechenden Regionen von HIV-1 und HIV-2. Die Aminosäurekonservierung ist von periodischer Natur, was eine gewisse Konservierung der Struktur und/oder Funktion nahelegt. Daher würde eine mögliche Klasse von Aminosäuresubstitutionen diejenigen Aminosäureänderungen einschließen, von denen vorausgesagt wird, dass sie die Struktur der erfindungsgemäßen DP-178-Peptide stabilisieren.
  • Aminosäuresubstitutionen können von konservativer oder nicht-konservativer Natur sein. Konservative Aminosäuresubstitutionen bestehen aus dem Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren der DP-178(SEQ ID: 1)-Peptidsequenz durch Aminosäuren mit ähnlicher Ladung, Größe und/oder Hydrophobizitätsmerkmale, wie beispielsweise einer Aminosäuresubstitution von Glutaminsäure (E) zu Asparaginsäure (D). Wenn ausschließlich konservative Substitutionen durchgeführt werden, ist das resultierende Peptid zu DP-178 (SEQ ID: 1) oder zu dem DP-178-Peptid, von dem es abgeleitet wird, funktionell äquivalent. Nicht-konservative Substitutionen bestehen aus eine Austausch ein oder mehrerer Aminosäuren der DP-178(SEQ ID: 1)- Peptidsequenz durch Aminosäuren, die unähnliche Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobizitätsmerkmale aufweisen, wie beispielsweise eine Substitution von Glutaminsäure (E) zu Valin (V).
  • Aminosäureinsertionen können aus einzelnen Aminosäureresten oder Strängen von Resten, deren Länge von 2 bis 15 Aminosäuren reicht bestehen. Es können ein oder mehrere Insertionen in DP-178 (SEQ ID: 1), DP-178-Fragmente, -Analoge und/oder DP-178-Homologe eingeführt werden (nachstehend beschrieben).
  • Es werden vorliegend ebenfalls Deletionen in DP-178 (SEQ ID: 1), DP-178-Fragmenten, -Analogen und/oder DP-178-Homologen offenbart (nachstehend beschrieben). Derartige Deletionen bestehen aus dem Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren aus der DP-178- oder DP-178-ähnlichen Peptidsequenz, wobei die untere Grenze der Länge der resultierenden Peptidsequenz bei 4 bis 6 Aminosäuren liegt. Derartige Deletionen können einen einzelnen zusammenhängenden oder mehr als einen gesonderten Teil der Peptidsequenz einschließen.
  • Es werden vorliegend Peptide offenbart, die Homologe von DP-178 (SEQ ID: 1) und/oder DP-178-Verkürzungen sind, welche eine antivirale Aktivität entfalten. Derartige DP-178-Homologe sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen aus Peptidregionen von anderen (d.h. nicht von HIF-1LAI) Viren aufgebaut sind, die der gp41-Peptidregion entsprechen, von welcher DP-178 (SEQ ID: 1) abgeleitet wurde. Derartige Viren können andere HIV-1-Isolate und HIV-2-Isolate einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. DP-178-Homologe, die von der entsprechenden gp41-Peptidregion anderer (d.h. nicht HIV-1LAI) HIV-1-Isolaten abgeleitet sind, können beispielsweise die nachstehend gezeigten Peptidsequenzen einschließen.
  • Figure 00180001
  • SEQ ID: 3 (DP-185), SEQ ID: 4 und SEQ ID: 5 sind von den Isolaten HIV-1SP2, HIV-1RB bzw. HIV-1MN abgeleitet. Unterstrichene Aminosäurereste beziehen sich auf diejenigen Reste, die sich von der entsprechenden Position im Peptid DP-178 (SEQ ID: 1) unterscheiden. Ein derartiges DP-178-Homolog, DP-185 (SEQ ID: 3), ist in dem im nachstehenden Abschnitt 6 dargestellten Arbeitsbeispiel beschrieben, wo gezeigt wird, dass DP-185 (SEQ ID: 3) eine antivirale Aktivität aufweist. DP-178- Homologe können ebenfalls Verkürzungen, Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen, wie vorstehend beschrieben, aufweisen.
  • Es existieren des Weiteren auffallende Ähnlichkeiten, wie in 1 gezeigt, innerhalb der Regionen von HIV-1- und HIV-2-Isolaten, die der DP-178-Sequenz entsprechen. Ein von dem HIV-2NIHZ-Isolat abgeleitetes DP-178-Homolog weist die folgende Sequenz mit 36 Aminosäuren auf (vom Amino- zum Carboxy-Terminus gelesen):
    NH2-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-COOH (SEQ ID: 7)
  • Die Tabelle III und die Tabelle IV zeigen einige mögliche Verkürzungen des HIV-2NIHZ-DP-178-Homolog, die Peptide mit zwischen 3 und 36 Aminosäureresten umfassen können (d.h. Peptide, deren Größe von einem Tripeptid bis zu einem 36-meren Polypeptid reicht). Die Peptidsequenzen in diesen Tabellen sind von Amino-(links) zum Carboxy-Terminus (rechts) angegeben. „X" kann eine Aminogruppe (-NH2) darstellen, und „Z" kann eine Carboxyl(-COOH)-Gruppe darstellen.
  • In anderen Ausführungsformen können bzw. kann, wie nachstehend beschrieben, „X" und/oder „Z" eine hydrophobe Gruppe, eine Acetyl-Gruppe, eine FMOC-Gruppe, eine Amido-Gruppe oder ein kovalent verbundenes Makromolekül, wie nachstehend beschrieben, darstellen. TABELLE III HIV-2NIHZ-DP-178-Homolog mit Carboxy-Verkürzungen
    Figure 00200001
    Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Amino-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine T-Butyloxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen. TABELLE IV HIV-2NIHZ-DP-178-Homolog mit Amino-Verkürzungen
    Figure 00210001
    Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Amino-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine T-Butyloxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • 5.2 DP-107 UND DP-178-ANALOGE ANTIVIRALE PEPTIDE
  • Peptidsequenzen, die den vorstehend im Abschnitt 5.1 beschriebenen DP-178-Sequenzen entsprechen und somit analog dazu sind, können in anderen Nicht-HIV-1-Hüllenviren gefunden werden. Des Weiteren können Peptidsequenzen, die DP-107, einem von HIV-1-abgeleiteten antiviralen Peptid, funktionell entsprechen und daher zu diesem analog sind, ebenfalls in anderen Nicht-HIV-1-Hüllviren gefunden werden. DP-107 ist ein Peptid mit 38 Aminosäuren, das den Resten 558 bis 595 des Transmembran(TM)-Proteins gp41 von HIV 1LAI entspricht, und das eine wirksame antivirale Aktivität entfaltet. DP-107 wird vollständiger in der ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/927,532 der Anmelderin beschrieben. Diese analogen Peptide sind DP-107-ähnlich und DP-178-ähnlich und liegen in TM-Proteinen von umhüllten Viren vor und weisen vorzugsweise eine antivirale Aktivität, am meisten bevorzugt eine antivirale Aktivität auf, die für den Virus, in welchem ihre nativen Sequenzen vorkommen, spezifisch ist.
  • DP-107-ähnliche und DP-178-ähnliche Peptide können beispielsweise durch Verwendung einer Computer-unterstützten Suchstrategie wie derjenigen, die nachstehend in den Beispielen, die in den Abschnitten 9 bis 16 dargestellt werden, beschrieben und gezeigt werden, identifiziert werden. Die Suchstrategie identifiziert Regionen in anderen Viren, die eine ähnliche vorhergesagte Sekundärstruktur wie DP-107 und DP-178 aufweisen.
  • Diese Suchstrategie wird nachstehend in dem Beispiel, das in dem Abschnitt 9 dargestellt wird, vollständig beschrieben. Obwohl diese Suchstrategie teilweise auf einen von DP-107 und DP-178 abgeleiteten primären Aminosäuremotiv beruht, beruht sie nicht allein auf einer Suche nach primären Aminosäuresequenzhomologien, da derartige Proteinsequenzhomologien innerhalb, aber nicht zwischen Virushauptgruppen existieren. Beispielsweise ist die primäre Aminosäuresequenzhomologie innerhalb des TM-Proteins von verschiedenen HIV-1-Stämmen oder innerhalb des TM-Proteins verschiedener Isolate des Affenimmundefizienzvirus (SIV) hoch. Die Primäraminosäuresequenzhomologie zwischen HIV-1 und SIV ist jedoch so gering, dass dies nicht anwendbar wäre. Es ist daher nicht möglich, DP-107- oder DP-178-ähnliche Peptide in anderen Viren, sei es strukturell oder in anderer Art und Weise, allein auf Basis einer primären Sequenzhomologie zu finden.
  • Während es des Weiteren potentiell von Nutzen wäre, Primärsequenzanordnungen von Aminosäuren eher anhand der physikalisch-chemischen Charakteristika verschiedener Klassen von Aminosäuren als anhand der spezifischen Aminosäuren selbst, beispielsweise indem man sich auf den Coiled-Coil-Charakter der Peptid-Sequenz konzentriert, zu identifizieren, ist ein Computeralgorithmus, der von Lupas et al. zur Identifizierung derartiger Coiled-Coil-Eigenschaften von Regionen innerhalb von Proteinen entworfen wurde (Lupas, A., et al., 1991, Science 252: 1162–1164), zur Identifizierung von zu DP-107 oder DP-178 analogen Proteinregionen unzulänglich.
  • Insbesondere identifiziert eine Analyse von HIV-1-gp160 (das sowohl gp120 als auch gp41 enthält) unter Verwendung des Lupas-Algorithmus nicht die Coiled-Coil-Region in DP-107. Tatsächlich identifiziert er jedoch eine Region in DP-178, die acht Aminosäuren N-terminal zum Start von DP-178 beginnt und acht Aminosäuren von dem C-Terminus endet. Es wurde experimentell gezeigt, dass das DP-107-Peptid ein stabiles Coiled-Coil bildet. Eine auf dem Lupas-Suchalgorithmus basierende Suche hätte daher die Coiled-Coil-Region von DP-107 nicht identifiziert. Umgekehrt identifizierte der Lupas-Algorithmus die DP-178-Region als ein potentielles Coiled-Coil-Motiv. Das DP-178-Peptid, das aus dieser Region abgeleitet ist, bildete jedoch in Lösung kein Coiled-Coil. Eine mögliche Erklärung für die Unfähigkeit des Lupas-Suchalgorithmus zur exakten Identifizierung von Coiled-Coil-Sequenzen im HIV-1-TM ist, dass der Lupas-Algorithmus auf der Struktur von Coiled-Coils aus Proteinen basiert, die zu den TM-Proteinen von Viren strukturell oder funktionell nicht ähnlich sind, von denen vorliegend antivirale Peptide (z. B. DP-107 und DP-178) beschrieben werden.
  • Die in den nachstehend in den Abschnitten 9 bis 16 dargestellten Beispielen beschriebene Computersuchstrategie identifiziert erfolgreich Regionen in viralen TM-Proteinen, die zu DP-107 und DP-178 ähnlich sind. Diese Suchstrategie wurde entworfen, um mit einem im Handel erhältlichen Sequenzdatenbankpaket, vorzugsweise PC/Gene, verwendet zu werden. Es wurde eine Reihe von Motiven entworfen und gestaltet, um, wie in Abschnitt 9 diskutiert, einen Stringenzbereich von sehr eng bis sehr breit abzudecken.
  • Unter den Proteinsequenzsuchmotiven, die in einer derartigen Computerunterstützten Suche nach DP-107-ähnlichen und DP-178-ähnlichen antiviralen Peptiden verwendet werden können, sind das 107 × 178 × 4-Motiv, das ALLMOTI5-Motiv und die PLZIP-Reihe von Motiven, von denen jedes in dem im nachstehenden Abschnitt 9 dargestellten Beispiel beschrieben wird, wobei 107 × 178 × 4 bevorzugt ist.
  • Man geht davon aus, dass Coiled-Coil-Sequenzen aus Wiederholungen von 7 Aminosäuren bestehen. Zur Erleichterung der Beschreibung werden die Aminosäurepositionen in den Siebener-Wiederholungen gelegentlich mit A bis G bezeichnet, wobei die erste Position A ist, die zweite B usw. Die zur Identifizierung von DP-107-ähnlichen und DP-178-ähnlichen Sequenzen vorliegend verwendeten Motive sind zur spezifischen Suche nach und Identifizierung von derartigen Siebener-Wiederholungen ausgestaltet. In der Beschreibung von jedem der nachstehend beschriebenen Motive bezeichnen Aminosäuren in Klammern, d.h. [], nur diejenigen Aminosäurereste, die in der gegebenen Position akzeptabel sind, während Aminosäuren in geschweiften Klammern, d.h. {}, nur diejenigen Aminosäuren bezeichnen, die in der gegebenen Siebener-Position nicht akzeptabel sind. Wenn ein Satz von Aminosäuren in eckigen oder geschweiften Klammern von einer Zahl in runden Klammern, d.h. (), gefolgt wird, bezieht sie sich auf die Anzahl nachfolgender Aminosäurepositionen, für die der bezeichnete Satz von Aminosäuren gilt, z.B. eine (2) bedeutet „für die nächsten zwei heptadischen Aminosäurepositionen".
  • Das ALLMOTI5 wird wie folgt geschrieben:
  • Figure 00240001
  • Die Übersetzung dieses Motivs würde sich lesen: „In der ersten Position (A) der Heptade ist jeder Aminosäurerest außer C, D, G, H oder P akzeptabel, in den nächsten zwei (B, C) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F oder P akzeptabel, in der vierten Heptadenposition (D) ist jeder Aminosäurerest außer C, D, G, H oder P akzeptabel, in den nächsten drei (E, F, G) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F oder P akzeptabel. Dieses Motiv ist für die Suche nach fünf aufeinanderfolgenden Siebener-Wiederholungen ausgestaltet (daher die fünffache Wiederholung der ersten Zeile), was bedeutet, dass es nach Peptiden mit einer Größe von 35-Mer sucht. Es kann ebenfalls dazu entworfen werden, nach 28-Meren zu suchen, indem das Anfangsmotiv nur viermal wiederholt wird. Hinsichtlich des ALLMOTI5-Motivs ist eine 35-Mer-Suche bevorzugt. Diejenigen viralen Sequenzen, die über ein derartiges ALLMOTI5-Motiv identifiziert wurden, sind in der nachstehenden Tabelle V am Ende dieses Abschnitts angegeben. Die in der Tabelle V angegebenen viralen Sequenzen weisen potentiell eine anti virale Aktivität auf und können bei der Identifizierung von antiviralen Verbindungen von Nutzen sein.
  • Das 107 × 178 × 4-Motiv schreibt sich wie folgt:
  • Figure 00250001
  • Eine Übersetzung dieses Motivs würde sich lesen: „In der ersten (A) Position der Heptade ist jeder Aminosäurerest außer E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W oder Y akzeptabel, in den nächsten zwei (B, C) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F, M oder P akzeptabel, in der vierten Position (D) ist jeder Aminosäurerest außer E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W oder Y akzeptabel, in den nächsten drei (E, F, G) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F, M oder P akzeptabel. Dieses Motiv ist zur Suche nach vier aufeinanderfolgenden Siebener-Wiederholungen ausgestaltet (daher die viermalige Wiederholung der ersten Zeile), was bedeutet, dass es nach Peptiden von 28-Mer-Größe sucht. Es kann ebenfalls zur Suche nach 35-Meren ausgestaltet werden, indem das anfängliche Motiv fünfmal wiederholt wird. Hinsichtlich des 107 × 178 × 4-Motivs ist eine 28-Mer-Suche bevorzugt. Diejenigen viralen Sequenzen, die über ein derartiges 107 × 178 × 4-Motiv identifiziert wurden, sind in der nachstehenden Tabelle V am Ende dieses Abschnitts angegeben. Die in der Tabelle V angegebenen Sequenzen weisen potentiell eine antivirale Aktivität auf und sind bei der Identifizierung antiviraler Verbindungen von Nutzen.
  • Die PLZIP-Motivreihe ist in der 19 angegeben. Dieses Motive sind zur Identifizierung von Coiled-Coil-ähnlichen Leucin-Zipper-Heptaden ausgestaltet, wobei mindestens ein Prolinrest in einem vordefinierten Abstand N-terminal von der Wiederholung vorliegt. Diese PLZIP-Motive finden Proteinregionen mit Ähnlichkeiten zu HIV-1-DP-178, die sich im Allgemeinen direkt N-terminal zum Transmembrananker befinden. Diese Motive können gemäß der gleichen Konvention, die vorstehend beschrieben ist, übersetzt werden. Jede in der 19 dargestellte Zeile stellt ein einzelnes, vollständiges Suchmotiv dar. „X" in diesen Motiven bezeichnet einen beliebigen Aminosäurerest. In Fällen, in denen ein Motiv zwei Zahlen in runden Klammern enthält, bezeichnet dies eine variable Anzahl von Aminosäureresten. Beispielsweise wird X(1, 12) mit „die nächsten ein bis einschließlich zwölf Aminosäurereste können eine beliebige Aminosäure sein" übersetzt.
  • Die nachstehenden Tabellen VI bis X am Ende dieses Abschnitts geben Treffer von derartigen PLZIP-Motiven an. Die in den Tabellen VI bis X angegebenen Sequenzen weisen potentiell eine antivirale Aktivität auf und können bei der Identifizierung antiviraler Verbindungen von Nutzen sein.
  • Die nachstehend in den Abschnitten 17 und 18 dargestellten Beispiele zeigen, dass über eine derartige Computersuche identifizierte Sequenzen im Respiratory-Syncytial-Virus und Parainfluenza-Virus antivirale und/oder strukturelle Eigenschaften aufweisen, die zu denjenigen von DP-107 oder DP-178 ähnlich sind.
  • Die zu DP-107 ähnlichen und DP-178 ähnlichen, analogen Peptide können weiter beliebige der vorstehend im Abschnitt 5.1 hinsichtlich DP-178 beschriebenen Gruppen enthalten. Beispielsweise können diese Peptide beliebige der zusätzlichen Amino-terminalen Gruppen, die mit „X" in den Tabellen I bis IV dargestellt sind, enthalten, und sie können ebenfalls beliebige der Carboxy-terminalen Gruppen enthalten, die in den Tabellen I bis IV mit „Z" dargestellt sind.
  • Des Weiteren können derartige DP-107-ähnliche und DP-178-ähnliche Peptide weiter DP-107-ähnliche oder DP-178-ähnliche Peptide, wie diejenigen die in den vorstehenden Tabellen V bis X angegeben sind, einschließen, die ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder deletionen enthalten. Es werden auch Analoge derartiger DP-107-ähnlicher und DP-178-ähnlicher Peptide offenbart. Derartige Analoge können eine verstärkte antivirale Aktivität entfalten, und sie können des Weiteren eine erhöhte Bioverfügbarkeit und/oder Stabilität oder eine verringerte Immunerkennung aufweisen.
  • Die DP-107-ähnlichen und DP-178-ähnlichen Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und -deletionen sind wie vorstehend für DP-178 im Abschnitt 5.1 beschrieben. Analoge Modifikationen sind wie nachstehend im Abschnitt 5.3 beschrieben.
  • Tabelle V Zusammenfassung der Suchergebnisse für die Motive 107 × 178 × 4 und ALLMOTI5
    Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Tabelle VI Zusammenfassung der Suchergebnisse für die Motive PCTLZIP, P1CTLZIP und P2CTLZIP
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Tabelle VII Zusammenfassung der Suchergebnisse für die Motive P3CTLZIP, P4CTLZIP, P5CTLZIP und P6CTLZIP
    Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Tabelle VIII Zusammenfassung der Suchergebnisse für die Motive P7CTLZIP, P8CTLZIP und P9CTLZIP
    Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Tabelle IX Zusammenfassung der Suchergebnisse für das Motiv P12CTLZIP
    Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
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  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
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  • Tabelle X Zusammenfassung der Suchergebnisse für das Motiv P23CTLZIP
    Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
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  • 5.3. SYNTHESE VON PEPTIDEN
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können durch im Fachgebiet bekannte Techniken synthetisiert oder hergestellt werden. Siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY. Kurze Peptide können beispielsweise auf einem festen Träger oder in Lösung synthetisiert werden. Längere Peptide können unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Hierbei können die für die erfindungsgemäßen Peptide codierenden Nukleotidsequenzen synthetisiert und/oder kloniert und gemäß einem Fachmann bekannter Techniken exprimiert werden. Siehe beispielsweise Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Bde. 1–3, Cold Spring Harbor Press, N.Y.
  • In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide derart synthetisiert werden, dass eine oder mehrere der Bindungen, welche die Aminosäurereste der Peptide verknüpfen, Nicht-Peptid-Bindungen sind. Diese alternativen Nicht-Peptid-Bindungen können durch Ausnutzen von einem Fachmann bekannten Reaktionen gebildet werden und können, um nur einige zu nennen, Imino-, Ester-, Hydrazid-, Semicarbazid- und Azo-Bindungen einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer weiteren Ausführungsform können die Peptide der Erfindung mit zusätzlichen chemischen Gruppen, die an ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini vorliegen, synthetisiert werden, so dass beispielsweise die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder die inhibitorische Aktivität der Peptide erhöht wird. Beispielsweise können hydrophobe Gruppen wie Carbobenzoxyl-, Dansyl- oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen an die Aminotermini der Peptide angefügt werden. In ähnlicher Weise kann eine Acetyl-Gruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe an den Aminotermini der Peptide angeordnet werden. (Siehe „X" in den vorstehenden Tabellen I bis IV). Außerdem kann die hydrophobe Gruppe, die t-Butyloxycarbonyl- oder eine Amido-Gruppe an die Carboxyl-Termini der Peptide angefügt werden. (Siehe „Z" in den vorstehenden Tabelle I bis IV). Des Weiteren können die Peptide der Erfindung derart synthetisiert werden, dass ihre sterische Konfiguration geändert wird. Beispielsweise kann das D-Isomer eines oder mehrerer der Aminosäurereste des Peptids anstatt des üblichen L-Isomers verwendet werden. Mindestens einer der Aminosäurereste der vorliegend beschriebenen Peptide kann durch einen der bekannten, natürlicherweise nicht vorkommenden Aminosäurereste ersetzt werden. Modifikationen wie diese können dazu dienen, die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder inhibitorische Wirkung der Peptide zu erhöhen.
  • Beliebige der vorstehend beschriebenen Peptide können zusätzlich eine mit ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini kovalent verbundene nicht-peptidische makromolekulare Trägergruppe aufweisen. Derartige makromolekulare Trägergruppen können beispielsweise Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate einschließen. „X" in den vorstehenden Tabellen I bis IV kann daher zusätzlich beliebige der mit dem Aminoterminus eines Peptids kovalent verknüpften vorstehenden makromolekularen Trägergruppen darstellen. In ähnlicher Weise kann „Z" in den Tabellen I bis IV außerdem beliebige der vorstehend beschriebenen makromolekularen Trägergruppen darstellen.
  • 5.4. TESTS ZUR ANTIVIRALEN AKTIVITÄT
  • Die von den Peptiden der Erfindung entfaltete antivirale Aktivität kann beispielsweise durch leicht durchführbare In-vitro-Tests, wie die nachstehend beschriebenen, gemessen werden, welche die Befähigung der Peptide zur Inhibition der Syncytien-Bildung oder ihre Befähigung zur Inhibition der Infektion durch zellfreie Viren testen können. Unter Verwendung dieser Tests können Parameter, wie die gegen einen gegebenen Stamm eines Virus entfaltete relative antivirale Aktivität der Peptide und/oder die stammspezifische inhibitorische Aktivität des Peptids bestimmt werden. Es kann ein Zellfusionstest verwendet werden, um die Befähigung der Peptide zur Inhibition der HIV-induzierten Syncytien-Bildung in vitro zu testen. Ein derartiger Test kann das Züchten nicht-infizierter CD-4+-Zellen (wie beispielsweise Molt- oder CEM-Zellen) in Gegenwart chronisch HIV-infizierter Zellen und eines zu testenden Peptids umfassen. Für jedes Peptid wird ein Bereich von Peptidkonzentrationen getestet. Dieser Bereich sollte eine Kontrollkultur, bei der kein Peptid zugegeben worden ist, einschließen. Für die Kultur werden Standardbedingungen, die einem Fachmann bekannt sind, verwendet. Nach Inkubation für eine geeignete Zeitspanne (beispielsweise 24 Stunden bei 37°C) wird die Kultur mikroskopisch hinsichtlich des Vorhandenseins multinukleärer Riesenzellen, die eine Zellfusion und Syncytien-Bildung anzeigen, untersucht.
  • Es kann ein Reverse-Transkriptase(RT)-Test verwendet werden, um die Befähigung der Peptide zur Inhibition der Infektion von CD-4+-Zellen durch zellfreie HIV zu testen. Ein derartiger Test kann das Züchten einer geeigneten Konzentration (d. h. TCID50) von Viren und CD-4+-Zellen in Gegenwart des zu testenden Peptids umfassen. Es werden einem Fachmann bekannte Kulturbedingungen angewandt. Wie oben, kann zusätzlich zu einer Kontrollkultur, bei der kein Peptid zugegeben wird, ein Bereich von Peptidkonzentrationen verwendet werden. Nach der Inkubation für eine geeignete Zeitspanne (z.B. 7 Tage) der Kultur, wird ein zellfreier Überstand unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt und hinsichtlich der vorhan denen RT-Aktivität als Maß für eine erfolgreiche Infektion getestet. Die RT-Aktivität kann unter Verwendung von Standardtechniken, wie diejenigen, die beispielsweise von Goff et al. (Goff, S. et al., 1981, J. Virol. 38: 239–248) und/oder Willey et al., (Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62: 139–147) beschrieben wurden, getestet werden.
  • Es können einem Fachmann bekannte Standardverfahren zum Testen der nicht-retroviralen Aktivität verwendet werden. Siehe beispielsweise Pringle et al. (Pringle, C. R. et al., 1985. J. Medical Virology 17: 377–386) hinsichtlich einer Diskussion von Aktivitätstesttechniken für den Respiratory-Syncytial-Virus und Parainfluenza-Virus. Des Weiteren siehe beispielsweise „Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K. et al., Hsg., Appleton & Lange, Norwalk, CT: 19. Aufl., hinsichtlich eines allgemeinen Überblicks über derartige Techniken.
  • 5.5. VERWENDUNGEN DER ERFINDUNGSGEMÄßEN PEPTIDE
  • Die DP-178-(SEQ ID: 1)Peptide der Erfindung und die DP-178-Fragmente, -Analoge und -Homologe entfalten eine wirksame antivirale Aktivität. Außerdem entfalten vorzugsweise DP-107-ähnliche und DP-178-ähnliche Peptide eine antivirale Aktivität. Die Peptide als solche können als Inhibitoren der humanen und nicht-humanen und retroviralen, insbesondere HIV-, Übertragung auf nicht-infizierte Zellen verwendet werden.
  • Die humanen Retroviren, deren Übertragung durch die Peptide inhibiert werden kann, schließen alle Stämme von HIV-1 und HIV-2 und die humanen T-Lymphozytenviren (HTLV-I und -II) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die nicht-humanen Retroviren, deren Übertragung von den Peptiden inhibiert werden kann, schließen den Rinderleukosevirus, Katzensarkom- und -Leukämie-Viren, Affenimmundefizienz-, -sarkom- und -Leukämie-Viren und Schaf-progressive-Pneumonie-Viren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Nicht-retrovirale Viren, deren Übertragung durch die Peptide inhibiert werden kann, schließen den humanen Respiratory-Syncytial-Virus, Kaninchen-Distemper-Virus, Newcastle-Disease-Virus, humanen Parainfluenza-Virus und Influenza-Viren ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Des Weiteren können beliebige Viren oder Retroviren, welche die in den vorstehenden Tabellen V bis X angegebenen Peptide enthalten, durch die Peptide inhibiert werden.
  • Wie nachstehend im Abschnitt 5.5.1 und in dem im nachstehenden Abschnitt 8 dargestellten Beispiel ausführlicher diskutiert, bilden DP-107 und DP-178 und DP- 107-ähnliche und DP-178-ähnliche Peptide nicht-kovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen aus, die für die normale Aktivität des Virus erforderlich sind. Daher können die Peptide als Komponenten in Tests zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die derartige Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, und sie können daher als antivirale Mittel dienen. Diese Tests sind nachstehend im Abschnitt 5.5.1. erläutert.
  • 5.5.1 ANTIVIRUS-VERBINDUNGSSCREENINGTESTS NACH VERBINDUNGEN, DIE MIT DEM PKD1-GENPRODUKT WECHSELWIRKEN
  • Wie in dem im nachstehenden Abschnitt 8 dargestellten Beispiel gezeigt, bilden die DP-107- und DP-178-Abschnitte des TM-Proteins gp41 nicht-kovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen aus. Wie ebenfalls gezeigt, ist die Aufrechterhaltung derartiger Wechselwirkungen für die normale Virusaktivität erforderlich. Daher können Verbindungen, die an DP-107 binden, an DP-178 binden und/oder derart wirken, dass sie die normalen DP-107/DP-178-Protein-Protein-Wechselwirkungen aufheben, als patente antivirale Mittel wirken. Es werden nachstehend Tests zur Identifizierung derartiger Verbindungen beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, dass aus Gründen der Einfachheit und Klarheit der Diskussion DP-107- und DP-178-Peptide als Komponenten der beschriebenen Tests verwendet werden, es jedoch klar ist, dass beliebige der vorstehend in den Abschnitten 5.1 und 5.2 beschriebenen DP-107-ähnlichen oder DP-178-ähnlichen Peptide ebenfalls als Teil dieser Screenings nach antiviralen Verbindungen verwendet werden können.
  • Verbindungen, die hinsichtlich einer Befähigung, an DP-107, DP-178 zu binden und/oder DP-107/DP-178-Wechselwirkungen aufzuheben und daher potentiell antivirale Verbindungen darstellen, schließen Peptide aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration (beispielsweise in Form von Zufallspeptidbibliotheken; siehe Lam, K. S. et al., 1991, Nature 354: 82–84), Phosphorpeptide (beispielsweise in Form von zufälligen oder partiell degenerierten, zielgerichteten Phosphorpeptid-Bibliotheken; siehe beispielsweise Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767–778), Antikörper und kleine organische oder anorganische Moleküle ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und andere Quellen potentiell wirksamer Materialien können auf verschiedenen Wegen, wie in diesem Abschnitt beschrieben, gescreent werden. Die identifizierten Verbindungen, Antikörper oder anderen Moleküle können hinsichtlich einer Befähigung zur Inhibition der viralen Aktivität unter Verwendung von beispielsweise viralen Tests, wie diejenigen, die vorstehend im Abschnitt 5.4 beschrieben sind, getestet werden.
  • Unter den Peptiden, die getestet werden können, sind lösliche Peptide, welche DP-107- und/oder DP-178-Domänen umfassen, und Peptide, die DP-107- und/oder DP-178-Domänen mit einer oder mehreren Mutationen in einer oder beiden Domänen umfassen, wie das nachstehend in dem im Abschnitt 8 dargestellten Beispiel beschriebene M41-P-Peptid, das eine Mutation von Isoleucin zu Prolin in der DP-178-Sequenz aufweist.
  • Ein Beispiel derartiger Screeningverfahren ist ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, das hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zu testen ist, umfassend:
    • (a) Aussetzen mindestens einer Verbindung einem Peptid, das ein DP-107-Peptid umfasst, für eine Zeitspanne, die ausreicht, um eine Bindung der Verbindung mit dem DP-107-Peptid erlaubt,
    • (b) Entfernen nicht-gebundener Verbindungen und
    • (c) Bestimmen des Vorhandenseins der mit dem DP-107-Peptid verbundenen Verbindung, wodurch ein hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zum testender Wirkstoff identifiziert wird.
  • Ein zweites Beispiel derartiger Screeningverfahren ist ein Verfahren zur Identifizierung einer hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zu testenden Verbindung, umfassend:
    • (a) Aussetzen mindestens einer Verbindung einem Peptid, das ein DP-178-Peptid umfasst, für eine Zeitspanne, die ausreicht, um eine Bindung der Verbindung an das DP-178-Peptid zu erlauben,
    • (b) Entfernen nicht-gebundener Verbindungen und
    • (c) Bestimmen des Vorhandenseins der mit dem DP-178-Peptid verbundenen Verbindung, wodurch ein hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zu testender Wirkstoff identifiziert wird.
  • Ein Verfahren, das diese Arten von Vorgehensweisen verwendet und das bei der Isolierung derartiger DP-107-bindender oder DP-178-bindender Verbindungen betrieben werden kann, ist ein Test, der das Anbringen entweder des DP-107- oder DP-178-Peptids auf einer festen Matrix, wie beispielsweise Agarose- oder Kunststoff-Kügelchen, Microtiterplattenvertiefungen, Petrischalen oder beispielsweise aus Nylon oder Nitrocellulose aufgebauten Membranen, einschließen würde. In einem derartigen Testsystem kann entweder das DP-107- oder DP-178-Protein auf einer festen Oberfläche verankert werden, und die Verbindung oder Testsubstanz, die nicht verankert ist, wird entweder direkt oder indirekt markiert. In der Praxis werden Microtiterplatten in geeigneter Weise verwendet. Die verankerte Komponente kann durch nicht-kovalente oder kovalente Bindungen immobilisiert werden. Eine nicht-kovalente Bindung kann einfach durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Proteins und Trocknen erreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein immobilisierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der für das Protein spezifisch ist, verwendet werden, um das Protein auf der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können vorher hergestellt und gelagert werden.
  • Um den Test durchzuführen, wird die markierte Verbindung auf die beschichtete Oberfläche, die das verankerte DP-107- oder DP-178-Peptid enthält, gegeben. Nach der vollständigen Reaktion werden nicht-reagierte Komponenten unter derartigen Bedingungen entfernt (z.B. durch Waschen), dass alle gebildeten Komplexe auf der festen Oberfläche immobilisiert verbleiben. Die Detektion der Komplexe, die auf der Oberfläche verankert sind, kann durch eine Anzahl von Wegen erreicht werden. Wenn die Verbindung zuvor markiert wurde, zeigt die Detektion der auf der Oberfläche immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn die markierte Verbindung zuvor nicht markiert wurde, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um auf der Oberfläche verankerte Komplexe zu detektieren, z.B. unter Verwendung eines markierten Antikörpers, der für die Verbindung spezifisch ist (der Antikörper kann wiederum direkt markiert oder mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper markiert werden).
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein derartiger Test, in der flüssigen Phase durchgeführt, die Reaktionsprodukte von nicht-umgesetzten Komponenten getrennt und Komplexe detektiert werden, z.B. unter Verwendung eines für DP-107 oder DP-178 spezifischen immobilisierten Antikörpers, was auch immer für den gegebenen Test geeignet ist, oder eines für die Verbindung, d.h. die Testsubstanz, spezifischen Antikörpers, um jeden in Lösung gebildeten Komplex zu verankern, und eines markierten für den anderen Teil des Komplexes spezifischen markierten Antikörpers, um verankerte Komplexe zu detektieren.
  • Durch Anwenden von Verfahren wie diesem, kann eine große Anzahl von Molekültypen gleichzeitig hinsichtlich der Befähigung zur DP-107- oder DP-178-Bindung und somit hinsichtlich ihrer potentiellen antiviralen Aktivität getestet werden.
  • Des Weiteren können Verbindungen hinsichtlich einer Befähigung zur Inhibition der Bildung oder, in einer anderen Ausführungsform, Spaltung von DP-107/DP-178-Komplexen gescreent werden. Derartige Verbindungen können dann hinsichtlich einer antiviralen Befähigung getestet werden. Zur Vereinfachung der Beschreibung werden DP-107 und DP-178 als „Bindungspartner" bezeichnet. Verbindungen, welche derartige Wechselwirkungen aufheben, können eine antivirale Aktivität aufweisen. Derartige Verbindungen können Moleküle, wie vorstehend beschriebene Antikörper, Peptide und ähnliche einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Das zugrundeliegende Prinzip der zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen den DP-107- und DP-178-Peptiden stören, verwendeten Testsysteme, schließt das Herstellen eines die Peptide enthaltenden Reaktionsgemischs unter Bedingungen und für eine Zeitspanne ein, die ausreicht, um es den zwei Peptiden zu erlauben, miteinander zu Wechselwirken und zu binden und so einen Komplex zu bilden. Um eine Verbindung hinsichtlich einer Spaltungsaktivität zu testen, wird die Reaktion in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt, d.h., die Testverbindung kann anfänglich in dem Reaktionsgemisch enthalten sein oder zu einem nach dem Zufügen eines der Bindungspartner liegenden Zeitpunkt zugegeben werden. Kontrollen werden ohne die Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert. Dann wird die Bildung eines jeden Komplexes zwischen den Bindungspartnern detektiert. Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion, nicht aber in dem die Testverbindung enthaltenden Reaktionsgemisch, zeigt, dass die Verbindung die Wechselwirkung zwischen den DP-107- und DP-178-Peptiden stört.
  • Der Test für Verbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern stören, kann in heterogener oder homogener Form durchgeführt werden. Heterogene Tests schließen die Verankerung von einem der Bindungspartner auf einer festen Phase und die Detektion von auf der festen Phase verankerten Komplexen am Ende der Reaktion ein. In homogenen Tests wird die gesamte Reaktion in einer flüssigen Phase durchgeführt. Bei beiden Vorgehensweisen kann die Reihenfolge des Zugebens der Reaktanden verändert werden, um unterschiedliche Informationen über die getesteten Verbindungen zu erhalten. Beispielsweise können Testverbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern, z.B. durch Kompetition, stören, identifiziert werden, indem die Reaktion in Gegenwart der Testsubstanz, d.h. durch Zugeben der Testsubstanz zum Reaktionsgemisch vor oder gleichzeitig mit den Bindungspartnern, durchgeführt wird. Andererseits können Verbindungen, welche die zuvor gebildeten Komplexe spalten, z.B. Verbindungen mit höheren Bindungskonstanten, die einen der Bindungspartner aus dem Komplex verdrängen, durch Zugeben der Testverbindung zu dem Reaktionsgemisch, nachdem sich Komplexe gebildet haben, getestet werden. Die verschiedenen Formate sind nachstehend kurz beschrieben.
  • In einem heterogenen Testsystem wird ein Bindungspartner, z.B. entweder das DP-107- oder das DP-178-Peptid, auf einer festen Oberfläche verankert und sein Bin dungspartner, der nicht verankert wird, wird entweder direkt oder indirekt markiert. In der Praxis werden Microtiterplatten in geeigneter Weise verwendet. Die verankerte Spezies kann durch nicht-kovalente oder kovalente Bindungen immobilisiert werden. Eine nicht-kovalente Bindung kann einfach durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Proteins und Trocknen herbeigeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein für das Protein spezifischer, immobilisierter Antikörper verwendet werden, um das Protein auf der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können zuvor hergestellt und gelagert werden.
  • Um den Test durchzuführen, wird der Bindungspartner der immobilisierten Spezies auf die beschichtete Oberfläche mit der oder ohne die Testverbindung gegeben. Nach der vollständigen Reaktion werden nicht-reagierte Komponenten (z.B. durch Waschen) entfernt, und alle gebildeten Komplexe bleiben auf der festen Oberfläche immobilisiert. Die Detektion der auf der festen Oberfläche verankerten Komplexe kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Wenn der Bindungspartner zuvor markiert wurde, zeigt die Detektion der auf der Oberfläche immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn der Bindungspartner nicht vorher markiert wurde, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um die auf der Oberfläche verankerten Komplexe zu detektieren, z.B. unter Verwendung eines markierten, für den Bindungspartner spezifischen Antikörpers (der Antikörper kann wiederum direkt markiert oder mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper indirekt markiert sein). In Abhängigkeit von der Reihenfolge des Zugebens von Reaktionskomponenten können Testverbindungen, welche die Komplexbildung inhibieren oder die zuvor gebildeten Komplexe spalten, detektiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die Reaktion in einer flüssigen Phase in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden, die Reaktionsprodukte werden von nicht-reagierten Komponenten getrennt und Komplexe detektiert, z.B. unter Verwendung eines immobilisierten, für einen Bindungspartner spezifischen Antikörpers, um jeden in Lösung gebildeten Komplex zu verankern, und eines markierten Antikörpers, der für den anderen Bindungspartner spezifisch ist, um verankerte Komplexe zu detektieren. Es können wieder in Abhängigkeit von der Reihenfolge des Zugebens von Reaktanden zu der flüssigen Phase Testverbindungen identifiziert werden, die Komplexe inhibieren oder die zuvor gebildete Komplexe spalten.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein homogener Test verwendet werden. Bei dieser Vorgehensweise wird ein vorgebildeter Komplex aus den DP-107- und DP-178- Peptiden hergestellt, in welchem einer der Bindungspartner markiert ist, das vor der Markierung erzeugte Signal aufgrund der Komplexbildung jedoch gelöscht wird (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4,109,496 von Rubenstein, worin diese Vorgehensweise bei Immuntests verwendet wird). Die Zugabe einer Testsubstanz, die mit einem der Bindungspartner konkurriert und diesen aus dem zuvor gebildeten Komplex verdrängt, resultiert in der Erzeugung eines Signals über dem Hintergrund. Auf diesem Weg können Testsubstanzen, welche die DP-107/DP-178-Protein-Protein-Wechselwirkung aufheben, identifiziert werden.
  • 5.5. Pharmazeutische Formulierungen, Dosierungen und Verabreichungswege
  • In Bezug auf HIV können die Peptide der Erfindung als Therapeutikum in der Behandlung von AIDS verwendet werden.
  • Die Peptide der Erfindung können unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Techniken verabreicht werden. Vorzugsweise werden Wirkstoffe formuliert und systemisch verabreicht. Techniken zur Formulierung und Verabreichung können in „Remington's Pharmaceutical Sciences", 18. Aufl., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, gefunden werden. Geeignete Wege können eine orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung, eine parenterale Gabe, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intramedullare Injektionen sowie intrathekale, direkte intraventrikulare, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraoculäre Injektionen, um nur einige zu nennen, einschließen. Die am meisten bevorzugte Verabreichung erfolgt intravenös. Zur Injektion können die Wirkstoffe der Erfindung in wässerigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie die Hanks'sche Lösung, Ringer'sche Lösung oder physiologischer Kochsalzpuffer, formuliert werden. Für eine derartige transmukosale Verabreichung werden Durchdringungsmittel, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Derartige Durchdringungsmittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Des Weiteren können die Peptide als eine prophylaktische Maßnahme in zuvor nicht-infizierten Individuen nach einem akuten Kontakt mit einem HIV-Virus verwendet werden. Beispiele einer derartigen prophylaktischen Verwendung der Peptide können die Prävention der Virusübertragung von der Mutter auf das Kind und andere Situationen, bei denen eine Wahrscheinlichkeit für die HIV-Übertragung vorliegt, wie beispielsweise Unfälle bei medizinischen Versorgungssituationen, in denen Mitarbeiter mit HIV-haltigen Blutprodukten in Kontakt kommen, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Peptide der Erfindung können in derartigen Fällen die Rolle eines prophylaktischen Vakzins spielen, wobei der Wirt Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Peptide erzeugt, die dann zur Neutralisierung von HIV-Viren, beispielsweise durch Inhibition einer weiteren HIV-Infektion, dienen.
  • Die Verabreichung der Peptide der Erfindung als prophylaktisches Vakzin würde daher die Verabreichung einer Konzentration des Peptids, die zur Erzeugung einer Immunantwort wirksam ist ausreicht, um HIV, beispielsweise durch Inhibition der Befähigung von HIV zur Infektion von Zellen, zu neutralisieren, umfassen. Die exakte Konzentration hängt von dem spezifischen, zu verabreichenden Peptid ab, kann jedoch unter Verwendung von Standardtechniken zum Testen der Erzeugung einer Immunantwort, die einem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Die als Vakzine zu verwendenden Peptide werden üblicherweise intramuskulär verabreicht.
  • Die Peptide können mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken. Derartige Adjuvantien schließen Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanione, andere Peptide, Ölemulsionen und potentiell verwendbare humane Adjuvantien, wie BCG und Corynebacterium parvum, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es können viele Verfahren angewendet werden, um die vorliegend beschriebenen Vakzin-Formulierungen einzusetzen. Diese Verfahren schließen orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Wege ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine wirksame Konzentration von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäßen Peptide erzeugt wurden, an einen Wirt verabreicht werden, so dass keine nicht-infizierten Zellen durch HIV infiziert werden. Die exakte Konzentration derartiger Antikörper ist mit jeder spezifischen Antikörperpräparation veränderlich, kann aber unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Standardtechniken bestimmt werden. Die Verabreichung der Antikörper kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken durchgeführt werden, welche die in diesem Abschnitt beschriebenen einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • Wirksame Dosierungen der zu verabreichenden Peptide der Erfindung können durch einem Fachmann bekannte Verfahren, die auf Parameter, wie die biologische Halbwertszeit, Bioverfügbarkeit und Toxizität, gerichtet sind, bestimmt werden. Angesichts der nachstehend im Abschnitt 6 gezeigten Daten kann sich beispielsweise DP-178 in vivo bei Dosen, die zum Erreichen von Kreislaufspiegeln von 10 ng Peptid pro ml erforderlich sind, als wirksam erweisen.
  • Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die ausreicht, um eine Verbesserung der Symptome oder eine Verlängerung der Überlebenszeit bei einem Patienten zu ergeben. Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit derartiger Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Tierexperimenten, z.B. zur Bestimmung der LD50 (die für 50% der Population tödliche Dosis) und der ED50 (die in 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis), bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen den toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index, und er kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden. Verbindungen, die große therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Die aus diesen Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung einer Reihe von Dosierungen zur Anwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Kreislaufkonzentrationen, welche die ED50 bei einer geringen oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der verwendeten Dosisform und dem angewandten Verabreichungsweg verändert werden. Für jede Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich anhand von Zellkulturtests geschätzt werden. Es kann in Tiermodellen eine Dosis formuliert werden, um einen Kreislaufplasmakonzentrationsbereich zu erreichen, der die IC50 (d.h. die Konzentration der Testverbindung, bei der eine halbmaximale Spaltung des PTK/Adapter-Proteinkomplexes oder eine halbmaximale Inhibition des zellulären Spiegels und/oder Aktivität einer Komplexkomponente erreicht wird), wie sie in der Zellkultur bestimmt wurde, einschließt. Eine derartige Information kann dazu verwendet werden, um in Menschen verwendbare Dosen genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemessen werden.
  • Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können durch den jeweiligen Mediziner anhand des Zustandes des Patienten gewählt werden (siehe z.B. Fingl et al., 1975, in „The Pharmalogical Basis of Therapeutics", Kap. 1, Seite 1).
  • Es wird darauf hingewiesen, dass der behandelnde Arzt weiß, wann die Verabreichung aufgrund einer Toxizität oder Organdysfunktion zu beenden, zu unterbrechen oder anzupassen ist. Umgekehrt ist der behandelnde Arzt damit vertraut, die Behandlung auf höhere Spiegel einzustellen, falls die klinische Reaktion nicht angemessen ist (wobei eine Toxizität auszuschließen ist). Die Höhe der verabreichten Dosis bei der Behandlung der interessierenden onkogenen Erkrankung ist mit der Schwere des zu behandelnden Zustands und dem Verabreichungsweg veränder lich. Die Dosis und möglicherweise die Dosisfrequenz sind mit dem Alter, dem Körpergewicht und der Reaktion des einzelnen Patienten ebenfalls veränderlich. Eine mit der vorstehend diskutierten ähnliche Vorgehensweise kann in der Veterinärmedizin verwendet werden.
  • Wie in dem im nachstehenden Abschnitt 6 dargestellten Beispiel gezeigt, kann die antivirale Aktivität der Peptide der Erfindung eine ausgeprägte Typ- und Subtyp-Spezifität zeigen, d.h. spezifische Peptide können bei der Inhibition der Aktivität nur von spezifischen Viren wirksam sein. Dieses Merkmal der Erfindung stellt viele Vorteile dar. Einer der derartigen Vorteile liegt beispielsweise im Gebiet der Diagnostik, wobei man die antivirale Spezifität des Peptids der Erfindung verwenden kann, um die Identität des viralen Isolats zu ermitteln. In Bezug auf HIV kann man leicht bestimmen, ob ein virales Isolat aus einem HIV-1- oder HIV-2-Stamm besteht. Es können beispielsweise nicht-infizierte CD-4+-Zellen mit einem Isolat ko-infiziert werden, von dem festgestellt wurde, dass es das HIV-DP-178-(SEQ ID: 1)-Peptid enthält, wonach die retrovirale Aktivität von Zellüberständen, beispielsweise unter Verwendung der im vorstehenden Abschnitt 5.2 beschriebenen Techniken, getestet werden kann. Diejenigen Isolate, deren retrovirale Aktivität vollständig oder nahezu vollständig inhibiert wird, enthalten HIV-1. Diejenigen Isolate, deren virale Aktivität unverändert ist oder nur in einem geringen Ausmaß vermindert wird, werden als HIV-1-nicht-enthaltend betrachtet. Ein derartiges Isolat kann dann mit einem oder mehreren der anderen DP-178-Peptide der Erfindung behandelt und danach hinsichtlich seiner viralen Aktivität getestet werden, um die Identität des viralen Isolats zu bestimmen. Es können pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden, um die vorliegend offenbarten Verbindungen zu Dosierungen zu formulieren, die für eine systemische Verabreichung geeignet sind. Bei geeigneter Auswahl des Trägers und geeigneter Herstellungspraxis können die Zusammensetzungen, insbesondere diejenigen, die als Lösung formuliert sind, parenteral wie durch intravenöse Injektion verabreicht werden. Die Verbindungen können leicht unter Verwendung im Fachgebiet bekannter pharmazeutisch verträglicher Träger in Dosierungen formuliert werden, die für eine orale Verabreichung geeignet sind. Derartige Träger ermöglichen es den Verbindungen der Erfindung, als Tabletten, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und ähnliche zur oralen Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert zu werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen ein, bei denen die wirksamen Bestandteile in einer wirksamen Menge zum Erreichen des beabsichtigten Zwecks enthalten sind. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt, insbesondere im Licht der vorliegend bereitgestellten detaillierten Offenbarung, innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns.
  • Zusätzlich zu den wirksamen Bestandteilen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete, pharmazeutisch verträgliche Träger, umfassend Vehikel und Hilfsstoffe, enthalten, welche die Verarbeitung der wirksamen Verbindungen zu pharmazeutisch verwendbaren Präparaten erleichtern. Die für eine orale Verabreichung formulierten Präparate können in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Lösungen vorliegen.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer an sich bekannten Art und Weise, z.B. mit Hilfe üblicher Misch-, Auflösungs-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Verreibungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einfangungs- oder Lyophilisierungsverfahren, hergestellt werden.
  • Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässerige Lösungen der wirksamen Verbindungen in wasserlöslicher Form ein. Des Weiteren können Suspensionen der wirksamen Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen Fettöle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen ein. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran, enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung hoch konzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
  • Pharmazeutische Präparate für die orale Verwendung können durch Vereinigen der wirksamen Verbindungen mit festen Hilfsstoffen, ggf. Mahlen des resultierenden Gemischs und Verarbeiten des Granulatgemischs, nachdem, falls erwünscht, geeignete Hilfsstoffe zugegeben wurden, erhalten werden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Hilfsstoffe sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Lactose, Sucrose, Mannit oder Sorbit, Cellulose-Präparate, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Traganthgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls erwünscht, können Zerfallhilfsmittel wie quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alqinsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat, zugegeben werden.
  • Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die ggf. Gummiarabicum, Talcum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Es können Farbstoffe oder Pigmente zu den Tabletten- oder Drageebeschichtungen zu deren Kenntlichmachung oder zur Kennzeichnung verschiedener Kombinationen von Dosen wirksamer Verbindungen beigefügt werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen bzw. Präparate, die oral verwendet werden können, schließen Schiebesitz- bzw. „Push-fit"-Kapseln aus Gelatine sowie weiche, versiegelte Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher (wie Glycerin oder Sorbit) ein. Die „Push-fit"-Kapseln können die wirksamen Bestandteile im Gemisch mit einem Füllstoff, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärken, und/oder Gleitmitteln, wie Talcum oder Magnesiumstearat, und ggf. Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die wirksamen Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen, gelöst oder suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden.
  • 6. BEISPIEL: DP-178 (SEQ ID: 1) IST EIN WIRKSAMER INHIBITOR DER HIV-1-INFEKTION
  • In diesem Beispiel wird gezeigt, dass DP-178 (SEQ ID: 1) ein wirksamer Inhibitor der HIV-1-vermittelten CD-4+-Zell-Zell-Fusion und Infektion durch zellfreie Viren ist. In dem Fusionstest blockiert dieses Peptid vollständig die Virusinduzierte Syncytien-Bildung bei Konzentrationen von 1–10 ng/ml. In dem Infektiositätstest ist die inhibitorische Konzentration etwas höher, wobei die Infektion bei 90 ng/ml blockiert wird. Es wird weiter gezeigt, dass die antivirale Aktivität von DP-178 (SEQ ID: 1) für HIV-1 hoch spezifisch ist. Des Weiteren wird festgestellt, dass ein synthetisches Peptid, DP-185 (SEQ ID: 3), das ein von DP-178 aus HIV-1-abgeleitetes Homologes darstellt, die HIV-1-vermittelte Syncytien-Bildung blockiert.
  • 6.1. MATERIALIEN UND METHODEN
  • 6.1.1. PEPTID-SYNTHESE
  • Peptide wurden unter der Verwendung der Fast-Moc-Chemie auf einem Peptidsynthetisierungsgerät Modell 431A von Applied Biosystems synthetisiert. Amidierte Peptide wurden unter Verwendung eines Rink-Harzes (Advanced Chemtech) hergestellt, während Peptide, die freie Carboxyl-Termini enthielten, auf einem Wang-(p- Alkoxybenzylalkohol)-Harz (Bachem) synthetisiert wurden. Die ersten Reste wurden doppelt mit dem geeigneten Harz gekoppelt und nachfolgende Reste wurden einfach gekoppelt. Jedem Kopplungsschritt folgte eine Kappenbildung mit Essigsäureanhydrid. Die Peptide wurden von dem Harz durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) (10 ml), H2O (0,5 ml), Thioanisol (0,5 ml), Ethandithiol (0,25 ml) und kristallinem Phenol (0,75 g) abgespalten. Die Reinigung wurde durch Umkehrphasen-HPLC durchgeführt. Proben von ungefähr 50 mg rohem Peptid wurden auf einer Waters Delta Pak C18-Säule (19 mm × 30 cm, 15 μm kugelförmig) mit einem linearen Gradienten von H2O/Acetonitril 0,1% TFA chromatographiert. Lyophilisierte Peptide wurden in einem Exsiccator gelagert, und es wurden Peptidlösungen in Wasser bei etwa 1 mg/ml hergestellt. Die Elektrospray-Massenspektroskopie ergab die folgenden Ergebnisse: DP-178 (SEQ ID: 1): 4491,87 (berechnet 4491,94); DP-180 (SEQ ID: 2): 4991,45 (berechnet 4491,94); DP-185 (SEQ ID: 3): nicht bestimmt (berechnet 4546.97).
  • 6.1.2. VIRUS
  • Der HIV-1LAI-Virus wurde von R. Gallo (Popovic, M. et al., 1984, Science 224: 497–508) erhalten und in CEM-Zellen, die in RPMI 1640, enthaltend 10% fötales Kälberserum, gezüchtet wurden, vermehrt. Der Überstand von den infizierten CEM-Zellen wurde durch einen 0,2-μm-Filter filtriert und der infektiöse Titer in einem Mikroinfektiositätstest unter Verwendung der AA5-Zelllinie zur Unterstützung der Virusreplikation abgeschätzt. Zu diesem Zweck wurden 25 μl seriell verdünnte Viren zu 25 μl AA5-Zellen bei einer Konzentration von 2 × 105/ml in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Jede Virusverdünnung wurde dreifach getestet. Die Zellen wurden für 8 Tage unter Zugabe von frischem Medium an jedem zweiten Tag kultiviert. Am Tag 8 nach der Infektion wurden Überstandsproben hinsichtlich der Virusreplikation anhand der in den Überstand abgegebenen Reverse-Transkriptase-Aktivität getestet. Der TCID50 wurde gemäß der Formel von Reed und Muench berechnet (Reed, L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493–497). Der Titer der HIV-1LAI- und HIV-IMN-Stammlösungen, die für diese Untersuchungen verwendet wurden, betrug gemäß Messung mit der AA5-Zelllinie ungefähr 1,4 × 106 bzw. 3,8 × 104 TCID50/ml.
  • 6.1.3. ZELLFUSIONSTEST
  • Es wurden ungefähr 7 × 104 Molt-Zellen mit 1 × 104 CEM-Zellen, die chronisch mit dem HIV-ILAI-Virus infiziert waren, in Platten mit 96 Vertiefungen (Halbbereichsclusterplatten; Costar, Cambridge, MA) in einem Endvolumen von 100 μl Kulturmedium, wie zuvor beschrieben (Matthews, T. J. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5924–5428) inkubiert. Peptidinhibitoren wurden in einem Volumen von 10 μl zugegeben, und das Zellgemisch wurde für 24 h bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden multinukleäre Riesenzellen durch mikroskopische Untersuchung bei einer Vergrößerung von 40 ×, welche die Visualisierung der gesamten Vertiefung in einem einzelnen Feld erlaubte, beurteilt.
  • 6.1.4. TEST ZUR ZELLFREIEN VIRUSINFEKTION
  • Synthetische Peptide wurden bei 37°C mit entweder 247 TCID50- (bei dem in 2 dargestellten Experiment) oder 62 TCID50-(bei dem in 3 dargestellten Experiment)Einheiten des HIV-1LAI-Virus oder 25 TCID50-Einheiten des HIV-2NIH2- und CEM-CD4+-Zellen bei Peptidkonzentrationen von 0, 0,04, 0,4, 4,0 und 40 μg/ml für 7 Tage inkubiert. Die resultierende Reverse-Transkriptase(RT)-Aktivität in Zählungen pro Minute wurde unter Verwendung des nachstehend im Abschnitt 6.1.5. beschriebenen Tests bestimmt. Siehe Reed, L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493–497 hinsichtlich einer Erklärung der TCID50-Berechnungen.
  • 6.1.5. REVERSE-TRANSKRIPTASE-TEST
  • Der Mikro-Reverse-Transkriptase(RT)-Test wurde von Goff et al. (Goff, S. et al., 1981, J. Virol. 38: 239–248 und Willey et al. (Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62: 139–147) adaptiert. Überstände von Virus/Zell-Kulturen werden auf 1% Triton-X100 eingestellt. Eine Überstandsprobe von 10 μl wurde zu 50 μl RT-Cocktail in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden gegeben, und die Proben wurden bei 37°C für 90 min inkubiert. Der RT-Cocktail enthielt 75 mM KCl, 2 mM Dithiothreitol, 5 mM MgCl2, 5 μg/ml Poly-A (Pharmacia, Katalog-Nr. 27-4110-01), 0,25 Einheiten/ml Oligo-dT (Pharmacia, Katalog-Nr. 27-7858-01), 0,05% NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,5 μM nicht-radioaktives dTTP und 10 μCi/ml 32P-dTTP (Amersham, Katalog-Nr. PB.10167).
  • Nach der Inkubationszeit wurden 40 μl Reaktionsgemisch auf eine NA45-Membran (oder DE81-Papier) von Schleicher und Schuell (S + S), die mit 2 × SSC-Puffer (0,3 M NaCl und 0,003 M Natriumcitrat) gesättigt und in einem S + S-Minifold über einem Blatt GB003-Filterpapier (S + S) gehalten wurde, aufgetragen, wobei ein partielles Vakuum angelegt wurde. Jede Vertiefung des Minifold wurde viermal mit 200 μl 2 × SSC unter vollem Vakuum gewaschen. Die Membran wurde aus dem Minifold entnommen und zweimal mehr in einer Pyrex-Schale mit einem Überschuss von 2 × SSC gewaschen. Schließlich wurde die Membran auf absorbierendem Papier entwässert, auf ein Whatman-Nr.-3-Papier gelegt, mit Saran-Folie bedeckt und über Nacht bei –70°C einem Film exponiert.
  • 6.2. ERGEBNISSE
  • 6.2.1. PEPTIDINHIBITION DER VON INFIZIERTEN ZELLEN INDUZIERTEN SYNCYTIEN-BILDUNG
  • Beim anfänglichen Screening zur antiviralen Aktivität wurde die Befähigung von Peptiden getestet, die Syncytium-Bildung, die durch Ko-Kultivierung über Nacht von nicht-infizierten Molt4-Zellen mit chronisch HIV-1-infizierten CEM-Zellen induziert wurde, zu blockieren. Die Ergebnisse von einigen derartigen Experimenten sind vorliegend dargestellt. In den ersten dieser Experimente wurden serielle Konzentrationen des DP-178-(SEQ ID: 1)Peptids zwischen 10 μg/ml und 12,5 ng/ml hinsichtlich der Blockierung des Zellfusionsprozesses getestet. Für diese Experimente wurden chronisch mit entweder HIV-1LAI-, HIV-1MN-, HIV-1RF oder HIV-1SF2-Viren infizierte CEM-Zellen über Nacht mit nicht-infizierten Molt-4-Zellen kokultiviert. Die Ergebnisse (4) zeigen, dass DP-178 (SEQ ID: 1) einen vollständigen Schutz gegen jedes der HIV-1-Isolate bis hinunter zur niedrigsten verwendeten Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1) ermöglichte. Bei der HIVLAI-Inhibition betrug die niedrigste Konzentration 12,5 ng/ml, bei allen anderen HIV-1-Viren betrug die geringste in dieser Untersuchung verwendete Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1) 100 ng/ml. Ein zweites Peptid, DP-180 SEQ ID: 2), das die gleichen Aminosäurereste wie DP-178 (SEQ ID: 1) enthält, die jedoch in einer zufälligen Reihenfolge angeordnet sind, zeigte keinen Hinweis auf eine antifusiogene Aktivität selbst bei einer hohen Konzentration von 40 μg/ml (4). Diese Beobachtungen zeigen, dass der inhibitorische Effekt von DP-178 (SEQ ID: 1) primärsequenzspezifisch ist und nicht mit nicht-spezifischen Peptid/Protein-Wechselwirkungen zusammenhängt. Der tatsächliche Endpunkt (d.h. die niedrigste wirksame inhibitorische Konzentration) der inhibitorischen Wirkung von DP-178 liegt im Bereich von 1–10 ng/ml.
  • Die nächste Reihe von Experimenten schloss die Herstellung und das Testen eines DP-178-(SEQ ID: 1)-Homologen hinsichtlich seiner Befähigung zur Inhibition der HIV-1-induzierten Syncytien-Bildung ein. Wie in 1 gezeigt, ist die Sequenz von DP-185 (SEQ ID: 3) leicht von DP-178 (SEQ ID: 1) dadurch verschieden, dass seine Primärsequenz dem HIV-1SF2-Isolat entnommen ist und einige Aminosäureunterschiede im Vergleich zu DP-178 (SEQ ID: 1) nahe dem N-Terminus enthält. Wie in der 4 gezeigt, entfaltet DP-185 (SEQ ID: 3) eine inhibitorische Aktivität selbst bei 312,5 ng/ml, der niedrigsten getesteten Konzentration.
  • Die nächste Reihe von Experimenten schloss einen Vergleich der inhibitorischen Aktivität von DP-178 (SEQ ID: 1) gegenüber HIV-1 und HIV-2 ein. Wie in 5 gezeigt, blockierte DP-178 (SEQ ID: 1) die HIV-1-vermittelte Syncytien-Bildung bei Peptidkonzentrationen unterhalb von 1 ng/ml. DP-178 (SEQ ID: 1) versagte jedoch bei der Blockierung der HIV-2-vermittelten Syncytien-Bildung bei Konzentrationen von bis zu 10 μg/ml. Diese bemerkenswerte Selektivität über vier Größenordnungen von DP-178 (SEQ ID: 1) als Inhibitor der HIV-1-vermittelten Zellfusion zeigt eine unerwartete HIV-1-Spezifität bei der Wirkung von DP-178 (SEQ ID: 1). DP-178 (SEQ ID: 1) inhibierte die HIV-1-vermittelte Zellfusion, jedoch die Unfähigkeit des Peptids, die HIV-2-vermittelte Zellfusion im gleichen Zelltyp bei den getesteten Konzentrationen zu inhibieren, stellt einen weiteren Beweis für den hohen Selektivitätsgrad der antiviralen Wirkung von DP-178 (SEQ ID: 1) bereit.
  • 6.2.2. PEPTIDINHIBITION DER INFEKTION DURCH ZELLFREIE VIREN
  • Als nächstes wurde DP-178 (SEQ ID: 1) hinsichtlich seiner Befähigung zur Blockierung der CD-4+-CEM-Zellinfektion durch zellfreie HIV-1-Viren getestet. Die in der 2 gezeigten Ergebnisse stammen von einem Experiment, in dem DP-178 (SEQ ID: 1) hinsichtlich seiner Befähigung getestet wurde, die Infektion von CEM-Zellen durch ein HIV-1LAI-Isolat zu blockieren. Das Experiment schloss drei Kontrollpeptide, DP-116 (SEQ ID: 9), DP-125 (SEQ ID: 8) und DP-118 (SEQ ID: 10), ein. DP-116 (SEQ ID: 9) stellt ein Peptid dar, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es unter Verwendung dieses Tests inaktiv ist, und DP-125 (SEQ ID: 8; Wild, C. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537) und DP-118 (SEQ ID: 10) sind Peptide, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie in diesem Test aktiv sind. Jede Peptidkonzentration (0, 0,04, 0,4, 4 und 40 μg/ml) wurde mit 247 TCID50-Einheiten des HIV-1LAI-Virus und CEM-Zellen inkubiert. Nach 7 Tagen Kultur wurde der zellfreie Überstand hinsichtlich des Vorhandenseins einer RT-Aktivität als Maß für eine erfolgreiche Infektion getestet. Die in der 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass DP-178 (SEQ ID: 1) den vom viralen HIV-1-Isolat vermittelten Denovo-Infektionsprozess bei Konzentrationen von bis hinunter zu 90 ng/ml (IC50 = 90 ng/ml) inhibierte. Im Gegensatz dazu wiesen die zwei Positivkontrollpeptide, DP-125 (SEQ ID: 8) und DP-118 (SEQ ID: 10) mit ungefähr 5 μg/ml mehr als 60fach höhere IC50-Konzentrationen auf.
  • In einem getrennten Experiment wurde die inhibitorische Wirkung von DP-178 (SEQ ID: 1) gegenüber HIV-1 und HIV-2 mit CEM-Zellen und entweder HIV-1LAI oder HIV-2NIHZ getestet. Es wurden in diesen Experimenten 62 TCID50 von HIV-1LAI oder 25 GCID50 von HIV-2NIHZ verwendet und diese wurden für 7 Tage inkubiert. Wie man der 3 entnehmen kann, inhibierte DP-178 (SEQ ID: 1) die HIV-1-Infektion mit einer IC50 von etwa 31 ng/ml. Im Gegensatz dazu zeigte DP-178 (SEQ ID: 1) eine viel höhere IC50 bei HIV-2NIHZ, was DP-178 (SEQ ID: 1) einen um zwei Größenordnungen wirksamen HIV-1-Inhibitor als einen HIV-2-Inhibitor werden lässt. Diese Erkenntnis ist mit den Ergebnissen der vorstehend im Abschnitt 6.2.1 beschriebenen Fusionsinhibitionstests konsistent und unterstützt weiter einen deutlichen Selektivitätsgrad (d.h. für HIV-1 gegenüber HIV-2).
  • 7. BEISPIEL: DER HIV-1-INHIBITOR DP-178 (SEQ ID: 1) IST NICHT TOXISCH
  • In diesem Beispiel wird gezeigt, dass der 36 Aminosäuren umfassende synthetische Peptidinhibitor DP-178 (SEQ ID: 1) gegenüber Zellen in Kultur selbst bei den höchsten getesteten Peptidkonzentrationen (40 μg/ml) nicht zytotoxisch ist.
  • 7.1. MATERIALIEN UND METHODEN
  • Zellproliferations- und Toxizitäts-Tests:
  • Ungefähr 3,8 × 105 CEM-Zellen für jede Peptidkonzentration wurden für 3 Tage bei 37°C in T25-Kolben inkubiert. Die getesteten Peptide waren DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-116 (SEQ ID: 9), wie in 1 beschrieben. Die verwendeten Konzentrationen jedes Peptids waren 0, 2,5, 10 und 40 μg/ml. Es wurden Zellzählungen nach Inkubationszeiten von 0, 24, 48 und 72 Stunden vorgenommen.
  • 7.2. ERGEBNISSE
  • Ob der wirksame HIV-1-Inhibitor DP-178 (SEQ ID: 1) irgendwelche zytotoxischen Wirkungen entfaltete, wurde durch Testen der Auswirkungen des Peptids auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von Zellen in Kultur beurteilt. CEM-Zellen wurden in Gegenwart veränderlicher Konzentrationen von DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-116 (SEQ ID: 9), einem Peptid, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es als HIV-Inhibitor unwirksam ist (Wild, C. et al., 1992, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537–10,541), inkubiert. Zusätzlich wurden die Zellen in Abwesenheit jedes der Peptide inkubiert.
  • Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsuntersuchungen zeigen, dass P-178 (SEQ ID: 1) keine zytotoxischen Wirkungen auf Zellen in Kultur entfaltet. Wie nachstehend in der Tabelle XI zu sehen ist, unterscheiden sich selbst die Proliferations- und Lebensfähigkeitseigenschaften von Zellen, die für 3 Tage in Gegenwart der höchs ten getesteten Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1) (40 μg/ml) nicht signifikant von denjenigen der DP-116-(SEQ ID: 9) oder der Kontrollen ohne Peptid. Die Zellproliferationsdaten sind ebenfalls in graphischer Form in 6 dargestellt. Wie in dem im vorstehenden Abschnitt 6 dargestellten Arbeitsbeispiel gezeigt wurde, inhibiert DP-178 (SEQ ID: 1) vollständig die HIV-1-vermittelte Syncytien-Bildung bei Peptidkonzentrationen zwischen 1 und 10 ng/ml und inhibiert vollständig die zellfreie Virusinfektion bei Konzentrationen von mindestens 90 ng/ml. Somit zeigt diese Untersuchung, dass selbst bei Peptidkonzentrationen, die um 3 Größenordnungen höher sind als die gegenüber HIV inhibitorische Dosis sind, DP-178 (SEQ ID: 1) keine zytotoxischen Wirkungen entfaltet.
  • TABELLE XI
    Figure 01010001
  • 8. BEISPIEL: DIE WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DP178 UND DP107
  • Lösliche rekombinante Formen von gp41, die in dem nachstehend beschriebenen Beispiel verwendet werden, zeigen, dass das DP178-Peptid mit einer entfernten Stelle von gp41 assoziiert, deren wechselwirkende Struktur durch das Leucin-Zipper-Motiv von DP107 beeinflusst wird. Eine einzige Mutation, welche die Coiled-Coil-Struktur der Leucin-Zipper-Domäne zerstört, transformierte das lösliche rekombinante gp41-Protein von einem inaktiven zu einem aktiven Inhibitor der HIV-1-Fusion. Diese Transformation kann aus einer Freisetzung der wirksamen DP178-Domäne aus einer molekularen Klammer mit der Leucin-Zipper-Determinante DP107 resultieren. Die Ergebnisse deuten ebenfalls darauf hin, dass die Anti-HIV-Aktivität verschiedener gp41-Derivate (Peptide und rekombinante Proteine) auf ihre Befähigung zurückzuführen sind, Komplexe mit viralem gp41 zu bilden und seinen fusiogenen Prozess zu stören.
  • 8.1. MATERIALIEN UND METHODEN
  • 8.1.1. KONSTRUKTION VON FUSIONSPROTEINEN UND GP41-MUTANTEN
  • Die Konstruktion der in 7 gezeigten Fusionsproteine und Mutanten wurde wie folgt durchgeführt: Die der extrazellulären Domäne von gp41 (540–686) entsprechende DNA-Sequenz wurde in die Xmn I-Stelle des Expressionsvektors pMal-p2 (New England Biolab) kloniert, um M41 zu ergeben. Die gp41-Sequenz wurde, ausgehend von pgtat (Malin et al., 1988, Nature 355: 181–183) unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit dem Stromaufwärts-Primer 5'-ATGACGCTGACGGTACAGGCC-3' (Primer A) und dem Stromabwärts-Primer 5'-TGACTAAGCTTAATACCACAGCCAATTTGTTAT-3' (Primer B) amplifiziet. M41-P wurde unter Verwendung des T7-Gen-in-vitro-Mutagenese-Kits von United States Biochemicals (USB) nach den Angaben des Herstellers konstruiert. Der Mutagenese-Primer (5'-GGAGCTGCTTGGGGCCCCAGAC-3') führt eine Mutation von Ile zu Pro in M41 in der Position 578 ein. M41Δ107 wurde unter Verwendung eines Deletionsmutagenese-Primers 5'-CCAAATCCCCAGGAGCTGCTCGAGCTGCACTATACCAGAC-3' (Primer C) gemäß dem T7-Gen-Mutageneseprotokoll von USB hergestellt. M41Δ178 wurde durch Klonierung des den Aminosäuren 540–642 von gp41 entsprechenden DNA-Fragments in die Xmn I-Stelle von pMal-p2 hergestellt. Die Primer A und 5'-ATAGCTTCTAGATTAATTGTTAATTTCTCTGTCCC-3' (Primer D) wurden in der PCR mit der Matrize pgtat verwendet, um die eingefügten DNA-Fragmente zu erzeugen. M41-P wurde als Matrize mit den Primern A und D in einer PCR verwendet, um M41-PΔ178 zu erzeugen. Alle eingefügten Sequenzen und mutierten Reste wurden durch Restriktionsenzymanalyse kontrolliert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • 8.1.2. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON FUSIONSPROTEINEN
  • Die Fusionsproteine wurden gemäß dem Protokoll, das in der Broschüre des Herstellers des Proteinfusions- und -reinigungssystems von New England Biolabs (NEB) beschrieben ist, gereinigt. Fusionsproteine (10 ng) wurden durch Elektrophorese auf 8% SDS-Polyacrylamid-Gelen analysiert. Die Western-Blot-Analyse wurde, wie von Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Kapitel 18, Seiten 64–75, beschrieben, durchgeführt. Ein 1000fach verdünntes HIV-1-positives Serum oder ein humanes Fab, das durch eine Vorratsklonierung bzw. Repertoire-Klonierung erzeugt wurde, wurde zur Reaktion mit dem Fusionsprotein verwendet. Der zweite Antikörper war HRP-konjugiertes Ziege-Anti-Mensch- Fab. Es wurde ein ECL-Western-Blot-Detektionssystem (Amersham) verwendet, um den gebundenen Antikörper zu detektieren. Ein detailliertes Protokoll für dieses Detektionssystem wurde vom Hersteller bereitgestellt. Rainbow-Molekulargewichtsmarker (Amersham) wurden verwendet, um die Größe der Fusionsproteine abzuschätzen.
  • 8.1.3. ZELLFUSIONSTESTS ZUR ANTI-HIV-AKTIVITÄT
  • Zellfusionstests wurden wie zuvor beschrieben (Matthews et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5424–5481) durchgeführt. CEM-Zellen (7 × 104) wurden mit chronisch mit HIV-1Mn-infizierten CEM-Zellen (104) in Halbbereichsplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (Costar) in 100 μl Kulturmedium inkubiert. Peptid und Fusionsproteine wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen in 10 μl Kulturmedium mit Zellgemischen bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Multinukleäre Syncytien wurden durch mikroskopische Untersuchung beurteilt. Sowohl M41 als auch M41-P zeigten keine Zytotoxizität bei den getesteten und in 8 gezeigten Konzentrationen.
  • Die Inhibition der HIV-1-induzierten Zell-Zell-Fusionsaktivität wurden in Gegenwart von 10 nM DP178 und verschiedenen Konzentrationen von M41Δ178 oder M41-PΔ178, wie in 9 angegeben, durchgeführt. Es lagen keine beobachtbaren Syncytien in Gegenwart von 10 nM DP178 vor. In den Kontrollproben wurde kein Peptid oder Fusionsprotein zugegeben.
  • 8.1.4. ELISA-ANALYSE DER DP178-BINDUNG AN DAS LEUCIN-ZIPPER- MOTIV VON GP41
  • Die verwendete Aminosäuresequenz von DP178 ist:
    YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF. Für den Enzym-verknüpften Immuntest (ELISA) wurde M41Δ178 oder M41-PΔ178 (5 μg/ml) in 0,1 M NaHCO3, pH 8,6, auf Linbro-ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Flow Lab, Inc.) über Nacht beschichtet. Jede Vertiefung wurde dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, dann mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) für 2 Stunden blockiert. Nach dem Blockieren wurden Peptide mit 0,5% BSA in TBST (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) zu den ELISA-Platten gegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen mit TBST wurde Fab-d bei einer Konzentration von 10 ng/ml mit 0,1% BSA in TBST zugegeben. Die Platten wurden dreimal mit TBST nach Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde gewaschen. Mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Ziege-Anti-Mensch-Fab-Antiserum bei 2000facher Verdünnung in TBST mit 0,5% BSA wurde in jede Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur für 45 Minuten inkubiert. Die Platten wurden dann viermal mit TBST gewaschen. Das Peroxidase-Substrat o-Phenylendiamin (2,5 mg/ml) und 0,15% H2O2 wurden zur Entwicklung der Farbe zugegeben. Die Reaktion wurde mit einem gleichen Volumen von 4,5 N H2SO4 nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten gestoppt. Die optische Dichte des gestoppten Reaktionsgemischs wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Molecular Design) bei 490 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
  • 8.2. ERGEBNISSE
  • 8.2.1. DIE EXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DER EKTODOMÄNE VON GP41
  • Als ein Schritt zum Verständnis der Rollen der zwei helikalen Regionen in der gp41-Struktur und deren Funktion wurde die Ektodomäne von gp41 als Maltosebindungs-Fusionsprotein (M41) exprimiert (7). Die fusiogene Peptidsequenz am N-Terminus von gp41 wurde bei diesem rekombinanten Protein und seinen Derivaten weggelassen, um die Löslichkeit zu verbessern. Das Maltosebindungsprotein erleichterte die Reinigung der Fusionsproteine unter vergleichsweise milden, nicht-denaturierenden Bedingungen. Da das lösliche rekombinante gp41 M41 nicht glycosyliert war, ihm einige Regionen des Transmembranproteins fehlten (d.h. das Fusionspeptid, die Transmembran- und die zytoplasmatischen Domänen) und es in Abwesenheit von gp120 exprimiert wurde, wurde nicht erwartet, dass es genau die Struktur des nativen gp41 bei HIV-1-Viren widerspiegelt. Ungeachtet dessen faltete sich gereinigtes M41 in einer Weise, die bestimmte diskontinuierliche Epitope bewahrte, was durch die Reaktivität mit humanen monoklonalen Antikörpern, 98-6, 126-6 und 50-69 belegt wurde, von denen zuvor gezeigt wurde, das sie an konformationelle Epitope in nativen gp41, das in eukaryontischen Zellen exprimiert wurde, binden (Xu et al., 1991, J. Virol. 65: 4832–4838; Chen, 1994, J. Virol. 68: 2002–2010). Somit scheinen mindestens gewisse, durch diese Antikörperkörper definierte Regionen des nativen gp41 im rekombinanten Fusionsprotein M41 wiedergegeben zu sein. Des Weiteren reagierte M41 mit einem humanen rekombinanten Fab (Fab-d), das ein konformationelles Epitop in gp91 erkennt und an HIV-1-Viren sowie an HIV-1-infizierte Zellen, nicht aber an nicht-infizierte Zellen, wie es durch FACS analysiert wurde, bindet. Die Deletion jeweils eines der Helix-Motive, d.h. DP107 oder DP178, des M41-Fusionsproteins eliminierte die Reaktivität mit Fab-d. Diese Ergebnisse deuten an, dass beide helikalen Regionen, die durch 60 Aminosäuren in der Primärsequenz voneinander getrennt sind, erforderlich sind, um das Fab-d-Epitop zu erhalten.
  • 8.2.2. ANTI-HIV-AKTIVITÄT DER REKOMBINANTEN EKTODOMÄNE VON GP41
  • Das Wild-Typ-M4l-Fusionsprotein wurde hinsichtlich einer Anti-HIV-1-Aktivität getestet. Wie vorstehend dargelegt, zeigen synthetische Peptide, die dem Leucin-Zipper (DP107) und der C-terminalen vermuteten Helix (DP178) entsprechen, eine wirksame Anti-HIV-Aktivität. Trotz Einbeziehung beider dieser Regionen beeinflusste das rekombinante M41-Protein die HIV-1-induzierte Membranfusion bei Konzentrationen von bis zu 50 μM nicht (nachstehende Tabelle XII).
  • Tabelle XII ZERSTÖRUNG DES LEUCIN-ZIPPERS VON GP41 BEFREIT DAS ANTI-HIV-MOTIV
    Figure 01050001
  • Antivirale Infektiositätstests. 20 μl seriell verdünnte Virusstammlösung wurden für 60 Minuten bei Umgebungstemperatur mit 20 μl der angezeigten Konzentration von gereinigtem rekombinantem Fusionsprotein in RPMI 1640, enthaltend 10% fötales Kälberserum und Antibiotika, in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen inkubiert. 20 μl CEM4-Zellen bei 6 × 105 Zellen/ml wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Kulturen wurden bei 37°C in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden für 9 Tage unter Zugabe von frischem Medium alle 2 bis 30 Tage kultiviert. An den Tagen 5, 7 und 9 nach der Infektion wurden Überstandsproben hinsichtlich einer Reverse-Transkriptase(RT)-Aktivität, wie nachstehend beschrieben, getestet, um die virale Replikation zu überwachen. Die 50%ige infektiöse Dosis in der Gewebekultur (TCID50) wurde für jede Bedingung gemäß der Formel von Reed & Muench, 1937, Am. J. Hyg. 27: 493–497, berechnet. Die RT-Aktivität wurde durch eine Modifikation der veröffentlichten Verfahren von Goff et al., 1981, J. Virol. 38: 239–248 und Willey et al., 1988, J. Virol. 62: 139–147, wie in Chen et al., 1993, AIDS Res. Human Retroviruses 9: 1079–1086 beschrieben, bestimmt.
  • Überraschenderweise ergab eine einzelne Aminosäuresubstitution, Prolin anstatt von Isoleucin in der Mitte des Leucin-Zipper-Motivs, ein Fusionsprotein (M41-P), das eine antivirale Aktivität entfaltete (Tabelle XII und 8). Wie in der Tabelle XII zu sehen ist, blockierte M41-P die Syncytien-Bildung um 90% bei ungefähr 85 nM und neutralisierte die HIV-1IIIB-Infektion um 90% bei Konzentrationen von ungefähr 70 nM. Die Anti-HIV-1-Aktivität von M41-P schien durch die C-terminale helikale Sequenz vermittelt zu werden, da die Deletion dieser Region aus M41-P ein inaktives Fusionsprotein, M41-PΔ178 (Tabelle XII) ergab. Diese Interpretation wurde durch Experimente unterstützt, die zeigen, dass ein verkürztes Fusionsprotein, M41Δ178, dem die DP178-Sequenz fehlt, die wirksame Anti-Fusionsaktivität des DP178-Peptids in einer konzentrationsabhängigen Weise aufhob (9). Das gleiche verkürzte Fusionsprotein, M41-PΔ178, das die Prolin-Mutation enthält, welche den Leucin-Zipper zerstört, war in ähnlichen Kompetitionsexperimenten inaktiv (9). Die Ergebnisse deuten an, dass das DP178-Peptid mit einer zweiten Stelle in gp41 assoziiert, deren wechselwirkende Struktur von einer Wildtyp-Leucin-Zipper-Sequenz abhängt. Eine ähnliche Wechselwirkung kann innerhalb des Wildtyp-Fusionsproteins, M41, auftreten und bewirken, dass sich eine intramolekulare Klammer bildet, welche die DP178-Region sequestriert, was sie für eine antivirale Aktivität nicht verfügbar werden lässt.
  • Eine spezifische Assoziierung zwischen diesen zwei Domänen wird ebenfalls durch andere Studien mit humanem monoklonalem Fab-d angedeutet. Beispielsweise bindet Fab-d weder das DP178-Peptid noch das Fusionsprotein M41Δ178, jedoch wurde sein Epitop einfach durch Zusammenmischen dieser zwei Reagenzien wiederhergestellt (10). Wiederum versagte die Prolin-Mutation in der Leucin-Zipper-Domäne des Fusionsproteins, M41-PΔ178, bei der Wiederherstellung des Epitops in ähnlichen Mischungsexperimenten.
  • 9. BEISPIEL: VERFAHREN ZUR COMPUTER-GESTÜTZTEN IDENTIFIZIERUNG DP-107-ÄHNLICHER UND DP-178-ÄHNLICHER SEQUENZEN
  • Es ist eine Anzahl bekannter Coiled-Coil-Sequenzen ausführlich in der Literatur beschrieben worden, und diese enthalten Siebener-Wiederholungspositionierungen für jede Aminosäure. Die Coiled-Coil-Nomenklatur bezeichnet jede der sieben Aminosäuren einer Siebener-Wiederholung mit A bis G, wobei die Aminosäuren A und D dazu tendieren, hydrophobe Positionen zu sein. Die Aminosäuren E und G tendieren dazu, geladen zu sein. Diese vier Positionen (A, D, E und G) bilden die amphipathische Rückgrat-Struktur einer monomeren alpha-Helix. Die Rückgrate von zwei oder mehr amphipathischen Helices wechselwirken miteinander zur Bildung von di-, tri-, tetrameren usw. Coiled-Coil-Strukturen. Um mit dem Design von Computersuchmotiven zu beginnen, wurde eine Reihe gut charakterisierter Coiled-Coils, einschließlich dem Hefetranskriptionsfaktor GCN4, der Schleife 36 des Influenza-Virus-Hämagglutinins und der humanen Protoonkogene c-Myc, c-Fos und c-Jun, ausgewählt. Für jede Peptidsequenz wurde eine strenge Homologie in den A- und D-Positionen und eine Liste der Aminosäuren, die in den Positionen B, C, E, F und G ausgeschlossen werden konnten (da sie in diesen Positionen nicht vorkommen) bestimmt. Die Motive wurden auf die DP-107- und DP-178-Sequenzen durch Ableitung der wahrscheinlichsten Möglichkeiten der Siebener-Positionierung der Aminosäuren von HIV-1 Bru DP-107, von dem es bekannt ist, dass es eine Coiled-Coil-Struktur aufweist, und HIV-1 Bru DP-178, das immer noch nicht strukturell definiert ist, maßgeschneidert. Die Analyse von jeder der Sequenzen ist in der 12 enthalten. Beispielsweise wurde das Motiv für GCN4 wie folgt entworfen:
    • 1. Die einzigen Aminosäuren (unter Verwendung des Standard-Ein-Buchstaben-Aminosäurecodes), die in den A- oder D-Positionen von GCN4 gefunden wurden, waren [LMNV].
    • 2. Es wurden alle Aminosäuren in den Positionen B, C, E, F und G außer {CFGIMPTW} gefunden.
    • 3. Das PESEARCH-Motiv würde daher wie folgt geschrieben:
  • Figure 01070001
  • Das Motiv übersetzt oder liest sich: „In der ersten Position A muss eines von L, M, N oder V auftreten, in den Positionen B und C (die nächsten zwei Positionen) wird alles außer C, F, G, I, M, P, T oder W akzeptiert, in der Position D muss eines von L, M, N oder V auftreten, in den Positionen E, F und G (die nächsten drei Positionen) wird alles außer C, F, G, I, M, P, T oder W akzeptiert." Diese Anweisung ist viermal in einem 28-mer-Motiv und fünfmal in einem 35-mer-Motiv enthalten. Der Basismotivschlüssel wäre dann: [LMNV]-{CFGIMPTW}. Die Motivschlüssel für die restlichen gut beschriebenen Coiled-Coil-Sequenzen sind in der 12 zusammengefasst.
  • Das Motiv-Design für DP-107 und DP-178 war etwas von den vorstehenden 28-meren Modellsequenzen verschieden, was auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die Siebener-Wiederholungspositionen nicht definiert sind und die Peptide beide län ger als 28 Reste sind. Die 13 veranschaulicht einige mögliche Sequenzgegenüberstellungen sowohl für DP-107 als auch DP-178 und enthält ebenfalls Motiv-Gestaltungen, die auf 28-mer-, 35mer- und vollständigen Peptiden basieren. Es wird darauf hingewiesen, dass nur leichte Unterschiede in den Motiven auftreten, wenn die Peptide verlängert werden. Im Allgemeinen resultiert die Verlängerung des Basispeptids in einem weniger stringenten Motiv. Dies ist bei der Verbreiterung der Möglichkeiten zur Identifizierung von DP-107- oder DP-178-ähnlichen primären Aminosäuresequenzen, die in dieser Druckschrift als „Treffer" bezeichnet werden, sehr von Nutzen.
  • Zusätzlich zur Erzeugung hoch spezifischer Motive für jeden zu suchenden Peptidsequenztyp ist es ebenfalls möglich, „Hybrid"-Motive zu erzeugen. Diese Motive werden durch „Kreuzen" von zwei oder mehreren sehr stringenten Motiven hergestellt, um einen neuen Suchalgorithmus zu erzeugen, der nicht nur beide „Eltern"-Motivsequenzen findet, sondern auch beliebige Peptidsequenzen, die Ähnlichkeiten zu einem, dem anderen oder beiden „Eltern" aufweisen. Beispielsweise wird in Tabelle 3 die „Eltern"-Sequenz von GCN4 mit jedem der möglichen „Eltern"-Motive von DP-107 gekreuzt. Nunmehr muss das Hybridmotiv alle der in den A- und D-Positionen beider Eltern zu findenden Aminosäuren enthalten und alle diejenigen Aminosäuren ausschließen, die in keinem Elternteil in den anderen Positionen auftreten. Das aus der Kreuzung von GCN4 oder [LMNV] {CFGIMPTW} und DP-107 (28-mer mit dem ersten L in der D-Position) oder [ILQT]{CDFIMPST} resultierende Hybrid ist [ILMNQTV]{CFIMPT}. Es wird darauf hingewiesen, dass nunmehr nur zwei Basishybridmotive existieren, die beide Rastermöglichkeiten sowie alle Peptidlängen des DP-107-Elternmoleküls abdecken. Die 15 stellt die Hybridisierungen von GCN4 mit DP-178 dar. Die 16 stellt die Hybridisierungen von DP-107 und DP-178 dar. Es ist wichtig, daran zu denken, dass die dargestellten sowohl Eltern- als auch Hybridmotive Motivschlüssel sind und keine Darstellung der zur tatsächlichen Durchführung der Computersuche erforderlichen vollständigen Motive.
  • Hybridisierungen können mit jeder beliebigen Kombination von zwei oder mehr Motiven durchgeführt werden. Die Tabelle 5 fasst einige Hybridisierungen mit drei Motiven, einschließlich GCN4, DP-107 (beide Raster) und DP-178 (ebenfalls beide Raster), zusammen. Es wird darauf hingewiesen, dass die resultierenden Motive nun sehr viel ähnlicher zueinander werden. Tatsächlich sind die ersten und dritten Hybridmotive tatsächlich Teilmengen der zweiten bzw. vierten Hybridmotive. Dies bedeutet, dass die ersten und dritten Hybridmotive leicht stringenter sind als die zweiten und vierten. Es ist ebenfalls darauf hinzuweisen, dass mit nur geringen Veränderungen in diesen vier Motiven oder durch deren Hybridisierung ein einzelnes Motiv erhalten werden könnte, das alle diese Sequenzen finden würde. Es wird jedoch daran erinnert, dass die Stringenz ebenfalls reduziert ist. Schließlich ist das Hybridmotiv mit dem breitesten Spektrum und der geringsten Stringenz in 18 beschrieben, welche die Hybridisierung von GCN4, DP-107 (beide Raster), DP-178 (beide Raster), c-Fos, c-Jun, c-Myc und Flu Loop 36 zusammenfasst.
  • Es wurde ein spezieller Satz von Motiven auf Basis der Tatsache erzeugt, dass sich DP-178 nur ungefähr 10 Aminosäuren stromaufwärts der Transmembranregion von gp41 und direkt C-terminal von einem Prolin, das DP-107 und DP-178 trennt, befindet. Es wurde postuliert, dass DP-178 eine amphipathische Helix ist, wenn es Membran-assoziiert ist, und dass das Prolin die Initiation der Helix-Bildung unterstützt. Die gleiche Anordnung wurde im Respiratory-Syncytial-Virus beobachtet. Jedoch wies die DP-178-ähnliche Region in diesem Virus einen Leucin-Zipper unmittelbar C-terminal zum Prolin auf. Daher wurden designte Leucin-Zipper-Motive mit N-terminalem Prolin erzeugt, um zu analysieren, ob möglicherweise beliebige andere Viren das gleiche Muster enthalten. Die Motive sind in 19 zusammengefasst.
  • Die PC/Gene-Proteindatenbank enthält 5879 virale Aminosäuresequenzen (Bibliotheksdatei PVIRUSES; CD-ROM Ausgabe 11.0). Von diesen sind 1092 virale Hüll- oder Glycoproteinsequenzen (Bibliotheksdatei PVIRUSE1). Die Tabellen V bis X enthalten Listen von Proteinsequenznamen und Motivtrefferlokalisierungen für die gesamten gesuchten Motive.
  • 10. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM HUMANEN IMMUNDEFIZIENZ-VIRUS
  • Die 20 stellt Suchergebnisse für das gp41 des HIV-1-BRU-Isolat dar (PC/Gene-Proteinsequenz PENV_HV1BR). Man sieht, dass das Hybridmotiv, das DP-107 mit DP-178 kreuzt (107 × 178 × 4 genannt; das gleiche Motiv wie in 16) drei Treffer fand, welche die Aminosäuren 550–599, 636–688 und 796–823 einschließen. Diese drei Bereiche schließen DP-107 plus acht N-terminale und vier C-terminale Aminosäuren, DP-178 plus sieben N-terminale und zehn C-terminale Aminosäuren und einen Bereich innerhalb der Transmembranregion (zytoplasmatisch) ein. 20 enthält ebenfalls die Resultate, die aus einer Suche mit dem ALLMOTI5 genannten Motiv erhalten wurden, dessen Schlüssel in der 17 zu finden ist ({CDGHP}{CFP} × 5). Dieses Motiv fand ebenfalls drei Treffer, die DP-107 (Aminosäuren 510–599), DP-178 (615–717) und eine zytoplasmatische Region (772–891) einschließen. Diese Treffer überlappen mit den durch das Motiv 107 × 178 × 4 gefun denen Treffern, mit beträchtlichen zusätzlichen Sequenzen sowohl an den Amino- als auch den Carboxyl-Termini. Dies ist nicht überraschend, da 107 × 178 × 4 eine Untermenge des ALLMOTI5-Hybridmotivs ist. Bedeutsamerweise, obgleich die Stringenz von ALLMOTI5 beträchtlich geringer ist als die von 107 × 178 × 4, identifiziert es dennoch selektiv die DP-107- und DP-178-Regionen von gp91, von denen gezeigt wurde, dass sie Sequenzen für inhibitorische Peptide von HIV-1 enthalten. Die Ergebnisse dieser zwei Motivsuchen sind in der Tabelle V unter dem PC/Gene-Proteinsequenznamen PENV HV1BR zusammengefasst. Die Prolin-Leucin-Zipper-Motive ergaben ebenfalls einige Treffer in HIV-1 BRU, einschließlich 503–525, die sich ganz am C-Terminus von gp120, direkt stromaufwärts von der Spaltstelle (P7LZIPC und P12LZIPC), befinden, und 735–768 in der zytoplasmatischen Domäne von gp41 (P23LZIPC). Diese Ergebnisse sind in den Tabellen VIII, IX und X unter den gleichen, wie vorstehend genannten Sequenznamen zu finden. Man beachte, dass der einzige Bereich von HIV-1 BRU, von dem vom Lupas-Algorithmus vorausgesagt wird, dass er eine Coiled-Coil-Region enthält, von Aminosäure 635–670 liegt. Dieser beginnt acht Aminosäuren N-terminal vom Start und endet acht Aminosäuren N-terminal vom Ende von DP-178. Obwohl bekannt ist, dass es ein Coiled-Coil ist, wird unter Verwendung des Lupas-Verfahrens nicht vorausgesagt, dass DP-107 eine Coiled-Coil-Region enthält.
  • 11. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM HUMANEN RESPIRATORY-SYNCYTIAL-VIRUS
  • Die 21 stellt Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 (PC/Gene-Proteinsequenzname PVGLF HRSVA) des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV; Stamm A2) dar. Das Motiv 107 × 178 × 4 findet drei Treffer, welche die Aminosäuren 152–202, 213–243 und 488–515 einschließen. Die Anordnung dieser drei Treffer ist ähnlich zu derjenigen, die in HIV-1 gefunden wird, außer, dass das Motiv zwei Regionen mit Ähnlichkeit zu DP-178, eine unmittelbar stromabwärts von dem, was mit DP-107-Region, oder Aminosäuren 213–243, und eine unmittelbar stromaufwärts der Transmembranregion (ebenfalls ähnlich zu DP-178) oder Aminosäuren 488–515, findet. Das Motiv ALLMOTI5 findet ebenfalls drei Bereiche, welche die Aminosäuren 116–202, 267–302 und 506–549 einschließen. Die Prolin-Leucin-Zipper-Motive ergaben ebenfalls einige Treffer, einschließlich Aminosäuren 205–221 und 265–287 (PILZIPC 265–280, P12LZIPC) und 484–513 (P7LZIPC und P12LZIPC 489–506, P23LZIPC). Man beachte, dass die PLZIP-Motive ebenfalls Regionen identifizieren, die Lokalisierungsähnlichkeiten zu DP-178 von HIV-1 aufweisen.
  • 12. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM AFFEN-IMMUNDEFIZIENZ-VIRUS
  • Motivtreffer für gp41 des Affen-Immundefizienz-Virus (AGM3-Isolat; PC/Gene-Proteinsequenzname PENV SIVAG) sind in 22 gezeigt. Das Motiv 107 × 178 × 4 findet drei Treffer, welche die Aminosäuren 566–593, 597–624 und 703–730 einschließen. Die ersten zwei Treffer weisen nur drei Aminosäuren zwischen ihnen auf und können wahrscheinlich zu einem Treffer von 566–624 vereint werden, der einen DP-107-ähnlichen Treffer darstellen würde. Die Aminosäuren 703 bis 730 würden dann einen DP-178-ähnlichen Treffer darstellen. ALLMOTI5 findet ebenfalls drei Treffer, welche die Aminosäuren 556–628 (DP-107-ähnlich), 651–699 (DP-178-ähnlich) und 808–852, das die Transmembranregion darstellt, einschließen. SIV weist ebenfalls eine Region von 655–692 mit einer Tendenz zur Bildung eines Coiled-Coil nach der Voraussage des Lupas-Algorithmus auf. Sowohl das 107 × 178 × 4- als auch das ALLMOTI5-Motiv findet die gleiche Region. SIV weist keine PLZIP-Motivtreffer in gp41 auf.
  • 13. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM KANINCHEN-DISTEMPER-VIRUS
  • Das Fusionsglycoprotein F1 des Kaninchen-Distemper-Virus (Stamm Onderstepoort) (PC/Gene-Proteinsequenzname PVGLF CDVO) weist Regionen auf, die ähnlich zum humanen RSV sind, von denen vorausgesagt wird, dass sie DP-107-ähnlich und DP-178-ähnlich sind (23). Das Motiv 107 × 178 × 4 hebt einen Bereich unmittelbar C-terminal zum Fusionspeptid bei den Aminosäuren 252–293 hervor. Die Aminosäuren 252–286 bilden auch nach Voraussage des Lupas-Algorithmus ein Coiled-Coil. Beinahe 100 Aminosäuren C-terminal zur ersten Region befindet sich ein bei den Resten 340–367 ein DP-178-ähnlicher Bereich. ALLMOTI5 hebt drei Bereiche von Interesse hervor, einschließlich: Aminosäuren 228–297, was vollständig mit der Lupas-Vorhersage und dem DP-107-ähnlichen 107 × 178 × 4-Treffer überlappt, Reste 340–381, welche den zweiten 107 × 178 × 4-Treffer überlappen, und die Aminosäuren 568–602, die DP178-ähnlich sind, indem sie sich unmittelbar N-terminal zur Transmembranregion befinden. Sie überlappen eine weitere Region (Reste 570–602), von denen das Lupas-Verfahren vorhersagte, dass sie eine starke Tendenz zur Bildung eines Coiled-Coils aufweisen. Einige PLZIP-Motive identifizierten erfolgreich Bereiche von Interesse, einschließlich P6 und P12LZIPC, welche die Reste 336–357 bzw. 336–361 hervorheben, P1 und P12LZIPC, welche die Reste 398–419 finden, und P12 und P23LZIPC, welche die Reste 562–589 bzw. 562–592 finden.
  • 14. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM NEWCASTLE-DISEASE-VIRUS
  • Die 24 zeigt die im Newcastle-Disease-Virus (Stamm Australia-Victoria/32; PC Gene-Proteinsequenzname PVGLF NDVA) gefundenen Motivtreffer. Das Motiv 107 × 178 × 4 findet zwei Bereiche, einschließlich einen DP-107-ähnlichen Treffer bei den Aminosäuren 151–178 und einen DP-178-ähnlichen Treffer bei den Resten 426–512. ALLMOTI5 findet drei Bereiche, welche die Reste 117–182, 231–272 und 426–512 einschließen. Die Treffer von 426–512 schließen einen Bereich ein, von dem das Lupas-Verfahren vorhersagt, dass er eine hohe Coiled-Coil-Tendenz aufweist (460–503). Die PLZIP-Motive identifizieren nur eine Region von Interesse bei den Aminosäuren 273–289 (P1 und 12LZIPC).
  • 15. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM HUMANEN PARAINFLUENZA-VIRUS
  • Beide Motive 107 × 178 × 4 und ALLMOTI5 ergeben DP-107-ähnliche Treffer in der gleichen Region, 115–182 bzw. 117–182, im humanen Parainfluenza-Virus (Stamm NIH 47885; PC/Gene-Proteinsequenzname PVGLF_p13H4; 25). Zusätzlich ergeben die zwei Motive einen DP-178-ähnlichen Treffer unmittelbar leicht C-terminal bei den Aminosäuren 207–241. Beide Motive ergeben auch DP-178-ähnliche Treffer näher zur Transmembranregion, einschließlich Aminosäuren 457–497 bzw. 462–512. Einige PLZIP-Motivtreffer werden ebenfalls beobachtet, die 283–303 (P5LZIPC), 283–310 (P12LZIPC), 452–474 (P6LZIPC) und 453–481 (P23LZIPC) einschließen. Der Lupas-Algorithmus sagt voraus, dass die Aminosäuren 122–176 eine Tendenz zur Bildung eines Coiled-Coil aufweisen.
  • 16. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM INFLUENZA-A-VIRUS
  • Die 26 stellt die Lupas-Vorhersage für ein Coiled-Coil im Influenza-A-Virus (Stamm A/Aichi/2/68) bei den Resten 379–436 sowie die Motivtreffer für 107 × 178 × 4 bei den Aminosäuren 387–453 und für ALLMOTI5 bei den Resten 380–456 dar. Es wurde von Carr und Kim gezeigt, dass die Reste 383–471 (38–125 von HA2), bei saurem pH ein gestrecktes Coiled-Coil bilden (Carr und Kim, 1993, Cell 73: 823–832). Der Lupas-Algorithmus sagt ein Coiled-Coil für die Reste 379–436 voraus. Alle drei Verfahren sagen erfolgreich die Region voraus, von der gezeigt wurde, dass sie tatsächlich eine Coiled-Coil-Struktur aufweist. Allerdings sagte ALLMOTI5 den größten Teil des Stranges von 88 Resten voraus.
  • 17. BEISPIEL: RSV-ANTIVIRALE VERBINDUNGEN
  • Im vorliegend dargestellten Beispiel wird gezeigt, dass Peptidsequenzen des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), die durch Verwendung der Computer-gestützten Coiled-Coil-Peptidsequenzsuchen, die im vorstehenden Beispiel 9 beschrieben sind, identifiziert wurden, Peptiddomänen kodieren, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu tatsächlichen bekannten Coiled-Coil-Peptiden aufweisen und von denen außerdem festgestellt wird, dass sie eine antivirale Aktivität entfalten.
  • 17.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • Strukturelle Analysen bestanden aus Zirkulardichroismus(CD)-Untersuchungen, die gemäß den Verfahren durchgeführt wurden, die in der ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/073,028 beschrieben sind.
  • Die anti-RSV-antivirale Aktivität wurde, wie in Pringle, C. R. et al., 1985, J. Medical Vir. 17: 377–386, beschrieben, getestet.
  • Ein RSV-F2-Peptid mit 48 Aminosäuren und ein RSV-T67-Peptid mit 53 Aminosäuren werden verwendet, welche sich über Sequenzen erstrecken, die über die im vorstehenden Beispiel 9 beschriebenen Computer-gestützten Peptidsequenzsuchstrategien identifiziert wurden. Siehe 21 hinsichtlich der exakten Position dieser Sequenzen und hinsichtlich der verwendeten Motive.
  • 17.2 ERGEBNISSE
  • Es wurden 35-mere Oligopeptide synthetisiert, die Teile der RSV-F2-Peptidsequenz mit 48 Aminosäuren (27) und Teile der RSV-T67-Peptidsequenz mit 53 Aminosäuren (28) ausmachten. Die Oligopeptide wurden über eine CD-Analyse hinsichtlich einer strukturellen Ähnlichkeit mit bekannten Coiled-Coil-Strukturen und hinsichtlich einer Anti-RSV-Aktivität getestet. Wie in 27 und 28 gezeigt, wiesen eine Anzahl dieser Oligopeptide eine bedeutsame strukturelle Coiled-Coil-Ähnlichkeit und/oder antivirale Aktivität auf.
  • Somit identifizierten die Computer-gestützten Suchen, die vorliegend beispielsweise in Beispiel 9 beschrieben werden, virale Peptiddomänen, die sehr vielversprechende Anti-RSV-antivirale Verbindungen darstellen.
  • 18. BEISPIEL: HPF3-ANTIVIRALE VERBINDUNGEN
  • Im vorliegend dargestellten Beispiel wird gezeigt, dass Peptidsequenzen des humanen Parainfluenza-Virus-3 (HPF3), die unter Verwendung der im obigen Beispiel 9 beschriebenen Computer-gestützten Coiled-Coil-Peptidsequenzsuchen identifiziert wurden, Peptiddomänen kodieren, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu tatsächlich bekannten Coiled-Coil-Peptiden aufweisen, und von denen außerdem festgestellt wird, dass sie eine antivirale Aktivität entfalten.
  • 18.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • Strukturelle Analysen bestanden aus Zirkulardichroismus(CD)-Untersuchungen, die gemäß den Verfahren durchgeführt wurden, die in der ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/073,028 beschrieben sind.
  • Die anti-HPF3-antivirale Aktivität wurde, wie in Pringle, C. R. et al., 1985, J. Medical Vir. 17: 377–386, beschrieben, getestet.
  • Es werden HPF3-Peptide mit 56 Aminosäuren und 70 Aminosäuren verwendet, die sich über Sequenzen erstrecken, die über die im obigen Beispiel 9 beschriebenen Computer-gestützten Peptidsequenzsuchstrategien identifiziert wurden. Siehe 25 hinsichtlich der exakten Positionen dieser Sequenzen und hinsichtlich der verwendeten Motive.
  • 18.2 ERGEBNISSE
  • Es wurden 35-mere Oligopeptide synthetisiert, die Teile der HPF3-Peptidsequenz mit 56 Aminosäuren (29) und Teile der HPF3-Peptidsequenz mit 70 Aminosäuren (30) ausmachten. Die Oligopeptide wurden über eine CD-Analyse hinsichtlich einer strukturellen Ähnlichkeit mit bekannten Coiled-Coil-Strukturen und hinsichtlich einer Anti-HPF3-Aktivität getestet. Wie in 29 und 30 gezeigt, wies eine Anzahl dieser Oligopeptide eine bedeutsame strukturelle Coiled-Coil-Ähnlichkeit und/oder antivirale Aktivität auf.
  • Somit identifizierten beispielsweise die vorliegend im Beispiel 9 beschriebenen Computer-gestützten Suchen erfolgreich virale Peptid-Domänen, die sehr vielversprechende anti-HPF3-antivirale Verbindungen darstellen.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Bereich der spezifischen beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, die als einzelne Veranschaulichungen individueller Gesichtspunkte der Erfindung vorgesehen sind, und funktionell äquivalente Verfahren und Komponenten liegen im Schutzbereich der Erfindung. Tatsächlich sind einem Fachmann verschiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu den vorliegend gezeigten und beschriebenen, anhand der vorstehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es ist vorgesehen, dass derartige Modifikationen in den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001
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  • Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001
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  • Figure 01290001
  • Figure 01300001
  • Figure 01310001
  • Figure 01320001
  • Figure 01330001
  • Figure 01340001

Claims (15)

  1. Peptid mit einer Formel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 01350001
    worin die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist, Z eine Carbonylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglykol oder eine Kohlenhydrateinheit ist.
  2. Peptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz
    Figure 01350002
    worin die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist, Z eine Carbonylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglykol oder eine Kohlenhydrateinheit ist.
  3. Peptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz
    Figure 01350003
    worin die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist, Z eine Carbonylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglykol oder eine Kohlenhydrateinheit ist.
  4. Peptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz
    Figure 01360001
    worin die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist, Z eine Carbonylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglykol oder eine Kohlenhydrateinheit ist.
  5. Peptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz
    Figure 01360002
    worin die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt werden, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die hydrophobe Gruppe X Carbobenzoxyl, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl ist, Z eine Carbonylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe darstellt, worin die makromolekulare Trägergruppe ein Lipid/Fettsäure-Konjugat, ein Polyethylenglykol oder eine Kohlenhydrateinheit ist.
  6. Peptid nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, worin eine Bindung, die benachbarte Aminosäure verbindet, eine Nicht-Peptid-Bindung darstellt und worin zusätzlich die Nicht-Peptid-Bindung eine Imino-, Ester-, Hydrazin-, Semicarbazid- oder Azobindung ist.
  7. Peptid nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, worin mindestens ein Aminosäurerest in einer D-Isomer-Konfiguration vorliegt.
  8. Peptid nach Anspruch 2, worin X eine Aminogruppe und Z eine Carboxylgruppe ist.
  9. Peptid nach Anspruch 2, worin X eine Carbobenzoxyl, Dansyl oder hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe ist und worin Z eine hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe oder eine Amidogruppe ist.
  10. Peptid nach Anspruch 2, worin X eine Acetylgruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe ist und worin Z eine hydrophobe t-Butyloxycarbonylgruppe oder eine Amidogruppe ist.
  11. Peptid mit der Aminosäuresequenz
    Figure 01370001
    worin die Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code darstellt sind.
  12. Peptid nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung als antivirales Mittel bei der Behandlung von HIV-1.
  13. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als antivirales Mittel bei der Behandlung einer HIV-1-Infektion.
  14. Die Verwendung nach Anspruch 13, worin die Behandlung das In-Kontakt-Bringen des Virus in Anwesenheit einer Zelle mit einer effektiven Konzentration des Peptids für eine ausreichende Zeitspanne umfasst, so dass die HIV-1-Transission an die Zelle inhibiert wird.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
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