ES2219649T3 - Repliegue de polipeptidos similares al factor de crecimiento similar a insulina recombinante (igf-i). - Google Patents

Abstract

SE SUMINISTRA UNA COMPOSICION QUE COMPRENDE ENTRE 0.1 Y 15 MG/ML DE UN POLIPEPTIDO EN UN NEUTRALIZADOR QUE TIENE UN PH DE ALREDEDOR DE ENTRE 7-12 QUE COMPRENDE ENTRE UN 5% Y UN 40% (V/V) DE UN SOLVENTE APROTICO ALCOHOLICO O POLAR, ENTRE 0.2 Y 3 M DE TIERRA ALCALINA, METAL ALCALI O SAL DE AMONIO, ENTRE 0.1 Y 9 M DE AGENTE CAOTROPICO, Y ENTRE 0.01 Y 15 {MI}M DE SAL DE COBRE O DE MANGANESO. EL NEUTRALIZADOR SE USA DE FORMA ADECUADA EN UN METODO PARA REPLEGAR IMPROPIAMENTE POLIPEPTIDOS PLEGADOS.

Description

Repliegue de polipéptidos similares al factor de crecimiento similar a insulina recombinante (IG-I).

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención hace referencia a soluciones tampón especiales y a su utilización para el replegamiento de polipéptidos.

Descripción de materias relacionadas

Para la producción comercial de muchos polipéptidos y proteínas, las técnicas del DNA recombinante se han convertido en el procedimiento de elección debido a las grandes cantidades que pueden producirse en bacterias y otros huéspedes celulares. La producción de proteína recombinante implica la transfección o la transformación de células huésped con el DNA que codifica la proteína exógena deseada y el crecimiento de las células en condiciones que favorecen la expresión de la proteína recombinante. E. coli y levaduras son los huéspedes preferidos porque pueden ser inducidos a producir proteínas recombinantes a títulos elevados.

Entre las numerosas patentes americanas sobre la expresión general de las proteínas codificadas por DNA recombinante, se incluyen: la patente americana U.S. 4.565.785 sobre una molécula de DNA recombinante que comprende un gen bacteriano para una proteína transportadora extracelular o periplásmica y un gen no bacteriano; U.S. 4.673.641 sobre la coproducción de un polipéptido foráneo con un polipéptido formador de agregados; U.S. 4.738.921 sobre un vector de expresión con un promotor/operador trp y una fusión de trp LE con un polipéptido como el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I); 4.795.706 sobre la expresión de secuencias control a incluir junto con una proteína foránea; y U.S. 4.710.473 sobre plásmidos de DNA circulares y específicos como los que codifican para IGF-I.

En ciertas condiciones, algunas proteínas heterólogas expresadas en grandes cantidades en bacterias huéspedes precipitan dentro de la célula en densos agregados, reconocidos como manchas brillantes visibles dentro de las células con el microscopio de contraste de fases. Estos agregados o proteínas precipitadas son referidos como "cuerpos refráctiles" y constituyen una porción significativa de la proteína celular total. Brems y col., Biochemistry, 24:7662 (1985). Por otra parte, los agregados proteicos pueden no ser visibles con el microscopio de contraste de fases y el término "cuerpos de inclusión" se utiliza a menudo para referirse a los agregados de proteína visibles o no con el microscopio de contraste de fases.

Se ha observado que las proporciones solubles de proteína expresada a niveles elevados en E. coli se incrementan drásticamente al disminuir la temperatura de fermentación por debajo de los 30ºC. De este modo, una fracción considerable de varias proteínas foráneas, como por ejemplo, el interferón-alfa humano (IFN-\alpha2), el interferón-gamma (IFN-\gamma) y la proteína murina MX [Schein y Notebron, Bio/Technology, 6:291-294 (1988)] y el IFN-\beta humano [Mmizukami y col., Biotechnol. Lett., 8:605-610 (1986)] se mantienen en solución. Este proceso representa una alternativa a la renaturalización de proteínas recuperadas de los cuerpos de inclusión, pero requiere un sistema de expresión que se induzca eficientemente a temperaturas inferiores a los 30ºC. El proceso, en consecuencia, no es eficaz para todas las proteínas.

Para artículos de revisión general, véase Marston, supra; Mitraki y king, Bio/Technology, 7:690 (1989); Marston y Hartley, Methods in Enzymol., 182:264-276 (1990); Wetzel, "Protein Aggregation In vitro: Bacterial Inclusion Bodies and Mammalian Amyloid", en ``Stability of Protein Pharmaceuticals: In vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, Ahern and Manning (ed.) (Plenum Press, 1991); y Wetzel, "Enhanced Folding and Stabilization of Proteins by Suppression of Aggregation in vitro and in vivo", en Protein Engineering-A Practical Approach, Rees, A.R. y col. (eds). (IRL Press en Oxford University Press, Oxford, 1991).

La recuperación de estas proteínas a partir de estos cuerpos ha presentado numerosos problemas, por ejemplo cómo separar la proteína encajada dentro de la célula del material celular y de las proteínas que la cobijan y cómo recuperar la proteína del cuerpo de inclusión en la forma biológica activa. Las proteínas recuperadas están predominantemente en la forma biológica inactiva debido a que se han plegado en una conformación tridimensional distinta de la proteína activa. Por ejemplo, el IGF-I plegado incorrectamente con parejas de enlaces disulfuro distintas a las halladas en el IGF-I nativo tiene significativamente una actividad biológica reducida. Raschdorf y col., Biomedical and Environmental Mass Espectroscopy, 16:3-8 (1988). El plegamiento erróneo puede tener lugar en la célula tanto durante la fermentación como durante el proceso de aislamiento. Los procedimientos para el replegamiento de las proteínas en la conformación correcta y biológicamente activa son esenciales para obtener proteínas funcionales.

Otra propiedad experimentada por las proteínas durante el replegamiento es la tendencia para producir dímeros, trímeros y multímeros unidos por puentes disulfuro. Morris y col., Biochem. J., 268:803-806 (1990); Toren y col., Anal. Biochem., 169:287-299 (1988); Frank y col., en Peptides: synthesis-structure-function, ``ed. D.H. Rich y E. Gross, pág. 729-738 (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1981). Este fenómeno de asociación es muy común durante el replegamiento proteico, en particular a concentraciones proteicas elevadas, y parece a menudo implicar la asociación a través de interacción hidrofóbica de intermediarios plegados parcialmente. Cleland y Wang, Biochemistry, 29:11072-11078 (1990).

El plegamiento proteico está influenciado por la naturaleza del medio que contiene la proteína y por una combinación de fuerzas débiles o fuerzas intramoleculares repelentes implicadas en los enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos e interacciones hidrofóbicas. Cuando parejas de residuos de cisteína se llevan a una proximidad estrecha a medida que el esqueleto se pliega, se forman enlaces disulfuro covalentes fuertes entre las cisteínas, sirviendo para cerrar su conformación terciaria. Se han diseñado protocolos para romper enlaces disulfuro incorrectos, bloquear enlaces disulfuros aleatorios y permitir el replegamiento y los enlaces disulfuros correctos en condiciones favorables para la formación de la conformación activa.

Una serie de técnicas para recuperar la proteína activa de los cuerpos de inclusión implica la solubilización de los cuerpos de inclusión en soluciones fuertemente desnaturalizantes y a continuación, y opcionalmente, cambiar las soluciones altamente desnaturalizantes por soluciones débilmente desnaturalizantes (o diluir la solución fuertemente desnaturalizante), o utilizar técnicas de centrifugación a alta velocidad o de cribaje molecular. Dichos procedimientos de recuperación, descritos, p.ej., en las patentes americanas 4.512.922, 4.518.256, 4.511.502 y 4.511.503, se consideran de aplicación universal, con sólo pequeñas modificaciones para la recuperación de proteínas recombinantes biológicamente activas de los cuerpos de inclusión. Estos procedimientos pretenden eliminar los enlaces disulfuro aleatorios antes de inducir que la proteína recombinante adopte su conformación biológicamente activa gracias a sus fuerzas de estabilización.

En un procedimiento para la recuperación de proteína de los cuerpos de inclusión, la proteína desnaturalizada que se desea replegar se purifica además en condiciones reductoras, de modo que se mantienen las porciones de cisteína de la proteína como grupos sulfidrilos libres. El agente reductor se diluye entonces en una solución acuosa para permitir que la proteína se repliegue para formar los enlaces disulfuro adecuados en presencia de aire o algún otro agente oxidante. Esto permite incorporar fácilmente el replegamiento en los procesos de generales de purificación.

En otra aproximación, el replegamiento de la proteína recombinante tiene lugar en presencia de ambas formas, la reducida (R-SH) y la oxidada (R-S-S-R) de un compuesto sulfidrilo. Esto permite que los grupos sulfidrilos libres y los disulfuros se formen y reformen constantemente durante el proceso de purificación. Las formas reducidas y las oxidadas del compuesto sulfidrilo se proporcionan en un tampón con un poder suficientemente desnaturalizante, de modo que todas las conformaciones intermedias de la proteína permanecen solubles durante el proceso de desnaturalización y replegamiento. Se ha sugerido la urea como medio tampón adecuado. La tercera alternativa en esta serie está diseñada para romper cualquier enlace disulfuro que pueda haberse formado incorrectamente durante el aislamiento de los cuerpos de inclusión y a continuación modificar los grupos sulfidrilos libres disponibles de la proteína recombinante. Este objetivo se logra mediante la sulfonación de la proteína para bloquear las parejas disulfuro aleatorias, permitiendo que la proteína se repliegue correctamente en una solución débilmente desnaturalizante, y a continuación desulfonar la proteína, en condiciones favorecedoras de uniones disulfuro correctas. La desulfonación tiene lugar en presencia de un compuesto sulfidrilo y de una pequeña cantidad de su forma oxidada correspondiente para asegurar que los enlaces disulfuro adecuados permanecerán intactos. El pH se eleva a un valor en el que el compuesto sulfidrilo esté por lo menos parcialmente en una forma ionizada para incrementar el desplazamiento nucleofílico del sulfonato.

Estos protocolos de replegamiento, aunque prácticos por su utilidad universal, no se ha demostrado necesariamente que sean eficientes al máximo con, por ejemplo, el IGF-I recombinante.

La recuperación de la actividad biológica requiere un procedimiento de renaturalización monitorizado cuidadosamente, lo que puede ser bastante difícil dependiendo de la proteína en cuestión. Existen diversas publicaciones que tratan sobre los intentos de replegamiento de proteínas individuales producidas en huéspedes bacterianos o de proteínas que se hallan en una forma no-nativa o desnaturalizada. Por ejemplo, en la patente internacional WO 88/8003 y por Halenbeck y col., Biotechnology, 7:710-715 (1989), se describe la formación de un factor estimulador de la formación de colonias de macrófagos activo biológicamente (M-CSF), dimérico después de la expresión en E. coli. Los procesos descritos implican las etapas de: (i) solubilización inicial de los monómeros de M-CSF aislados de los cuerpos de inclusión en condiciones reductoras en un entorno caotrópico con urea o hidrocloruro de guanidina, (ii) replegamiento que se logra mediante diluciones seriadas de los agentes caotrópicos y (iii) una oxidación final de las moléculas replegadas en presencia de aire o un sistema redox.

En la patente americana U.S. 4.923.967 y la europea EP 361.830 se describe un protocolo para la solubilización y sulfitolisis de la proteína refráctil en un solvente desnaturalizante y a continuación un cambio de solvente para precipitar la proteína. La proteína se resolubiliza en una solución desnaturalizante y se deja replegar en presencia de agente reductor. Las etapas múltiples requeridas para lograr el plegamiento correcto requieren mucho tiempo.

Se han publicado procedimientos para el replegamiento de proteínas para algunas proteínas como la interleucina-2 (IL-2) [Tsuji y col., Biochemistry, 26:3129-3134 (1987); patente internacional WO 88/8849 (que describe en la página 17 la utilización de concentraciones elevadas de cobre como oxidante], la hormona de crecimiento de diversas fuentes [George y col., DNA, 4:273-281 (1984); Gil y col., Bio/Technology, 3:643-646 (1985); Sekine y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4306-4310 (1985); patente americana U.S. 4.985.544, implicando esta última referencia la adición de un agente desnaturalizante y de un agente reductor para solubilizar la proteína, la eliminación del agente reductor, la oxidación de la proteína y la eliminación del agente desnaturalizante], la proquimosina [Green y col., J. Dairy Res., 52:281-286 (1985)], la uroquinasa [Winkler y col., Bio/Technology, 3:990-1000 1095)], la somatotropina [U.S. patente americana 4.652.630, en la que se utiliza la urea para la solubilización y un agente oxidante para el replegamiento], el interferón-beta [patente europea EP 360.937, publicada el 4 de abril de 1990] y el activador del plasminógeno tisular [Rudolph y col., en "623º Biochem Soc. Meeting", Canterbury (1987)]. Ver también, Marston, Biochemical J., 240:1-12 (1986). Otro proceso de plegamiento utiliza la prosecuencia del polipéptido natural para promover el plegamiento de un polipéptido biológicamente inactivo en su forma activa, ejemplificado por la subtilina, se describe en la patente americana U-S. 5.191.063.

En algunas técnicas de recuperación, se ha obtenido por lo menos el 60% de la proteína foránea. Ver, p.ej., Boss y col., Nucl. Acids. Res., 12:3791-3806 (1984); Cabilly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277 (1984); Marston y col., Bio/Technology, 2:800-804 (1984); Rudolph y col., supra.

La literatura adicional y representativa del replegamiento de proteínas no-nativas derivadas de fuentes distintas incluye un informe en el que la IL-2 y el interferón-\beta(IFN-\beta) se han replegado utilizando SDS para la solubilización e iones Cu^{+2} como promotores de la oxidación de las proteínas completamente reducidas. Patente americana U-S. 4.572.798. Un proceso para aislar proteínas refráctiles recombinantes tal como se describe en la patente americana U.S. 4.620.948 implica la utilización de soluciones fuertemente desnaturalizantes para solubilizar las proteínas, de condiciones solubilizantes para facilitar el plegamiento correcto y la sustitución del desnaturalizante en presencia de aire u otros agentes oxidantes para formar de nuevo los enlaces disulfuros. En las proteínas a las que se puede aplicar el proceso se incluyen la uroquinasa, la hormona de crecimiento humana, porcina y bovina, el interferón, el activador del plasminógeno tisular, la proteína de la cubierta en la enfermedad de la boca y pies (FMD), la pro-renina y una proteína src.

En la patente internacional WO 86/5809, se describe un procedimiento para la renaturalización de proteínas no plegadas incluye el citocromo c, la ovalbúmina y el inhibidor de tripsina mediante unión reversible de la proteína desnaturalizada a una matriz sólida y la renaturalización por etapas mediante dilución del desnaturalizante. Una forma monomérica modificada del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano (PDGF) expresado en E. coli se ha S-sulfonado durante la purificación para proteger las porciones tioles y luego se ha dimerizado en presencia de agentes oxidantes para producir la proteína activa. Hoope y col., Biochemistry, 28:2956-2960 (1989).

Adicionalmente, la patente europea EP 433.225 publicada el 19 de junio de 1991 describe un proceso para producir el factor-\beta de crecimiento transformante biológicamente activo o una sal de lo mismo, en donde la forma monomérica desnaturalizada de la proteína se somete a condiciones de replegamiento que incluyen un agente solubilizante, como por ejemplo un detergente suave, un solvente miscible en agua y orgánico y/o un fosfolípido. La patente americana U.S. 4.705.848 describe el aislamiento de la hormona de crecimiento activa biológicamente a partir de cuerpos de inclusión, utilizando una etapa desnaturalizante con una sal de guanidina y una etapa renaturalizante. Véase también, Bowden y col., Bio/Technology, 9: 725-730 (1991) sobre los cuerpos de inclusión citoplasmáticos y periplásmicos de la \beta-lactamasa y en Samuelsson y col., Bio/Technology, 9:73d1 (1991) sobre el replegamiento de los mutantes interferón-gamma humanos. Además, Hejnaes y col., Protein Engineering, 5:797-806 (1992) describen la utilización de un agente caotrópico con el IGF-I.

Existen diversas referencias bibliográficas sobre la producción de IGF-I en bacterias. Estas incluyen la patente europea EP 128.733 publicada el 19 de diciembre de 1984 y la patente europea EP 135.094 publicada el 27 de marzo de 1985, que dirige la expresión de IGF-I en bacterias. La patente europea EP 288.451 dirige la utilización de la señal lamB u ompF para secretar el IGF-I en bacterias; Obukowicz y col., Mol. Gen. Genet., 215:19-25 (1988) y Wong y col., Gene, 68:193-203 (1988) describe procesos similares. La patente europea EP 286.345 describe la fermentación del IGF-I utilizando un promotor lambda.

Además, se han sugerido procedimientos para preparar el IGF-I como una proteína de fusión. Por ejemplo, la patente europea EP 130, 166 describe la expresión de péptidos de fusión en bacterias y en la patente americana U.S. 5.019.500 y la patente europea 219.814, se describe una fusión de IGF-I con un polipéptido protector para su expresión en bacterias. La patente europea EP 264.074 describe un vector de expresión met-IGF-I doble cistrónico con un péptido protector de 500-50.000 Da de peso molecular (véase también la patente americana 5.028.531 y Saito y col., J. Biochem., 101:1281-1288 (1987)]. Otras técnicas de fusión del IGF-I incluyen el péptido protector al que se le ha eliminado el gen rop [patente europea 219.814], la expresión del multímero IGF-I [Schulz y col., J. Bacteriol., 169:5385-5392 (1987)], la fusión de IGF-I con la hormona luteinizante (LH) gracias a un residuo metionil o triptófano hidrolizable en el sitio de unión [Saito y col., J. Biochem., 101:123-134 (1987)], y la fusión con superóxido dismutasa. La patente europea EP 196.056. Niwa y col., Ann. NY Acad. Sci., 469:31-52 (1986) describe la síntesis química, el clonaje y la expresión satisfactoria de los genes para el IGF-I fusionado a otro polipéptido. Sin embargo, estos procedimientos que utilizan proteínas de fusión requieren en general una secuencia líder relativamente larga y están dirigidos para mejorar la expresión de la proteína del cuerpo de inclusión, pero no para mejorar el replegamiento de la proteína recombinante desnaturalizada.

La patente americana U.S. 5.158.875 describe un procedimiento para el replegamiento del IGF-I recombinante que implica el clonaje del gen IGF-I con una secuencia líder cargada positivamente antes de la transfección del DNA en la célula huésped. La carga positiva adicional sobre el extremo amino-terminal del IGF-I recombinante corrige el replegamiento cuando la proteína solubilizada se agita durante 2-16 horas en una solución desnaturalizante. Después del replegamiento, la secuencia líder se corta y se purifica la proteína recombinante activa. Sin embargo, este proceso en múltiples etapas es largo, requiere materiales extras y el esfuerzo adicional que representa el clonar una secuencia líder heteróloga delante del gen IGF-I y luego eliminarla de la proteína purificada.

Otro procedimiento para facilitar el replegamiento in vitro del IGF-I recombinante implica la utilización de una pareja de fusión de afinidad solubilizada que consiste de dos dominios de unión IgG (ZZ) derivados de la proteína A staphylococal. Véase Samuelsson y col., supra. Este procedimiento utiliza el dominio de la proteína A como un solubilizador del IGF-I multimérico y mal plegado. Aunque este procedimiento no utiliza agentes desnaturalizantes o agentes químicos redox, implica etapas extras de fusión del gen IGF-I y otro gen por separado y la eliminación del polipéptido codificado por dicho gene después de la expresión del gen de fusión.

Otros investigadores han descrito estudios sobre el replegamiento del IGF-I que implica el equilibrio de intercambio de disulfuros de los intermediarios de replegamiento. Por ejemplo, se investigó el replegamiento del IGF-I utilizando tampones redox y se caracterizaron las formas de IGF-I producidas por Hober y col., Biochemistry, 31:1749-1756 (1992).

El intercambio de disulfuros puede también ser modulado utilizando el agente adicional de la peptidil disulfuro isomerasa (PDI) o la peptidil prolil isomerasa (PPI). Véase, por ejemplo, la patente japonesa JP 63294796 publicada el 1 de diciembre de 1988; la patente europea EP 413.440 publicada el 20 de febrero de 1991 y la patente europea 293.793 publicada el 7 de diciembre de 1988.

Se ha publicado un aumento de la formación de enlaces disulfuros por adición de metanol al 50% al tampón a baja fuerza iónica por Snyder, J. Biol. Chem., 259:7468-7472 (1984). La estrategia implica aumentar la formación de enlaces disulfuros ajustando los factores electrostáticos en el medio para favorecer la yuxtaposición de aminoácidos cargados que limitan los residuos de cisteína seleccionados. Véase también, Tamura col., resumen y póster presentados en el Onceavo Simposio Americano el 11 de Julio de 1989, en donde aconsejan la adición de acetonitrilo, DMSO, metanol o etanol para mejorar la producción de IGF-I plegado correctamente.

En la patente internacional WO 92/03477, publicada el 5 de marzo de 1992, se describe un procedimiento para el plegamiento de AlaGlu-IGF-I que implica el cambio del potencial redox mediante diálisis frente a un tampón que contiene de un 20-40% de etanol v/v durante un período de hasta cinco horas y la acidificación de la mezcla.

El metanol se utilizó a determinadas concentraciones en la desnaturalización de la ribonucleasa. Lustig y Fink, Biochim. Biophys. Acta, 1119:205-210 (1992). Los estudios de otros laboratorios indican que concentraciones moderadas de alcohol pueden reducir la asociación de los péptidos similares a la insulina en condiciones que promueven la desestabilización de la estructura. Bryant y col., Biochemistry, 31:5692-5698 (1992); Hua y Weiss, Biochim. Biophys. Acta, 1078:101-110 (1991); Brems y col., Biochemistry, 29:9289-9293 (1990); Ueda y col., JP 62-190199 publicada el 20 de julio de 1987.

Otros investigadores demostraron que la polaridad de la solución influencia la propensión de los péptidos a adquirir cierta estructura secundaria. Jackson y Mantsch, Biochim Biophys. Acta, 1118: 139-143 (1992); Shibata y col., Biochemistry, 31:5728-5733 (1992); Zhong y Johson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4462-4465 (1992). En general, la polaridad de la solución parece favorecer la formación de hélice alfa en péptidos cortos. Jackson y Mantsch, supra., en estudios espectroscópicos de la insulina también indican que las concentraciones moderadas de los alcoholes incrementan el contenido de hélice alfa. Hua y Weiss, supra.

Se necesitan procedimientos eficaces y no costosos para realizar el replegamiento de polipéptidos, incluyendo el IGF-I plegado incorrectamente e insoluble entre otros, en una conformación correcta para que la actividad biológica del polipéptido pueda restaurarse.

Según ello, es un objetivo de la presente invención el proporcionar un procedimiento de replegamiento eficaz para los polipéptidos.

Otro objetivo es el proporcionar un procedimiento de replegamiento que no utilice reactivos de intercambio de disulfuros costosos como el glutatión.

Un objetivo más es proporcionar condiciones de replegamiento que no produzcan un producto que contenga disulfuros adicionales.

Otro objetivo más es proporcionar unas condiciones de replegamiento que sean reproducibles al máximo, robustas y escalables.

Estos y otros objetivos serán evidentes para un experto en la materia.

Resumen de la invención

Se ha observado que la utilización de concentraciones bajas de cobre o manganeso facilita en gran manera la oxidación de los disulfuros polipeptídicos. Según ello, la presente invención proporciona una composición que comprende aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml de un polipéptido en un tampón de pH 7-12 que comprende aproximadamente 5-40% (v/v) de un solvente alcohólico o aprótico polar, aproximadamente 0,2-3 M de metal alcalino-térreo, metal alcalino o sal amoniacal, aproximadamente 0,1-9 M de un agente caotrópico y aproximadamente 0,01 a 15 \muM de una sal de cobre o manganeso.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de un replegamiento correcto de un polipéptido mal plegado en células huésped, en donde la etapa de replegamiento del polipéptido está presente a una concentración de aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml en un tampón a pH 7-12, que comprende aproximadamente el 5-40% (v/v) de un solvente alcohólico o aprótico polar, aproximadamente 0,2-3 M de un metal alcalino-térreo, metal alcalino o sal amoniacal, aproximadamente 0,1-9 M de un agente caotrópico y aproximadamente 0,01 a 15 \muM de una sal de cobre o manganeso.

La esencia de la invención es utilizar un tampón que contenga una concentración mínima de cobre o manganeso para aumentar el replegamiento de polipéptidos mal plegados. La utilización de sales de cobre como catalizador de la oxidación elimina la necesidad de utilizar agentes caros de intercambio de disulfuros como el glutatión. Además, el procedimiento elimina la posibilidad de producir el polipéptido que contiene disulfuros adicionales que pueden producirse cuando se utilizan agentes de intercambio de disulfuros. En una realización preferida, se identifican las condiciones de la solución que son favorables para el replegamiento del IGF-I mal plegado, recuperado de los cuerpos refráctiles periplásmicos de procariotas para obtener un alto rendimiento de IGF-I plegado correctamente.

En particular, dicho proceso es preferible para polipéptidos de mamífero no nativos producidos de forma recombinante en células procariotas, como las bacterias, incluyendo E. coli, que forma cuerpos refráctiles en el periplasma de las células. Además, la presente invención produce rendimientos mayores de proteína independientemente de la concentración proteica utilizada en la mezcla de reacción.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra un mapa de restricción para el plásmido p200, utilizado para producir pLamBIGF, un plásmido intermedio en la producción de pLBIGFTsc, utilizado para preparar pBKIGF-2, un plásmido intermedio en la preparación de un vector de expresión que codifica IGF-I, denominado pBKIGF-2B.

La Figura 2 muestra las secuencia nucleotídica del fragmento EcoRI-EcoRI (desde las posiciones 1149 a 1633) de p200 que contiene las secuencias MF alfa I prepro y del gen IGF-I (SEC ID Nº. 1).

La Figura 3 muestra la construcción del plásmido pLamBGF a partir de los fragmentos plasmídicos y un trozo del DNA sintético (SEC ID Nº. 2 y 3). El plásmido pLamBIGF es un plásmido intermedio en la producción de pLBIGFTsc, utilizado para preparar pBKIGF-2.

La Figura 4 muestra la construcción del plásmido intermedio pLBIGFTsc a partir de pLamBIGF.

La Figura 5 muestra la construcción del plásmido intermedio pRanTsc utilizado en la producción de pBKIG-2.

La Figura 6 muestra la construcción de pBKIGF-2 a partir de pLS32Tsc, pLBIGFTsc, pLS33Tsc y pRanTsc.

La Figura 7 muestra la construcción de pBKIGF-2A, utilizado para preparar pBKIGF-2B, a partir de pLBIGFTsc, pBKIGF-2 y un fragmento del DNA sintético (SEC ID Nº 4 y 5).

La Figura 8 muestra la construcción de pLamBRan, utilizado para preparar pBKIGF-2B, a partir de pLS33LamB, pRANTES y un fragmento del DNA sintético (SEC ID Nº 6 y 7).

La Figura 9 muestra la construcción del vector de expresión pBKIGF-2B a partir de pBKIGF-2, pBKIGF-2A, pLamBRan y un fragmento del DNA sintético (SEC ID Nº 8 y 9).

La Figura 10 es una serie de tres cromatogramas de HPLC que muestra la evolución de especies de IGF-I (de izquierda a derecha, IGF-I plegado incorrectamente, correctamente y reducido) durante el replegamiento. Estos cromatogramas se tomaron al inicio del plegamiento (cromatograma inferior), al cabo de 1 hora de iniciarse el plegamiento (cromatograma del medio) y al cabo de 3 horas de haberse iniciado el plegamiento (cromatograma superior).

La Figura 11 es un diagrama de fases que describe los sistemas de dos fases acuosas producidos mediante adición de sal y un polímero a un extracto entero que contiene urea, DTT, IGF-I no nativo y sólidos asociados a células. Los símbolos se utilizaron para indicar los sistemas de dos fases (círculos vacíos), sistemas monofásicos (círculos rellenos), sistemas de dos fases con sólidos flotando (p) y puntos binodales publicados (X). Las curvas se utilizaron para mostrar la posición aproximada del binodal (sólido), el límite para la sedimentación de los sólidos (sombreado) y el límite de la proporción de fases que permite que los sólidos se hallen en la fase inferior (punteado). La región sombreada indica la región óptima de separación del IGF-I y los sólidos asociados a células.

La Figura 12 muestra el efecto de la concentración de cobre sobre la cinética de replegamiento del IGF-I. El replegamiento se llevó a cabo a 25ºC con concentraciones traza de cloruro de cobre (astas) del orden de 0,013 \muM (círculo vacío), 0,052 \muM (círculo relleno), 0,13 \muM (cuadrado abierto), 0,52\muM (asterisco), 1,3 \muM (triángulo abierto), 5,2 \muM (triángulo relleno) y 13 \muM (cuadrado relleno).

Descripción de las realizaciones preferidas A. Definiciones

Tal como se utiliza aquí, "polipéptido de interés" hace referencia generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Los polipéptidos pueden ser homólogos a la célula huésped, o preferentemente, pueden ser exógenos, lo que significa que son heterólogos, es decir, foráneos, a la célula huésped que se utiliza, como una proteína humana producida por una célula de ovario de hámster Chino o por una bacteria, o un polipéptido de levaduras producido por una levadura distinta o una bacteria o célula de mamífero. Preferentemente, se utilizan polipéptidos de mamífero (polipéptidos derivados originariamente de un organismo mamífero), más preferentemente los producidos en células procariotas, más preferentemente como cuerpos de inclusión en células bacterianas, especialmente a partir del periplasma de la bacteria.

Ejemplos de polipéptidos bacterianos incluyen, p.ej., la fosfatasa alcalina y la \beta-lactamasa. Ejemplos de polipéptidos de mamífero incluyen las moléculas como, p.ej., la renina, una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana; la hormona de crecimiento bovina; el factor liberador de la hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimuladora del tiroides; las lipoproteínas; la \alpha-1 anti-tripsina; la cadena A de la insulina; la cadena B de la insulina; la proinsulina; la hormona estimuladora del folículo; la calcitonina; la hormona luteinizante; el glucagón; los factores de coagulación como el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular y el factor de von Willebrand; los factores anti-coagulantes como la Proteína C; el factor natriurético atrial; el tensioactivo pulmonar; el activador del plasminógeno, como la uroquinasa o el activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA); la bombesina; la trombina; el factor de crecimiento hematopoyético; el factor de necrosis tumoral-alfa y beta; la encefalinasa; una albúmina sérica como la seroalbúmina humana; la sustancia inhibidora mulleriana; la cadena A de la relaxina; la cadena B de la relaxina; el péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, como la beta-lactamasa; la DNasa; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; los receptores de hormonas o factores de crecimiento; la integrina; la proteína A o D; los factores reumatoides; un factor neurotrófico como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), la neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento neuronal como el NGF-\beta; el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); el factor de crecimiento de fibroblastos como el aFGF y el bFGF; el factor de crecimiento epitelial (EGF); el factor de crecimiento transformante (TGF) como el TGF-alfa y el TGF-beta, incluyendo el TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4, o el TGF-\beta5; el factor de crecimiento similar a la insulina -I y -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), las proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; las proteínas CD como el CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; la eritropoyetina, los factores osteoinductivos; las inmunotoxinas; una proteína morfogenética del hueso (BMP); un interferón como el interferón alfa, -beta y -gamma; los factores estimuladores de la formación de colonias (CSFs), p.ej., M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; las interleucinas (ILs), p.ej., IL-1 a IL-10; la superóxido dismutasa; los receptores de la célula T; las proteínas de superficie de membrana; el factor acelerador del declive; el antígeno antiviral como, por ejemplo, un fragmento de la cubierta del SIDA; las proteínas transportadoras; los receptores autoguiados; las adresinas; las proteínas reguladoras; los anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos citados anteriormente.

Los polipéptidos preferidos de interés son aquellos que se producen fácilmente en las células procariotas con un mínimo de proteolisis y no necesitan ser glicosilados para su utilización pretendida. Ejemplos de polipéptidos de mamífero incluyen el IGF-I, IGF-II, el IGF-I de cerebro, la hormona de crecimiento, las cadenas de la relaxina, el factor de liberación de la hormona de crecimiento, las cadenas de la insulina o la pro-insulina, la uroquinasa, las inmunotoxinas, el NGF, NT-5 y antígenos. Polipéptidos de mamífero especialmente preferidos incluyen el IGF-I, el IGF-I de cerebro, la hormona de crecimiento y una neurotrofina como el NGF, NT-3, NT-4, NT-5 y NT-6, incluyendo el NT-5, siendo el polipéptido de mamífero más preferido el IGF-I.

Tal como se utiliza aquí, "IGF-I" hace referencia al factor de crecimiento similar a la insulina de cualquier especie, incluyendo la bovina, ovina, porcina, equina y preferentemente la humana, en una secuencia nativa o en una forma variante y producida de forma recombinante. En la patente europea EP 128.733, publicada el 19 de diciembre de 1984, se describe un procedimiento para la producción de IGF-I.

Tal como se utiliza aquí, el término "en una conformación no nativa" describe los polipéptidos que adoptan una estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria que no es equivalente a la nativa. El polipéptido puede hallarse en una tal conformación en cualquier momento del proceso reivindicado, bien antes de la etapa de contacto o durante o después del contacto con el agente caotrópico y las especies formadoras de fases. El polipéptido en esta conformación no nativa puede ser soluble, pero hallarse en una forma inactiva o puede ser una proteína de membrana no nativa, o puede ser insoluble y hallarse en una conformación inactiva biológicamente con enlaces disulfuro mal o no formados. Este polipéptido insoluble, se hallará preferentemente, aunque no de forma indispensable, contenido en los cuerpos refráctiles, es decir, puede ser o no visible con el microscopio de contraste de fases.

Tal como se utiliza aquí, el término "polipéptidos ``plegados incorrectamente" hace referencia a polipéptidos precipitados o agregados que están contenidos dentro de los cuerpos refráctiles. Los polipéptidos no-nativos se obtienen de polipéptidos plegados incorrectamente e incluyen material plegado correcta e incorrectamente.

El término "cuerpos de inclusión" o "cuerpos refráctiles" hace referencia a masas intracelulares densas de polipéptidos agregados de interés, que constituyen una porción significativa de la proteína celular total, incluyendo todos los componentes celulares. En algunos casos, pero no en todos, estos agregados de polipéptidos pueden reconocerse como manchas brillantes visibles dentro de la célula con el microscopio de contraste de fases a un aumento inferior a 1000.

Tal como se utiliza aquí, el término "células" hace referencia a cualquier célula. Las células de quienes se recupera el polipéptido de interés se pueden tratar con reactivos formadores de fase y reactivos de replegamiento sin importar su estado. Por ejemplo, la invención abarca las células en cultivo (todo el cultivo, en donde las células no están separadas independientemente del tanque en donde crecen), así como aquellas que se han sometido a homogenización o centrifugación. El término "cultivo celular" hace referencia no sólo a cultivos de células de mamífero, sino también a cultivos de cualquier tipo de células, incluyendo las células procariotas y de levaduras.

El término "variaciones conformacionales" hace referencia a polipéptidos que difieren únicamente en los enlaces disulfuros intramoleculares. Por ejemplo, el IGF-I tiene 70 aminoácidos y seis residuos de cisteína que forman enlaces disulfuros intramoleculares. La variación conformacional del IGF-I activa y correcta tiene enlaces disulfuro entre los residuos aminoacídicos C6-C48, C47-C52 y C18-C61. El otro polipéptido principal es una variación conformacional menos activa biológicamente que tiene enlaces disulfuros entre los residuos aminoacídicos C6-C47, C48-C52 y C18-C61.

Tal como se utiliza aquí, el término "recipiente de fermentación" hace referencia a un tanque u otro aparato en donde tiene lugar el cultivo del huésped procariota para producir el polipéptido de interés. El caldo de fermentación o medio es el medio de cultivo utilizado por las células.

Tal como se utiliza aquí, "agente caotrópico" hace referencia a un compuesto que, en una concentración adecuada en solución acuosa, es capaz de cambiar la configuración o la conformación espacial de los polipéptidos a través de alteraciones en la superficie para convertir el polipéptido en soluble en el medio acuoso. Las alteraciones pueden tener lugar cambiando, p.ej., el estado de hidratación, el entorno del solvente, o la interacción de solvente-superficie. La concentración de agente caotrópico afectará directamente a su fuerza y eficacia. Una solución caotrópica fuertemente desnaturalizante contiene un agente caotrópico en grandes concentraciones que, en solución, de hecho desplegarán un polipéptido que se halle en la solución. La desnaturalización será relativamente amplia, pero reversible. Una solución caotrópica moderadamente desnaturalizante contiene un agente caotrópico que, en concentraciones suficientes en solución, permiten el plegamiento parcial de una forma polipeptídica a partir de cualquier conformación retorcida que haya adoptado el polipéptido mediante sus intermediarios solubles en la solución, en la conformación espacial en la que se halle cuando se trabaja en su forma activa en condiciones fisiológicas endógenas u homólogas. Ejemplos de agentes caotrópicos incluyen el hidrocloruro de guanidina, la urea y los hidródroxidos como el hidróxido sódico o potásico. Los agentes caotrópicos incluyen una combinación de estos reactivos, como por ejemplo una mezcla de una base con urea o hidrocloruro de guanidina.

Tal como se utiliza aquí, el término "agente reductor" hace referencia a un compuesto que, en una concentración adecuada en solución acuosa, mantiene grupos sulfidrilo con lo que se rompen químicamente los enlaces disulfuro intra- o intermoleculares. Ejemplos representativos de agentes reductores adecuados incluyen el ditiotreitol (DTT), el ditioeritritol (DTE), el beta-mercaptoetanol (BME), la cisteína, la cisteamina, el tioglicolato, el glutatión y el borohidruro de sodio.

Tal como se utiliza aquí, los términos "especies formadoras de fases" o "reactivos formadores de fases" hacen referencia a moléculas que actúan para formar múltiples fases cuando se añaden a una solución acuosa. Una solución "acuosa" es una en la que la mayor parte de la solución (es decir, más de aproximadamente el 50%) está constituido por agua. Así, por ejemplo, etanol al 40%, que contiene aproximadamente el 60% de agua, es un solvente adecuado para una especie formadora de fases. Ejemplos de especies formadoras de fases incluyen las combinaciones de polímero-polímero, las combinaciones de solvente-sal, las combinaciones de polímero-sal y las combinaciones de polímero-solvente. La más preferida aquí es la combinación polímero-sal.

Tal como se utiliza aquí, el término "sólidos y ácidos nucleicos de biomasa" hacen referencia a sólidos determinados (no disueltos) que son el resultado (o se originan) de células o cultivo celular en donde se produce el polipéptido, así como los ácidos nucleicos (DNA, RNA). Esto incluiría todas las fuentes distintas a las de solubilización y adición del componente de extracción líquido. Dichos sólidos incluyen, por ejemplo, células, restos celulares, componentes del medio, membranas celulares y vesículas y proteínas endógenas a la célula que no son proteínas solubles u otros componentes insolubles de la célula. Después de realizar el procedimiento de la presente invención, los sólidos de biomasa y los ácidos nucleicos se hallan en una fase opuesta de la del polipéptido.

Tal como se utiliza aquí, el término "múltiple" al aplicarse a las fases significa más de una fase, preferentemente de dos a cuatro fases, y más preferentemente dos fases. Una fase ``enriquecida en el polipéptido y empobrecida en "sólidos de biomasa" hace referencia a una fase en donde el polipéptido tiene un coeficiente de partición superior a uno y los sólidos de biomasa tienen un coeficiente de partición inferior a uno, en donde el coeficiente de partición se referencia a la fase de interés. Por ejemplo, si la fase inferior está enriquecida en producto, entonces el coeficiente de partición es la concentración en la fase inferior dividida por la concentración en la fase superior.

Tal como se utiliza aquí, "osmolito" hace referencia a un agente que proporciona la osmolalidad a la solución tamponada o afecta la hidratación o la tensión superficial. Ejemplos incluyen los polioles y los azúcares como el glicerol, eritritol, arabitol, sorbitol, manitol, xilitol, mannisidomanitol, glicosil, glicerol, glucosa, fructosa, sacarosa, trehalosa y isofluorósido; polímeros como los dextranos, levanos y polietilén glicol; y algunos aminoácidos y derivados de lo mismo como la glicina, alanina, \beta-alanina, prolina, taurina, betaína, octopina, glutamato, sarcosina y ácido \gamma-aminobutírico y el óxido N-trimetilamina (TMAO), tal como se describe de forma más detallada en Yancey y col., Science, 217:1214-1222 (1982) y Schein, Bio/Technology, 8:308-315 (1990).

Tal como se utiliza aquí, el término "tampón" hace referencia a una solución tamponada que resiste los cambios del pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base.

Tal como se utiliza aquí, "solvente" hace referencia a los alcoholes y solventes polares apróticos. Los alcoholes se indican según la terminología comúnmente utilizada, y son preferentemente alcoholes de 1 a 10 átomos de carbono, más preferentemente el metanol, etanol, iso-propanol, n-propanol, o t-butanol, así como el glicerol, propilén glicol, etilén glicol, polipropilén glicol y polietilén glicol y más preferentemente el etanol o el isopropanol. Dichos alcoholes son solventes que al añadirse a una solución acuosa incrementan la hidrofobicidad de la solución al disminuir la polaridad de la solución. Los solventes apróticos polares son moléculas como el dimetil sulfóxido (DMSO), dimetil formamida (DMF), N-metilpirrolidona (NMP), tetrahidrofurano (THF), dioxano, acetonitrilo, etc., que pueden utilizarse en lugar de o en adición al alcohol.

Tal como se utiliza aquí, el término "sal de metal alcalino, de metal alcalino-térreo o sal amoniacal" hace referencia a una sal que tiene un catión procedente de elementos metálicos alcalinos o alcalino-térreos o un catión amoniacal y un anión inorgánico u orgánico (de base hidrocarbonada). Ejemplos de dichas sales incluyen el cloruro sódico, el cloruro amónico, el citrato sódico, el citrato potásico, el cloruro potásico, el cloruro magnésico, el cloruro cálcico, el fosfato sódico, el fosfato cálcico, el fosfato amónico, el fosfato magnésico, el fosfato potásico, el sulfato disódico, el sulfato amónico, el sulfato potásico, el sulfato magnésico, el sulfato cálcico, etc. Las sales preferidas en la presente invención son los cloruros o los sulfatos, siendo la más preferida el cloruro sódico.

Tal como se utiliza aquí, el término "sal de cobre o manganeso" hace referencia a una sal de cobre o manganeso con cualquier anión, incluyendo los aniones orgánicos, que es responsable de estimular la oxidación de los residuos de cisteína. Los aniones adecuados incluyen los sulfatos y los cloruros, siendo el cloruro cúprico el preferido. El cobre o el manganeso pueden añadirse exógenamente o pueden ser residuales de la fermentación o ya estar presentes en la solución que contiene el polipéptido de interés.

B. Modos para llevar a cabo la invención

La presente invención hace referencia a un procedimiento para aumentar los rendimientos del replegamiento del polipéptido a partir de células huésped utilizando una cantidad mínima de sal de cobre o manganeso como catalizador en un tampón. Este tampón está a un pH de aproximadamente 7 a 12, dependiendo principalmente del tipo de polipéptido y del agente reductor, preferentemente a aproximadamente un pH de 8-11, más preferentemente a pH 8,5-11 y más preferentemente a 8,5-10,5.

Un ingrediente clave del tampón es un solvente aprótico polar o alcohólico a una concentración de aproximadamente 5-40% (p/v), preferentemente al 10-30% (volumen/volumen) de la solución, dependiendo, p.ej., del tipo de polipéptido y del solvente y de la concentración del agente caotrópico, siendo la concentración más preferida del 20% (v/v) aproximadamente.

Un segundo ingrediente clave a este tampón es una sal de metal alcalino, metal alcalino-térreo o amoniacal, que está presente a una concentración de aproximadamente 0,2 a 3 M, preferentemente a 0,2-2 M, dependiendo principalmente de la concentración caotrópica, de la concentración del solvente y del tipo de sal de metal alcalino, alcalino-térreo y del polipéptido utilizado. Por ejemplo, si el catión es el sodio, potasio o amoníaco, la concentración es de aproximadamente 0,5 a 3 M, pero si el catión es el magnesio, la concentración es de aproximadamente 0,2 a 1 M.

Un tercer ingrediente del tampón es una cierta cantidad de agente caotrópico. La cantidad de dicho caótropo dependerá principalmente de la concentración de sal de metal alcalino, alcalino-térreo o amoniacal, de la concentración de solvente, del tipo específico de sal de metal alcalino, alcalino-térreo o amoniacal utilizada, del tipo específico de agente caotrópico utilizado y del tipo de polipéptido, así como también del pH del tampón, pero en general se hallará en un intervalo de aproximadamente 0,1 a 9 M, preferentemente a aproximadamente 0,5 a 6 M y más preferentemente a aproximadamente 1,5 a 4 M. Referente a caotropos específicos, preferentemente a aproximadamente 0,1 a 2 M de hidrocloruro de guanidinio y preferentemente a aproximadamente 1-3 M, más preferentemente a aproximadamente 1-2,5 m y todavía más preferentemente se utiliza urea 2 M.

Un cuarto ingrediente del tampón es una cantidad eficaz de una sal de metal de transición seleccionada a partir de sales de cobre y de manganeso para que se produzca la oxidación y el replegamiento resultante. La cantidad de sales de cobre o manganeso depende finalmente del tipo de metal de transición y del polipéptido utilizado y del nivel de oxígeno presente. Cuanto más baja es la tasa de adición de oxígeno o el nivel de oxígeno, mayor es la cantidad de sal de cobre o manganeso que se puede utilizar. La concentración de sal de cobre o manganeso es de generalmente de 0,01 a 15 \muM, preferentemente de aproximadamente 0,01 a 10 \muM, más preferentemente de aproximadamente 0,01 a 5 \muM y aún más preferentemente de 0,01 a 0,5 \muM. Los intervalos preferidos anteriores se recomiendan especialmente para el IGF-I. Si la concentración se aumenta por encima de los 15 \muM, el rendimiento del polipéptido plegado correctamente disminuye dramáticamente. Más preferentemente, la concentración de sal de cobre o manganeso es de aproximadamente 0,5 \muM. La sal de metal de transición puede estar presente en el tampón sin adición de sal de metal de transición exógena, por ejemplo, si es residual de la fermentación, o puede añadirse al tampón o a ambos.

Las células huésped adecuadas para la expresión del DNA que codifica el polipéptido deseado son las procariotas, levaduras o las eucariotas superiores. En las procariotas adecuadas para este propósito se incluyen las bacterias como las arqueobacterias y las eubacterias. Las bacterias preferidas son eubacterias, como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo. Las enterobacteriáceas como Escherichia coli, p.ej., E. coli, Enterobacter, Erwinina, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ej., Serratia marcescans y Shigella; Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis (p.ej., B. licheniformis, 41P descrito en la patente DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989); Pseudomonas como P. aeruginosa, Streptmyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla y Paracoccus. Huéspedes de E. coli adecuados incluyen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E.coli 294 (ATCC 31.446), E. coliB y E. coliX1776 (ATCC 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

También pueden emplearse las células mutantes de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas. Desde luego es necesario seleccionar la bacteria adecuada teniendo en consideración la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, para suministrar el replicón, se utilizan E coli, Serratia, o especies de Salmonella pueden ser adecuadas como huésped cuando plásmidos bien conocidos como el pBR322, pBR325, pACYA177, o pKN410.

La cepa E. coli W3110 es un huésped preferido o huésped parental ya que es una cepa huésped común para fermentaciones del producto del DNA recombinante. Preferentemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para generar una mutación genética en los genes que codifican proteínas, por ejemplo dichos huéspedes incluyen la cepa 27C7 de E. coli W3110. el genotipo completo de 27C7 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15\Delta (argF-lac) 169 ompT\Delta degP41kan^{r}. La cepa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991, en el American Type Culture Collection como ATCC 55.244. Alternativamente, se puede utilizar la cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante se describe en la patente americana 5.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos in vitro de clonaje, p.ej., PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos nucleicos.

Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para producir una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del huésped, por ejemplo huéspedes como la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA\Delta; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo de tonA\Delta ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta (argF-lac) 169 ompT\Delta degP41Kan^{r}; la cepa 37D6 de E. coli W3110 que tiene el genotipo completo de tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta (argF-lac) 169 ompT\Delta degP41Kan^{r}rbs7\Delta ilvG; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es una cepa 37D6 con una mutación por deleción degP y no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la patente americana 4.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990.

Además de los microbios procariotas, los eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras también son adecuados como huéspedes de clonaje y expresión para vectores codificantes de polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común del pan, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, están generalmente disponibles y son de utilidad en la presente invención otros géneros, especies y cepas como por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981); patente europea EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985]; huéspedes de Kluyveromyces (patente americana U.S. 4.943.529; Fleer y col., supra), como por ejemplo K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Lovencourt y col., J. Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van der Berg y col., supra), K. thermoctolerans y K. marxianus; Yarrowia [patente europea EP 402.226]; Pichia pastoris [patente europea EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia [Patente europea EP 244.234]; Neurospora crassa [Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)]; Schawanniomyces como Schawanniomyces occidentalis [patente europea EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990], y los hongos filamentosos como p.ej., Neurospora; Penicillium, Tolypocladium [patente internacional WO 91/00357, publicado el 10 de enero de 1991] y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans [Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn y col., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)].

También se pueden obtener células huéspedes adecuadas de organismos multicelulares, para la expresión del DNA codificante del polipéptido deseado. Dichos huéspedes son capaces de realizar procesamientos complejos y de actividades de glicosilación. En principio, es adecuado cualquier cultivo celular de eucariota superior, bien sean cultivos de vertebrados o de invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y de variantes y las células huésped de insectos permisivas como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Véase por ejemplo, Luckow y col., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller y col., in Genetic Engineering, Setlow, J.K. y col., eds., vol 8 (Plenum Publishing, 1986), pág. 277-279; y Maeda y col., Nature, 315:592-594 (1985). Están disponibles diversas cepas víricas para la transfección, p.ej, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, pudiéndose utilizar dichos virus como los virus de la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Pueden utilizarse como huéspedes os cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. De forma característica, las células vegetales se transfectan incubándose con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que previamente se ha manipulado para contener el DNA que codifica el polipéptido deseado. Durante la incubación de las células vegetales con A. tumefaciens, el DNA que codifica para el polipéptido deseado se transfiere a la célula vegetal huésped de modo que se transfecta y en condiciones adecuadas expresa el DNA que codifica el polipéptido deseado. Además, están disponibles las secuencias reguladoras y la señal compatible con las células vegetales, como el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias señal de poliadenilación. Depicker yc ol., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982). Además, los segmentos de DNA aislados de la región cadena arriba del gen 780 T-DNA son capaces de activar o aumentar los niveles de transcripción de genes expresables en plantas en el tejido vegetal que contenga el DNA recombinante. Patente europea 321.196, publicada el 21 de junio de 1989.

Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrional humano (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en el cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]); células de riñón de bebé de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO; Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]); células de riñón de mono, 23.243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDK; ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo [BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transfectan y transforman preferentemente con los vectores de expresión y clonaje anteriormente descritos de la presente invención y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según sea necesario para la inducción de promotores, selección de transformantes, o amplificación de genes que codifican para las secuencias deseadas.

La transfección hace referencia a la incorporación de un vector de expresión por un huésped independientemente de que las secuencias codificantes se expresen. Existen muchos procedimientos que son conocidos por un experto en la materia, como por ejemplo, el método del CaPO_{4} y la electroporación. Se reconoce una transfección satisfactoria cuando tiene lugar cualquier operación de este vector dentro de la célula huésped.

La transformación hace referencia a la introducción del DNA en un organismo para que dicho DNA se replique, bien como un elemento extracromosómico o como un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas adecuadas a dichas células. El tratamiento del calcio que utiliza cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], o la electroporación se utilizan generalmente para células procariotas u otras células que contengan paredes celulares importantes. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de células de plantas, tal como se describe por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Además, las plantas pueden transformarse utilizando el tratamiento con ultrasonidos, tal como se describe en la patente internacional WO 91/00358, publicada el 10 de enero de 1991.

Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, es preferible el procedimiento del fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de células huésped de mamífero están descritos por Axel en la patente americana U.S. 4.399.216, publicada el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo de forma característica de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y col., J.Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para la introducción de DNA en las células, tal como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, p.ej., el polibreno, la poliornitina,etc.,. Para algunas de las técnicas de transformación en mamíferos, véase Keown y col., Methods in Enzymology (1989), Keown y col., Methods in Enzymology (1990), vol. 185:527-537 y Mansour y col., Nature, 336:348-352 (1988).

Si se utilizan células procariotas para producir el polipéptido de interés de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, éstas se cultivan en medios adecuados en donde el promotor pueda ser inducido constitutiva o artificialmente, tal como se describe de forma general en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989). Ejemplos de medios adecuados se proporcionan en la sección se ejemplos.

También se puede incluir cualquier otro suplemento además de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico a la concentración adecuada, sólo o como una mezcla junto con otros suplementos o medios, como por ejemplo una fuente de un complejo nitrogenado. El pH del medio puede ser cualquier pH de aproximadamente 5-9, dependiendo principalmente del organismo huésped.

Si para producir el polipéptido de la presente invención se utilizan las células huésped de mamífero, éstas se pueden cultivar en diversos tipos de medios. Los medios disponibles comercialmente como el HamF10 (Sigma), el Medio Mínimo Esencial (MEM de Sigma), el RPMI-1640 (Sigma) y el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1988), patente americana U.S. 4.767.704; 4.657.866; o 4.560.655; patente internacional WO 90/03430; patente internacional WO 87/00195; patente americana U.S. Pat Re. 30.985; o patente americana U.S. 5.122.469, pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina, o el factor epitelial de crecimiento), sales (como el cloruro sódico, el calcio, el magnesio y el fosfato), tampones (como el HEPES), nucleósidos (como la adenosina y la timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina^{TM}), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes a concentraciones finales del orden de micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede añadir cualquier otro suplemento a concentración adecuada, conocido por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son las previamente utilizadas con el huésped seleccionado para la expresión y serán evidentes para un experto en la materia.

En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos de células de mamífero in vitro se pueden hallar en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press en Oxford University Press, Oxford, 1991).

Los anteriores procedimientos se pueden utilizar si el polipéptido se halla en el espacio intracelular o en el periplásmico. Las condiciones preferidas, que se proporcionan en la presente invención para el aislamiento de un polipéptido, se dirigen en especial a los cuerpos de inclusión localizados en el espacio periplásmico.

A menudo es preferible purificar el polipéptido de interés de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que sean esencialmente homogéneas en el polipéptido de interés antes de su replegamiento. En una realización, las fracciones proteicas pueden separarse si es necesario. El polipéptido puede entonces purificarse a partir de la proteína soluble y de la fracción de membranas del lisado del cultivo, dependiendo de si está o no unido a membrana, de si es soluble, o si está presente en una forma agregada. Después de ello, el polipéptido se solubiliza y a continuación se repliega utilizando un tampón adecuado. Los detalles para este primer procedimiento de aislamiento se describen más adelante.

El polipéptido no nativo e insoluble se aísla de las células huésped procariotas en un tampón de aislamiento adecuado mediante cualquier técnica adecuada, p.ej., una que implique la exposición de las células a un tampón de fuerza iónica adecuada para solubilizar mejor las proteínas del huésped, pero en el que el polipéptido agregado sea esencialmente insoluble, rompiendo las células para liberar los cuerpos de inclusión y hacerlos accesibles para su recuperación mediante, por ejemplo, centrifugación. Esta técnica es bien conocida y se describe en, por ejemplo, la patente americana U.S. 4.511.503.

En resumen, las células se resuspenden en el tampón (de forma característica a pH 5-9; preferentemente a 6-8, utilizando una fuerza iónica de aproximadamente 0,01 a 2 M, preferentemente a 0,1-0,2 M). Cualquier sal adecuada, incluyendo el cloruro sódico, es útil para mantener un valor de fuerza iónica suficiente. Las células, mientras están resuspendidas en dicho tampón, se rompen mediante lisis utilizando técnicas comunes como, por ejemplo, los procedimientos mecánicos, p.ej., una prensa de Manton-Gaulin, una prensa francesa, o un oscilador sónico, o mediante procedimientos químicos o enzimáticos.

Ejemplos de procedimientos químicos o enzimáticos para la rotura de células incluyen la formación de esferoplastos, que conlleva la utilización de lisozima para lisar la pared bacteriana [Neu y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 17:215 (1964)), y el choque osmótico, que implica el tratamiento de células viables con una solución de alta tonicidad y con un lavado en agua fría de baja tonicidad para liberar los polipéptidos [Neu y col., J. Biol. Chem., 240:3685-3692 (1965)]. Un tercer procedimiento, se describe en la patente americana U.S. 4.680.262, publicada el 14 de julio de 1987, e implica el contacto de las células bacterianas con una cantidad efectiva de un alcanol inferior con 2-4 átomos de carbono durante el tiempo y temperatura suficientes para destruir y lisar las células.

Después de romper las células, la suspensión se centrifuga de forma característica para sedimentar los cuerpos de inclusión. En una realización, esta etapa se lleva a cabo a aproximadamente 500-15.000 xg, preferentemente a unas 12.000 xg en una centrífuga estándar durante el tiempo suficiente, que dependerá del volumen y del diseño de la centrífuga, generalmente unos 10 minutos a 0,5 horas. El sedimento resultante contiene esencialmente toda la fracción polipeptídica insoluble, pero si el proceso de rotura celular no se completa, también puede contener células intactas o fragmentos de células rotas. Se puede analizar si la rotura celular ha sido completa, resuspendiendo el sedimento en una pequeña cantidad de la misma solución tampón y examinando la suspensión con un microscopio de contraste de fases. La presencia de fragmentos de células rotas o de células enteras indica que es necesaria una rotura adicional para eliminar los fragmentos o células y los polipéptidos no-refráctiles asociados. Después de dicha rotura celular, si es necesario, se centrifuga de nuevo la suspensión celular, se recupera el sedimento y se resuspende. El proceso se repite hasta que el examen visual pone de manifiesto la ausencia de fragmentos de células rotas en el material sedimentado o hasta que un tratamiento adicional no logra reducir el tamaño del sedimento resultante.

En una realización alternativa, el polipéptido de interés, preferentemente exógeno, se aísla mediante solubilización en un tampón adecuado. Este procedimiento puede ser una solubilización in situ implicando la adición directa de reactivos al recipiente de fermentación después de que el polipéptido se haya producido de forma recombinante, eliminando así etapas extras de cosecha, homogeneización y centrifugación para obtener el polipéptido. Las partículas restantes pueden eliminarse mediante centrifugación o filtración, o mediante combinaciones de lo mismo. Alternativamente, y más preferentemente, se puede utilizar un sistema de aislamiento/extracción en fases múltiples para purificar los polipéptidos a partir de las partículas restantes.

En el sistema de aislamiento en fases múltiples acuosas, se añaden uno o más agentes desnaturalizantes (agentes caotrópicos), como la urea, el cloruro de guanidinio y/o una bases y un agente reductor, como el ditiotreitol o la cisteína, al medio que contiene el polipéptido a un pH básico y luego se añaden las especies formadoras de fases al caldo. Una vez que se añade este segundo grupo de reactivos al caldo, se forman fases múltiples, con lo que una fase se enriquece en el polipéptido y se ve mermada en sólidos de biomasa y "ácidos nucleicos". Preferentemente, el sistema tiene de dos a cuatro fases, y más preferentemente dos fases, una enriquecida en el polipéptido y la otra enriquecida en sólidos de biomasa y ácidos nucleicos. Preferentemente, el polipéptido deseado se reparte en la fase superior a fin de que la fase superior se enriquezca en el polipéptido y disminuya en sólidos de biomasa y ácidos nucleicos.

En consecuencia, después de finalizar la fermentación, el cultivo celular se pone en contacto con uno o más agentes caotrópicos, un agente reductor opcional y reactivos formadores de fases para que se formen fases múltiples, una de las cuales se enriquecerá en el polipéptido de interés. Es preferible añadir el agente caotrópico o reductor antes de extraer el polipéptido de la célula y mantener su solubilidad en el medio antes de añadir los reactivos formadores de fases. También, aunque el polipéptido de interés pueda extraerse de cualquier fase (enriquecida en dicho polipéptido), se recupera preferentemente de la fase superior.

Más preferentemente, el agente caotrópico y el agente reductor opcional se añaden directamente al caldo de fermentación en el recipiente de fermentación antes del aislamiento del polipéptido para que los reactivos permeabilicen las células y el polipéptido se solubilice y difunda al medio envolvente.

Ejemplos de agentes reductores adecuados incluyen el ditiotreitol (DTT), el \beta-mercaptoetanol (BME), la cisteína, el tioglicolato y el borohidruro sódico. La cantidad de agente reductor en el tampón dependerá principalmente del tipo de agente reductor y del agente caotrópico, del tipo y pH del tampón utilizado y del tipo y concentración del polipéptido en el tampón. Una cantidad efectiva de agente reductor es la suficiente para eliminar la agregación mediada por disulfuros intermoleculares. Por ejemplo, de 0,5-6 mg/ml de IGF-I en una solución tamponada a pH 7,5-10,5 que contenga urea 1-4 M, DTT a aproximadamente 1-20 mM y cisteína 10-50 mM. El agente reductor preferido es DTT a aproximadamente 2-10 mM o cisteína a 30-50 mM.

Los agentes caotrópicos adecuados para la práctica de la presente invención incluyen, p.ej., la urea y las sales de guanidina o tiocianato, más preferentemente la urea, la el cloruro de guanidina, o el tiocianato de sodio. La cantidad de agente caotrópico necesaria para estar presente en el tampón depende, por ejemplo, del tipo de agente caotrópico y del polipéptido presente. La cantidad de agente caotrópico a añadir al caldo de fermentación será suficientemente elevada para extraer el polipéptido de la célula y mantener su solubilidad en el medio. Si el polipéptido ha de extraerse de la fase superior, la cantidad de agente caotrópico debe ser suficientemente baja para que después de la adición de las especies formadoras de fases la densidad no se incremente a un punto en donde los sólidos se localicen en la parte superior en lugar de depositarse en la inferior. En general, la concentración de agente caotrópico es de aproximadamente 0,1 a 9 M, preferentemente de aproximadamente 0,5-9 M, más preferentemente de 0,5 a 6 M, y más preferentemente de 0,5 a 3 M. También se añade, de preferencia, el agente caotrópico al medio de cultivo antes de añadir los reactivos formadores de fases. El agente caotrópico preferido es la urea a aproximadamente 1,5-2,5 M, más preferentemente a aproximadamente 2 M o el cloruro de guanidina a aproximadamente 0,5-3 M. De preferencia, el agente caotrópico es la urea.

La concentración del polipéptido en la solución acuosa a la cual el agente caotrópico y el reductor se añaden debe ser tal que el polipéptido se recuperará con el rendimiento máximo. La cantidad exacta a utilizar dependerá, p.ej., del tipo de polipéptido y de la concentración y tipos de otros ingredientes en la solución acuosa, en particular del agente reductor, agente caotrópico, especies formadoras de fases y pH. Para los polipéptidos, en general, la concentración preferida del polipéptido es de aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml. La concentración preferida de IGF-I (que da como resultado un rendimiento máximo de IGF-I desnaturalizado o no nativo) se halla en el intervalo de 0,5-6 mg por ml, más preferentemente de 1,5-5 mg/ml.

Los tipos de especies formadoras de especies a utilizar en la presente invención dependen de muchos factores, incluyendo el tipo de polipéptido y de los ingredientes en el caldo de fermentación que se trata. Las especies deben seleccionarse para que los polipéptidos no precipiten y una fase sea más hidrofóbica que la otra con lo que el polipéptido se localizará en la fase más hidrofóbica y los sólidos de biomasa y ácidos nucleicos se depositarán en la fases menos hidrofóbica.

Las especies formadoras de fases pueden ser una combinación de agentes, incluyendo las combinaciones de polímeros (polímero-polímero), combinaciones de polímero-sal, solvente-sal y combinaciones de polímero-solvente. Polímeros adecuados son tanto los polímeros altamente hidrofílicos como los menos hidrofílicos, es decir, cualquier polímero formador de fases conocido en la materia. Ejemplos incluyen el polietilén glicol o sus derivados, incluyendo diversos pesos moleculares de PEG como el PEG 4000, PEG 6000 y el PEG 8000, los derivados del PEG descritos, por ejemplo, en Grunfeld y col., supra, polivinilpirrolidona (PVP) a un peso molecular preferible en el intervalo de aproximadamente 36.000 a 360.000, almidones como el dextrano (p.ej., el dextrano 70 y el 500), las dextrinas y las maltodextrinas (preferentemente con un peso molecular de aproximadamente 600 y 5.000), la sacarosa y el polímero de Ficoll-400^{TM} (un copolímero de sacarosa y epiclorhidrina). El polímero preferido en la presente invención es el polietilén glicol, el propilén glicol, la polivinilpirrolidona, o un polisacárido como un dextrano. El polímero más preferido aquí es el PEG de pesos moleculares distintos o una combinación de PEG-polipropilén glicol o copolímero.

Ejemplos de solventes orgánicos adecuados incluyen el etilén glicol, el glicerol, el dimetil sulfóxido, el polivinilalcohol, la dimetil formamida, el dioxano y los alcoholes como el metanol, el etanol y el 2-propanol. Dichos solventes son tales que al añadirse a la solución acuosa, incrementan la hidrofobicidad de la solución.

Las sales pueden ser inorgánicas u orgánicas y preferentemente no actúan para precipitar el polipétido. No son preferibles las sales que contengan elementos de transición ya que tienden a precipitar el polipéptido. Los aniones se seleccionan para que tengan el potencial para formar sistemas de fases múltiples. En los ejemplos se incluyen el sulfato amónico, el fosfato dibásico sódico, el sulfato sódico, el fosfato amónico, el citrato potásico, el fosfato magnésico, el fosfato sódico, el fosfato cálcico, el fosfato potásico, el sulfato potásico, el sulfato magnésico, el sulfato cálcico, el citrato sódico, el sulfato de manganeso, el fosfato de manganeso, etc. Los tipos de sales que son útiles para la formación de sistemas acuosos bifásicos se evalúan más completamente en Zaslavski y col., J. Chrom., supra. Las sales preferidas en la presente invención son los sulfatos, los fosfatos, o los citratos y de metales alcalinos o alcalino-térreos. Más preferidos son los sulfatos y los citratos y todavía más preferidos son los sulfatos ya que presentan pocas limitaciones de pH. Las sales más preferidas son el sulfato sódico y el citrato sódico.

Son bien conocidos en la materia las cantidades de especies formadoras de fases a añadir al polipéptido de interés para obtener un sistema de fases múltiples satisfactorio. La cantidad de especies formadoras de especies añadidas al polipéptido dependerá de dichos factores, por ejemplo, la cantidad de agente caotrópico y de agente reductor, si lo hubiera, ya presente en el caldo de fermentación, la naturaleza del medio de cultivo celular, el tipo de células utilizadas en la fermentación, el tipo de polipéptido que se trata, si el polipéptido se ha de recuperar de la fase inferior o superior y del tipo(s) de especies formadoras de fases que se añaden. La concentración general del polímero utilizado es de aproximadamente el 5% (p/p) hasta el límite de solubilidad para el polímero y la concentración de sal utilizada es de aproximadamente el 3% (p/p) hasta el límite de solubilidad para la sal, dependiendo de la magnitud de la proporción fase-volumen que se requiera. La proporción fase-volumen debe ser suficiente para acomodar los sólidos de biomasa. Los tipos y cantidades efectivas de especies formadoras de fases se pueden determinar mediante diagramas de fase y evaluar el resultado final, es decir, el grado de pureza y el rendimiento del polipéptido de interés. Si las especies formadoras de fases son una combinación de polímero-sal, la concentración de sal será preferentemente del 4-15% (p/p) y la concentración del polímero del 5-18% (p/p), para que el polipéptido deseado se halle en una fase opuesta a la fase en donde se hallen los sólidos de biomasa y ácidos nucleicos.

Si el sistema que se desea corresponde a uno en donde el polipéptido se distribuye en la fase superior y los sólidos de biomasa y ácidos nucleicos se distribuyen en la fase inferior, entonces existe una ventana de concentraciones de especies formadoras de fases. Cuando se añaden cantidades superiores de agentes caotrópicos para mantener la solubilización, mayor es la cantidad de especies formadoras de fases que se necesita. Sin embargo, una concentración superior de todos estos reactivos incrementará la densidad de la solución. Una densidad elevada causará que los sólidos de biomasa sedimenten menos rápidamente. Una densidad alta superpuesta causará que los sólidos de biomasa floten en la superficie. En consecuencia, las concentraciones de agente caotrópico y de especies formadoras de fases deben ser suficientemente altas para mantener un polipéptido completamente solubilizado, pero lo suficientemente bajas para permitir que los sólidos de biomasa y los ácidos nucleicos sedimenten en la fase opuesta (inferior).

Si el polipéptido se ha de recuperar en la fase superior, la concentración de sal típica será de aproximadamente 4-7% (p/p) y la concentración del polímero de aproximadamente 12-18% (p/p), dependiendo, p.ej., del tipo de sal, polímero y polipéptido. Si se añade un solvente orgánico como una especie formadora de fases, como el etanol, es preferible añadir en una cantidad de aproximadamente el 10-30% (volumen/volumen) de la solución, dependiendo, p.ej., del tipo de polipéptido y de alcohol y si está presente alguna de las especies formadoras de fases, preferentemente a una concentración de aproximadamente el 20% (v/v).

Las condiciones exactas para poner en contacto el cultivo de células con los diversos reactivos dependerá de, p.ej., el pH del tampón, los tipos de reactivos formadores de fases y del tipo y concentración del polipéptido y agentes caotrópico y reductor. Generalmente, La temperatura de reacción es de aproximadamente 20-40ºC y preferentemente, a temperatura ambiente. La etapa de contacto se llevará a cabo generalmente durante al menos 30 minutos, preferentemente de 30 minutos a 12 horas dependiendo de que existan reacciones secundarias, más preferentemente de unos 30 minutos a 8 horas y más preferentemente, de 30 minutos a 1,5 horas.

Si el polipéptido se pliega incorrectamente, el grado de plegado incorrecto se determinará mediante cromatografía del polipéptido no-nativo, incluyendo la cromatografía de interacción hidrofóbica o la de intercambio iónico. Un incremento del área para el material no-nativo es indicativo de cuánto polipéptido no-nativo está presente.

Una vez se ha establecido el sistema de fases múltiples, una fase se enriquecerá en el polipéptido y se empobrecerá en partículas rotas y células que comprenden los sólidos de biomasa y ácidos nucleicos. En un sistema de dos fases, la fase superior se enriquece preferentemente en el polipéptido, mientras que la fase inferior se enriquece en las partículas rotas y restos celulares. El polipéptido se puede recuperar fácilmente mediante separación de las fases. Esta etapa de recuperación puede completarse decantando la fase superior, drenando la fase superior, o centrifugando. El polipéptido puede entonces aislarse de la fase en la que se halla mediante un cambio de pH para precipitar el polipéptido o mediante adición de un solvente adecuado, después de lo cual el polipéptido precipitado se recupera adecuadamente mediante centrifugación o filtración o como un lodo. Alternativamente, el polipéptido puede recuperarse de la fase que contiene el polímero mediante re-extracción añadiendo un polímero adecuado, una sal o un solvente. En el caso del IGF-I, el polipéptido se recupera de la fase del polímero aislado disminuyendo el pH para que el IGF-I precipite, dando como resultado un rendimiento de IGF-I igual o superior a aproximadamente el 97%.

Una vez obtenido de la fase líquida del sistema de fases múltiples, o en un estadio posterior de purificación, el polipéptido se repliega adecuadamente en una conformación activa utilizando el procedimiento de la presente invención.

Si el polipéptido ya no está en la forma soluble antes de que se vuelva a plegar, puede ser solubilizado mediante incubación en un tampón alcalino que contenga un agente caotrópico y un agente reductor en las cantidades necesarias para solubilizar esencialmente el polipéptido. Esta incubación tiene lugar en condiciones de concentración polipeptídica, tiempo de incubación y temperatura de incubación que permitirán la solubilización del polipéptido en un tampón alcalino.

La cuantificación del grado de solubilización del polipéptido en el tampón se lleva a cabo mediante la determinación de la turbidez, analizando el fraccionamiento del polipéptido entre el sobrenadante y el sedimento después de la centrifugación en geles de SDS reductores, mediante el ensayo de cuantificación proteica (p.ej., el equipo de ensayo proteico de Bio-Rad), o mediante HPLC.

El intervalo de pH del tampón alcalino para la solubilización es generalmente de por lo menos 7,5, siendo un intervalo preferido de 8-11. Ejemplos de tampones adecuados que proporcionen un pH dentro de este último intervalo incluyen la glicina, CAPSO (ácido 3-[ciclohexylamino]-2-hidroxi-1-propansulfónico), AMP (2-amino-2-metil-1-propanol), CAPS (ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propansulfónico), CHES (ácido 2-[N-Ciclohexilamino]-etansulfónico) y el Tris-HCl (Tris[hidroximetil]aminometano) hidrocloruro. El tampón preferido aquí es el de glicina o el CAPSO, preferentemente a una concentración de aproximadamente 20 mM, a un pH de aproximadamente 8,5 a 11, preferentemente a 10-11.

La concentración del polipéptido en la solución tamponada para la solubilización debe ser tal que el polipéptido se solubilizará o reducirá y desnaturalizará completa o parcialmente. Alternativamente, el polipéptido puede estar inicialmente insoluble. La cantidad exacta a utilizar dependerá, p.ej., de las concentraciones y tipos de otros ingredientes en la solución tamponada, en particular del tipo de polipéptido utilizado, del tipo y cantidad de agente reductor, del tipo y cantidad de agente caotrópico y del pH del tampón. Por ejemplo, la concentración del IGF-I puede incrementarse por lo menos tres veces si la concentración del agente reductor, p.ej., DTT se aumenta simultáneamente, para mantener una proporción de DTT:IGF-I de aproximadamente 3:1 a 10:1. Es deseable producir una solución de proteína solubilizada más concentrada antes de diluir para el replegamiento. En consecuencia, la concentración preferida del polipéptido es de por lo menos 30 mg/ml, siendo un intervalo más preferido de 30-50 mg/ml. Por ejemplo, el IGF-I se puede solubilizar a una concentración de aproximadamente 30-50 mg/ml en urea 2M, DTT 10 mM y diluir a, por ejemplo, 1 mg/ml para el replegamiento.

Después de solubilizar el polipéptido, éste se coloca o diluye en un tampón que contiene el solvente, un agente caotrópico y sales, tal como se describió anteriormente. El tampón puede ser cualquiera de los enunciados anteriormente para la primera solución tamponada, preferiblemente CAPSO, glicina y CAPS, a pH 8,5-11, en particular a una concentración de aproximadamente 20 mM y más preferentemente CAPSO y glicina. El polipéptido puede diluirse con el tampón de replegamiento, preferentemente al menos cinco veces y más preferentemente diez veces por lo menos. Alternativamente, el polipéptido puede dializarse contra el tampón de replegamiento. El replegamiento se lleva a cabo de forma característica a aproximadamente 0-45ºC, preferentemente a unos 20-40ºC, más preferentemente a 23-37ºC, todavía más preferentemente a unos 25-37ºC y todavía más preferentemente a unos 25ºC durante por lo menos una hora. La temperatura preferida no se ve afectada en apariencia por los niveles de sal, solvente y agente caotrópico, pero sí por la presencia de sacarosa y glicerol, en cuyo caso se debería mantener por encima de aproximadamente 20ºC. La solución también contiene originalmente un agente reductor y un osmolito.

El agente reductor se selecciona adecuadamente a partir de los descritos anteriormente para la etapa de solubilización en el intervalo dado de concentraciones. Su concentración dependerá esencialmente de las concentraciones de sal de metal alcalino, de metal alcalino-térreo, del polipéptido y del solvente. Preferentemente, la concentración del agente reductor es de aproximadamente 0,5 a 8 mM, más preferentemente de aproximadamente 1-5 mM, aún preferentemente de 0,5-2 mM. Los agentes reductores preferidos son el DTT y la cisteína.

El osmolito opcional es preferentemente la sacarosa (a una concentración de aproximadamente 0,25-1 M) o el glicerol (a una concentración de aproximadamente 1-4 M). Más preferentemente, la concentración de sacarosa es de 1 M y la de glicerol de 4 M.

La concentración inicial del polipéptido en el tampón de replegamiento es tal que se maximizará la proporción de la molécula recuperada con una conformación plegada correctamente respecto a la plegada incorrectamente, según se determine por HPLC, RIA o bioensayo. La concentración exacta dependerá, por ejemplo, del tipo de polipéptido utilizado. La concentración preferida del polipéptido (que resulta en un máximo rendimiento de la molécula plegada correctamente) se halla en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 6 mg/ml y más preferentemente a aproximadamente 0,2 a 5 mg/ml.

Además, una fuente de oxígeno como el aire o el gas oxígeno se introduce en el tampón para ejercer una oxigenación junto con la sal de cobre o manganeso. El oxígeno puede estar presente en tampón en cualquier momento, incluso antes de añadir el polipéptido o cualquier otro reactivo al tampón.

La cantidad de oxígeno introducida dependerá, p.ej., del tipo de recipiente utilizado, del tipo y concentración de polipéptido, del tipo de fuente de oxígeno, del tipo y cantidad de sal de cobre y manganeso y del tipo y cantidad de agente reductor presente, si lo hubiera, y del tipo y cantidad de agente caotrópico presente, así como del pH del tampón. En general, la fuente de oxígeno se introducirá mediante medios pasivos (p.ej., aire en el espacio superior en una proporción de espacio aireado respecto al volumen líquido de 2:1) utilizando un agitador. Alternativamente, la fuente de oxígeno puede introducirse mediante burbujeo. La velocidad de introducción del oxígeno debe ser suficiente para permitir que el replegamiento se complete en preferentemente 1-12 horas, más preferentemente en aproximadamente 1-6 horas, y más preferentemente en aproximadamente 1 a 3 horas. La adición de oxígeno molar es proporcional a la concentración del agente reductor y a la concentración del polipéptido, pero inversamente proporcional a la concentración de sal de cobre o de magnesio. La velocidad de oxidación está limitada por el nivel del catalizador, no por la velocidad de adición de oxígeno. Es necesaria una velocidad de burbujeo superior para el plegamiento de volúmenes mayores.

El grado de replegamiento que tiene lugar tras esta segunda incubación se determina de forma adecuada mediante titulación por RIA del polipéptido o mediante análisis de HPLC utilizando, p.ej., una columna Vydac o Baker C-18. Un aumento del título RIA o del tamaño del pico del polipéptido plegado correctamente se correlaciona directamente con cantidades aumentadas del polipéptido activo biológicamente y plegado correctamente presente en el tampón. La incubación se lleva a cabo para maximizar el rendimiento del polipéptido plegado correctamente y de la proporción de polipéptido plegado correctamente respecto al plegado incorrectamente que se recupera, según se determine mediante RIA o HPLC, y para minimizar el rendimiento del polipéptido asociado y multimérico, tal como se determina mediante equilibrio de masas.

Después de replegar el polipéptido, se procede a su purificación. A continuación se muestran ejemplos de procedimientos de purificación adecuada para obtener una mayor pureza: fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o de inmunoafinidad; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía en sílice o resina de intercambio iónico como la S-sepharose y DEA; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

La invención será mejor comprendida mediante los siguientes ejemplos, que pretenden ilustrar la invención pero sin limitar su ámbito. Todas las citas literarias y las patentes se han incorporado aquí expresamente como referencias.

Ejemplo I A. Construcción de la cepa 37D6 de célula huésped

El huésped utilizado para producir el IGF-I humano recombinante en la fermentación descrita en este ejemplo fue un derivado de E. coliW3110, denominado 37D6. El genotipo completo de 37D6 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Deltarbs ilvG\Delta (argF-lac)169 ompT\Delta degP41Kan^{r}. La derivación de la cepa 27C, que es una cepa parental para 37D6 tiene el genotipo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 (argF-lac)169 ompT\Delta degP41Kan^{r}, se describe en la patente internacional WO 93/11240, publicada el 10 de junio de 1993, cuya descripción se incorpora aquí mediante referencias. La capa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991, en el American Type Culture Collection como ATCC 55.244.

La cepa 37D6 es la misma que la 27C7 descrita anteriormente excepto que tiene una deleción rbs7 (no utilización de ribosa) y con un locus ilvG restaurado. Ambos marcadores se pueden introducir mediante transducción con
P1.

B. Descripción/Construcción del plásmido de expresión de IGF-I pBKIGF2B

En el plásmido de expresión de IGF-I pBKIGF-2B, las secuencias transcripcionales y de traducción requeridas para la expresión del gen IGF-I en E. coli se proporcionan mediante el promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia de Shine-Dalgarno. El terminador t_{0} transcripcional se sitúa adyacente al codón de terminación. La secreción de la proteína a partir del citoplasma está dirigida por la secuencia señal lamB o alternativamente por la secuencia señal STII. La mayoría de rhIGF-I se halla en el espacio periplásmico celular. El plásmido pBKIGF-2B confiere resistencia a la tetraciclina en el huésped transformado.

El plásmido pBKIGF-2B se construyó en varias etapas utilizando los plásmidos intermedios pLS32Tsc, PLBIGFTsc, PLS3Tsc y pRanTsc.

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Etapa 1

pLS32Tsc

El plásmido de secreción pLS32Tsc contiene el gen IGF-I. Las secuencias de transcripción y traducción necesarias para la expresión del gen IGF-I en E. coli se proporcionan por el promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia Shine-Dalgarno de trp. El terminador transcripcional t0 de lambda está situado adyacente al codón de finalización. La secreción de la proteína a partir del citoplasma está dirigida por la secuencia señal lamB o alternativamente por la secuencia señal STII. La mayor parte del IGF-I se halló en el espacio periplásmico. El plásmido pLS32Tsc confiere resistencia a la tetraciclina al huésped transformado.

El plásmido pLS32Tsc se construyó en diversas etapas utilizando los plásmidos intermedios pLS32, pAPlamB, pLS321amB, pLS331amB y pLS33Tsc tal como se describe con mayor detalle en la patente internacional WO 93/11240, supra.

Etapa 2

pLBIGFTsc

Etapa a

pLamBIGF

Para la primera parte de la ligación, se aisló el fragmento del vector EcoRI-PstI a partir de PBR322. Para la segunda parte de la ligación, se aisló un fragmento PstI-NcoI de 1244 pb a partir del pAPLamB. Para la tercera parte de la ligación, el fragmento HaeII-EcoRI de 196 pb que contiene el gen IGF-I excepto el extremo 5' terminal se aisló del plásmido p200. El p200 es un plásmido derivado de pBR322 que tiene, en el orden 5' a 3', el promotor de quelatina, la secuencia señal prepro alfa I MF, el DNA que codifica para el IGF-I maduro y el terminador 2-\mu. Contiene el origen ColE1 de replicación en bacterias y el origen 2-\mu para levaduras. Un diagrama de restricción del plásmido p200 proporciona en la figura 1. La secuencia nucleotídica (SEC ID Nº 1) del fragmento EcoRI (iniciándose en la posición 1149) al EcoRI (iniciándose en la posición 1628) de p200 que contiene el prepro alfa I MF y el gen IGF-I se proporciona en la Figura 2. Las dianas de restricción Haeii, PstI, BamHI y SalI que se hallan también en el diagrama de la Figura 2 están señaladas mediante subrayado. Un fragmento del DNA sintético que une la secuencia señal con el gen IGF-I (NcoI a HaeII) se preparó con la siguiente secuencia:

5'-CATG GCC GGT CCG GAA ACT CTG TGC GGC GC (SEC ID Nº 29).

3'- CGG CCA CTT TGA GAC ACG C (SEC ID Nº 3).

Los tres fragmentos plasmídicos y el DNA sintético se ligaron para formar pLamBIGF, tal como se muestra en la Figura 3.

Etapa b

pLBIGFTsc

El fragmento del vector XbaI-BamHI se aisló a partir del pLS18 como el primer fragmento de ligación. La segunda parte de la ligación se preparó mediante digestión con EcoRI del pLaBIGF, seguido de tratamiento con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa, seguido por una digestión XbaI. A continuación se aisló el fragmento de 302 pb resultante. Los tres fragmentos se ligaron para producir el pLBIGFTsc, tal como se muestra en la Figura 4.

Etapa 3

pRanTsc

El fragmento XbaI-BamHI de pLS18 se aisló como el primer fragmento de ligación. La segunda parte de la ligación fue un fragmento de 412 pb StuI-BamHI del plásmido pdH108-4, descrito anteriormente. La tercera parte de la ligación se preparó a partir de pRANTES. El pRANTES es un plásmido derivado de pBR322 que contiene un fragmento de un adaptador XbaI seguido por la secuencia señal STII, seguido por el cDNA que codifica RANTES [tal como publicó Schall y col., J. Immunol., 141:1018 (1988)], seguido por el adaptador BamHI. El tercer fragmento se preparó mediante digestión de RANTES con BamHI, seguido por el tratamiento con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa, seguido por una digestión con XbaI. A continuación se aisló el fragmento resultante de 303 pb. Estos tres fragmentos se ligaron para generar pRanTsc, tal como se muestra en la Figura 5.

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Etapa 4

pBKIGF-2

Tal como se muestra en la Figura 6, el fragmento EcoRI-PstI de 540 pb que contenía el promotor de la fosfatasa alcalina, la secuencia señál de lamB y el DNA que codifica los primeros 15 aminoácidos del IGF-I se extrajeron de pLS32Tsc. El fragmento Pst-Bsp1286I (\sim70 pb) que contenía el DNA codificante de los aminoácidos 16-38 de IGF-I se obtuvo de pLBIGFTsc. El fragmento Bsp12861-HindIII (\sim179 pb) conteniendo el DNA que codifica los aminoácidos 39-70 de IGF-I, el terminador lambda y el promotor Tc se obtuvo de pLS33Tsc. Por último, el fragmento del vector (derivado de pBR322) de \sim4331 pb EcoRI-HindIII se obtuvo de pRanTsc. Estos cuatro fragmentos se ligaron para generar pBKIGF-2, que contenía el promotor AP, la secuencia señal lamB, el DNA que codifica para toda la proteína IGF-I, el terminador transcripcional, el promotor Tc y los marcadores de resistencia a tetraciclina y ampicilina.

Etapa 5

pBKIGF-2A

El pBKIGF-2 se digirió con PstI y ClaI y a continuación se aisló el fragmento de \sim245 pb. Este fragmento contiene los aminoácidos 16-70 del IGF-I y el terminador lambda t_{o}. El pLBIGFTsc se digirió con NcoI y ClaI y se aisló el fragmento del vector. Este fragmento contiene el promotor AP, la secuencia señal lamB y el gen Tet^{r}. Estos dos fragmentos se ligaron en un uno sólo del DNA sintético que remplaza el extremo 5' del DNA de IGF-I desde NcoI a PstI con codones derivados sintéticamente siguientes:

5'-CATGGCC GGT CCC GAA ACT CTG TGC GGT GCT GAA CTG GTT GAC GCT CTG CA-3'

3'-CGG CCA GGG CTT TGA GAC ACG CCA CGA CTT GAC CAA CTG CGA G-5'

(SEC ID Nº 4 y 5, respectivamente).

El plásmido resultante se denominó pBKIGF-2A. La construcción se muestra en la Figura 7.

Etapa 6

plamBRan

Este plásmido se preparó mediante digestión de pLS33LamB con NcoI y BamHI y se aisló el fragmento del vector. El pLS33LamB es un plásmido derivado de pBR322 en el que se ha insertado el promotor AP, la secuencia señal lamB y el gen IGF-I. BamHI corta en la porción Tc del plásmido y NcoI corta en el extremo 5' del gen IGF-I. El segundo fragmento se generó mediante digestión de pRANTES con BsaJI y BamHI y se aisló el fragmento resultante \sim 200 pb. El tercer fragmento fue una porción de DNA sintético para unir el gen RANTES con la secuencia señal de NcoI a BsaJI. Este DNA sintético tiene la secuencia siguiente:

NcoI

\hskip3,9cm

BsaJI

5'-CATGGCCTCCCCATATTC-3'

\hskip0,1cm

3'-CGGAGGGGTATAAGGAGC-5'

(SEC ID Nº 6 y 7, respectivamente).

El vector resultante se denominó pLamBRan y su construcción se muestra en la Figura 8.

Etapa 7

pBKIGF-2B

La construcción de este plásmido se muestra en la Figura 9. El pLamBRan se digirió con NcoI y SphI y se aisló el fragmento del vector que contenía el promotor y la secuencia señal. El pBKIGF-2 se digirió con DdeI y SphiI y se aisló el fragmento de \sim 600 pb que contenía el terminador de transcripción y el extremo 5' del gen Tet^{R}. El pBKIGF-2A se digirió con NcoI y Bsp12861 y se aisló el fragmento que contenía el DNA que codifica los aminoácidos 1-38 de IGF-I. Estos tres fragmentos se ligaron junto con el DNA sintético que codifica los aminoácidos 39-70 de IGF-I para producir pBKIGF-2B. Este adaptador sintético tiene la secuencia siguiente:

5'-TTCGTCGTGCTCCC CAG ACT ATT GTT GAC GAA TGC TGC TTT CGT TCT NTGC GAC CTG CGT GGT CTG-3'

(SEC ID Nº 8)

3'-AGA ACG CTG GAC GCA GCA GAC CTT TAC ATA ACG GGA GGG GAC TTT GGG CGATTTAGACGAATCTTCGAGG-5'

C. Procedimiento de fermentación y recuperación i. Transformación

Las células competentes de E. coli 27C7 se transformaron con pBKIGF-2B mediante técnicas de transformación estándares. Los transformantes se seleccionaron y purificaron en placas de LB que contenían 20 mg/l de tetraciclina. La composición del medio fue la siguiente: 10g/l de Bacto-triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10g/l de cloruro sódico y 20 mg/l de tetraciclina-HCl.

ii. Inóculo de fermentación

Se preparó un inóculo para el fermentador de 10 l, en primer lugar se inoculó un frasco de agitación de 2 litros con aproximadamente 500 ml de medio LB estéril con tetraciclina con el vial de cultivo de 1-2 ml recién descongelado. Este frasco se incubó a 35-39ºC durante 8 horas y se transfirió a un fermentador de 10 l que contenía el medio de producción en el intervalo descrito en la Sección C de este Ejemplo. El inóculo del fermentador de 10-litros se incubó a 35-39ºC a pH 7,1-7,5 durante 6-12 horas. La velocidad de agitación fue de 650-1000 rpm y la velocidad de aireación de 0,7-1,5 volúmenes de aire por volumen de cultivo por minuto. El inóculo se transfirió asépticamente a un recipiente de fermentación de 1000-l en donde se introdujo glucosa desde la base.

El inóculo de 10-l se creció de igual forma que el de 500 ml en un recipiente de cultivo en agitación hasta una fase de crecimiento exponencial (cultivo del lote). Toda la glucosa se añadió al fermentador de 10 l al inicio de la fermentación. Únicamente la fermentación de 1000-l utilizó alimentación de glucosa.

iii. Procedimiento de fermentación

El recipiente de 1000-l contenía inicialmente 600-800 litros de medio de fermentación compuesto de la manera siguiente:

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

El proceso de fermentación se realizó a 35-39ºC a pH 7,1-7,5 durante 24-48 horas. La velocidad de agitación se ajustó a 200 rpm y la velocidad de aireación a 0,7-1,5 volúmenes de aire por volumen de aire del cultivo por minuto. La producción de IGF-I tuvo lugar después de disminuir el fosfato ene l medio. Este procedimiento dio como resultado el caldo de fermentación que contenía aproximadamente el 18% de volumen celular empaquetado y unos 3 g/l de IGF-I, que se halló principalmente en el espacio periplásmico con niveles inferiores en el medio extracelular.

D. Hibridación in situ

Al término de la fermentación, se desconectaron todos los alimentadores y controladores, con excepción del de temperatura. La temperatura se mantuvo a 37ºC. Las líneas de aspersión y el espacio superior del fermentador ce donde brota el gas nitrógeno, primero a una velocidad de 150 lpm durante 1 min, luego a 50 lpm durante el resto del proceso. A continuación se bombeó rápidamente unos 220 l del barro que contenía 174 Kg de urea en el fermentador, y seguidamente unos 8 l de hidróxido sódico al 50% (p/p), lo suficiente para ajustar el pH a 10,0. A continuación se añadieron unos 20 l de solución que contenía 2,9 Kg de ditiotreitol y el pH se reajustó a 10,0 con aproximadamente 3 litros adicionales de hidróxido sódico al 50%. El lote se mantuvo en agitación a 37ºC durante 60 minutos, después de lo cual se enfrió a 22ºC y se transfirió a un tanque de retención para extracción de fases acuosas. Los ensayos mediante HPLC de fase inversa mostraron que el título inicial de IGF-I fue de 3,8 g/l y que después de la solubilización se liberaba una cantidad significativa de IGF-I de las células.

E. Extracción acuosa en dos fases líquidas

La temperatura del lote se mantuvo a 22ºC y la parte superior del tanque se inyectó con nitrógeno. Al caldo tratado, con un volumen de 1450 l, se añadieron 250 Kg de PEG-8000 y 90 Kg de sulfato sódico. El lote se mezcló durante aproximadamente 40 minutos. La centrifugación y el análisis de las muestras mostraron que la proporción fase-volumen (Kv) se estabilizó a 2,6 y que el coeficiente de distribución del IGF-I (Kc) fue de 8,5. El lote se separó utilizando un separador SB-7 de Westfalia, produciendo aproximadamente 1300 l de fase ligera y 550 l de fase pesada. Los ensayos de HPLC de fase inversa mostraron que la fase ligera aislada contenía aproximadamente el 88% del IGF-I en los 1450 l iniciales de caldo tratado. La fase ligera se mantuvo en nitrógeno y se descartó la fase pesada.

F. Precipitación de IGF-I

Se añadieron aproximadamente 36 l de ácido fosfórico 2 M a la fase ligera para ajustar el pH a 7,0 a 22ºC. El lote se mantuvo aproximadamente 8 horas con ligera agitación. Al cabo de dicho tiempo, el ensayo de HPLC de fase inversa mostró que aproximadamente el 96% del IGF-I había precipitado. El sedimento se recogió a continuación utilizando un clarificador Westfalia SB-7. La masa del barro sedimentado fue de aproximadamente 88 Kg.

G. Replegamiento

Una alícuota del barro sedimentado, con una masa de 17,6 Kg, se disolvió añadiendo urea sólida suficiente para llevar la concentración final a 2 M, añadiendo ditiotreitol suficiente para llevar la concentración a 10 mM y ajustando el pH a 10,0 con hidróxido sódico al 50% (p/p). A continuación se añadieron 700 l de tampón de plegamiento con una composición de urea 2M, cloruro sódico 1 M, etanol al 19% (v/v), glicina 20 mM, cobre 0,5 \muM, pH 10,5. La concentración final de ditiotreitol se ajustó a continuación a 1 mM. El plegamiento se llevó a cabo a 22ºC con ligera agitación inyectando gas oxígeno a 280 ml/minuto. El progreso de plegamiento se controló mediante HPLC de fase inversa. Los cromatogramas de HPLC tomados al inicio, en la mitad y después de terminar el plegamiento se muestran en la Figura 10. Al cabo de aproximadamente 3 horas, el plegamiento se finalizó al cesar la inyección de oxígeno y añadir aproximadamente 1,6 ml de ácido fosfórico para titular el lote a pH 3,5. El ensayo de HPLC por fase inversa mostró que el rendimiento de plegamiento fue del 50%.

Ejemplo II

La construcción huésped, la construcción del plásmido y la fermentación se llevaron a cabo tal como se describió en el Ejemplo 1, apartados A-C. La solubilización in situ se llevó a cabo tal como se describió en el Ejemplo I, apartado D, excepto en la que se utilizó DTT, el caldo de cultivo se redujo mediante adición de L-cisteína suficiente para llevar la concentración final a 50 mM (aproximadamente 8,8 Kg). Al término de la solubilización, el ensayo de HPLC de fase inversa mostró que el 93% del IGF-I se liberó de las células.

El aislamiento siguiente se llevó a cabo en versiones reducidas de las operaciones descritas en el Ejemplo I, apartados E-G.

Ejemplo III

El IGF-I nativo se preparó utilizando el huésped, el plásmido, el procedimiento de fermentación y de solubilización in situ descritos en el Ejemplo I, apartados A-D.

Los sistemas de dos fases se produjeron utilizando el procedimiento siguiente: (1) se colocaron las especies formadoras de fases en un tubo de cultivo de poliestireno de 15 ml graduado; (2) se añadieron 7 ml del extracto completo de la solubilización in situ, se mezclaron los contenidos y la parte superior se inyectó con nitrógeno; (3) la composición se incubó durante dos horas a temperatura ambiente o 37ºC con un mezclado vertical. Se añadieron los polímeros de las soluciones madre (PEG al 50% p/p con un PM de 3350, PEG al 50% p/p con un PM de 8000 y DOW Poliglicol (15-200TM de marca del polímero) al 100% p/p, mientras que las sales se añadieron como reactivos químicos secos. Los componentes se añadieron para lograr una composición predeterminada según el peso, asumiendo que el extracto completo tiene una densidad de 1 g/ml.

Las fases se separaron mediante centrifugación a 25ºC o 37ºC aproximadamente 1300 g durante 20 minutos. La concentración de IGF-I en la fase superior se determinó mediante análisis de HPLC de fase inversa. La concentración del IGF-I en la fase inferior se calculó asumiendo un equilibrio de masas.

Se llevaron a cabo tres experimentos en los que se varió la concentración y el tipo de polímero formador de fases, concentración y tipo de sal formadora de fases, concentración y tipo de sal no formadora de fases y la temperatura. Los sistemas resultantes pudieron caracterizarse visualmente en una de las cinco categorías enunciadas: (1) sistemas de una fase, (2) sistemas de dos fases en los que los sólidos sedimentan en la fase inferior, (3) sistemas de dos fases en los que algunos sólidos flotan en el fase inferior, (4) sistemas de dos fases en los que los sólidos se distribuyen a través de las fases superior e inferior y (5) sistemas de dos fases en los que los sólidos se distribuyen en la fase superior.

El trazado que se muestra en la Fig. 11 ilustra esta relación entre la composición de los sistemas y la disposición para los sistemas compuestos únicamente de extracto completo, PEG-8000 y Na_{2}SO_{4}. En este trazado, "sistemas bifásicos con sólidos flotando" representan todos los sistemas bifásicos en donde los sólidos no sedimentan en la fase inferior. El trazado también indica que el límite que describe los sistemas en los que los sólidos sedimentan en una fase inferior que es suficientemente amplio para acomodar su volumen. Los sistemas más preferidos son aquellos en donde los sólidos sedimentan en la parte inferior, estando contenidos en la región sombreada el volumen de fase inferior suficiente para acomodar los sólidos y el cociente de fase-volumen superior a aproximadamente.

Estos tres experimentos también proporcionan resultados que permiten que los sistemas bifásicos distintos se comparen cuantitativamente tal como se muestra en la Tabla I. Para reducir el error y permitir que el efecto de un cambio dado sea más evidente, se obtuvo el promedio de los resultados de la proporción volumétrica y del coeficiente de partición para sistemas distintos, tal como se indicó. Los resultados de este análisis indican algunas tendencias. Los polímeros PEG-8K y PEG-4K (con valores de PM de 8000 y 3350, respectivamente) de sistemas que tienen proporciones volumétricas similares y en similares particiones de IGF-I no nativo. Incluso el NaCl en los sistemas de fases examinados no afecta la proporción volumétrica, pero sí disminuye el coeficiente de partición de IGF-I. Añadiendo aleatoriamente el polietilén glicol, copolímero de glicol polipropileno DOW Poliglicol de marca comercial 15-200TM (PM-2500) no se altera la proporción volumétrica o el coeficiente de partición. Incluyendo la sal de citrato formadora de fases en PEG-8000 y Na_{2}SO_{4} se desplaza la posición de la curva binodal pero no se afecta la partición de IGF-I. Realizando la extracción bifásica acuosa a 37ºC se disminuye la proporción volumétrica y el coeficiente de partición relativo a los 25ºC.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I

2

Ejemplo IV

Se preparó el IGF-I no nativo utilizando el huésped, el plásmido, la fermentación y el procedimiento de solubilización in situ descritos en el Ejemplo I, apartados A-D.

Los sistemas bifásicos acuosos se produjeron tal como se describe en el Ejemplo III con la excepción de que el PEG-8000 se añadió en seco en lugar de una solución madre. Las concentraciones de IGF-I en la fase líquida superior y la inferior se determinaron mediante análisis por HPLC de fase inversa. La fase líquida inferior se sometió a filtración con 0,2 \mum antes de analizarse para eliminar los sólidos resuspendidos residuales.

Los resultados de la determinación directa del coeficiente de partición del IGF-I no nativo en los sistemas bifásicos acuosos se muestran en la Tabla I. Con concentraciones condicionantes de Na_{2}SO_{4} (p/p) al 50%, PEG-8000 al 14% (p/p), el coeficiente de distribución tiene una magnitud de 9 a 10. Un incremento del 1% (p/p) en la concentración de sal o un incremento del 2% (p/p) en la concentración del polímero doblan su magnitud. Aumentos combinados en las concentraciones de sal y polímero conducen a un incremento de cuatro veces, dando como resultado un valor cercano a 40. Esta última combinación da como resultado la formación de un sistema bifásico con sólidos flotando.

TABLA II

3

Ejemplo V

El IGF-I no nativo se preparó utilizando los procedimientos de fermentación, solubilización in situ y de extracción bifásica acuosa descritos en el Ejemplo I, apartados A-E. Para la precipitación del IGF-I, una porción de la fase ligera se dividió en varias alícuotas que se titularon a aproximadamente pH 6 utilizando uno de los ácidos siguientes: fosfórico 2N, acético 2N, sulfúrico 2N, clorhídrico 2N, cítrico 2N, nítrico 2N. A continuación, las alícuotas se centrifugaron rápidamente a aproximadamente 5000 xg durante 15 minutos y se decantaron los sobrenadantes. Los ensayos de HPLC en fase inversa mostraron que, en todos los casos, al menos el 93% del IGF-I inicial se recuperó en el sedimento. El plegamiento consiguiente de la proteína de los sedimentos se llevó a cabo mediante una versión reducida del procedimiento descrito en el Ejemplo I, apartado G.

Ejemplo VI

El IGF-I no nativo se preparó utilizando los procedimientos de fermentación, in situ solubilización y extracción bifásica acuosa descritos en el Ejemplo I, apartados A-E.

Una muestra de fase ligera del apartado E del Ejemplo I se dividió en varias alícuotas pequeñas y se inició la precipitación ácida titulando estas alícuotas a pH 10, 4,5, 4,0 3,5, o 3,0 con ácido sulfúrico 2M. Cada uno de estas cinco soluciones madre se dividieron posteriormente en cinco alícuotas, las cuales recibieron suficiente sulfato sódico sólido para proporcionar una concentración final de 3, 4, 5, 6, o 7% en peso. Las muestras se incubaron durante dos horas a 25ºC con ligera agitación. Las fases se separaron después de centrifugarlas aproximadamente 5000 xg durante 20 minutos. Se analizó la concentración de IGF-I en ambas fases mediante HPLC de fase inversa.

Para todos los niveles de sulfato sódico a pH 10, más del 95% de IGF-I permaneció en la fase superior. Para el resto de pHs (4,5 a 3,0), más del 98% del IGF-I se recuperó en la fase inferior.

Ejemplo VII

El IGF-I no nativo se preparó utilizando los procedimientos de fermentación, solubilización in situ, extracción bifásica acuosa y precipitación por neutralización descritos en el Ejemplo I, apartados A-G.

Una suspensión que contenía IGF-I reducido se preparó a partir del sedimento de IGF-I obtenido mediante precipitación por neutralización. Para producir esta suspensión, 30 g del sedimento húmedo que contenía el IGF-I se resuspendió en una solución que contenía glicina 20 mM (pH 10,5), urea 2 M y DTT 10 mM a un volumen final de 100 ml. El pH de la suspensión resultante se ajustó a pH 10,5 mediante adición suficiente de NaOH y HCl. Los análisis de HPLC de fase inversa de la suspensión indicaron que contenían 35 mg/ml del IGF-I.

Los tampones de replegamiento se prepararon en tubos de cultivo de 15 ml de poliestireno mediante adición de las cantidades adecuadas de las siguientes soluciones madre: glicina 1M (pH 10,5) y CuCl_{2} 25 \muM, urea 9M, etanol al 100%, Na_{2}SO_{4} 1,8 M, PEG-3350 al 20% (p/p) y PEG-8000 al 20% (p/p). Cada tubo recibió 0,1 ml de la solución tampón madre 50X que contenía glicina y CuCl_{2}. Otras soluciones madre se añadieron para alcanzar la concentración indicada a un volumen final de 5 ml. Cada tubo que contenía los componentes tampón de replegamiento se llevó a un volumen final de 4 ml.

El replegamiento del IGF-I se inició mediante dilución de 1 ml de la suspensión de IGF-I reducido en los tampones de replegamiento preparados anteriormente, proporcionando una concentración inicial de IGF-I de 7 mg/ml. Los tubos se taparon y se agitaron horizontalmente en un agitador orbital. Cada tubo contenía 5 ml de líquido y 10 ml de aire. El replegamiento se dejó que tuviera lugar durante tres horas, después de lo cual se recolectaron las muestras, se diluyeron por un factor de 10 en un tampón acídico con glicina 20 mM (pH 3), urea 2 M se analizaron mediante HPLC de fase inversa para determinar el contenido de IGF-I plegado correctamente.

El objetivo de este ejemplo es mostrar el efecto de los componentes formadores de fases acuosas sobre el rendimiento del IGF-I plegado correctamente obtenido durante el replegamiento. Los componentes de fases específicas investigados fueron el Na_{2}SO_{4}, PEG-3350, PEG-8000 y el etanol. Las concentraciones examinadas fueron consistentes con aquellas que podían producirse mediante dilución de una fase acuosa aislada mediante un factor de 10 a 15.

Los resultados que se muestran en la Tabla III, indican que el rendimiento del IGF-I plegado correctamente aumenta mediante replegamiento del IGF-I en presencia de componentes formadores de fases, etanol y Na_{2}SO_{4}.El rendimiento del IGF-I no se vio afectado por la presencia de los componentes formadores de fases PEG-3350 o PEG-8000.

TABLA III

4

Ejemplo VIII

Se preparó el IGF-I no nativo utilizando los procedimientos de fermentación, solubilización in situ, extracción bifásica acuosa y precipitación por neutralización descritos en el Ejemplo I, apartados A-G.

Una suspensión que contenga el IGF-I reducido se preparó a partir del IGF-I sedimentado obtenido mediante precipitación por neutralización. Para producir esta suspensión, se resuspendieron 10 g de sedimento húmedo que contenía IGF-I en 45 ml de una solución que contenía glicina 20 mM (pH 10,5), urea 2M y DTT 10 mM. El pH de la suspensión resultante se ajustó a pH 10,5 mediante adición de NaOH. El análisis de HPLC de fase inversa de la suspensión de pH ajustado indicó que contenía 15 mg/ml de IGF-I. La suspensión de pH ajustado se salpicó con una solución de DTT concentrada para obtener una concentración de DTT final de 15 mM. La suspensión de IGF-I reducida resultante contenía 15 mg/ml de IGF-I, glicina 20 mM (pH 10,5), urea 2M y DTT 15 mM.

Los tampones de replegamiento se prepararon en tubos de cultivo de poliestireno de 15 ml mediante adición de cantidades adecuadas de varias soluciones madre y reactivos químicos secos. Cada tubo recibió 0,1 ml de una solución madre de tampón 50X que contenía glicina 1 M (pH 10,5) y CuCl_{2} 25 \muM. Se añadieron cantidades adecuadas de otros reactivos químicos hasta alcanzar la concentración indicada a un volumen final de 5 ml. El etanol y el glicerol se añadieron como líquidos. La urea, el NaCl y el Na_{2}SO_{4} se añadieron en forma seca. Cada tubo que contenía los componentes del tampón de replegamiento se llevaron a un volumen final de 4,7 ó 3,7 ml, dependiendo de si el replegamiento se debía llevar a cabo a 1 ó 4 mg/ml de IGF-I, respectivamente.

El replegamiento del IGF-I se inició diluyendo 0,3 a 1,3 ml de la suspensión de IGF-I reducida, para el replegamiento a 1 ó 4 mg/ml de IGF-I, respectivamente, en tampones de replegamiento preparados con anterioridad. Los tubos se cerraron y se agitaron horizontalmente en un agitador orbital. Cada tubo contenía 5 ml de líquido y 10 ml de aire. El replegamiento se dejó que sucediera durante 8 horas, después de lo cual se recolectaron las muestras, se acidificaron y se analizaron mediante HPLC de fase inversa para determinar el contenido del IGF-I plegado correctamente.

Se investigaron los aspectos siguientes de la composición del tampón de replegamiento: tipo y concentración de sal (NaCl 0,05M, 1,0 M; o Na_{2}SO_{4} 0,6 M); la concentración del solvente (0, 10, 20% de etanol v/v), la concentración del osmolito (0, 20, 30% de glicerol v/v) y la concentración inicial de IGF-I (1,4 mg/ml). Los rendimientos obtenidos con las combinaciones seleccionadas de estos componentes se muestran en la Tabla IV. La inspección muestra que el mayor rendimiento del IGF-I plegado correctamente se obtuvo mediante replegamiento en las condiciones siguientes: 1 mg/ml de IGF-I, glicina 20 mM (pH 10,5), urea 2 M, NaCl 1 M, etanol al 20% (v/v) y CuCl_{2} 0,5 \muM
(muestra #0).

El experimento descrito en este ejemplo se diseñó para permitir el análisis estadístico multifactorial del IGF-I plegado correctamente produjera resultados 5 con el fin de valorar la importancia de todos los factores independientemente y de todas las interacciones de dos factores. Los resultados de este análisis estadístico se muestran en las Tablas V y VI. La inspección de estos resultados muestra que, en las condiciones experimentales utilizadas, las siguientes tendencias fueron evidentes: (1) se obtuvieron los mejores rendimientos mediante replegamiento a una concentración baja de IGF-I; (2) la inclusión de sal a una concentración de aproximadamente 1 M mejora el replegamiento y especialmente en presencia de etanol; (3) el NaCl es una sal más preferida que el Na_{2}SO_{4}; (4) se obtuvo un rendimiento mejor con el replegamiento con urea 2-3 M en relación con una concentración menor de urea, aunque la diferencia fue menor en presencia de etanol; (5) se obtuvo un mejor rendimiento en presencia de etanol al 20% (v/v) en relación con la ausencia de solvente; y (6) la inclusión de glicerol mejora el rendimiento pero su ventaja se redujo en presencia de etanol.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA IV

5

6

TABLA V

7

8

TABLA VI

9

Ejemplo IX

Se preparó una solución madre de IGF-I reducido a partir del IGF-I plegado correctamente y altamente purificado. Se colocó una solución de IGF-I 1 mg/ml, glicina 20 mM (pH 10,5), citrato 2 mM, NaCl 0,1 M y urea 2M en un vial tapado y se inyectó gas argón en la parte superior durante aproximadamente una hora con turbulencia ocasional. Después de oxigenar la solución, se añadió DTT mediante una jeringa a partir de una solución madre a 117 mM a una concentración final de 1,17 mM. Después de la adición de DTT, la solución se incubó durante dos horas con inyección continua de argón en la parte superior.

Las soluciones de replegamiento se prepararon a partir de una solución tampón común que contenía glicina 20 mM (pH 10,5), NaCl 0,1 M y urea 2 M. Esta solución madre tampón se dispensó en viales y se añadió separadamente CuCl_{2}, NiCl_{2}, ZnCl_{2}, CoCl_{2}, MnCl_{2} y FeCl_{3} a partir de soluciones madre a 1,3 mM. Los viales que contenían las soluciones resultantes se cerraron con tapones, inyectándose continuamente argón u oxígeno humidificados.

Para iniciar una reacción de replegamiento, se diluyó rápidamente una alícuota de una solución madre de IGF-I por un factor de 10 en una solución de replegamiento. La solución madre de IGF-I reducida se transfirió mediante una jeringa para iniciar el replegamiento. Las reacciones de control del replegamiento (carentes de sales de metal de transición) y de análisis del replegamiento se llevaron a cabo simultáneamente y compartieron una fuente común de gas.

Al cabo de 18 minutos de oxidación, se recogieron muestras con jeringa y se añadieron rápidamente a microviales con un septo de separación en donde se hallaba una pequeña cantidad de HCl 6 N. La magnitud del replegamiento del IGF-I se determinó mediante el análisis de las muestras por HPLC de fase inversa.

Tal como se muestra en la Tabla VII, la exposición de IGF-I reducido a oxígeno en presencia de CuCl_{2} o MnCl_{2} condujo tanto a la oxidación del IGF-I reducido como a la formación de IGF-I plegado correctamente. La presencia de CoCl_{2} condujo a la oxidación del IGF-I reducido, pero a la formación de menos IGF-I plegado correctamente. Tanto el NiCl_{2} como el FeCl_{3} dieron como resultado una menor oxidación de IGF-I reducido y a la formación de IGF-I plegado correctamente. La respuesta a ZnCl2 no fue distinta a la de los oligoelementos.

TABLA VII

10

Ejemplo X

Se preparó una solución madre de IGF-I a partir de IGF-I plegado correctamente y altamente purificado tal como se describe en el Ejemplo IX.

Las soluciones de replegamiento se prepararon a partir de una solución madre de tampón corriente que contenía glicina 20 mM (pH 10,5), NaCl 0,1 M y urea 2 M. Este tampón madre se dispensó en viales y se añadió CuCl_{2} separadamente para obtener soluciones madres a 1,3, 0,13, 0,013 y 0,0013 mM obtenidas previamente mediante dilución seriada. Después de añadir el CuCl_{2}, los viales se cerraron con tapones y se inyectó de forma continuada argón u oxígeno humidificados.

Para iniciar la reacción de replegamiento, se diluyó rápidamente una alícuota de una solución madre de IGF-I reducido por un factor de diez en una solución de replegamiento. La solución madre de IGF-I reducido se transfirió mediante una jeringa para iniciar el proceso de replegamiento. Se llevaron a cabo reacciones control del replegamiento (sin CuCl_{2}) y de análisis del replegamiento simultáneamente, compartiendo una fuente de gas común.

La muestras de las reacciones de replegamiento se obtuvieron con una jeringa a intervalos predeterminados y se añadió rápidamente a los viales divididos con un septo en donde se hallaba una pequeña cantidad de HCl 6 N. Este tratamiento disminuye el pH de la muestra a pH 3 y para de forma eficaz la reacción de replegamiento. Se paró la reacción de las muestras y se recogieron éstas a los siguientes intervalos de tiempo después del inicio del replegamiento: 0, 2, 4, 6, 10, 20, 40, 0, 100 y 200 minutos. La magnitud del replegamiento del IGF-I se determinó con el tiempo analizando las muestras a diversos tiempos mediante HPLC de fase inversa.

Se investigaron las siguientes concentraciones de CuCl_{2}: trazas, 0,013 \muM, 0,052 \muM, 0,13 \muM, 0,52 \muM, 1,3 \muM y 13 \muM de CuCl_{2}. En la Figura 12, se muestra un trazado de la evolución del IGF-I plegado correctamente durante la catálisis de oxidación aeróbica a dichas concentraciones de CuCl_{2}.

Los resultados muestran que durante la catálisis de oxidación aeróbica, una concentración baja de CuCl_{2} (entre 0,05 \muM y 15 \muM, preferentemente entre 0,05 y 0,5 \muM) proporciona un mayor rendimiento del polipéptido plegado correctamente que concentraciones superiores (mayores de 15 \muM) y proporciona cinéticas de oxidación más rápidas y reproducibles que la catálisis de oligoelementos.

Los resultados mostrados en la Figura 12 se obtuvieron mediante replegamiento de IGF-I en soluciones carentes de un solvente alcohólico o aprótico polar. Los experimentos adicionales mostraron que la inclusión de alcohol en el tampón de replegamiento no influencia la dependencia de las cinéticas de replegamiento del IGF-I ni del rendimiento con una concentración CuCl_{2}, y por lo tanto no se espera que alteren la dependencia de la concentración de otros metales de transición. Los experimentos también demostraron que la inclusión de EDTA (proporción molar 1:1 respecto al CuCl_{2}), o la fenantrolina (proporción molar 3:1 respecto al CuCl_{2}) en soluciones de replegamiento con CuCl_{2} 1,3 \muM no afecta las cinéticas de oxidación aeróbica del IGF-I catalizada con CuCl_{2}.

Ejemplo XI Fermentación

La construcción del plásmido de expresión phGH4R utilizado para la expresión y secreción de hGH se detalla en Chang y col., Gene, 55:189-196 (1987).

La cepa 40G3 de E. coli es un derivado de E. coli W3110. El genotipo completo de 40G3 es tonA\Delta phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac) 169 deoC \DeltaompT degP41 (\DeltaPstI-Kan^{r}) ilvG2096^{R} phn(EcoB). La cepa 40G3 puede derivarse de la cepa E. coliW3110 16C9, que tiene el genotipo tonA\Delta phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC. La deleción ompT se introdujo mediante cotransducción con P1 con una inserción Tn10 unida en el gen purE. Esta cepa se transdujo a prototrofía de purina al eliminar el transposón. La mutación degP41(\DeltaPst-Kanr) se introdujo mediante selección para resistencia a kanamicina. El gen ilvG2096R se introdujo reparando un auxótrofo de isoleucina/valina a prototrofía utilizando la transducción con P1. Por último, el operón phn(EcoB) se introdujo en el huésped mediante transducción con P1 de los genes phn de E. coli.

Las células competentes de E. coli 40G3 se transformaron con phGH4R mediante técnicas de transformación estándares. Los transformantes se seleccionaron y purificaron en placas de LB que contenían tetraciclina a 20 mg/ml. Este medio tenía la composición siguiente: 10 g/l de Bacto-triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de cloruro sódico y 20 mg/l de tetraciclina-HCl.

Se preparó un inóculo en un fermentador de 10 L inoculando en primer lugar un frasco de dos litros que contenía aproximadamente 500 ml de medio LB estéril que contenía 5 mg/l de tetraciclina con 0,5 ml de cultivo madre recién descongelado. Este frasco se cultivó a 35-39ºC durante 8 horas y se transfirió a un fermentador de 10 litros que contenía el medio de producción en las cantidades que se describen a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

11

El cultivo de 10 litros se incubó a 35-39ºC a pH 7,2-7,4 durante 42-48 horas. La velocidad de agitación se ajustó a 650-1000 rpm y la velocidad de aireación a 0,7-1,5 volúmenes de aire por volumen de cultivo por minuto.

El cultivo de 10 l se creció con adición continua de glucosa durante la fermentación. La producción de hGH tuvo lugar después de que disminuir el fosfato del medio.

Solubilización y extracción acuosa de la hormona de crecimiento humano

La hGH del caldo de fermentación anterior se solubilizó añadiendo 240 g de urea, 20 ml de glicina 1 M (pH 10) y 10 ml de ditiotreitol 1 M (DTT) a 1 l del caldo de fermentación contenido en una botella de 2l. El pH de la mezcla resultante se ajustó a pH 10 añadiendo NaOH 1 N. Durante la incubación, la mezcla se agitó continuamente con un motor sumergido conducido por un impulsor y la parte superior se inyectó con nitrógeno. Al cabo de 2 horas de incubación, se recogió una alícuota, se centrifugó para sedimentar los sólidos y se analizó el sobrenadante para conocer su contenido en hGH. El análisis de HPLC inversa mostró que el 31% de la hGH total se hallaba en el sobrenadante de la centrifugación.

La hGH se extrajo a continuación añadiendo 308 g de PEG-8000 y 103 g de Na_{2}SO_{4} para solubilizar la mezcla. El sistema de fases resultante se incubó con mezclado continuo y adición de nitrógeno durante una hora adicional. La inspección de una alícuota centrifugada de 14,5 ml del sistema de fases mostró que contenía 11,2 ml de fase ligera clara y 3,3 ml de fase pesada conteniendo los sólidos. Después de la incubación, el sistema de fases se dividió entre dos botellas de 1 l y se centrifugó para separar las fases. La decantación de las fases separadas produjo como resultado 1,2 l de fase ligera clara. El análisis de HPLC de fase inversa mostró que la fase ligera contenía el 82% de la hGH del sobrenadante de la solubilización.

La hGH se precipitó a partir de la fase ligera aislada ajustando el pH a 4. Se colocó una alícuota de la suspensión precipitada en un tubo con tapón de 15 ml y se centrifugó para clarificar la alícuota. Después de la centrifugación, el sobrenadante claro se decantó en un nuevo tubo y el sedimento se resuspendió con 2,5 ml de guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 50 mM (pH 9), DTT 0,1 M. El análisis de HPLC de fase inversa mostró que el sedimento resuspendido contenía el 92% de la hGH contenida originalmente en la fase ligera, mientras que el sobrenadante contenía menos de un 1%.

Replegamiento de la hormona de crecimiento humana

La fase ligera que contiene la hGH nativa se preparó utilizando los procedimientos de solubilización y extracción acuosa descritos anteriormente. Los tampones de replegamiento se prepararon en tubos de cultivo de poliestireno de 15 ml mediante adición de cantidades adecuadas de los siguientes reactivos químicos secos: urea, guanidina-HCl, NaCl, Na_{2}SO_{4} y etanol de grado reactivo. Cada tubo recibió 0,1 ml de una solución madre de tampón 50X que contenía Tris-HCl 1 M (pH 8,0), CuCl_{2} 25 \muM o glicina 1 M (pH 10), CuCl_{2} 25 \muM. Se añadieron otros reactivos químicos para obtener la concentración indicada a un volumen final de 5 ml. Cada tubo que contenía los componentes del tampón de replegamiento se llevó a un volumen final de 4,5 ml con agua purificada.

El replegamiento de la hGH se inició diluyendo 0,5 ml de la fase ligera que contenía la hGH reducida en los tampones de replegamiento preparados con antelación lo que proporcionó una concentración inicial de hGH de aproximadamente 0,05 mg/ml. Los tubos se cerraron con tapones y se agitaron horizontalmente en un orbital. Cada tubo contenía 5 ml de líquido y 10 ml de aire. Se dejó que el replegamiento tuviera lugar durante 12 horas, después de lo cual se recogieron las muestras, se diluyeron por un factor de 2 en un tampón acidificado que contenía ácido acético 50 mM (pH 3), NaCl 50 mM y se analizaron por HPLC de fase inversa para determinar el contenido de la hGH plegada correctamente.

El objetivo de este experimento es mostrar el efecto de la composición del tampón de replegamiento sobre el rendimiento de la hGH plegada correctamente y obtenida durante el replegamiento. Se investigaron los siguientes aspectos de la composición del tampón de replegamiento: tipo y concentración de sal (0,2 M Na_{2}SO_{4}, NaCl 0,5 M), tipo y concentración del caotropo (urea 0,5, 4 M; o guanidina-HCl 0,5, 2 M), concentración del solvente (0,10% [v/v] etanol) y tipo de tampón y pH (Tris-HCl pH 8, glicina pH 10). Los rendimientos obtenidos con las combinaciones de estos componentes se muestran en la Tabla VIII. La inspección muestra que los mayores rendimientos de la hGH plegada correctamente se obtuvieron mediante replegamiento en las condiciones siguientes: glicina 20 mM (pH 10), guanidina 0,5 M, NaCl 0,5 M, etanol al 10% (v/v) y CuCl_{2} 0,5 \muM (muestra #5).

TABLA VIII

12

El experimento descrito en este ejemplo se diseñó para permitir el análisis estadístico multifactorial de los resultados del rendimiento de hGH plegada correctamente con el fin de valorar la importancia de todos los factores independientemente. Los resultados de este análisis estadístico se muestran en la Tabla IX.

TABLA IX

13

Los resultados anteriores muestran que la hGH recombinante se puede solubilizar y excretar de las células añadiendo caotropo y reductor al caldo de fermentación (rendimiento de aproximadamente el 30% de promedio). Se pueden obtener promedios superiores durante la solubilización si las células se lisan antes de la adición de agentes de solubilización (aproximadamente una mejora del 50% de rendimiento). Otras pequeñas diferencias durante la solubilización incluyen un rendimiento superior con guanidina que con urea (aproximadamente una mejora del 10% del rendimiento) y rendimientos superiores con una concentración de caotropo moderada que con una concentración de caotropo baja (aproximadamente una mejora del rendimiento del 20% utilizando una concentración de 4 M en lugar de una 2 M).

El procedimiento de extracción acuosa fue prácticamente el mismo durante la separación de la hGH no-nativa a partir de la biomasa que durante la separación del IGF-I no-nativo a partir de biomasa. La única diferencia a remarcar implica una pequeña preferencia para una concentración del caotropo superior durante la extracción (aproximadamente una mejora del rendimiento del 5% utilizando urea 4 M en lugar de 2 M). La inclusión de una concentración de caotropo superior durante la extracción no afecta significativamente la concentración del polímero y de sal requerida en un sistema de dos fases en el que la fase ligera se enriquece en un polipéptido no-nativo deseado y los sólidos de biomasa sedimentan en la fase pesada. De igual manera, la lisis mecánica de células antes de la solubilización no afecta la realización de la extracción acuosa.

Considerando estas diferencias en conjunto, se indica que la proteína hGH prefiere condiciones caotrópicas más fuertemente desnaturalizantes para su solubilización y se secreta menos fácilmente a partir de células permeabilizadas que la proteína más pequeña IGF-I.

En conclusión, los resultados descritos anteriormente para hGH muestran claramente que el procedimiento reivindicado es aplicable al aislamiento de la hGH no-nativa, así como también al IGF-I. El IGF-I y la hGH son esencialmente proteínas distintas ya que difieren esencialmente en muchas de sus propiedades. Específicamente, tienen secuencias aminoacídicas distintas, pesos moleculares distintos, número y patrones de enlaces disulfuros distintos y puntos isoeléctricos distintos. A pesar de estas diferencias, el IGF-I y la hGH presentan un comportamiento distinto durante la separación extractiva de sólidos de biomasa por el procedimiento de la presente invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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Genentech, Inc.

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Builder, Stuart

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Hart Roger

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Lester, Phillip

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Reifsnyder, David

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Replegamiento de polipéptidos

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS:9

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(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA

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(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

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(B)

CALLE: 460, Point San Bruno Blvd

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO INFORMÁTICO:

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(A)

TIPO MEDIO: 5,25 pulgadas, 360 Kb disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

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(vi)

RESULTADOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE SOLICITUD:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/110664

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(B)

FECHA DE SOLICITUD: 20-agosto-1993

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(viii)

ABOGADO/ DEL INFORMACIÓN AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Hasak, Janet E.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 28.616

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: 804p1pct

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 415/225-1896

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415/952-9881

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(C)

TÉLEX: 910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 485 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:

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14

15

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 30 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:

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\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGCCGGT CCGGAAACTC TGTGCGGCGC

\hfill

30

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 22 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCAGGCC TTTGAGACAC GC

\hfill

22

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 51 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGCCGGT CCCGAAACTC TGTGCGGTGC TGAACTGGTT GACGCTCTGC

\hfill

50

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 43 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCAGGGC TTTGAGACAC GCCACGACTT GACCAACTGC GAG

\hfill

43

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGCCTCC CCATATTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAGGGGTA TAAGGAGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 67 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:

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TCGTCGTGCT CCCCAGACTG GTATTGTTGA GGAATGCTGC TTTCGTTCTT

\hfill

50

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GCGACCTGCG TCGTCTG

\hfill

67

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 70 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:

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AGAACGCTGG ACGCAGCAGA CCTTTACATA ACGCGAGGGG ACTTTGGGCG

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50

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\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTAGACGA ATCTTCGAGG

\hfill

70

Claims (16)

1. Composición que comprende aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml de un polipéptido plegado incorrectamente, seleccionado a partir del grupo que consiste en: el IGF-I, la hormona de crecimiento y una neurotropina en un tampón de pH 7-12 que comprende aproximadamente el 5-40% (v/v) de un solvente alcohólico o aprótico polar, una concentración de 0,2 a 3 M de una sal de metal alcalino, de metal alcalino térreo o una sal amónica, una concentración de 0,1 a 9 M de un agente caotrópico y una concentración de 0,01 a 15 \muM de una sal de cobre o manganeso.

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración del solvente es aproximadamente del 10-30% (v/v) y/o la concentración del polipéptido es aproximadamente de 0,1 a 6 mg/ml y/o la concentración de la sal de metal alcalino, alcalino-térreo o amónica es aproximadamente de 0,2 a 2 M y/o la concentración del agente caotrópico es aproximadamente de 0,5 a 6 M y/o la concentración de sal de cobre o manganeso es aproximadamente de 0,01 a 5 \muM o aproximadamente de 0,01 a 0,5 \muM.

3. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 o la 2, en donde el solvente es metanol, etanol, isopropanol,n-propanol; t-butanol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, dioxano, glicerol, acetonitrilo o propilén glicol.

4. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente caotrópico es la urea.

5. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sal de metal alcalino, alcalino-térreo o amónica es una sal de sodio, potasio o amoníaco a aproximadamente 0,5 a 2 M, o una sal de magnesio a 0,2 a 1 M.

6. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sal de cobre o manganeso es un cloruro o un sulfato.

7. Composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la sal de cobre está presente en una concentración de aproximadamente 0,5 \muM.

8. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón también comprende un osmolito y un agente reductor.

9. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón es glicina, CAPS, o CAPSO.

10. Composición de acuerdo con la reivindicación 8 o la 9, en donde el agente reductor es la cisteína o el ditiotreitol en una concentración de aproximadamente 1-5 mM.

11. Procedimiento para aumentar el rendimiento de un replegamiento correcto de un polipéptido plegado incorrectamente, seleccionado a partir del grupo que consiste en: el IGF-I, la hormona de crecimiento humana y una neurotropina contenida en las células huéspedes; comprendiendo dicho procedimiento la etapa de contacto de dicho polipéptido plegado incorrectamente con un tampón y en donde durante dicho proceso el mencionado polipéptido plegado incorrectamente se desnaturaliza y pliega de nuevo en su conformación activa biológicamente, y en donde dicho polipéptido se halla a una concentración de aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml del tampón y dicho tampón tiene un pH de 7-12 y comprende aproximadamente un 5-40% (v/v) de un solvente alcohólico o aprótico polar, aproximadamente 0,2 a 3 M de una sal de metal alcalino, alcalino-térreo o amónica, aproximadamente 0,1 a 9 M de un agente caotrópico a y aproximadamente de 0,01 a 15 \muM de una sal de cobre o manganeso.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la sal de metal alcalino, alcalino-térreo o amoniacal es aproximadamente una sal de sodio, potasio o amónica 0,5-2 M, o una sal de magnesio 0,2-1 M.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en donde el tampón comprende además un agente reductor y un osmolito.

14. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la sal de cobre es el cloruro cúprico.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en donde el tampón es CAPSO o glicina tiene un pH de aproximadamente 8 a 11, el agente caotrópico es urea a una concentración de aproximadamente 1-3 M, la sal es el cloruro sódico, el solvente es etanol o isopropanol a una concentración de aproximadamente el 20% (v/v), el polipéptido es el IGF-I, el agente reductor es el ditiotreitol o la cisteína y el osmolito es la sacarosa o el glicerol.

16. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 15, en donde se aíslan a partir de células eucariotas el IGF-I, la hormona de crecimiento humana o una neurotropina.