JP2005502710A - ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、リジン、リン酸、および非イオン性界面活性剤を含有するアルギニン非含有無水製剤であって、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、リジン、リン酸、および非イオン性界面活性剤は、それぞれ10〜60mg、100〜700mg、20〜100mg、および0.2〜5mgの量;または同様の相対比の量である、アルギニン非含有無水製剤に関する。
Description
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、その内容が参照によりここに組み込まれる、2001年9月7日に出願された、米国仮出願第60/318,173号の優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
背景
プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼであり、プラスミンは、一方で、重要臓器への血液の流れを妨げる血栓を血管中で分解する。Collen,D.(1980)Thromb.Haemost.43:77−89。よって、プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンの活性化を介した局所的な線維素溶解活性を発現することが必要とされる病気を予防し、または治療するために用いられうる。このような病気としては、卒中症、静脈血栓症、肺塞栓症、または、深部静脈および末梢動脈閉塞症が挙げられる。Bang,N.U.(1989)Circulation 79:1391−1392を参照。
【発明の開示】
【0003】
要約
一態様において、本発明は、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子;リジン;リン酸;および非イオン性界面活性剤を含有するアルギニン非含有無水製剤に関する。前記製剤において、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、リジン、リン酸、および非イオン性界面活性剤は、それぞれ10〜60mg(例えば、15〜50mgもしくは30〜40mg)、100〜700mg(例えば、150〜500mgもしくは200〜350mg)、20〜100mg(例えば、30〜80mgもしくは40〜60mg)、および0.2〜5mg(例えば、0.3〜3mgもしくは0.4〜0.8mg)の量;または同様の相対比の量である。本発明の製剤の一つは、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、リジン、リン酸、および非イオン性界面活性剤を、それぞれ35mg、200mg、50mg、および0.5mgの量で;または同様の相対比の量で含有する。前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート20またはポリソルベート80であってもよい。
【0004】
他の態様において、本発明は、5〜20質量%(例えば、8〜16質量%もしくは10〜14質量%)のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、および55〜85質量%(例えば、60〜80質量%もしくは65〜75質量%)のリジンを含有するアルギニン非含有無水製剤に関する。前記製剤は、15〜20質量%のリン酸、および0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有してもよい。
【0005】
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子とヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子とのハイブリッドタンパク質である。前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、組換え細胞培養系により製造されうる。このようなハイブリッドタンパク質のアミノ酸配列は、米国特許第4,997,766号、米国特許第4,916,071号、米国特許第5,045,315号、および米国特許第5,047,241号に開示されている。「ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子」の語は、少なくとも80%(例えば、90%、95%、または99%)の百分率相同性(percent identity)を有し、実質的に同一(±10%)の線維素溶解活性を示す、開示されているハイブリッドタンパク質の均等物を含む。2つのアミノ酸配列の「百分率相同性」は、Karlin and Altschul(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)において修正された、Karlin and Altschul(1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268)のアルゴリズムを用いることにより決定されうる。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.(1990,J.Mol.Biol.215:403−410)のNBLASTおよびXBLASTプログラム中に組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行われる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行われる。2つの配列間にギャップが存在する場合には、Altschul et al.(1997,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)に記載されているギャップ(Gapped)BLASTが用いられる。BLASTおよびギャップBLASTプログラムを用いる場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(例えば、XBLASTおよびNBLAST)が用いられる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照。
【0006】
ここで用いられる「リジン」の語は、リジンのD−型またはL−型のいずれかを意味する。電気的中性を維持するために、本発明の製剤中のリジンはリン酸由来のリン酸塩(すなわち、対イオン)とバランスを保っている。他の適切な対イオン(例えば、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、または炭酸塩)も用いられうる。
【0007】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【0008】
詳細な説明
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、ヒトにみられる2つの型のプラスミノーゲン活性化因子であるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子とヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子とのハイブリッドタンパク質である。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子およびヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子のDNA配列およびアミノ酸配列については、Pennica et al.(1983)Nature 301:214;Ny et al.(1984)proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5355;およびVerde et al.(1984)proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4727を参照。両方のプラスミノーゲン活性化因子が、フィブリンに結合し、血栓の部位において作用する。このハイブリッドタンパク質はまた、線維素溶解活性が高く、かつ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子またはヒトウロキナーゼプラスミノーゲンのいずれかと比較して、安定性が向上し、フィブリンに対する結合親和性が向上し、インビボにおける半減期が改善されるという利点を示す。米国特許第4,997,766号、米国特許第4,916,071号、米国特許第5,045,315号、および米国特許第5,047,241号を参照。本発明の製剤は、アルギニンを含有せず、予期せぬことに、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のこれらの特性を保持している。
【0009】
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、本技術分野において周知の手法により調製されうる。より詳細には、米国特許第4,997,766号、米国特許第4,916,071号、米国特許第5,045,315号、および米国特許第5,047,241号に記載のような組換えDNA技術を用いることによって、培養され形質転換された細胞株から得られる。次いで、前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、カラムクロマトグラフィまたは他の技術により精製されうる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィ分析、または線維素溶解活性の分析により容易に測定されうる。
【0010】
本発明の製剤は、緩衝液交換法(例えば、ゲル濾過または透析)において前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を用い、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子含有溶液を凍結乾燥させることによって調製されうる。前記緩衝液交換法において用いられうる緩衝液(すなわち、製剤緩衝液)は、0.1〜0.7Mのリジン(例えば、0.15〜0.5M、または0.2〜0.35M)を含有する。前記緩衝液のpHは、6.5〜7.5である。さらに、前記緩衝液は、ポリソルベート20またはポリソルベート80のような1以上の非イオン性界面活性剤を、0.001%〜1%の量で含有する。緩衝液交換、例えば透析、の後、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子含有溶液はガラスバイアルに移され、凍結乾燥されて貯蔵の形態とされうる。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子含有溶液の凍結乾燥、すなわちフリーズ−ドライは、当業者に周知の手法および装置を用いて行われうる。
【0011】
本発明を実施するために用いられるヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の線維素溶解活性は、30,000〜38,000IU/mgであり、例えば36,000IU/mgである。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の線維素溶解活性は、例えば、米国特許第4,777,043号に記載の方法により決定されうる。本発明の無水製剤は、薬学的に有効量のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する。薬学的な有効量とは、10〜60mgのような、治療される患者に対して治療効果を示す、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の量を意味する。また、当業者により認識されるように、賦形剤の使用、投与経路、および他の治療上の処置との併用の可能性に依存して、有効量は変動する。
【0012】
本発明の無水製剤は、従来の方法を用いて患者に投与されうる。投与は、種々の注射または輸液技術による非経口経路を介したものであってもよい。いずれにせよ、無水製剤は、適切な水性溶媒、例えば注射水、に溶解する。無水製剤中の全ての成分を溶解させるためには、適切な容積の水性溶媒(例えば、5mLまたは10mLの注射水)が必要である。適切な剤形を調製する一例として、35mgのヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、200mgのリジン、50mgのリン酸、および0.5mgのポリソルベート80を含有するバイアルに10mLの注射水が添加され、これによりヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する溶液が復元される。好ましくは、無水製剤は、10mLの注射水を用いて復元された直後に単回静脈内ボーラス投与のために用いられる。
【0013】
さらに詳述しなくとも、上記の説明により本発明は充分に実施可能と考えられる。したがって、下記の具体的な実施態様は単に例示のためのものであり、開示の残りを何ら制限するものではないと解釈されるべきである。ここに引用された全ての文献は、特許も含めて、その全体がここに参照により組み込まれる。
【実施例】
【0014】
無水製剤の調製
例えば米国特許第4,916,071号に記載のように、ハイブリッドヒト組織型ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子を産生する、形質転換C127細胞株を得た。細胞は、胎児ウシ血清(10%)、グルタミン(4mM)、およびゲンタマイシン(50μg/mL)が添加された、DMEM:F12(1:1)増殖培地(GIBCO/BRL)中で維持した。細胞培養液を、加湿された37℃の5%CO2インキュベータ中で1日間インキュベートした。次いで、細胞を回収し、10mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)緩衝液で洗浄した。細胞を分離させるために、トリプシン−EDTAを含有する4mLの溶液を添加し、細胞を5mLの前記増殖培地に移した。得られた細胞培養液を、0.5rpmの回転速度のローラードラム上で、37℃でインキュベートした。2日後、アプロチニン(10KIU/mL)を含有する新鮮なDMEM:F12(1:1)増殖培地で培養液を置換し、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する培養液を保存した。続けて、この置換を1日おきに繰り返した。馴化培地をプールし、3.0および0.22μmフィルターで順に濾過した。
【0015】
濾過された溶液を、亜鉛キレート化−セファロースカラム(ファルマシア,5.0cm×7.5cm)にアプライした。150mLのPBS/TW緩衝液(0.02Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.4)および600mLのPB緩衝液(0.02Mリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.4)を用いて洗浄した後、溶出緩衝液(0.02Mリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、0.05Mイミダゾール、0.01%ポリソルベート80、pH7.4)を用いてカラムを溶出した。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する画分を回収し、プールした。プールされた画分を、L−リジンセファロースカラム(1.5cm×20cm)にアプライした。35mLのPB緩衝液および250mLの洗浄緩衝液(0.05M Tris−HCl、0.3M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.5)を用いて洗浄した後、別の溶出緩衝液(0.05M Tris−HCl、0.5M L−アルギニン、0.3M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.5)を用いてカラムを溶出した。緩衝液中の、精製されたヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を得た。上記の全ての工程は、5〜8℃で行った。
【0016】
緩衝液中の精製されたヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子0.5mLを、透析膜(スペクトラム)中にロードし、この透析膜を、0.5Lの製剤緩衝液(0.2Mリジン、0.1Mリン酸、0.01%ポリソルベート80、pH7.1)を含有する透析液タンクに入れた。4℃で18時間透析を行い、製剤緩衝液を1Lの新鮮な緩衝液に置換した後に18時間透析を続け、次いで、さらに1Lの新鮮な緩衝液を添加した後に16時間透析を続けた。前記透析膜から取り出すことにより、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する水溶液を得て、凍結乾燥し、無水製剤を調製した。
【0017】
ヒト組織ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子活性の測定
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子活性の測定は、スタンダードとしてヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(NIBSC組織より購入、組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト、組換えとラベル化。第3次国際標準98/714(labeled as tissue plasminogen activator,human,recombinant.Third International Standard 98/714))を用いた平板線維素溶解分析法により行った。スタンダードの力価は、国際共同研究(International Collaborative Study)により決定され、10,000IU/アンプルであることがわかっている。15μLのトロンビン溶液(0.5U/μL)を5mLのPBS緩衝液で希釈し、5mLのプラスミノーゲン含有(10U)PBS緩衝液と混合した。9mLの1%アリコートアガロースに、4.5mLの混合溶液、および4.5mLのフィブリノーゲン溶液を、48℃で添加した。こうして得られた混合液を撹拌し、90×90mm2プレートに注いだ。パンチを用いて冷えたプレートに3mmの穴を開け、ウェルを作製した。スタンダードのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のPBS緩衝液(0.1mg/mLウシ血清アルブミン、0.01%ポリソルベート80)による連続希釈法を用いた。上記で得られた製剤緩衝液中のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子サンプル、およびスタンダードのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の希釈液のサンプル10μLを、ウェル上にロードし、室温で20〜24時間インキュベートした。各サンプルについて、フィブリンの透明な領域の直径を測定した。スタンダードのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の希釈液について、領域の直径を希釈液の活性単位に対してプロットし、標準曲線を得た。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子については、領域の直径は、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子サンプルの活性を測定するために用いられた。
【0018】
他の実施態様
本明細書中に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書中に開示された各特徴は、同一の、均等な、または類似の目的を達成しうる他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明示されていない限り、開示された各特徴は、均等な、または類似の一般的なシリーズのほんの一例である。
【0019】
上記の詳細な説明によれば、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確定でき、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修飾を施して、各種の用途および条件に適用することが可能である。例えば、本発明を実施するために、同一の官能基およびpKaを有するリジンの代替物が用いられうる。よって、他の実施態様もまた、特許請求の範囲に含まれる。
【0001】
関連出願
本願は、その内容が参照によりここに組み込まれる、2001年9月7日に出願された、米国仮出願第60/318,173号の優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
背景
プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼであり、プラスミンは、一方で、重要臓器への血液の流れを妨げる血栓を血管中で分解する。Collen,D.(1980)Thromb.Haemost.43:77−89。よって、プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンの活性化を介した局所的な線維素溶解活性を発現することが必要とされる病気を予防し、または治療するために用いられうる。このような病気としては、卒中症、静脈血栓症、肺塞栓症、または、深部静脈および末梢動脈閉塞症が挙げられる。Bang,N.U.(1989)Circulation 79:1391−1392を参照。
【発明の開示】
【0003】
要約
一態様において、本発明は、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子;リジン;リン酸;および非イオン性界面活性剤を含有するアルギニン非含有無水製剤に関する。前記製剤において、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、リジン、リン酸、および非イオン性界面活性剤は、それぞれ10〜60mg(例えば、15〜50mgもしくは30〜40mg)、100〜700mg(例えば、150〜500mgもしくは200〜350mg)、20〜100mg(例えば、30〜80mgもしくは40〜60mg)、および0.2〜5mg(例えば、0.3〜3mgもしくは0.4〜0.8mg)の量;または同様の相対比の量である。本発明の製剤の一つは、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、リジン、リン酸、および非イオン性界面活性剤を、それぞれ35mg、200mg、50mg、および0.5mgの量で;または同様の相対比の量で含有する。前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート20またはポリソルベート80であってもよい。
【0004】
他の態様において、本発明は、5〜20質量%(例えば、8〜16質量%もしくは10〜14質量%)のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、および55〜85質量%(例えば、60〜80質量%もしくは65〜75質量%)のリジンを含有するアルギニン非含有無水製剤に関する。前記製剤は、15〜20質量%のリン酸、および0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有してもよい。
【0005】
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子とヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子とのハイブリッドタンパク質である。前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、組換え細胞培養系により製造されうる。このようなハイブリッドタンパク質のアミノ酸配列は、米国特許第4,997,766号、米国特許第4,916,071号、米国特許第5,045,315号、および米国特許第5,047,241号に開示されている。「ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子」の語は、少なくとも80%(例えば、90%、95%、または99%)の百分率相同性(percent identity)を有し、実質的に同一(±10%)の線維素溶解活性を示す、開示されているハイブリッドタンパク質の均等物を含む。2つのアミノ酸配列の「百分率相同性」は、Karlin and Altschul(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)において修正された、Karlin and Altschul(1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268)のアルゴリズムを用いることにより決定されうる。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.(1990,J.Mol.Biol.215:403−410)のNBLASTおよびXBLASTプログラム中に組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行われる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行われる。2つの配列間にギャップが存在する場合には、Altschul et al.(1997,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)に記載されているギャップ(Gapped)BLASTが用いられる。BLASTおよびギャップBLASTプログラムを用いる場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(例えば、XBLASTおよびNBLAST)が用いられる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照。
【0006】
ここで用いられる「リジン」の語は、リジンのD−型またはL−型のいずれかを意味する。電気的中性を維持するために、本発明の製剤中のリジンはリン酸由来のリン酸塩(すなわち、対イオン)とバランスを保っている。他の適切な対イオン(例えば、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、または炭酸塩)も用いられうる。
【0007】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【0008】
詳細な説明
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、ヒトにみられる2つの型のプラスミノーゲン活性化因子であるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子とヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子とのハイブリッドタンパク質である。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子およびヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子のDNA配列およびアミノ酸配列については、Pennica et al.(1983)Nature 301:214;Ny et al.(1984)proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5355;およびVerde et al.(1984)proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4727を参照。両方のプラスミノーゲン活性化因子が、フィブリンに結合し、血栓の部位において作用する。このハイブリッドタンパク質はまた、線維素溶解活性が高く、かつ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子またはヒトウロキナーゼプラスミノーゲンのいずれかと比較して、安定性が向上し、フィブリンに対する結合親和性が向上し、インビボにおける半減期が改善されるという利点を示す。米国特許第4,997,766号、米国特許第4,916,071号、米国特許第5,045,315号、および米国特許第5,047,241号を参照。本発明の製剤は、アルギニンを含有せず、予期せぬことに、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のこれらの特性を保持している。
【0009】
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、本技術分野において周知の手法により調製されうる。より詳細には、米国特許第4,997,766号、米国特許第4,916,071号、米国特許第5,045,315号、および米国特許第5,047,241号に記載のような組換えDNA技術を用いることによって、培養され形質転換された細胞株から得られる。次いで、前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、カラムクロマトグラフィまたは他の技術により精製されうる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィ分析、または線維素溶解活性の分析により容易に測定されうる。
【0010】
本発明の製剤は、緩衝液交換法(例えば、ゲル濾過または透析)において前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を用い、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子含有溶液を凍結乾燥させることによって調製されうる。前記緩衝液交換法において用いられうる緩衝液(すなわち、製剤緩衝液)は、0.1〜0.7Mのリジン(例えば、0.15〜0.5M、または0.2〜0.35M)を含有する。前記緩衝液のpHは、6.5〜7.5である。さらに、前記緩衝液は、ポリソルベート20またはポリソルベート80のような1以上の非イオン性界面活性剤を、0.001%〜1%の量で含有する。緩衝液交換、例えば透析、の後、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子含有溶液はガラスバイアルに移され、凍結乾燥されて貯蔵の形態とされうる。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子含有溶液の凍結乾燥、すなわちフリーズ−ドライは、当業者に周知の手法および装置を用いて行われうる。
【0011】
本発明を実施するために用いられるヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の線維素溶解活性は、30,000〜38,000IU/mgであり、例えば36,000IU/mgである。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の線維素溶解活性は、例えば、米国特許第4,777,043号に記載の方法により決定されうる。本発明の無水製剤は、薬学的に有効量のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する。薬学的な有効量とは、10〜60mgのような、治療される患者に対して治療効果を示す、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の量を意味する。また、当業者により認識されるように、賦形剤の使用、投与経路、および他の治療上の処置との併用の可能性に依存して、有効量は変動する。
【0012】
本発明の無水製剤は、従来の方法を用いて患者に投与されうる。投与は、種々の注射または輸液技術による非経口経路を介したものであってもよい。いずれにせよ、無水製剤は、適切な水性溶媒、例えば注射水、に溶解する。無水製剤中の全ての成分を溶解させるためには、適切な容積の水性溶媒(例えば、5mLまたは10mLの注射水)が必要である。適切な剤形を調製する一例として、35mgのヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、200mgのリジン、50mgのリン酸、および0.5mgのポリソルベート80を含有するバイアルに10mLの注射水が添加され、これによりヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する溶液が復元される。好ましくは、無水製剤は、10mLの注射水を用いて復元された直後に単回静脈内ボーラス投与のために用いられる。
【0013】
さらに詳述しなくとも、上記の説明により本発明は充分に実施可能と考えられる。したがって、下記の具体的な実施態様は単に例示のためのものであり、開示の残りを何ら制限するものではないと解釈されるべきである。ここに引用された全ての文献は、特許も含めて、その全体がここに参照により組み込まれる。
【実施例】
【0014】
無水製剤の調製
例えば米国特許第4,916,071号に記載のように、ハイブリッドヒト組織型ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子を産生する、形質転換C127細胞株を得た。細胞は、胎児ウシ血清(10%)、グルタミン(4mM)、およびゲンタマイシン(50μg/mL)が添加された、DMEM:F12(1:1)増殖培地(GIBCO/BRL)中で維持した。細胞培養液を、加湿された37℃の5%CO2インキュベータ中で1日間インキュベートした。次いで、細胞を回収し、10mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)緩衝液で洗浄した。細胞を分離させるために、トリプシン−EDTAを含有する4mLの溶液を添加し、細胞を5mLの前記増殖培地に移した。得られた細胞培養液を、0.5rpmの回転速度のローラードラム上で、37℃でインキュベートした。2日後、アプロチニン(10KIU/mL)を含有する新鮮なDMEM:F12(1:1)増殖培地で培養液を置換し、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する培養液を保存した。続けて、この置換を1日おきに繰り返した。馴化培地をプールし、3.0および0.22μmフィルターで順に濾過した。
【0015】
濾過された溶液を、亜鉛キレート化−セファロースカラム(ファルマシア,5.0cm×7.5cm)にアプライした。150mLのPBS/TW緩衝液(0.02Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.4)および600mLのPB緩衝液(0.02Mリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.4)を用いて洗浄した後、溶出緩衝液(0.02Mリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、0.05Mイミダゾール、0.01%ポリソルベート80、pH7.4)を用いてカラムを溶出した。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する画分を回収し、プールした。プールされた画分を、L−リジンセファロースカラム(1.5cm×20cm)にアプライした。35mLのPB緩衝液および250mLの洗浄緩衝液(0.05M Tris−HCl、0.3M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.5)を用いて洗浄した後、別の溶出緩衝液(0.05M Tris−HCl、0.5M L−アルギニン、0.3M NaCl、0.01%ポリソルベート80、pH7.5)を用いてカラムを溶出した。緩衝液中の、精製されたヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を得た。上記の全ての工程は、5〜8℃で行った。
【0016】
緩衝液中の精製されたヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子0.5mLを、透析膜(スペクトラム)中にロードし、この透析膜を、0.5Lの製剤緩衝液(0.2Mリジン、0.1Mリン酸、0.01%ポリソルベート80、pH7.1)を含有する透析液タンクに入れた。4℃で18時間透析を行い、製剤緩衝液を1Lの新鮮な緩衝液に置換した後に18時間透析を続け、次いで、さらに1Lの新鮮な緩衝液を添加した後に16時間透析を続けた。前記透析膜から取り出すことにより、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含有する水溶液を得て、凍結乾燥し、無水製剤を調製した。
【0017】
ヒト組織ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子活性の測定
ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子活性の測定は、スタンダードとしてヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(NIBSC組織より購入、組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト、組換えとラベル化。第3次国際標準98/714(labeled as tissue plasminogen activator,human,recombinant.Third International Standard 98/714))を用いた平板線維素溶解分析法により行った。スタンダードの力価は、国際共同研究(International Collaborative Study)により決定され、10,000IU/アンプルであることがわかっている。15μLのトロンビン溶液(0.5U/μL)を5mLのPBS緩衝液で希釈し、5mLのプラスミノーゲン含有(10U)PBS緩衝液と混合した。9mLの1%アリコートアガロースに、4.5mLの混合溶液、および4.5mLのフィブリノーゲン溶液を、48℃で添加した。こうして得られた混合液を撹拌し、90×90mm2プレートに注いだ。パンチを用いて冷えたプレートに3mmの穴を開け、ウェルを作製した。スタンダードのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のPBS緩衝液(0.1mg/mLウシ血清アルブミン、0.01%ポリソルベート80)による連続希釈法を用いた。上記で得られた製剤緩衝液中のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子サンプル、およびスタンダードのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の希釈液のサンプル10μLを、ウェル上にロードし、室温で20〜24時間インキュベートした。各サンプルについて、フィブリンの透明な領域の直径を測定した。スタンダードのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の希釈液について、領域の直径を希釈液の活性単位に対してプロットし、標準曲線を得た。ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子については、領域の直径は、ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子サンプルの活性を測定するために用いられた。
【0018】
他の実施態様
本明細書中に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書中に開示された各特徴は、同一の、均等な、または類似の目的を達成しうる他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明示されていない限り、開示された各特徴は、均等な、または類似の一般的なシリーズのほんの一例である。
【0019】
上記の詳細な説明によれば、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確定でき、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修飾を施して、各種の用途および条件に適用することが可能である。例えば、本発明を実施するために、同一の官能基およびpKaを有するリジンの代替物が用いられうる。よって、他の実施態様もまた、特許請求の範囲に含まれる。
Claims (24)
- ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子;
リジン;
リン酸;および
非イオン性界面活性剤;
を含有するアルギニン非含有無水製剤であって、
前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、前記リジン、前記リン酸、および前記非イオン性界面活性剤は、それぞれ10〜60mg、100〜700mg、20〜100mg、および0.2〜5mgの量;または同様の相対比の量である、アルギニン非含有無水製剤。 - 前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、前記リジン、前記リン酸、および前記非イオン性界面活性剤は、それぞれ15〜50mg、150〜500mg、30〜80mg、および0.3〜3mgの量;または同様の相対比の量である、請求項1に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート20である、請求項2に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート80である、請求項2に記載の製剤。
- 前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、前記リジン、前記リン酸、および前記非イオン性界面活性剤は、それぞれ30〜40mg、200〜350mg、40〜60mg、および0.4〜0.8mgの量;または同様の相対比の量である、請求項1に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート20である、請求項5に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート80である、請求項5に記載の製剤。
- 前記ヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、前記リジン、前記リン酸、および前記非イオン性界面活性剤は、それぞれ35mg、200mg、50mg、および0.5mgの量;または同様の相対比の量である、請求項1に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート20である、請求項8に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート80である、請求項8に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート20である、請求項1に記載の製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート80である、請求項1に記載の製剤。
- 5〜20質量%のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、および55〜85質量%のリジンを含有する、アルギニン非含有無水製剤。
- 8〜16質量%のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、および60〜80質量%のリジンを含有する、請求項13に記載の製剤。
- 15〜20質量%のリン酸をさらに含有する、請求項14に記載の製剤。
- 0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項15に記載の製剤。
- 0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項14に記載の製剤。
- 10〜14質量%のヒト組織ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、および65〜75質量%のリジンを含有する、請求項13に記載の製剤。
- 15〜20質量%のリン酸をさらに含有する、請求項18に記載の製剤。
- 0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項19に記載の製剤。
- 0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項18に記載の製剤。
- 15〜20質量%のリン酸をさらに含有する、請求項13に記載の製剤。
- 0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項22に記載の製剤。
- 0.15〜0.2質量%の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項13に記載の製剤。
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