ES2219521T3 - Medicamento que contiene un inhibidor tisular de metaloproteinasas-2 (timp-2) como sustancia osteoanabolicamente activa. - Google Patents
Medicamento que contiene un inhibidor tisular de metaloproteinasas-2 (timp-2) como sustancia osteoanabolicamente activa.Info
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Abstract
Utilización de un TIMP-2 con la secuencia de aminoácidos significando X1 el aminoácido E ó D, X2 el aminoácido T ó I, X3 el aminoácido N ó S, Z1 -NH2, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, Z2 -COOH, CONH2, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, así como sus fragmentos biológicamente activos y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados, glicosilados y/o modificados con polietilen-glicoles, para la preparación de un medicamento destinado a la estimulación de osteoblastos después de fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.
Description
Medicamento que contiene un inhibidor tisular de
metaloproteinasas-2(TIMP-2)
como sustancia osteoanabólicamente activa.
El invento se refiere a un medicamento y a un
agente de diagnóstico, que contienen un inhibidor tisular de
metaloproteinasas-2 (TIMP-2, de
Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-2) como
formulación peptídica eficaz osteoanabólicamente, y a las
utilizaciones de los mismos.
Un TIMP-2 pertenece a la familia
de los "inhibidores tisulares de metaloproteinasas" de los que
hasta ahora se conocen cuatro diferentes péptidos
(TIMP-1 hasta -4) con funciones biológicas
diversas.
La estructura primaria de un
TIMP-2 se pudo esclarecer en diferentes organismos
tales como seres humanos (Liotta y colaboradores, 1991), ratas
(Roswit y colaboradores, 1992) y ratones (Kishi y colaboradores,
1991). El péptido contiene en total 12 cisteínas, que están unidas
unas con otras a través de 6 puentes de cisteínas.
A las funciones biológicas de un
TIMP-2 pertenece sobre todo la inhibición de
metaloproteinasas de la matriz (MMPs, de Matrix -
Metalloproteinases) activas. Por el concepto de MMPs se entiende un
conjunto de endoproteinasas dependientes del zinc, que están en
situación de descomponer a la matriz extracelular. La matriz
extracelular consta de una estructura compleja y está formada a
base de colágeno, proteoglicanos, glicoproteínas y
glicosaminoglicanos, entre otras sustancias. Una descomposición de
la matriz extracelular es esencial para muchos procesos biológicos
tales como la embriogénesis, la morfogénesis, así como la resorción
y remodelación de tejidos. No obstante, una actividad sin regular
de las MMPs puede conducir a una considerable destrucción de
tejidos, tal como por ejemplo en el caso de una artritis reumática
(Okada y colaboradores, 1986).
Con la inhibición de las metaloproteinasas de la
matriz se encuentran conectadas otras funciones biológicas
adicionales de un TIMP-2, entre las que se cuentan,
entre otras, la reducción del crecimiento de células tumorales
(Gómez y colaboradores, 1997) así como la inhibición de la
angiogénesis (Valente y colaboradores, 1998).
Junto a estas funciones, se describen también
actividades biológicas intrínsecas de un TIMP-2.
Entre ellas, se cuentan una formación aumentada de glóbulos rojos
de la sangre (Stetler-Stevenson y colaboradores,
1992) así como un efecto mitógeno sobre diferentes linajes
celulares (Hayakawa y colaboradores, 1994). Además, se pudieron
mostrar in vitro tanto una inhibición de la resorción ósea
en cultivos globales de huesos (Hill y colaboradores, 1993), como
también una estimulación de la resorción ósea por medio de
osteoclastos (Shibutani y colaboradores, 1999).
El documento de patente de los EE.UU.
US-A-5.714.465 se refiere al
tratamiento de enfermedades óseas con composiciones farmacéuticas,
que contienen un TIMP-2.
También el documento
US-A-5.595.885 se refiere a
composiciones farmacéuticas, que contienen un
TIMP-2.
El documento
US-A-5.643.752 se refiere a la
utilización de metaloproteinasas de la matriz, en particular un
TIMP-4, para el tratamiento de diferentes
enfermedades óseas.
Figura 1: A) hasta D) Las diferentes etapas de
cromatografía para la purificación del TIMP-2
osteoproliferativo.
Figura 2: A) Efecto proliferativo de un
TIMP-2 humano recombinante sobre osteoblastos
fetales primarios de ratas. B) Influencia de un
TIMP-2 humano recombinante sobre el diámetro medio
de las células en el caso del linaje celular osteoblástico de ratón
MC3T3-E1.
Sorprendentemente, un TIMP-2 con
la secuencia de aminoácidos
| significando | X1 | el aminoácido E ó D, |
| X2 | el aminoácido T ó I, | |
| X3 | el aminoácido N ó S, | |
| Z^{1} | -NH_{2}, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, | |
| Z^{2} | -COOH, -CONH_{2}, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, |
así como sus fragmentos biológicamente activos
y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados,
glicosilados y/o modificados con
polietilen-glicoles, están en situación de producir
una estimulación de los osteoblastos responsables de la formación
de huesos después de fracturas óseas o de intervenciones
quirúrgicas. Un TIMP-2 actúa en tal caso de modo
proliferativo y protector sobre los osteoblastos fetales.
Conforme al invento se utiliza un medicamento que
contiene un TIMP-2 con la secuencia de
aminoácidos
| significando | X1 | el aminoácido E ó D, |
| X2 | el aminoácido T ó I, | |
| X3 | el aminoácido N ó S, | |
| Z^{1} | -NH_{2}, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, | |
| Z^{2} | -COOH, -CONH_{2}, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, |
así como sus fragmentos biológicamente activos
y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados,
glicosilados y/o modificados con
polietilen-glicoles.
De modo preferido, se utilizan conforme al
invento un TIMP-2 humano (SEQ ID. No 1) y un
TIMP-2 de rata (SEQ ID. No 2):
Es objeto del invento la utilización de un
TIMP-2 con la secuencia de aminoácidos
| significando | X1 | el aminoácido E ó D, |
| X2 | el aminoácido T ó I, | |
| X3 | el aminoácido N ó S, | |
| Z^{1} | -NH_{2}, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, | |
| Z^{2} | -COOH, -CONH_{2}, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, |
así como sus fragmentos biológicamente activos
y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados,
glicosilados y/o modificados con
polietilen-glicoles, para la preparación de un
medicamento destinado a la estimulación de osteoblastos después de
fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.
Los derivados de TIMP-2,
utilizables conforme al invento, presentan, de modo preferido por
lo menos una identidad entre secuencias de 90% con la secuencia
nativa del TIMP-2 o con las modificaciones
mencionadas.
Puede ser ventajoso emplear el
TIMP-2, que se ha de utilizar conforme al invento,
en combinación con otros factores de crecimiento y/o medicamentos,
así como en combinación con sustancias coadyuvantes medicinales,
por ejemplo en el caso de implantes.
La administración del TIMP-2 se
efectúa en particular como una formulación en forma de inyecciones,
pomadas, cápsulas de "liberación lenta" y formulaciones
galénicas similares.
El TIMP-2 que se ha de utilizar
conforme al invento se emplea para la preparación de un medicamento
osteoanabólico destinado al tratamiento de defectos óseos y al
mejoramiento de la regeneración ósea después de fracturas óseas o
intervenciones quirúrgicas.
El fundamento para la identificación de un
TIMP-2 como péptido osteoanabólico lo constituyó la
observación de que existe una capacidad diversa de regeneración de
defectos óseos en función de la edad de un organismo. Mientras que,
normalmente, los organismos adultos no están en situación de
regenerar defectos óseos de tamaño mayor mediante la formación de
tejido óseo nuevo, en el caso de organismos más jóvenes tiene lugar
una regeneración ósea completa de defectos comparables.
Se obtuvieron observaciones similares también
in vitro al realizar la investigación de osteoblastos: Los
osteoblastos aislados a partir de organismos fetales crecen sin
problemas en un cultivo y comienzan a mineralizarse después de unos
pocos días. Los osteoblastos procedentes de animales inmaduros y
adultos no están, por el contrario, en situación de proliferarse en
condiciones clásicas de cultivo, y mueren finalmente. Si estas
células, incapaces de vivir por sí solas, se suplementan con el
material sobrenadante de osteoblastos fetales, entonces éstas se
proliferan y mineralizan de una manera similar a como lo hacen las
células fetales.
Una capacidad manifiestamente regenerativa del
material sobrenadante de cultivo celular de osteoblastos fetales se
pudo mostrar también in vivo. En tal caso, se ocasionó en
ratas por medios quirúrgicos un defecto craneal, que sin una
estimulación externa no se puede curar mediando formación de tejido
óseo. Sin embargo, si se aplica en uno de estos defectos un extracto
peptídico procedente del material sobrenadante de cultivo celular
de osteoblastos primarios fetales, entonces tiene lugar una
regeneración completa del defecto mediando formación de nuevo tejido
óseo.
Con el fin de aislar la sustancia, que es
responsable de los efectos antes descritos, se llevó a cabo una
extracción de péptidos a partir del material sobrenadante de
osteoblastos fetales, y los péptidos obtenidos se investigaron a
continuación in vitro en cuanto a sus capacidades
osteoproliferativas (véase el Ejemplo 3). En tal caso, el péptido
conforme al invento se puede purificar mediante una cromatografía
de RP (de Reverse Phase = fase inversa) preparativa,
semipreparativa y analítica, con ayuda de su actividad
biológica.
La caracterización bioquímica del péptido
conforme al invento, purificado, se efectuó mediante una
espectrometría de masas y una secuenciación del extremo terminal de
N. La determinación de la masa molecular mediante una espectrometría
de masas con ionización por proyección de electrones (ESI) arrojó
un peso molecular de 21.715 Da. El análisis de la secuencia del
extremo terminal de N mediante una descomposición de Edmann, dio
como resultado la siguiente secuencia:
XSXSPVHPQQAFXNADVVIRAKAV
La sustancia conforme al invento se puede emplear
para obtener un crecimiento aumentado y una regeneración mejorada
de un tejido óseo. Esto se puede concebir después de fracturas
óseas o intervenciones quirúrgicas.
El invento se explica con mayor detalle con ayuda
de los siguientes ejemplos:
Materiales sobrenadantes de cultivos celulares se
obtuvieron a partir de cultivos confluyentes de osteoblastos
fetales primarios. Para esto, los osteoblastos se aislaron en
primer lugar a partir de las cubiertas de cráneos de fetos de ratas
mediante una digestión secuencial con colagenasa y tripsina, y a
continuación se cultivaron en un medio esencial mínimo (MEM, de
Minimal Essential Medium) de Eagle, con una mezcla de penicilina y
estreptomicina y 10% de suero de ternero fetal (FCS, de Fetal Calf
Serum). Después de haberse alcanzado la confluencia, las células se
mantuvieron, de modo alternado, en cada caso durante 24 h con 10% de
FCS y durante 24 h sin suero. Los materiales sobrenadantes exentos
de suero se recogieron en tal caso y se utilizaron para el
aislamiento ulterior de los péptidos.
El aislamiento de un TIMP-2 se
efectuó mediante diferentes etapas consecutivas de
RP-HPLC (de Reverse Phase -
High Performance Liquid Chromatography = cromatografía en fase líquida de alto rendimiento en fase inversa), que sirvieron para el fraccionamiento del extracto peptídico global. Partes alícuotas de las fracciones se ensayaron en el bioensayo. Las fracciones se almacenaron a -20ºC.
High Performance Liquid Chromatography = cromatografía en fase líquida de alto rendimiento en fase inversa), que sirvieron para el fraccionamiento del extracto peptídico global. Partes alícuotas de las fracciones se ensayaron en el bioensayo. Las fracciones se almacenaron a -20ºC.
Las diferentes etapas de cromatografía para la
purificación de un TIMP-2 osteoproliferativo están
mostradas en las Figuras 1 A-D.
Los materiales sobrenadantes de cultivo celular,
exentos de suero, se ajustaron a un pH de 2,5 con HCl y a una
concentración de 5% de acetonitrilo por adición de acetonitrilo.
Después de ello, se filtraron primeramente a través de un filtro de
fibras de vidrio (GF6, de Schleicher & Schuell) y a continuación
a través de un filtro de membrana (OE G7, 4,43 \mum, de
Schleicher & Schuell). El material así obtenido se aplicó en
unas cantidades de 1-2 l, con un caudal de 40 a 50
ml/min, a una columna de RP.
Condiciones de la cromatografía:
| Columna: | YMC Gel Basic (15 - 30 \mum, 47 x 300 mm) |
| Caudal: | 40 ml/min |
| Fracciones: | 50 ml |
| Tampón A: | 10 mM de HCl |
| Tampón B: | 80% (p/v = peso / volumen) de acetonitrilo, 10 mM de HCl |
| Gradiente: | 5 - 75% de B en 47,5 min |
| 75 - 100% de B en 5 min |
A continuación, se ensayaron en un bioensayo
partes alícuotas de las fracciones obtenidas.
Las fracciones 37-40 que eran
bioactivas en el ensayo, se separaron con ayuda de otra etapa de RP
adicional.
Condiciones de la cromatografía:
| Columna: | Biotek RP Silica C4 (100 \ring{A}, 5 \mum, 20 x 125 mm) |
| Caudal: | 5 ml/min |
| Fracción: | 5 ml |
| Tampón A: | 0,1% de TFA (ácido trifluoroacético) |
| Tampón B: | 80% (p/v) de acetonitrilo, 0,1% de TFA |
| Gradiente: | 5 - 40% de B en 10 min |
| 40 - 100% de B en 60 min |
Partes alícuotas de las fracciones obtenidas se
ensayaron de nuevo en el bioensayo.
El subsiguiente fraccionamiento de las fracciones
bioactivas 22 y 23 se efectuó con ayuda de una cromatografía RP
adicional.
Condiciones de la cromatografía:
| Columna: | YMC C18 (120 \ring{A}, 5 \mum, 4,6 x 250 mm) |
| Caudal: | 0,6 ml/min |
| Fracción: | 0,6 ml |
| Tampón A: | 0,1% de TFA |
| Tampón B: | 80% (p/v) de acetonitrilo, 0,1% de TFA |
| Gradiente: | 5 - 30% de B en 4 min |
| 30 - 55% de B en 50 min | |
| 55 - 100% de B en 5 min |
Partes alícuotas de las fracciones obtenidas se
ensayaron en el bioensayo.
Las fracciones bioactivas 27 - 29 se separaron de
nuevo mediante una cromatografía en RP.
Condiciones de la cromatografía:
\newpage
| Columna: | Phenomenex C5 (4,6 x 250 mm) |
| Caudal: | 0,6 ml/min |
| Fracción: | 0,6 ml |
| Tampón A: | 0,1% de TFA |
| Tampón B: | 80% (p/v) de acetonitrilo, 0,1% de TFA |
| Gradiente: | 5 - 38% de B en 4 min |
| 38 - 58% de B en 60 min | |
| 58 - 100% de B en 5 min |
En el siguiente bioensayo, el péptido conforme al
invento, presente en la fracción 24, se pudo obtener en forma
pura.
La determinación de la masa del péptido nativo
purificado se llevó a cabo con ayuda de un espectrómetro de masas
con ESI. Se obtuvo una masa molecular de 21.715 Da. Ésta concuerda
muy bien con la masa teórica de la forma oxidada de un
TIMP-2, en la que todas las cisteínas están
puenteadas a través de puentes de cisteína.
El péptido nativo purificado se analizó mediante
una descomposición de Edmann en un secuenciador ABI 494, mediando
utilización del programa patrón. Las primeras 24 etapas de
descomposición proporcionaron la siguiente secuencia terminal de
N:
XSXSPVHPQQAFXNADVVIRAKAV
En el caso de X se trata en este contexto de
radicales de cisteína, que no son detectables al realizar la
secuenciación. Tomando en consideración estas cisteínas no
detectables, la secuencia obtenida concuerda exactamente con la
secuencia conocida de un TIMP-2. No se obtuvieron
secuencias secundarias.
Al realizar el subsiguiente balance en el banco
de datos SwissProt la secuencia se identificó inequívocamente como
la parte de comienzo de un TIMP-2. La masa teórica
de la proteína, de 21.713 Da, concuerda asimismo con la masa medida
de 21.715 Da. El péptido purificado se pudo identificar por
consiguiente de manera inequívoca como un
TIMP-2.
El aislamiento de un TIMP-2 se
efectuó con ayuda de su actividad biológica, midiéndose la
proliferación de osteoblastos fetales de ratas.
Para ello, partes alícuotas de las fracciones
obtenidas de péptidos se liofilizaron y se volvieron a suspender en
un medio exento de suero. A continuación, se ensayó su efecto
proliferativo sobre osteoblastos fetales. Las fracciones con efecto
proliferativo se sometieron después de ello a una separación por
cromatografía adicional. Las diferentes etapas de cromatografía
para la purificación del TIMP-2 osteoproliferativo
se muestran en las Figuras 1 A-D.
Para la medición de la proliferación, los
osteoblastos primarios fueron tripsinizados y sembrados, en un
número de células de 5.000 células por pocillo, en placas de 96
pocillos en un medio exento de suero. A continuación, se añadieron
las fracciones que se habían de ensayar. Después de un período de
tiempo de incubación de 48 h ó 72 h se ensayó la proliferación
mediante dos diferentes métodos. Como testigos positivos se
utilizaron diferentes concentraciones de un suero de ternero fetal
y de TGF\beta1 (de Tumor Growth Factor = factor de crecimiento de
tumores). Como testigo negativo sirvieron células sin
estimulación.
La medición de la proliferación se efectuó, por
una parte, con ayuda del substrato Wst-1. Este
substrato es convertido por enzimas mitocondriales en células
activas sobre el metabolismo para dar un producto coloreado, siendo
la resultante intensidad de color proporcional al número de
células. La intensidad de color se determina a una longitud de onda
de 405 nm y a una longitud de onda de referencia situada por encima
de 600 nm en el aparato lector de un ELISA.
Por otra parte, se mide la proliferación a través
de una medición directa del número de células en un contador
Coulter Counter (de CASY).
Ambos métodos mostraron un efecto fomentador del
crecimiento, dependiente de la dosis, de un TIMP-2
humano recombinante sobre osteoblastos (Figura 2A). Un importante
efecto osteoproliferativo de un TIMP-2 puede
detectarse a partir de concentraciones de 100 ng/ml en estos
experimentos in vitro. Además de ello, un
TIMP-2 humano recombinante produce una disminución
del diámetro medio de las células en el caso del linaje celular
osteoblástico de ratón MC3T3-E1 (Figura 2B).
Unos efectos significativos de un
TIMP-2 se pueden detectar en este experimento in
vitro a partir de concentraciones de 100 ng/ml. Además, se pudo
mostrar en un microscopio un efecto protector y proliferativo sobre
el linaje celular osteoblástico de ratón
MC3T3-E1.
Puesto que todas estas células son típicas
células óseas, un TIMP-2 se puede considerar como
factor osteoanabólico.
Claims (4)
1. Utilización de un TIMP-2 con
la secuencia de aminoácidos
así como sus fragmentos biológicamente activos
y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados,
glicosilados y/o modificados con
polietilen-glicoles, para la preparación de un
medicamento destinado a la estimulación de osteoblastos después de
fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, poseyendo el derivado de TIMP-2 una identidad
entre secuencias de por lo menos 90% con respecto a la secuencia de
acuerdo con la reivindicación 1.
3. Utilización de un TIMP-2 de
acuerdo con las reivindicaciones 1 y/ó 2 en combinación con otros
factores de crecimiento y/o medicamentos, así como en combinación
con agentes coadyuvantes medicinales, por ejemplo en el caso de
implantes.
4. Utilización de un TIMP-2 de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 formulado a la forma de
inyecciones, pomadas, cápsulas de "liberación lenta" y
formulaciones galénicas similares.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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