ES2221061T3

ES2221061T3 - Aminas para la fabricacion de medicamentos destinados a impedir la proliferacion de celulas tumorales.

Info

Publication number: ES2221061T3
Application number: ES97935643T
Authority: ES
Inventors: Jean-Claude Breliere; Pascual Ferrara; Christine Lebouteiller; Raymond Paul; Jorge Rosenfeld; Didier Van Broeck
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1997-07-28
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2017-07-28
Also published as: IL127922A0; SK285344B6; RU2176502C2; ID17707A; FR2751645A1; HUP9902806A3; KR100315559B1; DK0917464T3; JP2000500782A; BR9711606A; CN1226825A; NO322897B1; EE9900029A; DE69729099D1; NO990401L; CA2261827A1; SK7999A3; EE03851B1; PT917464E; MY120426A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA UTILIZACION DE COMPUESTOS CAPACES DE DESPLAZAR LA CIS N - CICLOHEXIL N - ETIL [ 3 - 3 - CLORO - 4 - CICLOHEXILFENIL ) ALIL ] AMINA TRITIADA DE SUS RECEPTORES PARA LA PREPARACION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS DESTINADAS A OPONERSE A LA PROLIFERACION CELULAR.

Description

Aminas para la fabricación de medicamentos destinados a impedir la proliferación de células tumorales.

La presente invención, se refiere a una nueva utilización de la cis N-ciclohexil-N-etil-[3-3-cloro-4-ciclohexilfenil)-alil]amina, así como de sus sales farmacéuticamente aceptables.

La cis N-ciclohexil-N-etil-[3-(3-cloro-4-ciclohexil-fenil)alil]amina, la cual se conoce también bajo el código CM 31747 ó SR 31747, y la cual se designará, en la parte que sigue, de este documento, como \ll SR 31747, se describe en la patente europea EP 376 850, la cual da también a conocer su actividad inmunosupresora. Se ha encontrado el hecho de que, la SR 31747, impide el que las células cancerosas proliferen y que, por consiguiente, ésta puede ejercer una actividad antitumoral.

El artículo de P.J. Brent et al. Eur. Pharmacol. 278, 151 - 160 (1995), da a conocer la facultad de ciertos ligandos de sitio sigma, para inhibir la proliferación celular de líneas celulares, carcinomas mamario y de colon. Se precisa, igualmente, en el documento, el hecho de que, los ensayos al nivel de proliferación celular, varían significativamente según el enlace sigma, la dosis utilizada, y la línea celular examinada. Se subraya, también, el hecho de que no puede establecerse ninguna relación en el poder inhibidor del crecimiento celular manifestado por el ligando sigma sometido a test de ensayo y su afinidad para los sitios sigma.

El documento de solicitud de patente francesa FA - A - 2 455 889, propone, a título de analgésico y de anti-depresivo, derivados de amina. Este documento, no se refiere al compuesto SR 31 747.

El documento de solicitud de patente francesa FR - A - 016 169, describe derivados del ácido ciclopropano-carboxílico, que tienen propiedades antiinflamatorias y analgésicas.

B. Bourrié et al, en el artículo publicado en Immunology, 88, 389 - 393 (1996), reporta a la SR 31 747, como poseedora de una afinidad elevada para los receptores sigma expresados al nivel de los linfocitos.

No obstante, no se facilita ninguna explicación para explicitar este comportamiento de la SR 31 747, con respecto a la proliferación linfocítica.

Esta determinación, puede efectuarse con células tumorales, elegidas de forma apropiada, de una forma preferente, entre las líneas celulares que proliferan fácilmente in vitro, por ejemplo, células de mielomas humano, de carcinoma del riñón o del pulmón humano, o incluso células del carcinoma mamario.

En el contexto de la presente invención, con el fin de poder efectuar las determinaciones en las condiciones estandarizadas que permitan obtener resultados constantes y reproducibles, se han elegido, de una forma arbitraria, células del tumor mamario humano \ll MCF-7 \gg.

Según estudios bioquímicos y farmacológicos, la exposición de la SR 31 747, a células normales, en las mismas condiciones que las que permiten obtener una actividad antiproliferativa de las células cancerosas, no provoca ningún efecto deletéreo sobre todos los criterios examinados, tales como, por ejemplo, la integridad de las estructuras y de las funciones celulares o el mantenimiento de la viabilidad.

Estos productos, actúan, de esta forma, con una gran especificidad de acción, con respecto a las células tumorales. La actividad antitumoral, se ha establecido sobre varias líneas tumorales humanas, in vivo e in vitro, en los ratones. Las células utilizadas, proceden de la colección internacional ATCC. Se utilizaron células MCF-7, para realizar ensayos de enlace.

Las membranas, se prepararon de la siguiente forma: se procede a homogeneizar 10^{9} células MCF-7, durante un transcurso de tiempo de 10 segundos, con Polytron®, en 10 ml de tampón Hepes®, pH = 7,4, el cual contenía: D-manitol 210 mM, sucrosa 70 mM, EDTA 1 Mm, PMSF 0,3 Mm. El homogeneizado, se centrifuga a 650 xg, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos y, a continuación, el sobrenadante, se retira y se centrífuga, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a 100.000 xg. La torta residual, se vuelve a poner en suspensión, en el tampón Tris-HCl, a un pH = 7,4, a una concentración de 1 mg/ml, y almacena a una temperatura de -70ºC.

El enlace total, se realiza en un tubo de 5 ml, en el cual se introduce:

50 \mul de suspensión membranaria con un contenido de 10 a 50 \mug de proteínas

175 \mug de tampón Tris 50 mM, pH = 7,4

20 \mul de ^{3}H SR 31 747 20 nM, en un Tris 50 mM, pH = 7,4 + 0,1% SAB (suero de albúmina bovina).

El enlace no específico, se realiza procediendo a añadir 25 \mul de SR 31 747 10^{-5} M, en la solución anterior (volumen final, 250 \mul) y, a continuación, procediendo a incubar durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 25ºC.

Las fracciones libres y enlazadas, se separan procediendo a depositar 200 \mul sobre una columna de 1 ml de Sephadex® L 20 y, a continuación, se cuenta la radiactividad sobre los dos primeros ml obtenidos procediendo a eluir la columna con tampón Tris 50 mM, pH = 7,4.

El compuesto utilizado según la invención, muestra actividades Cl_{50}, comprendidas dentro de unos márgenes situados entre 10^{-10} y 10^{-6} M.

Entre otras células utilizadas, se ha procedido a cultivar de una forma rutinaria, en medio RPMI, adicionado de un 10% de suero de ternero fetal (SVF), las líneas siguientes:

mielomas humanos U266 y RPMI 8226

carcinoma del riñón humano 293

carcinoma del pulmón humano A549

carcinoma mamario humano MCF - 7

MCF-7 leucemia linfocítica humana.

La actividad antitumoral, se mide según el procedimiento de colororimetría, utilizado el MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2,5-difeniltetrazolio), tal y como se describe por parte de Mosmann T. Journ. of Imm. Methods; 1983, 65, 55.

Esta dosificación colorimétrica, permite medir de una forma cuantitativa, la actividad antitumoral de una solución que contiene un compuesto utilizado según la invención.

Según el protocolo utilizado, las células en suspensión (tales como las células de mielomas) se siembran a 2.015 células/ml, en hoyos de 1 ml, en medio definido. Las células adherentes, (tales como las células MCF-7), se siembran a 5.104 células/ml en hoyos de 1m, en medio RPMI + 0,5% SVF, durante un el transcurso de una noche. Al día siguiente, la alfombra celular, se lava dos veces y se reemplaza por el medio definido. El medio definido, corresponde a: RPMI + 10 \mug/ml de insulina + 10 \mug/ml de trasferrina humana.

Para realizar este ensayo, se mantienen células en presencia de una solución que contiene un compuesto utilizado según la invención, durante un transcurso de tiempo de 5 días y, a continuación, el MTT, se añade en el medio de cultivo.

El tiempo de 5 días que se ha seleccionado, corresponde al tiempo óptimo para el cultivo. Después de 5 días de cultivo, se procede a medir la proliferación de las células, mediante el test de ensayo descrito anteriormente, arriba. Se procede a medir la densidad óptica, a 570 nm. Se desarrolla una coloración azul, en los hoyos, en donde, las células, se encuentran todavía vivas. La intensidad de coloración, es proporcional a la cantidad de células vivas.

Los resultados obtenidos, se describen en la Tabla A que se facilita a continuación.

Tabla A

Efecto de la SR 31747 sobre diferentes líneas tumorales humanas, después de un tratamiento de 5 días de duración

Los resultados obtenidos, se expresan en porcentaje de proliferación celular, con relación al control, no tratado, tomado con un 100%.

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Puede verse que, unas concentraciones tan débiles como de 1 nM a 1 \muM, son suficientes como para inducir un paro del crecimiento en un porcentaje del 50%, y que, este efecto, se obtiene sobre todas las células tumorales examinadas.

El efecto constatado in vitro, de inhibición de una línea de células MCF-7, se estudió, in vivo, en el ratón
\ll nude \gg, por vía intraperitoneal, a dosificaciones comprendidas dentro de unos márgenes situados entre 3 y 100 mg/kg, en un modelo según Nëri M., et al: Cancer Research, 1990, 50; 5892 - 5897, y según Berebbi M. et al; Oncologene, 1990, 5; 505 - 509.

Se realizó también otro estudio, con el fin de determinar el efecto de la SR 31747 sobre el crecimiento in vitro e in vivo, de las células epiteliales tumorales mamarias y prostáticas.

El estudio, consistió en evaluar la actividad antitumoral potencial de la SR 31747, sobre el crecimiento de una variedad de líneas epiteliales cancerosas del seno. El estudio, se efectuó in vitro, sobre cultivos celulares, así como in vivo, después de la inoculación de las líneas mamarias tumorales en el ratón atímico \ll nude \gg.

Las líneas celulares que se utilizaron, fueron las siguientes:

La línea MCF-7 hormono-sensible, precedía de una efusión pleural de un adenocarcinoma del seno. Las células MCF-7LY2 antiestrógeno-resistentes, se obtuvieron a partir de la línea MCF-7, mediante presión selectiva, en presencia de un antiestrógeno de alta afinidad. Las líneas MCF-7LCC1 y MCF-7LCC2, se desarrollaron, en el ratón "nude", después de inoculación de las células MCF-7. Estas dos líneas, son estrógeno-independientes. Las células MCF-7LCC2, son también anti-estrógeno-resistentes. La línea MCF-7AZTD5, procede de la línea MCF-7- después de transfección estable con el oncogén H-ras. Las células MCF-7AZTD5, son antiestrógeno-resistentes, in vivo. El conjunto de estas líneas, se mantiene sobre DMEM/F 12 (1/1 volumen / volumen), que contiene un porcentaje del 10% de suero de ternero fetal descomplementado, y 16 ng/ml de insulina humana. La línea MCF-7LCC2, se cultiva en presencia permanente de 10^{-7} M hidroxi-tamoxifeno. Las células epiteliales mamarias tumorales MDA-MB231, son estrógenos y antiestrógenos-insensibles. Éstas se cultivan en medio L15, suplementado, con 10% FCS, 1% de aminoácidos esenciales y 10 \mug/l de insulina humana.

Las líneas epiteliales lnCap, PC3 y DU145, preceden de adenocarcinomas prostáticos. Únicamente las células LnCap, son hormono-sensibles. Las tres líneas, se cultivan en RPMI, suplementado con un 10% de FCS.

Todas las líneas, se mantienen a una temperatura de 37ºC, en atmósfera húmeda, aire /CO_{2} (95%, 5%), con excepción de las células MDA - MB231, las cuales se cultivan en ausencia de CO_{2}. Las líneas celulares, se controlan regularmente, exentas de microplamas.

La inoculación y el tratamiento de los animales, se efectúa de la forma que sigue:

Los animales utilizados, son ratones atímicos \ll nude \gg hembras, ovario-ectomizadas o no, obtenidos a una edad de 4 semanas (R. Janvier). Antes de la inoculación de las células mamarias hormonosensibles (MCF-7, MCF-7AZTD5), los animales, recibieron 10 \mul de una solución etanólica de estradiol 10^{-5}, aplicados de forma percutánea. El tratamiento, se renovó tres veces, durante un transcurso de tiempo de una semana. Se procedió a inocular un millón de células en suspensión, en 100 \mul de PBS/Ca^{++} de forma subcutánea, por encima de cada una las caderas. Al día siguiente, los animales, recibieron 200 \mul de solución de inyección de etanol / Tween 80 /suero fisiológico, 1/1/18, volumen/volumen), que contenía los diferentes reactivos a las concentraciones anteriormente definidas. Las inyecciones, se efectuaron por vía intraperitoneal y se renovaron cada día.

Resultados Actividad in vitro de la SR 31747, sobre la proliferación de las diferentes líneas epiteliales tumorales del seno

Los resultados concernientes al efecto de la SR 31747, sobre la proliferación de las células epiteliales mamarias en cultivo, se presentan en la Tabla B. La actividad de la SR 31747, se evaluó en presencia de diferentes concentraciones de suero. En presencia de concentraciones reducidas de suero, la SR 31747, ejerce una acción inhibitora sobre la proliferación de todas las líneas epiteliales tumorales sometidas a test de ensayo. Las cantidades más elevadas de suero, en el medio de cultivo, antagonizan parcialmente o totalmente la actividad inhibitoria de la SR 31747 sobre el crecimiento celular.

Para una concentración sérica dada, la capacidad de la SR 31747, para inhibir la proliferación, varía igualmente según la línea considerada. En presencia de 0,1% FCS, el cual permite a la vez el mantener una proliferación celular mínima y el observar una actividad consecuente de la SR 31747, el IC_{50} determinado para las líneas MCF-7 hormonosensibles (MCF-7, MCF-7 22HTB), varía dentro de unos márgenes que van de 2\cdot10^{-9} M a 7\cdot10^{-3} M. Se han obtenido igualmente valores de IC_{50} similares, para las células MDA-MB231 y MCF-7LCC. Por el contrario, las líneas MCF-TAZTD5 y MCF-7LY2, presentan sensibilidades más importantes para la acción inhibitoria de la SR 31747, debido al hecho de que, los IC_{50} determinados, son, respectivamente, de unos valores comprendidos entre 2\cdot10^{-10} M y 7\cdot10^{-12} M.

En todos los casos, las inhibiciones casi totales de proliferación celular observados en presencia de 10^{-6} M y, algunas veces, 10^{-7} M SR 31747, son, con toda evidencia, efectos citotóxicos.

Los resultados obtenidos, indican igualmente el hecho de que, la SR 31747, es incapaz de reservar la acción simultánea del estradiol, sobre la línea hormonosensible MCF-7.

TABLA B Efecto de la SR 31747, sobre la proliferación de las células epiteliales mamarias. Determinación de los valores de IC_{50}, después de un transcurso de tiempo de 6 horas de tratamiento - Medio cambiado cada 48 horas

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TABLA B (continuación)

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Efecto in vivo de la SR 31 747, sobre la frecuencia y el tamaño de los tumores desarrollados después de inoculación de líneas epiteliales mamarias tumorales en el ratón \ll nude \gg

Las Figuras 1 y 2, indican el efecto de la SR 31747 sobre los tumores desarrollados en el ratón \ll nude \gg, ovario-ectomizado, a partir de las células MDA - MB231.

Cada uno de los ratones, recibe 5\cdot10^{8} células MD - MB 231, por encima de cada cadera (es decir, 2 puntos de inoculación por ratón). Los animales, se tratan, a continuación, diariamente, por vía intraperitoneal, y reciben 500 \mug de SR 31747 + 0,003 \mug de E2 (20 ratones). El lote de control recibe 0,003 \mug de E2 (20 ratones). La cantidad (en porcentaje de tumores inoculados) y, el tamaño de partículas de los tumores desarrollados, se determinan a diferentes tiempos, durante el transcurso del tratamiento. Al final del tratamiento (día 92), los animales, se sacrifican y se pesan. Los tumores, se extraen y se pesan. Las Figuras, muestran una tendencia del SR 31747 a reducir el tamaño, el peso, y la frecuencia de los tumores desarrollados en el ratón \ll nude \gg ovario-ectomizado, a partir de las células MDA - MB 231. Mientras tanto, las diferencias al nivel del tamaño y del peso de los tumores, entre los grupos controlados y SR 31747, no aparecen como significativas, debido a la gran variedad observada en el seno de cada grupo.

Así, de este modo, la SR 31747, presenta, in vitro, una actividad antiproliferativa sobre la proliferación del conjunto de células epiteliales tumorales mamarias estudiadas. Esta actividad, es sobre todo evidente, en presencia de concentraciones reducidas de suero, y varía en función de las líneas consideradas. Si bien, en la mayoría de los casos, los valores de IC_{50} medidos en un 0,1% de FBS, varían entre 2\cdot10^{-9} N y 6\cdot10^{-8} M, se observa, mientras tanto, una sensibilidad extrema de las células MCF-7LY2 a la SR 31747.

Se observa una tendencia general de la SR 31747 a reducir a la vez el tamaño, el peso y la frecuencia de los tumores desarrollados a partir de las células MDA - MB231.

La utilización de la SR 31742, en concordancia con la presente invención, comprende igualmente la preparación de medicamentos destinados a la terapia, la cual implica la pretensión, como diana, de productos radiomarcados como liberadores de radiaciones en las proximidades del tumor, o en el tumor en sí mismo, procediendo a utilizar los citados compuestos para establecer, como diana, los productos radiomarcados sobre el tumor o en las inmediaciones de su entorno, con el fin de someter las células tumorales a las radiaciones emitidas por los citados productos radiomarcados.

La utilización de los compuestos en concordancia con la presente invención, puede igualmente comprender una etapa de radioterapia, en donde, las células, en contacto con los compuestos, siguen el efecto de las radiaciones ionizantes, que incluyen, por ejemplo, a los rayos gamma, beta, o partículas alfa, los cuales pueden suministrase mediante una fuente exterior tal como los rayos X ó gamma, o mediante radionucleótidos directamente administrados al paciente, tal y como se describe, por ejemplo, en Principles of Radiation Therapy in Cancer, - Principios de Terapia de Radiación en Cancer -, Principles and Practics of Oncology, - Principios y Práctica de Oncología -, Devita, V.T. et al., eds. 4 th ed J.B. Lippincott Co. Philadelphia, 1993, 15, 248 - 275.

Estos compuestos pueden igualmente administrarse en asociación con otros principios anticancerosos bien conocidos por parte de las personas especializadas en este arte de la técnica.

El compuesto consistente en la SR 31747, puede utilizarse en terapia, en todos los procesos patológicos que conllevan la proliferación de células tumorales. Esta proliferación celular, puede ser, bien ya sea hormono-sensible, o bien ya sea hormono-insensible.

De una forma más precisa, las aplicaciones clínicas para las cuales se puede pretender la utilización de estos compuestos, comprenden a las enfermedades que derivan de una proliferación celular, en particular, de los glioblastomas, de los neuroblastomas, de los linfomas, de los mielomas, de la leucemia, de los carcinomas de colon, colorrectal, epitelial, hepático, pulmonar, mamario, ovárico, pancreático, o también de la próstata.

Con esta finalidad, la SR 31747, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden utilizarse para la preparación de composiciones farmacéuticas por vía oral, parenteral, sublingual, transdérmica, o tópica. Estas composiciones farmacéuticas, contienen, por lo menos, unos de los productos anteriormente citados, arriba, en asociación con un vehículo farmacéuticamente inerte. De una forma más particular, la presente invención, concierne, según otro de sus aspectos, composiciones farmacéuticas las cuales contienen, en calidad de principio activo, la SR 31747 ó una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Los ácidos, tanto orgánicos como inorgánicos, pueden utilizarse par formar sales de adición de ácidos de la SR 31747, que no sean tóxicas y que sean farmacéuticamente aceptables, principalmente, los ácidos sulfúrico, nítrico, fosfórico, clorhídrico, cítrico, acético, láctico, tartárico, pamóico, etanodisulfónico, mentosulfónico, succínico, ciclohexil-sulfónico, furmárico, maléico y benzóico.

En cuanto a lo concerniente a la administración por vía o oral o sublingual, se utilizan, de una forma particular, comprimidos, simples o en forma de grageas, de píldoras, de gránulos, eventualmente, de liberación retardada, gotas, o también liposomas. En cuanto a lo concerniente a la administración por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular, se recurre a soluciones estériles o esterilizantes, de una forma particular, para la perfusión venosa, mientras que se pueden realizar parches convencionales para la administración por vía transdérmica. Para la utilización tópica, se pueden utilizar cremas o lociones para extender sobre la piel.

Las composiciones farmacéuticas en concordancia con la presente invención, pueden prepararse según procedimientos usuales bien conocidos en el sector de la técnica farmacéutica.

El principio activo, puede incorporarse en los excipientes habitualmente empleados en las composiciones farmacéuticas, tales como el talco, la goma arábica, la lactosa, el almidón, el estearato de magnesio, los vehículos acuosos o no, los cuerpos grasos de origen animal o vegetal, los derivados parafínicos, los glicoles, los diferentes agentes humectantes, dispersantes, o emulsionantes, conservantes, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención, pueden contener, de una forma ventajosa, la SR 31747, o una de sus sales de adición farmacéuticamente aceptables, en asociación con uno o varios otros medicamentos conocidos y comúnmente utilizados para las mismas indicaciones farmacéuticas.

La cantidad de principio activo a administrar por día, según el procedimiento de la presente invención, depende de la particularidad de la indicación terapéutica, de la gravedad de las infecciones a tratar, así como del peso del enfermo y de la vía de administración.

Para una administración sistemática, la dosis global, en el hombre, varía generalmente entre unos márgenes de 1 y 100 mg por día, por ejemplo, de 2 a 50 mg y, de una forma más conveniente, entre unos márgenes que van de 3 a 40 mg por día.

Las formas unitarias de dosificación, para la administración sistemática, comprenderán, de una forma general, de 3 a 50 mg (a saber, 3, 5, 10, 20, 30, 40 y 50 mg de producto). Estas dosis unitarias, se administrarán, normalmente, una o varias veces por día, de una forma preferente, de una a tres veces por día.

Para la administración tópica, las composiciones farmacéuticas, contienen generalmente de un 0,0001 a un 10% de principio activo y, de una forma preferente, de un 0,01 a un 5%.

Claims

1. Utilización de la cis N-ciclohexil-N-etil-[3-3-cloro-4-ciclohexilfenil)-alil]amina, o de una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de enfermedades que derivan de una proliferación celular.

2. Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que, la proliferación celular, es hormono-sensible.

3. Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que, la proliferación celular, es hormono-insensible.

4. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de glioblastomas, de los neuroblastomas, de los linfomas, de los mielomas, de la leucemia, de los carcinomas de colon, colorrectales, epiteliales, hepáticos, pulmonares, mamarios, ováricos, pancreáticos, o de la próstata.

5. Composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades que derivan de una proliferación celular, la cual comprende la cis N-ciclohexil-N-etil-[3-3-cloro-4-ciclohexilfenil)-alil]amina, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.

6. Composición farmacéutica, según la reivindicación 5, caracterizada por el hecho de que, ésta, se destina para el tratamiento de glioblastomas, de los neuroblastomas, de los linfomas, de los mielomas, de la leucemia, de los carcinomas de colon, colorrectales, epiteliales, hepáticos, pulmonares, mamarios, ováricos, pancreáticos, o de la próstata.