ES2214477T3 - Preparacion de microcapsulas. - Google Patents
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Abstract
SE PREPARAN MICROESFERAS POR UN PROCESO QUE CONSISTE EN LAS ETAPAS DE (I) SECAR POR PULVERIZACION UNA SOLUCION O DISPERSION DE UN MATERIAL FORMADOR DE PARED CON EL FIN DE OBTENER MICROESFERAS INTERMEDIAS Y (II) REDUCIR LA HIDROSOLUBILIDAD DE AL MENOS EL EXTERIOR DE LAS MICROESFERAS INTERMEDIAS. LOS MATERIALES FORMADORES DE PARED APROPIADOS COMPRENDEN PROTEINAS TALES COMO LA ALBUMINA Y LA GELATINA. LAS MICROESFERAS TIENES PAREDES DE 40-500 NM DE ESPESOR Y SON UTILES E LA FORMACION DE IMAGENES ULTRASONICAS. EL CONTROL DE DISTRIBUCION DE TAMAÑO, Y TAMAÑO MEDIANO, Y GRADO DE INSOLUBILIZACION Y LA RETICULACION DEL MATERIAL FORMADOR DE PARED PERMITE QUE SE PRODUZCAN PREPARACIONES DE NUEVAS MICROESFERAS. EN PARTICULAR, LAS MICROESFERAS PUEDE SE DE 15-20 (MU)M, DE OBJETIVO EN AREA SELECCIONADAS DEL CUERPO O DE VIDA PROLONGADA EN LA CIRCULACION.
Description
Preparación de microcápsulas.
La presente invención se refiere a la preparación
de agentes de diagnóstico que comprenden microcápsulas huecas para
mejorar la imaginología por ultrasonido.
El hecho que puedan usarse burbujas de aire en el
cuerpo para ecocardiografía ha sido conocido hace algún tiempo. Los
líquidos conteniendo burbujas pueden inyectarse en el torrente
sanguíneo para este propósito (véase Ophir et al (1980)
"Ultrasonic Imaging" 2, 67-77, quien
estabilizó las burbujas en una membrana de colágeno, las patentes de
los EE.UU. Nº 4 446 442 (Schering) y
EP-A-131 540 (Schering)), y las
patentes de los EE.UU. Nº 4 718 433, Nº 4 774 958 y Nº 4 844 882
revelan el uso de burbujas preparadas para aplicación del
ultrasonido a una solución de albúmina. Sin embargo, la distribución
del tamaño de burbujas, aparentemente, es ingobernable y las
burbujas desaparecen cuando se someten a la presión que se
experimenta en el ventrículo izquierdo (Shapiro et al (1990)
J. Am. Coll. Cardiology, 16(7),
1603-1607).
La patente europea
EP-A-52575 revela, para el mismo
propósito, partículas sólidas que tienen gas entrado en éstas,
siendo el gas liberado de las partículas en el torrente
sanguíneo.
La patente europea EP 458 745 (Sintetica)
revela un proceso para preparar microbalones, llenos de aire o de
gas, por polimerización interfacial de polímeros sintéticos como
poliláctidos y poliglicólidos. El documento WO 91/12823 (Delta
Biotechnology) revela un proceso similar que usa albúmina.
Wheatley et al (1990) Biomaterials 11,
713-717 revela la gelación ionotrópica de alginato
para formar microburbujas de unos 30 \mum de diámetro. El
documento WO 91/09629 revela los liposomas para su uso como agentes
de contraste en ultrasonido. Nuestra solicitud pendiente de patente
PCT/GB92/00643 (publicada desde la fecha de prioridad de esta
solicitud en el documento WO 92/18164) revela un método de secado
por spray que brinda microesferas particularmente ventajosas, que
presentan la resistencia mecánica requerida y una distribución de
tamaños estrechamente controlada. Se revelan otros procesos de
secado por spray, para propósitos diferentes, en Przyborowski et
al (1982 Eur. J. Nucl. Med. 7, 71-72), a
saber, la preparación de microesferas de albúmina de suero humana
(HSA, por las siglas de su expresión inglesa, Human Serum Albumin)
para el marcado por radiactividad y su uso posterior en
imaginología por centelleo del pulmón.
El artículo de Przyborowski et. al. se
refiere a dos descubrimientos más tempranos de métodos para obtener
partículas de albúmina para centigrafía pulmonar. Aldrich &
Johnston (1974) Int. J. Appl. Rad. Isot. 25,
15-18 descubrieron el uso de un disco giratorio
para generar partículas de 3-70 \mum de diámetro,
las que se desnaturalizan luego en aceite caliente. El aceite se
retiró y se marcaron las partículas con radioisótopos. En Raju et
al (1978) Isotopenpraxis 14(2),
57-61 se usó la misma técnica de disco giratorio,
pero se desnaturalizó la albúmina simplemente calentando las
partículas. En ningún caso se mencionó que las microesferas fueran
huecas, y las partículas preparadas no fueron convenientes para
ecocardiografía.
Nosotros ahora hemos desarrollado nuestro
anterior proceso de secado por spray (documento WO 92/18I64) y se
adaptó para producir productos aún más ventajosos.
Un aspecto de la presente invención proporciona
un proceso que comprende un primer paso de atomizar una solución o
dispersión de un material para formación de una pared y obtención
de: (i) microcápsulas huecas de 15-20 \mum de
diámetro, (ii) microcápsulas huecas que tengan una vida media
prolongada en el torrente sanguíneo humano o (iii) microcápsulas
huecas que se adaptan para direccionamiento selectivo a un área del
cuerpo humano o animal.
Estos tres productos de microcápsulas en la
presente solicitud serán denominados "microesferas grandes",
"microesferas de vida prolongada" y "microesferas
direccionadas", respectivamente. Las referencias a las
microesferas deben entenderse como referencias a microcápsulas.
Preferentemente, el producto obtenido en dicho
proceso se somete a un segundo paso de reducir la solubilidad en
agua por lo menos la del exterior de dichas microesferas.
Dichos dos pasos pueden llevarse a cabo como un
solo proceso, o el producto intermedio del primer paso puede
recogerse y puede separadamente tratarse en el segundo paso. Estas
dos posibilidades se refieren más adelante como los procesos de uno
y de dos pasos.
Deben escogerse el material para la formación de
una pared y las condiciones del proceso para que el producto sea lo
suficientemente no tóxico y no inmunogénico en las condiciones de
uso, lo que dependerá claramente de la dosis administrada y la
duración del tratamiento. El material para la formación de una pared
puede ser un derivado del almidón, un polímero sintético como
poliglutamato de
tert-butil-oxicarbonil-metilo
(patente de los EE.UU. Nº 4 888 398), o un polisacárido como
polidextrosa o almidón.
Generalmente, el material para formación de la
pared puede seleccionarse entre polímeros fisiológicamente
compatibles, mayoritariamente hidrófilos, biodegradables. Entre
tales polímeros se pueden citar polisacáridos de baja solubilidad
en agua, poliláctidos y poliglicólidos y sus copolímeros,
copolímeros de láctidos y lactonas como
\varepsilon-caprolactona,
\delta-valerolactona, polipéptidos, y proteínas
como gelatina, colágeno, globulinas y albúminas. Otros polímeros
convenientes incluyen poli-(orto)ésteres (véanse, por ejemplo, las
patentes de los EE.UU. Nº A-4.093.709; EE.UU.
A-4.131.648; EE.UU. A-4.138.344;
EE.UU. A-4.180.646; el ácido poliláctico y
poliglicólico y sus copolímeros, por ejemplo DEXON (véase J. Heller
(1980) Biomaterials 1, 51; poli
(DL-lactido-co-\delta-caprolactona),
poli(DL-lactido-co-\delta-valerolactona),
poli(DL-lactido-co-g-butirolactona),
poli(alquil-ciano-acrilatos);
poliamidas, poli-hidroxi-butirato;
poli-di-oxanona;
poli-\beta-aminocetonas
(Polymer 23 (1982), 1693); polifosfacenos (Science 193
(1976), 1214); y polianhídridos. Pueden encontrarse referencias
sobre polímeros biodegradables en Langer et al (1983)
Macromol. Chem. Phys. C23, 61-125. También
pueden usarse Poli(aminoácidos) como ácidos poliglutámico y
poliaspártico, así como sus derivados, es decir, los ésteres
parciales con alcoholes o glicoles inferiores. Un ejemplo útil de
tales polímeros es el poli-(t,butil-glutamato).
También son posibles copolímeros con otros aminoácidos como
metionina, leucina, valina, prolina, glicina, alamina, etc.
Recientemente se han informado algunos nuevos derivados de ácidos
poliglutámico y poliaspártico con una biodegradabilidad controlada
(véanse los documentos WO 87/03891; la patente de los EE.UU. Nº
4.888.398 y EP 130 935 incorporados en la presente solicitud como
referencias). Estos polímeros (y copolímeros con otros aminoácidos)
tienen fórmulas del siguiente tipo:
-(NH-CHA-CO)
_{x} (NH-CHX-CO)
_{y}
en la que X designa la cadena lateral de un
residuo de amino-ácido y A es un grupo de
fórmula
(II)-(CH_{2})_{n}COOR^{1}R^{2}OCOR
siendo R^{1} y R^{2} un átomo de H o alquilos
inferiores, y siendo R alquilo o arilo; ó R y R^{1} se
interconectan juntos por un miembro vinculante sustituido o no
sustituido para proporcionar anillos de 5 ó 6
miembros.
El grupo A también puede representar los grupos
de fórmulas:
(I)-(CH_{2})_{n}COO-CHR^{1}COOR
y
(III)-(CH_{2})_{n}CO(NH-CHX-CO)
_{m}NH-CH(COOH)-(CH_{2})_{n}COOH
y los correspondientes anhídridos. En todas estas
fórmulas n, m y p son números enteros bajos (no excediendo 5) así
como x e y también son enteros, seleccionados por tener pesos
moleculares no inferiores a
5000.
Los polímeros mencionados anteriormente son
convenientes para confeccionar las microesferas según la presente
invención y, dependiendo de la naturaleza de los sustituyentes R,
R^{1}, R^{2} y X, pueden controlarse las propiedades de la
pared, por ejemplo, resistencia, elasticidad y biodegradabilidad.
Por ejemplo, X puede ser metilo (alanina), isopropilo (valina),
isobutilo (leucina e isoleucina) o bencilo
(fenil-alanina).
Preferentemente, el material para la formación de
la pared es proteináceo. Por ejemplo, puede ser colágeno, gelatina
o albúmina (suero), en cada caso preferentemente de origen humano
(es decir, derivado de humanos o correspondiendo a la estructura de
la proteína humana). La más preferentemente, es la albúmina de
suero humana (HA, por las siglas de su expresión inglesa, Human
Protein) derivada de donaciones de sangre o de la fermentación por
microorganismos (incluyendo las líneas celulares) que se han
transformados o transfectado para expresar la HA.
Las técnicas para expresar la HA (cuyo término
incluye los análogos y fragmentos de albúmina humana, por ejemplo,
aquellos de la patente europea
EP-A-322094, y los polímeros de
albúmina monomérica) se revela, por ejemplo, en las patentes
europeas EP-A-201239 y
EP-A-286424. Todas cuyas referencias
se han incluidas en la presente solicitud. Los términos "análogos
y fragmentos" de la HA incluyen todos loa polipéptidos: (i) los
cuales sean capaces de formar microesferas en el proceso de la
presente invención y (ii) de los cuales se cumpla que una región
continua por lo menos de un 50% (preferentemente por lo menos 75%,
80%, 90% o 95%) de la secuencia de aminoácidos tenga por lo menos
un 80% de identidad de secuencia (preferentemente, por lo menos 90%,
95% o 99% de identidad) con una región continua por lo menos de un
50% (preferentemente 75%, 80%, 90% o 95%) de albúmina humana. Se
prefiere particularmente la HA que se produce por técnicas
recombinantes de ADN. Así, la HA puede producirse expresando una
secuencia de nucleótidos codificantes de la HA en la levadura o en
otro microorganismo y purificando el producto, tal como es conocido
en la técnica.
En la siguiente la descripción de realizaciones
preferentes, se usa el término "proteína" ya que es el que
nosotros preferimos, pero será entendido que pueden usarse otros
materiales biocompatibles formadores de pared, como se ha discutido
anteriormente.
La solución o dispersión de la proteína es
preferentemente 0,1 a 50% p/v, más preferentemente aproximadamente
5,0 - 25,0% de proteína, particularmente cuando la proteína es
albúmina. Aproximadamente 20% es lo óptimo. Pueden usarse mezclas
de los materiales para formación de pared, en cuyo caso los
porcentajes en las últimas dos frases se refieren al contenido
total de material para formación de pared.
La preparación a ser aspersada puede contener
sustancias de otro tipo que el material para formación de pared y
el solvente o portador líquido. Así, la fase acuosa puede contener
1-20% en peso de compuestos hidrófilos solubles en
agua como azúcares y polímeros como estabilizadores, por ejemplo,
alcohol polivinílico (PVA, por las siglas de su expresión inglesa,
Poly Vinil Alcohol), polivinil pirrolidona (PVP, por las siglas de
su expresión inglesa, Poly Vinil Pyrrolidone), polietilenglicol
(PEG), gelatina, ácido poliglutámico y polisacáridos como almidón,
dextrana, agar, xantano y análogos. Pueden usarse fases acuosas
similares como líquido portador, en el cual el producto final de
microesferas estará suspendido antes de su uso. Pueden usarse
emulsivos (0,1-5% en peso) incluyendo los emulsivos
más aceptables fisiológicamente, por ejemplo, lecitina de huevo o
lecitina de soja, o lecitinas sintéticas como las lecitinas
sintéticas saturadas, por ejemplo, fosfatidilo de dimiristoíl
colina, fosfatidilo de dipalmitoíl colina o fosfatidilo de
distearoíl colina o lecitinas sintéticas no saturadas, como
fosfatidilo de dioleíl colina o fosfatidilo de dilinoleíl colina.
Los emulsivos también incluyen tensioactivos como ácidos grasos
libres, ésteres de ácidos grasos con compuestos de polioxialquileno
como polioxipropilenglicol y polioxietilenglicol; éteres de
alcoholes grasos con glicoles de polioxialquileno; ésteres de
ácidos grasos con sorbitan polioxialquilado; jabones; estearato de
glicerol-polialquileno; ricinoleato de
glicerol-polioxietileno: homo- y copolímeros de
polialquilenglicoles; aceite de soja polietoxilado y aceite de
castor así como derivados hidrogenados; éteres y ésteres de
sacarosa u otros hidratos de carbono con ácidos grasos, alcoholes
grasos, éstos siendo opcionalmente polioxialquilados; mono-, di- y
triglicéridos de ácidos grasos saturados o no saturados, glicéridos
de aceite de soja y sacarosa.
Los aditivos pueden incorporarse a la pared de
las microesferas para modificar propiedades físicas como
dispersabilidad, elasticidad y permeabilidad al agua.
Entre los aditivos útiles, se pueden citar
compuestos que puedan "hidrofobizar" la pared para disminuir
su permeabilidad al agua, como grasas, ceras e hidrocarburos de
altos pesos moleculares. Los aditivos que mejoran la
dispersabilidad de las microesferas en el líquido portador
inyectable son los compuestos amfipáticos como fosfolípidos; ellos
también aumentan la permeabilidad al agua y velocidad de
biodegradabilidad.
Los aditivos que aumentan la elasticidad de la
pared son plastificadores como el miristato de isopropilo y sus
análogos. También, aditivos muy útiles son los constituidos por
polímeros semejantes a los de la propia pared, pero con un peso
molecular relativamente bajo. Por ejemplo, al usar copolímeros de
tipo polilácticos / poliglicólicos como material para la formación
de la pared, pueden modificarse ventajosamente las propiedades de
la pared (una suavidad y biodegradabilidad mejorada) incorporando,
como aditivos, poliglicólidos o poliláctidos de peso molecular bajo
(1000 a 15,000 Dalton). También el polietilenglicol de PM medio a
bajo (por ejemplo, PEG 2000) es un aditivo útil para
reblandecimiento.
La cantidad de aditivos que debe ser incorporada
en la pared es sumamente variable y depende de las necesidades. En
algunos casos, no se usa en absoluto ningún aditivo; en otros
casos, las cantidades de aditivos pueden alcanzar aproximadamente
20% en peso de la pared.
La solución o dispersión de proteína
(preferentemente, la solución) se atomiza y seca por spray, lo que
es denominado en adelante "preparación de la proteína", por
cualquier técnica conveniente que produzca microesferas discretas de
1,00 - 50,0 \mum de diámetro. Estos datos se refieren por lo menos
a 90% de la población de microesferas, cuyo diámetro es medido con
un Coulter Master Sizer II. El término "microesferas" denomina
las partículas huecas que encierran un espacio que esté lleno con
un gas o vapor, pero no con cualquier material sólido. No se
conforman las partículas en forma de panales de abejas, que se
parecen a productos de confitería, vendidas en el REINO UNIDO como
"Maltesers" (TM, marca registrada). No es necesario que el
espacio sea totalmente encerrado (aunque se prefiere) y no es
necesario que las microesferas sean precisamente esféricas, aunque
éstas sean generalmente esféricas. Si las microesferas no son
esféricas, entonces los diámetros, referidos anteriormente, se
aplican al diámetro de las microesferas esféricas correspondientes,
teniendo la misma masa y encerrando el mismo volumen de espacio
vacío, que las microesferas no esféricas.
El proceso de atomizado comprende formar un
aerosol para preparación de la proteína, por ejemplo, forzando a
presión la preparación a través por lo menos de un orificio hacia,
o usando un atomizador centrífugo en, una cámara de aire caliente u
otro gas inerte. La cámara idealmente debiera ser lo bastante grande
para que las gotas, proyectadas a la mayor distancia, no colisionen
las paredes antes de secarse. El gas o vapor en la cámara debe ser
inoxidable (es decir, preferentemente estéril y libre de sustancias
pirógenas) y no ser tóxico, cuando se administre en el torrente
sanguíneo en cantidades concomitantes con la administración de
microesferas para ecocardiografía. La velocidad de evaporación del
líquido, usado en la preparación de la proteína, debe ser lo
suficientemente alta como para formar microesferas huecas, pero no
tan alta como para provocar el estallido de las microesferas. La
velocidad de evaporación puede controlarse variando la velocidad de
flujo del gas, la concentración de la proteína en la preparación de
proteína, la naturaleza del portador líquido, la velocidad de
alimentación de la solución y, lo más importante, la temperatura
del gas encontrado por el aerosol. Con una concentración de albúmina
de 15-25% en agua, una temperatura de gas de
entrada por lo menos de aproximadamente 100ºC, preferentemente por
lo menos 110ºC, es generalmente suficiente para asegurar la oquedad
y la temperatura puede ser tan alta como 250ºC sin que las cápsulas
estallen. Aproximadamente 180-240ºC, preferentemente
aproximadamente 210-230ºC y la más preferente
aproximadamente 220ºC, es la óptima, por lo menos para la albúmina.
La temperatura puede, en la versión de un solo paso del proceso de
la presente invención, ser por lo menos suficiente para como para
insolubilizar parte (normalmente, el exterior) del material
destinado a la formación de la pared y frecuentemente esencialmente
a todo el material destinado a la formación de la pared. Ya que la
temperatura del gas encontrado por el aerosol también dependerá de
la velocidad a la que se suministre el aerosol, y del contenido del
líquido de la preparación de proteína, puede supervisarse la
temperatura de salida para asegurar una temperatura adecuada en la
cámara. Se ha encontrado que es conveniente una temperatura de
salida de 40- 150ºC. Aparte de este factor, sin embargo, el control
de la velocidad de flujo no se ha encontrado que sea tan útil como
el control de los otros parámetros.
En el proceso de dos pasos, las microesferas
intermedias representativamente comprenden 96-98%
de HA monomérico y tienen un tiempo de vida in vivo limitado
para la imaginología de ultrasonido. Éstas pueden, sin embargo, lo
mismo ser usadas para imaginología por ultrasonido (por lo menos, en
algunos usos de las microesferas de la presente invención), o éstas
pueden almacenarse y transportarse antes de que se lleve a cabo el
segundo paso del proceso de dos pasos. Éstas forman, por
consiguiente, un aspecto adicional de la invención.
En el segundo paso del proceso, las rnicroesferas
intermedias preparadas en el primer paso se fijan y se hacen menos
solubles en agua para que éstas persistan un intervalo de tiempo
más largo, aunque no siendo tan insolubles e inertes como para
volverse no biodegradables. Este paso también fortalece las
microesferas para que éstas puedan resistir bien los rigores de
administración, presión de esquila vascular y ventricular. Si las
microesferas estallaran, éstas se volverían menos ecogénicas.
Schneider et al (1992) Invest. Radiol. 27,
134-139 mostraron que las microburbujas de albúmina,
sonificadas según la técnica anterior, no tienen esta fuerza y
rápidamente pierden su ecogenicidad, cuando se someten a las
presiones típicas del ventrículo izquierdo. El segundo paso del
proceso puede emplear calor (por ejemplo, calor por microondas,
calor radiante o aire caliente, por ejemplo en un horno
convencional), irradiación ionizante (por ejemplo, una dosificación
de 10,0-100,0 kGy con rayos gamma), o puede emplear
reticulación usando un agente químico como, por ejemplo,
formaldehído, glutaraldehído, óxido de etileno u otros agentes para
reticulación de proteínas, y este paso se lleva a cabo
preferentemente en microesferas intermedias sustancialmente secas,
conformadas en el primer paso, o en una suspensión de microesferas
en un líquido, en el que las microesferas sean insolubles, por
ejemplo, en un solvente conveniente. En la versión del proceso en
un paso, puede rociarse un agente de reticulación como el
glutaraldehído dentro de la cámara de secado por spray, o
simplemente puede introducirse durante la preparación de la
proteína, justamente río arriba de los medios de rociado.
Alternativamente, la temperatura en la cámara puede ser lo bastante
alta como para insolubilizar las microesferas.
Las "microesferas de vida larga" y las
"microesferas direccionadas" pueden, si se desea, consistir en
microesferas que tengan un diámetro de 0,05 a 50,0 \mum (medido
de la misma manera como en las microesferas intermedias), pero con
el proceso de la presente invención son asequibles intervalos de
0,1 a 20,0 \mum y sobre todo 1,0 a 8,0 \mum, y éstos se
prefieren para la ecocardiografía. Nosotros hemos encontrado que un
intervalo de aproximadamente 0,5 a 3,0 \mum puede ser
especialmente conveniente para la producción de una imagen de bajo
contraste y para su uso en la imaginología Doppler a color,
considerando que un intervalo de aproximadamente 4,0 a 6,0 \mum
puede ser bueno para la producción de imágenes agudas. Se necesita
tener en cuenta el hecho, que para la determinación del tamaño
producido en el primer paso, el segundo paso puede alterar el
tamaño de las microesferas.
Se ha encontrado que el proceso de la presente
invención puede controlarse para obtener microesferas con las
características deseadas. Así, la presión a la que la solución de
proteína se administra a la boquilla para spray puede variarse, por
ejemplo de 1,0-10,0 x 10^{5} Pa, preferentemente
2,0-6,0 x 10^{5} Pa, y la más preferente
aproximadamente 5 x 10^{5} Pa. Otros parámetros pueden variarse
como se ha revelado anteriormente y se revela a continuación. De
esta manera, pueden obtenerse nuevas microesferas.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona microesferas huecas de vida grande, larga, o
microesferas direccionadas, en las que más de 30%, preferentemente
más de 40%, 50%, o 60%, de microesferas que tienen un diámetro
dentro de un intervalo de 2 \mum y, en el caso de microesferas de
vida larga o microesferas direccionadas, por lo menos 90%,
preferentemente por lo menos 95% o 99%, deben tener un diámetro
dentro del intervalo 1,0-8,0 \mum. En el caso de
microesferas grandes, el intervalo correspondiente de diámetros es
12-25 \mum.
Así, el intervalo intercuartil puede ser 2
\mum, con un diámetro promedio (para las microesferas de vida
larga o direccionadas) de 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 o 6,5
\mum.
Así, por lo menos 30%, 40%, 50% o 60% de las
microesferas de vida larga o las microesferas direccionadas pueden
tener diámetros dentro del intervalo 1,5-3,5
\mum; 2,0-4,0 \mum; 3,0-5,0
\mum; 4,0-6,0 \mum; 5,0-7,0
\mum o 6,0-8,0 \mum. Preferentemente dicho
porcentaje de dichas microesferas tiene diámetros dentro de un
intervalo de 1,0 \mum, como 1,5-2,5 \mum,
2,0-3,0 \mum, 3,0-4,0 \mum,
4,0-5,0 \mum, 5,0-6,0 \mum,
6,0-7,0 \mum o 7,0-8,0 \mum.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona microesferas huecas grandes, de vida larga, o
direccionadas con paredes proteináceas, en las que por lo menos
90%, preferentemente por lo menos 95% o 99% de las microesferas
tiene un diámetro en el intervalo 1,0-8,0 \mum
(o, en el caso de las microesferas grandes, 12-25
\mum); por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 95% o 99%
de las microesferas tienen un espesor de pared de
40-500 nm, preferentemente 100-500
nm; y por lo menos 50% de la proteína en las paredes está tan
reticulada como para durante 2 minutos resistir la extracción con
1% de HCl.
La microscopía electrónica de barrido de las
microcápsulas muestra que éstas son esferas huecas sin ninguna
materia sólida, excepto en las paredes. El espesor de pared puede
medirse por microscopía o puede calcularse, como se expone a
continuación. La masa de material que forma las paredes en cada uno
de las gotas aspersadas se da por la siguiente fórmula:
(I)M = V \ x \ C = 4/3 \
(\pi \ r_{e}{}^{3} \
c)
en la que M: Masa; V: volumen de la gotita; c:
concentración del material que forma las paredes en la solución
aspersada, y r_{e} es el radio externo de la
gotita.
Nuestros estudios han demostrado que la dimensión
externa de la gota queda esencialmente inalterada, aunque el
solvente se haya evaporado. La masa del material que forma las
paredes en la microcápsula seca, por consiguiente, se da por:
(II)M = 4/3 \ [\pi \
(r_{e}{}^{3}-
r_{i}{}^{3})\rho]
En la que r_{e} es el radio externo de la
microcápsula (el mismo que el de la gotita), r_{i} es el radio
interior de la microcápsula y \rho es la densidad del material
que forma la pared. El espesor de la pared entonces se representa
por
r_{e}- r_{i}. La cantidad r_{e} es conocida de la medida directa de las microcápsulas usando un contador Coulter, y r_{i} se obtiene de la ecuación (III)
r_{e}- r_{i}. La cantidad r_{e} es conocida de la medida directa de las microcápsulas usando un contador Coulter, y r_{i} se obtiene de la ecuación (III)
(III)r_{i} = [r_{e}{}^{3}-
(r_{e}{}^{3} \ \text{*} \ c / \rho)]
^{1/3}
De aquí, para un diámetro externo de 5 \mum
(radio externo de 2,5 \mum), una concentración en la solución
aspersada de 0,2 g/ml (20%) y una densidad de pared de 1,31 g/cm3
(determinable por picnometría con helio), el espesor de pared puede
calcularse, siendo134 nm.
Preferentemente, por lo menos un 75%, 90%, 95%,
98,0%, 98,5% o 99%, de la proteína en cualquiera de los tres tipos
de microesferas de la presente invención está lo suficientemente
reticulada como para ser resistente, durante 2 minutos, a la
extracción con una solución de HCl al 1%. La proteína extraída se
detecta usando el ensayo de proteína Blue Coomassie, Bradford. El
contenido de proteína en los lavados se expresa como un porcentaje
de la masa original de las microcápsulas.
El grado de reticulación es controlado variando
el calentamiento, irradiación o tratamiento químico de la proteína.
Durante el proceso de reticulación, el monómero de la proteína es
reticulado y rápidamente se vuelve inaccesible a un proceso de
disolución simple, como se ha descubierto por HPLC de permeación en
gel o por electroforesis en gel, como se muestra posteriormente en
el Ejemplo 8. El tratamiento continuado conlleva mayor reticulación
del material ya reticulado de forma tal que se vuelve inaccesible a
un proceso de extracción con HCl, el que ya se describió
anteriormente. Durante el calentamiento a 175ºC, las microesferas
obtenidas de rHA de acuerdo con la presente invención, pierden
aproximadamente 99% de la proteína extraíble por HCl en el
transcurso de unos 20 minutos, considerando que, a 150ºC, 20
minutos de calentamiento retiran sólo aproximadamente un 5% de la
proteína extraíble por HCl, 30 min. retiran 47,5%, 40 min. 83%, 60
min. 93%, 80 min. 97% y 100 min. retiran 97,8% de la proteína de
extraíble por HCl. Para lograr buenos niveles de reticulación, por
consiguiente, las microesferas pueden calentarse a 175ºC durante
por lo menos 17 min. (preferentemente durante 20-40
min., lo más preferente 35-40 min.) a 150ºC durante
por lo menos 80 min. y a otras temperaturas correspondientemente
durante tiempos más largos o más cortos. Nosotros hemos encontrado
que la albúmina derivada del suero necesita menos tiempo para
reticular que el rHA.
Las microesferas inyectables de la presente
invención pueden guardarse secas en presencia, o en ausencia, de
aditivos para mejorar la conservación y prevenir su coalescencia.
Se pueden seleccionar fisiológicamente de 0,1 a 25% en peso de
aditivos solubles en agua, de compuestos biológicamente aceptables
como manitol, galactosa, lactosa o sacarosa, o de polímeros
hidrófilos como dextrana, xantano, agar, almidón, PVP, ácido
poliglutámico, polivinilalcohol (PVA, por las siglas de su
expresión inglesa, Poly Vinyl Alcohol) y gelatina.
Para minimizar cualquier aglomeración de las
microesferas, éstas pueden molerse con excipientes inertes
convenientes usando un molino centrífugo de aguja Fritsch, equipado
con una pantalla de 0,5 mm, o un molino a chorro por impacto de
aire, Glen Creston. Los excipientes convenientes son polvos
finamente molidos, inertes, y convenientes para uso intravenoso,
como lactosa, glucosa, manitol, sorbitol, galactosa, maltosa o
cloruro de sodio. Una vez molida, la mezcla de las microesferas /
excipiente puede suspenderse en medio acuoso para facilitar la
retirada de microesferas no funcionales / defectuosas. En la
reconstitución en la fase acuosa, es deseable incluir una cantidad,
trazas, de tensioactivo para prevenir la aglomeración. Los
tensioactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos convenientes para
este propósito incluyen poloxámeros, ésteres de sorbitan,
polisorbatos y lecitina.
La suspensión de las microesferas se puede luego
dejar reflotar o se puede centrifugar para sedimentar cualquier
partícula defectuosa que tenga la superficie, que en su uso podría
causar el llenado con líquido y no continuar siendo ecogénicas por
más tiempo.
La suspensión de las microesferas puede luego ser
remezclada para asegurar una distribución uniforme de partículas,
se puede lavar y reconstituir en un búfer conveniente para
inyección intravenosa, como 0,15 M de NaCl 0,01 mM Tris pH 7,0. Se
pueden tomar alícuotas de la suspensión para su congelación y
esterilización posterior, por ejemplo, por irradiación gamma, calor
seco u óxido de etileno.
Un método alternativo para la deaglomeración de
las microesferas, insolubilizadas o fijadas, es suspenderlas
directamente en un medio acuoso que contenga un tensioactivo
escogido entre poloxámeros, ésteres de sorbitan, polisorbatos y
lecitina. Entonces puede lograrse la deaglomeración usando un
homogenizador conveniente.
La suspensión de las microesferas se puede luego
dejar reflotar o se puede centrifugar para sedimentar las
partículas defectuosas, como anteriormente se ha descrito, y
adicionalmente se puede tratar como se ha expuesto
anteriormente.
Aunque las microesferas de la presente invención
pueden comercializarse en estado seco, más precisamente, cuando
éstas se diseñan para un tiempo de vida limitado después de su
inyección, puede también ser deseable vender las preparaciones ya
listas, es decir suspensiones de las microesferas en un portador
líquido acuoso, listo para su inyección.
El producto generalmente es, sin embargo,
suministrado y almacenado como un polvo seco y será suspendido en
un líquido conveniente estéril, no pirogénico, sólo antes de su
administración.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona microesferas huecas grandes, de vida larga o
direccionadas, de las cuales por lo menos un 10% de las
microesferas, cuando son suspendidas en agua, son capaces de
sobrevivir durante 0,25 seg. a la aplicación de una presión de 2,66
x 10^{4} Pa sin estallar, colapsar o llenarse con agua. La
presión máxima transiente en el ventrículo izquierdo humano es
aproximadamente 200 rnm Hg (2,66 x 10^{4} Pa).
Preferentemente, un 50%, 75%, 90% o 100%
sobrevive durante 0,25 seg. a dicha aplicación de presión, 2.66 x
104 Pa, cuando se ensayan como anteriormente se describió, es
decir, que siguen siendo ecogénicas. Preferentemente, in
vivo, en los mismos porcentajes seguirán siendo ecogénicas
durante un pasaje a través de ambos ventrículos del corazón.
Las "microesferas grandes" de la presente
invención están caracterizadas porque, por lo menos 90%,
preferentemente por lo menos 95% o 99%, de las microesferas tiene
un diámetro dentro del intervalo 10,1-19,9 \mum,
preferentemente 13-18 \mum.
Debe notarse que estas microesferas sólo son
"grandes" respecto a las microesferas preferentes de nuestra
solicitud de patente anterior, el documento WO 92/18164, y respecto
a los tamaños preferentes de las microesferas de vida larga y
direccionadas reveladas en la presente solicitud; las microesferas
de la técnica anterior frecuentemente eran mayores que 25
\mum.
Las microesferas grandes de la presente invención
pueden ser producidas controlando los parámetros del proceso de
secado por spray. La concentración del material para la formación
de pared, en el líquido que debe ser convertido a spray, puede ser
igual, que para las microesferas menores descritas anteriormente, a
saber 0,1-50,0% p/v (preferentemente aproximadamente
5,0-25,0%, sobre todo cuando el material para la
formación de pared es la albúmina), como pueda ser la temperatura
en la cámara caliente (100-250ºC, preferentemente
200-250ºC) y el segundo paso del proceso, pero la
presión de spray se reduce a menos de 2 bar (2 x 10^{5} Pa), y
preferentemente no es mayor que 1,8 x 10^{5} Pa; 1,5 x 10^{5}
Pa; o 1,3 x 10^{5} Pa. Se prefiere una presión mínima de 1 x
10^{5} Pa.
Las microesferas grandes de la presente invención
son convenientes para su uso como agente de contraste ecográfico de
depósito para delinear áreas infraperfusas de microcirculación.
Nosotros hemos encontrado que las microesferas de tamaño promedio
15,0 \mum tienen ecogénisidades superiores en unas 4,6 x 10^{4}
veces a la de las microesferas similares de tamaño promedio 5,0
\mum. Así, puede usarse una dosis relativamente baja para
imaginizar regiones en lo más profundo del cuerpo, las cuales son
inaccesibles a las técnicas normales de ultrasonido. Las
microesferas pueden administrarse por técnicas conocidas que usan
catéteres para entregar las microesferas, por ejemplo, a los
capilares del hígado, riñón o vasos sanguíneos coronarios. Una
ventaja, comparadas con los estudios clásicos usando microesferas
radiomarcadas, es que, posterior a la administración arterial,
retirada del catéter y estabilización del paciente, se pueden tomar
imágenes planas múltiples para construir por perfusión un mapa en
3D del miocardio o de cama capilar similar. El flujo miocárdico
regional de sangre se puede evaluar cualitativamente en pacientes
con enfermedad de la arteria coronaria en el momento de la
angiografía por imaginología del corazón, posterior a la inyección
intracoronaria directa de las microesferas. Estas microesferas se
entrampan en la microvasculatura del corazón durante la transmisión
inicial a través de la circulación coronaria. No se espera ningún
efecto hemodinámico o electrofisiológico adverso, que sea
detectable, ya que sólo una fracción muy pequeña de los capilares o
arteriolas son embolizados. Cuando el flujo de sangre nutriente a
un segmento del miocardio ventricular izquierdo disminuye, como en
una región de cicatriz miocárdica o en una región causada por una
arteria coronaria ocluida o severamente estenótica, será reducido
el número de microesferas entregadas a estos segmentos. Esto se
aprecia como una reducción focal en la actividad, secundaria a una
infraperfusión regional. Debido a que las microesferas se
introducen en las arterias, se evita la necesidad de retirar las
microesferas en los capilares del pulmón.
En el contexto de la angiografía, un catéter se
pone dentro del ventrículo izquierdo vía inserción en la arteria
femoral. Se inyectan tintes, opacos a los rayos X, tanto en el
ventrículo izquierdo, como dentro de las propias arterias
coronarias. La inyección de tales agentes permite la visualización
de vasos al nivel de 100 \mum de diámetro, proyectando la
información en 3D hacia un plano de 2D. Actualmente la angiografía
permite identificar la estenosis de las arterias coronarias
mayores.
El uso de las microesferas grandes de la presente
invención con la tecnología de ultrasonido puede habilitar la
generación de imágenes tomográficas múltiples y también la
reconstrucción de imágenes en 3D. El depositar las microesferas
durante un tiempo suficiente como para habilitar la reconstrucción
de imágenes tomográficas o imágenes en 3D de la cama vascular, puede
delinear las camas de perfusión. Por consiguiente, adjunto a la
angiografía, un agente de contraste ecográfico de depósito,
constituido por las microesferas grandes de la presente invención,
puede permitir identificar territorios de perfusión en 3D para
identificar la lesión causativa mayor.
Gracias a la estabilidad frente a la presión de
las microesferas preferentes, éstas retienen aire y la ecogenicidad
durante un sustancial período de tiempo. Las microesferas se pueden
depositar en la vasculatura a continuación de la administración del
catéter, de una manera similar a los estudios clásicos con
microesferas, reflejando la cantidad de flujo a cualquier territorio
dado de perfusión. La imaginología del territorio puede hacerse
luego, después del retiro del catéter y de la estabilización del
paciente, para enseñar imágenes más óptimas en los planos múltiples
que deben ser captados. La comparación con una imagen de base no
reforzada enseña así la perfusión, seguida un procedimiento
correctivo, que debiera ser evaluado.
Las microesferas pueden adecuarse para uso
intracoronario no sólo por modificación de su tamaño y estabilidad
frente a la presión, sino también por su velocidad de
biodegradación.
Para el uso intracoronario, es preferible
reticular microcápsulas grandes (10-20 \mum) a
175ºC durante un período de 18-60 minutos, más
preferentemente 20-40 minutos, y lo más preferente
durante 35-40 minutos. Esto proporciona
microcápsulas que son resistentes a la presión, pero que tienen una
vida media del tejido acortada en comparación con las microcápsulas
del documento WO 92/18164 y, por consiguiente, son más aplicables
al usarlas en la microcirculación del miocardio. La vida media del
tejido puede medirse por el marcado de las microcápsulas con
^{125}I por el método de la Cloramina T, y evaluando el contenido
en microcápsulas del órgano por necrosis o la liberación del
^{125}I en la orina y heces.
Las "microesferas direccionadas" de la
presente invención se caracterizan por tener en sus paredes un
material que dirige u orienta las microesferas hacia una colocación
deseada en el cuerpo.
Las "microesferas direccionadas" de la
presente invención pueden ser preparadas incluyendo dentro o sobre
la pared de la microesfera un material que altere la carga
eléctrica de la microesfera.
Así, se puede impartir una carga positiva o
negativa aplicando un material cargado positiva o negativamente,
respectivamente, o se puede reducir una carga positiva o negativa
existente, o se la puede eliminar. Estos efectos pueden lograrse de
una variedad de maneras. Las microesferas del producto final (es
decir, resistentes a la presión) producidas por el proceso básico
de uno o dos pasos, descrito anteriormente, se pueden moler como
fue descrito con anterioridad y pueden ser resuspendidas para una
concentración de microesferas de 1,0-250
x10^{6}/ml en: una solución 0,5-20,0% p/v
(preferentemente 1,0- 10,0% p/v, por ejemplo, aproximadamente 5%
p/v) de un material cargado positiva o negativamente (si fuera
polimérico, de 1-30 kD, preferentemente
5-15 kD), y pueden ser incubadas durante
5-60 horas (preferentemente aproximadamente
8-24 horas) a 5-30ºC
(preferentemente aproximadamente 20ºC). Los ácidos poliaminados
positivamente cargados incluyen polilisina, poliaspartamida,
poliarginato y polihistidina. Los ácidos poliaminados negativamente
cargados incluyen poliglutamato y poliaspartato. Otros polímeros
negativamente cargados incluyen fosfolípidos, ácido hialurónico y
ácido poliglucónico. Una ventaja de tales agentes recubiertos de
contraste ecográfico es el aumentar la ecogenicidad del flujo de la
sangre para lograr una mejora en las señales Doppler.
Alternativamente, y más preferente, las carga
positivas o negativas sobre las microesferas pueden ser aumentadas
incorporando el material a la alimentación de secado en spray en el
intervalo de 1-30%, preferentemente
2-10% p/v. Este último método se prefiere
particularmente para el poliglutamato y, generalmente, para los
aditivos cargados negativamente.
Otros materiales, que pueden usarse de la misma
manera para impartir una carga negativa, incluyen los anhídridos y
cloruros de los ácidos orgánicos C_{1-10}, como
acético, fumárico y ácidos succínicos. Generalmente, es adecuada una
concentración final del cloruro o anhídrido de
5-1000 mg/ml, en un solvente no polar, como son la
dimetilformamida o tetrahidrofurano. Es conveniente un tiempo de
incubación de 0,5-5 horas, preferentemente
aproximadamente 1 hora, a 5-30ºC, preferentemente
aproximadamente 20ºC, seguido por un lavado con un exceso de
agua.
Las cargas negativas existentes en las
microesferas preparadas por el proceso básico de secado por spray
pueden ser retiradas exponiendo las microesferas a un agente
carbodiirnida, como el clorhidrato de
N-etil-N'-(3-dimetil-amino-propil)carbodiimida
(EDC), a una concentración de aproximadamente
5-1000 mg/ml durante un período de aproximadamente
5-30 horas (preferentemente aproximadamente 16
horas) a 5-30ºC (preferentemente aproximadamente
20ºC). El exceso de reactivo se elimina entonces, por ejemplo, por
lavado con etanolamina a tal concentración equivalente durante una
incubación adicional, antes de que las microesferas sean
lavadas.
Puede evaluarse la movilidad de las microesferas
en electroforesis en un aparato Malvern Zeta sizer o en una célula
de minielectroforesis de un sistema Pen Kem System 3000 (EE.UU.),
por ejemplo para 20 partículas en búferes de pH
4-10. Preferentemente, la movilidad en la
electroforesis está en uno de los intervalos positivo o negativo de
0,001-5,0 x 10^{-8} m/seg/v/cm. En estos
intervalos, la carga sobre las microesferas altera su comportamiento
circulatorio. Más preferentemente, la movilidad está en uno de los
intervalos positivo o negativo desde 0,01 hasta 0,5 x 10^{-8}
m/seg/v/cm, adecuadamente en uno de los intervalos positivo o
negativo desde 0,1 hasta 0,5 x 10^{-8} m/seg/v/cm.
En todos estos métodos de alteración de carga
sobre las microesferas, las microesferas resultantes pueden
finalmente formularse para almacenamiento como se ha descrito
anteriormente, suspendiéndolas por ejemplo en una solución manito
l/ Pluronic F 68, sometiéndolas a una congelación instantánea y a su
deshidratación por congelación.
La carga superficial de las microcápsulas puede
afectar las propiedades de imaginología del producto a través de su
influencia sobre el destino in vivo de las partículas. Por
ejemplo, se sabe que después de una inyección intravenosa de las
partículas negativamente cargadas del poliestireno se asimilan con
alta eficacia por el hígado, mientras que las partículas con una
carga positiva aumentan inicialmente en el pulmón. Adicionalmente,
se sabe que la superficie celular endotelial esta recubierta con un
glicocalyx que porta una carga negativa neta a valores fisiológicos
de pH. Por consiguiente, la superficie interna del endotelio puede
entintarse con partículas férricas coloidales que porten una carga
positiva neta. Por consiguiente, en las áreas de flujo lento o
débil, como las experimentadas en las camas capilares de la
vasculatura periférica, hígado, riñón y miocardio, el aumento de la
carga positiva neta en la corteza de las microcápsulas y del
revestimiento endotelial puede conducir a un tránsito deprimido a
través de la microcirculación. Esto crea la posibilidad de ventanas
de imaginología extendidas o incluso al depósito de agentes de
contraste ecográfico para el análisis de la microvasculatura
posterior a su administración intravenosa.
Las microesferas de "larga vida" tienen un
tiempo incrementado de circulación en el cuerpo, de forma tal que
t_{1/2} del suero por lo menos es 5 minutos, preferentemente por
lo menos 10 minutos, y el más preferente por lo menos 15 minutos.
Tales tiempos incrementados de circulación pueden ser logrados
recubriendo las microesferas con un material que oriente las
microesferas fuera del sistema retículo endotelial.
t_{1/2} in vivo puede evaluarse por el
marcado de las microcápsulas con ^{125}I usando el conocido
método de la Cloramina T, y administrándolas en la vena de la oreja
de un conejo de Nueva Zelanda adulto masculino, como en forma
general se describe más adelante en el Ejemplo Específico 10. El
nivel en suero del ^{125}I es medido por el conteo de la
radiación gamma.
Por ejemplo, dicho material puede ser uno que
reduzca o sustancialmente prevenga la "opsonización",
deposición de material proteináceo (como el fibrinógeno) sobre las
microesferas, dirigiendo así las microesferas fuera del hígado y
bazo. Materiales convenientes con que cubrir las microesferas
incluyen copolímeros de bloques de las series de poloxámeros (es
decir, copolímeros polietilenglicol/ óxido de polietileno), como
poloxámero 338, poloxámero 407 y poloxámero 908.
Al prolongar la vida media circulatoria de
microcápsulas conteniendo aire, altamente resistentes a la presión,
se tornan detectables las áreas de muy bajo flujo, como las que se
encuentran en las camas capilares, más aún que por los estudios
Doppler mejorados. El flujo de sangre anormal, asociado a los
carcinomas de células hepáticas, carcinomas renales, y tumores del
pecho, puede detectarse con el uso de técnicas Doppler. En general,
los tumores malignos mayores muestran los mayores cambios de
señales, y las señales Doppler anormales se vuelven más difíciles
de descubrir en tumores menores. Con los tumores malignos del
pecho, por ejemplo, la baja fuerza de señales provenientes de
dispersores móviles, cuyo eco se "diluye" por las del tejido
sólido estacionario, es un factor limitante en la detección de
tumores pequeños. Un criterio para la detección por Doppler del
flujo tumoral es la heterogeneidad de la distribución espacial de
vasos después de la neovascularización. El refuerzo por el
contraste permite el despliegue de vasos menores y por esto aumenta
la utilidad de este criterio en los estudios Doppler a color. El
agente puede reforzar la retrodispersión en tumores y vasos
normales. La reflectividad reforzada de la sangre mejora la
detección y diferenciación de tumores pequeños en órganos tales
como el pecho, hígado, riñones, páncreas y ovarios.
También, el agente de contraste de ultrasonido
puede ayudar a diferenciar las áreas de vascularidad normal de las
áreas de flujo reducido o ausente, debido a una presencia de tumor
o necrosis. La demostración de flujo arterial normal del parénquima
dentro de las áreas que fueron consideradas anormales puede ayudar a
distinguir el parénquima normal de los seudotumores (infiltración
focal en grasa del hígado o columnas renales de Bertin). Agentes de
contraste de ultrasonido también pueden mejorar los ecos de la
sangre arterial para la detección de isquemia u oclusión. En los
casos de oclusión parcial, el flujo a menudo es lo bastante rápido
para la detección por Doppler, pero la cantidad de sangre (que, con
la atenuación del tejido, determina la fuerza de la señal)
atravesando el estrechamiento puede ser lo bastante grande como para
ser detectada con el actual equipo Doppler. Bajo ciertas
circunstancias, la introducción de más reflectores puede ayudar a
la delineación del sitio a estrechar. Un agente de contraste
también puede ayudar a la visualización de colaterales causados por
oclusión o estenosis severa.
Las microesferas de vida larga se preparan de la
misma manera como las microesferas direccionadas descritas
anteriormente, en otros términos, el material de la capa puede
aplicarse a una suspensión de las microesferas secadas por spray
antes de que éstas se deshidraten por congelación, o puede incluirse
en la alimentación al secado por spray.
Una suspensión de las microesferas de la presente
invención generalmente se administra por inyección de
aproximadamente 1,0-10,0 ml en una vena conveniente
como la vena cubital u otro vaso sanguíneo. Es conveniente una
concentración de microesferas desde aproximadamente 1,0x10^{5}
hasta 1,0x10^{12} partículas/ ml, preferentemente desde
aproximadamente 5,0 x 10^{5} hasta 5,0 x 10^{9}.
Aunque la imaginología ultrasónica es aplicable a
sistemas de órganos del cuerpo de diversos animales y humanos, una
de sus aplicaciones principales es la obtención de imágenes de
tejidos del miocardio y modelos de perfusión o flujo de sangre.
Las técnicas usan equipo de examen ultrasónico
que consiste en un escáner y aparato de imaginología. El equipo
produce imágenes visuales de un área predeterminada, en este caso,
de la región del corazón de un cuerpo humano. Típicamente, el
transductor se pone directamente sobre la piel encima del área a
ser imaginada. El escáner aloja varios componentes electrónicos que
incluyen transductores ultrasónicos. El transductor produce ondas
ultrasónicas que realizan un examen de un sector de la región del
corazón. Los ultrasonidos se reflejan por las diversas porciones de
la región del corazón, se reciben por el transductor receptor y se
procesan de acuerdo con métodos de pulsos de eco, conocidos en la
técnica. Después de procesadas, las señales se envían al aparato de
imaginología (también bien conocido en la técnica) para su
visualización.
En el método de la presente invención, después de
que el paciente esté "preparado" y el escáner esté en su
lugar, se inyecta la suspensión de microesferas, por ejemplo a
través de una vena del brazo. El agente de contraste fluye a través
de la vena al lado venoso derecho del corazón, a través de la
arteria pulmonar principal que lleva a los pulmones, por los
pulmones, a través de los capilares, dentro de la vena pulmonar y
finalmente dentro el atrio izquierdo y la cavidad ventricular
izquierda del corazón.
Con las microesferas de la presente invención,
pueden hacerse observaciones y diagnósticos con respecto a la
cantidad de tiempo requerida para que la sangre atraviese los
pulmones, los modelos de flujo de la sangre, el tamaño del atrio
izquierdo, la competencia de la válvula mitral (que separa el atrio
izquierdo y el ventrículo izquierdo), dimensiones de la cámara en la
cavidad ventricular izquierda y anormalidades de movimiento de la
pared. En la eyección del agente del contraste desde el ventrículo
izquierdo, también puede analizarse la competencia de la válvula
aórtica, así como la fracción de eyección o porcentaje de volumen
eyectado desde el ventrículo izquierdo. Finalmente, los modelos de
contraste en el tejido indicarán cuáles áreas, si las hubiera, no
están siendo adecuadamente perfusas.
En resumen, un modelo tal de imágenes ayudará a
diagnosticar las características inusuales del flujo de sangre
dentro del corazón, la competencia valvular, dimensiones de cámara
y movimientos de pared, y proporcionará un indicador potencial de
perfusión miocárdica.
Las microesferas pueden permitir la imaginología
del corazón izquierdo a partir de inyecciones intravenosas. Las
microesferas de albúmina, cuando se inyectan en una vena
periférica, pueden ser capaces de un pasaje transpulmonar. Esto
produce la opacificación ecocardiográfica de la cavidad del
ventrículo izquierdo (LV, por las siglas de su expresión inglesa,
Left Ventricle), así como del tejido miocárdico.
Además del escáner brevemente descrito
anteriormente, existen otros escáneres ultrasónicos, cuyos ejemplos
se revelan en las patentes de los EE.UU. Nº 4.134.554 y 4.315.435,
cuyas revelaciones están incorporadas a la presente solicitud como
referencias. Básicamente, estas patentes se refieren a varias
técnicas que incluyen la ecografía dinámica de sección transversal
(DCE, por las siglas de su expresión inglesa, Dynamic
Cross-Sectional Echography) para producir imágenes
bidimensionales secuenciales de cortes transversales de anatomía
animal o humana por medio de energía ultrasónica a una velocidad de
trama suficiente como para habilitar la visualización dinámica de
los órganos en movimiento. Generalmente los tipos de aparatos
utilizados en DCE se denominan escáneres DCE, y transmiten y
reciben pulsos cortos, sónicos, en forma de rayos o líneas
estrechas. La fuerza de las señales reflejadas es una función del
tiempo que se convierte a una posición, usando una velocidad nominal
de sonido y se despliega en un tubo de rayos catódicos u otros
dispositivos convenientes de manera algo análoga a los monitores de
radar o sonar. Aunque la DCE puede usarse para producir imágenes de
muchos sistemas de órganos incluyendo hígado, vesícula, páncreas y
riñón, frecuentemente se usa para la visualización de tejido y
vasos sanguíneos mayores del corazón.
Las microesferas pueden usarse para la
imaginología una variedad amplia de áreas, incluso cuando se
inyectan a un sitio venoso periférico. Esas áreas incluyen (sin
limitación): (1) sistema de drenaje venoso al corazón; (2) tejido
miocárdico y características de la perfusión durante una prueba de
ejercicios o análogas; y (3) tejido miocárdico después de una
ingestión oral o inyección intravenosa de drogas diseñadas para
aumentar el flujo de sangre al tejido. Adicionalmente, las
microesferas pueden ser útiles delineando los cambios en la
perfusión de tejido miocárdico, debidos a intervenciones como (1)
injertos por venas de la arteria coronaria; (2) angioplastia de
arteria coronaria (dilatación por globo de una arteria estrechada);
(3) uso de agentes trombolíticos (como la estreptoquinasa) para
disolver coágulos en las arterias coronarias; o (4) defectos o
cambios de perfusión debido a un reciente ataque cardíaco.
Además, en el momento de un angiograma coronario
(o de un angiograma de sustracción digital) una inyección de
microesferas puede proporcionar datos con respecto a las
características de perfusión del tejido que aumentarían y
complementarían los datos obtenidos del procedimiento de angiograma
que identifica la anatomía sólo de vasos sanguíneos.
A través del uso de las microesferas de la
presente invención, otros sistemas de órganos no cardíacos
incluyendo el hígado, bazo y riñón que son actualmente imaginados
por técnicas ultrasónicas pueden ser adecuados para mejora de tales
imágenes actualmente ya asequibles, y/o generación de nuevas
imágenes que muestren las características de perfusión y flujo, que
no habían sido previamente susceptibles a la imaginología usando la
técnica anterior de imaginología ultrasónica.
Se describirán ahora aspectos preferentes de la
presente invención por vía de ejemplo y con la referencia a:
La Figura 1 es una vista en perspectiva de un
corte parcial frontal y un lado del aparato conveniente de secado
por spray para la primera fase del proceso de la invención.
La Figura 2 es un gráfico que muestra cómo el
grado de fijación de las paredes de las microesferas (en este caso,
la albúmina) se puede controlar variando la temperatura y el tiempo
de calentamiento en el segundo paso del proceso.
La Figura 3 es un gráfico que muestra cómo la
resistencia a la presión de las microesferas se puede variar
alterando la duración del tiempo de calentamiento en el segundo
paso del proceso.
La Figura 4 es un gráfico que muestra cómo se
puede variar la velocidad de biodegradación in vitro,
variando la duración del tiempo de calentamiento en el segundo paso
del proceso, evaluado por medida turbidimétrica para medir la
desaparición de las microcápsulas.
Las figuras 5a y 5b todavía son respectivas
copias para exhibición de cinta de vídeo, mostrando la apariencia
de miocardio de cerdo antes y después de la inyección de 4 millones
de microcápsulas grandes de la presente invención en el ventrículo
izquierdo.
Ejemplo preparativo general nº
1
Los ejemplos preparativos generales 1 hasta 10 no
pueden, sin modificación ulterior, producir microcápsulas de la
presente invención.
El secador de secado por spray adecuado (Figura
1) está disponible en A/S Niro Atomizer, Soeborg, Dinamarca bajo la
denominación comercial "Mobile Minor". Detalles de su
construcción se dan en la presente solicitud, inmediatamente antes
de las reivindicaciones. Comprende un atomizador centrífugo (Tipo
M-02/B Minor), manejado por una turbina a una
presión mínima de aire 4 bar y máxima 6 bar. A unas 6 bar se
alcanza una velocidad de rueda de atomizador de aprox. 33,000 rpm.
Se suministra y retira el aire comprimido del atomizador por medio
de una válvula colocada en el panel del instrumento. El consumo
máximo de aire comprimido suministrado al atomizador es 17
Nm^{3}/h a una presión de 6 bar. Todas las partes que entran en
contacto con la alimentación líquida y el polvo estás hechas de
acero inoxidable AISI 316, excepto el tubo de la bomba de
alimentación y la rueda del atomizador que están hechas de acero
inoxidable AISI 329, confeccionado para resistir una alta fuerza
centrífuga. El sistema 4 de tubería de interconexión de acero
inoxidable puede fácilmente despojarse desde abajo para su
limpieza.
La cámara de secado tiene un interior
confeccionado de acero inoxidable AISI 316, bien aislado con
Rockwool, y está recubierta por fuera con una chapa de acero al
carbono. La cámara de secado se proporciona con una luz lateral y
una hoja de vidrio de observación para su inspección durante el
funcionamiento y los pasos 5 para acceso a la cima de la cámara. El
tejado de la cámara de secado es confeccionado por dentro de acero
inoxidable AISI 316 y por fuera de acero inoxidable AISI 304. Hay
un interruptor 6 para una válvula de aire para activación del
dispositivo de levantamiento neumático al levantar la tapa de la
cámara.
Un distribuidor 2 de aire, confeccionado de acero
inoxidable AISI 304, se emplea para la distribución del aire en la
cámara de secado a fin de alcanzar el mejor efecto posible de
secado. Se dirige el aire removido alrededor de un atomizador de
disco con aspas. Un conducto de aire, confeccionado de acero
inoxidable AISI 316, proporciona el transporte lateral del aire de
descarga y del polvo al ciclón 7, confeccionado de acero inoxidable
AISI 316 y diseñado para separar el polvo del aire.
Una válvula de cierre del tipo mariposa, también
está confeccionada de acero inoxidable AISI 316 y está provisto de
una empaquetadura de caucho silicona, se usa para la descarga
hermética del polvo desde debajo del ciclón hacia un frasco 8 de
vidrio, colector de polvo, que se encuentra situado bajo el ciclón
accionado por un dispositivo de muelle.
Un ventilador centrífugo 10 de descarga,
confeccionado de silumin, completado con un motor trifásico de
jaula de ardilla, 025 kV y cinta en forma de V, accionado por una
cinta guardián, arrastra el aire y polvos a través de la cámara de
secado y ciclón. Hay un interruptor 11 para el control de flujo de
aire vía un regulador del tiro.
Un calentador eléctrico de aire 12 calienta el
aire de secado (consumo total 7,5 kVh/h, variable continuo) y puede
sumionistrar una temperatura de aire a la entrada de
aproximadamente 350ºC, aunque generalmente ésta es demasiado alta
para la preparación de las microesferas de la presente
invención.
La capacidad de evaporación es como sigue:
Capacidad de
evaporación
| Aire de secado | Temperatura del aire | Temperatura del aire | Capacidad de |
| a la entrada, ºC | a la salida, ºC | evaporación kg/h | |
| 85 | 150 | 80 | 1,3 |
| 85 | 170 | 85 | 1,7 |
| 80 | 200 | 90 | 2,5 |
| 80 | 240 | 90 | 3,4 |
| 75 | 350 | 90 | 7,0 |
Pueden agregarse equipos para atomización
simultánea de dos fluidos empleando una boquilla, que se
confecciona de acero inoxidable AISI 316 y consiste en una tubería
de entrada con un sostenedor de la boquilla y propiamente la
boquilla, que debe ser localizada en el techo de la cámara de
secado. El equipo incluye un separador aceite / agua, una válvula
reductora y manómetro para el aire comprimido suministrado a la
boquilla para dos fluidos. El consumo de aire comprimido es de
8-15 kg/h a una presión de 0,5-2,0
bar (0,5-2,0 x 10^{5} Pa).
Se emplea una bomba peristáltica adecuada para el
transporte de la alimentación de la preparación destinada a la
formación de las paredes de los gránulos, suministrada desde un
recipiente 1 a la boquilla atomizadora 3. La bomba está provista de
un motor (1 x 220V, 50 Hz, 0,18 Kw.) y un engranaje continuo
variable para ajuste manual. Una tubería de alimentación
confeccionada de manguera de silicona se extiende desde un tanque
de alimentación (suministro local) 1 a través de la bomba de
alimentación hasta el dispositivo de atomización 3 de tipo
rotatorio o de boquilla.
Un filtro absoluto de aire, consistiendo en un
prefiltro, el cuerpo de filtro, realizado en acero inoxidable, y el
filtro absoluto de aire, se emplea para tratamiento del aire de
secado entrante para abastecerlo completamente limpio. El aparato
entero es controlado desde un panel 9 de instrumentos.
Una solución en agua al 20% de rHA estéril, libre
de sustancias pirógenas, (adecuado para inyección) se bombea a la
boquilla de un atomizador, provisto de boquilla para dos fluidos,
montada en la unidad comercial de secado por spray descrita
anteriormente. La velocidad de la bomba peristáltica se mantuvo a
una tasa aproximadamente de 10 ml/minuto de forma que con una
temperatura de entrada del aire de 220ºC, la temperatura de salida
del aire se mantuvo a 95ºC.
Se suministró aire comprimido a la boquilla
atomizadora para dos fluidos a una presión de
2,0-6,0 bar (2,0-6,0 x 10^{5} Pa).
En este intervalo, se obtienen microesferas con un tamaño promedio
de 4,25-6,2 \mum.
Típicamente, un aumento en el tamaño promedio de
partículas (por presión reducida de atomización) llevó a un aumento
en la cantidad de microesferas con un tamaño superior a 10 \mum
(véase Tabla 1).
| Presión de atomización, (x 105 Pa) | Frecuencia de superiores a 10 \mum, % |
| 6,0 | 0,8 |
| 5,0 | 3,0 |
| 3,5 | 6,6 |
| 2,5 | 8,6 |
| 2,0 | 13,1 |
En el segundo paso del proceso, se calentaron 5 g
de microesferas en un beaker, usando un horno Gallenkamp. Un
calentamiento durante 1 hora a una temperatura de 175ºC era
suficiente para proporcionar microesferas con 100% de fijación,
determinado por HPLC (por las siglas de su expresión inglesa, High
Pressure Liquid Chromatography). El efecto de esta fijación por
calentamiento fue el aumento in vitro de la vida media
ecogénica desde unos segundo hasta más de 30 minutos. Alterando la
temperatura y duración de la incubación es posible variar el grado
de fijación entre aproximadamente 5% y 100%. Los ejemplos de los
perfiles de fijación por calentamiento al variar las temperaturas se
muestran en la Figura 2.
A continuación de la fijación por calentamiento,
las microesferas fueron deaglomeradas y dispersadas en agua en una
de las dos maneras. El Método 1 involucraba primero la mezcla de
las esferas, fijadas por calor, con un peso igual de lactosa
finamente molida (diámetro promedio 5 \mum). La mezcla se pasó
luego a través de un molino centrífugo Fritsch con una pantalla de
0,5 mM y un rotor de dientes 12. Las esferas molidas se
recolectaban y se pasaban a través del molino una segunda vez para
asegurar que había ocurrido un mezclado completo. El polvo molido
era luego resuspendido en agua que contenía 1 mg.ml^{-1} de
Pluronic F68. Típicamente, se agregaban 10 g de microesferas y
lactosa a 100 ml de agua. El Método 2 para la deaglomeración
involucraba la adición de 5 g de las microesferas fijadas por
calentamiento a 100 ml de agua que contenía 100 mg de Pluronic F68.
Las microesferas se dispersaron usando un homogenizador Silverson
(modelo L4R con una sonda tubular de homogenización de 2,54
centímetro y una pantalla de alto factor de esquila) y se
homogenizaba la dispersión durante 60 segundos.
Las esferas resuspendidas fueron separadas en
intactas (que contenían gas) y esferas rotas, usando una técnica de
flotación. Las esferas que contenían gas fueron vistas flotar sobre
la superficie durante un período de 1 hora y se decantaron de la
fracción que se hundió, que no contenían el gas requerido.
El proceso de separación puede acelerarse por
centrifugación. Unos 30 segundos de centrifugación a 5000 x g es
suficiente para separar las dos fracciones.
A continuación de la separación, las microesferas
intactas se deshidrataron por congelación en presencia de lactosa y
Pluronic F68. Las condiciones óptimas para la deshidrataron por
congelación involucraban la resuspensión de 30 mg de microesferas
en 5 ml de agua que contenía 50 mg de lactosa y 5 mg de Pluronic
F68. Las microesferas deshidratadas por congelación pueden ser
redispersadas en un líquido (es decir, agua o solución salina) para
dar una distribución monodispersa.
Ejemplo preparativo general
2
El proceso del Ejemplo 1 fue repetido, pero con
las siguientes diferencias en el primer paso: se usó un atomizador
centrífugo, en lugar de una boquilla para dos fluidos; la
temperatura de entrada fue 150ºC (con la temperatura del aire de
salida todavía manteniéndose a 105ºC); y se suministró aire
comprimido a la boquilla a 1,0-6,0 x 10^{5} Pa.
La rueda giró a 20-40,000 rpm y proporcionó las
gotas, y como consecuencia las microesferas, con un diámetro
promedio numérico en el intervalo de 1,0-8,0
\mum.
Ejemplo preparativo general
3
El segundo paso del proceso del Ejemplo 1 o del 2
fue variado como sigue. Una alícuota pequeña de las microesferas
(0,5 g) fue calentada en un horno de microonda que recibió
300-350 vatios horas de calor por microondas a 2500
mHz. Esto dio microesferas en las que un 90-95% de
la rHA monomérica resultó insoluble (determinada por cromatografía
de permeación en gel) y, como resultado de esta fijación por
calentamiento, su vida media ecogénica in vitro aumentó de
unos segundos a más de 30 minutos.
Ejemplo preparativo general
4
El segundo paso del proceso de Ejemplo 1 o 2 fue
variado como sigue. Una alícuota pequeña de las microesferas (0,5
g) se selló en atmósfera de argón en un vial de vidrio. El vial se
enfrió a 4ºC y luego se irradió con una fuente de ^{60}Co de
radiación gamma para proporcionar una dosis 15,0 kGy de rayos gamma.
La irradiación provocó la formación de microesferas, en las que un
10-15% de la albúmina monomérica era insoluble.
Ejemplo preparativo general
5
El segundo paso del proceso del Ejemplo 1 o del 2
fue variado como sigue. Una alícuota pequeña de las microesferas
(0,5 g) se selló en atmósfera de argón en un vial de vidrio. El
vial se enfrió a 4ºC y luego se irradió con una fuente de ^{60}Co
de radiación gamma para proporcionar una dosis 50,0 kGy de rayos
gamma a las microesferas. A continuación de la irradiación, las
microesferas se incubaron en oxígeno a 50ºC durante 6 horas. La
irradiación producía la formación de microesferas en las que
50-60% del rHA monomérica era insoluble.
Ejemplo preparativo general
6
El segundo paso del proceso del Ejemplo 1 o del 2
fue variado como sigue:
Una alícuota pequeña de microesferas (0,5 g) se
resuspendió en 5 ml de etanol, cloroformo o cloruro de metileno que
contenían a) 1,5% de glutaraldehído, b) 2,0% de cloruro de
diftaloílo o c) 5,0% de formaldehído. Las microesferas se agitaron
durante tiempos diferentes desde 10 minutos hasta 3 horas. Las
microesferas se retiraron por filtración y se lavaron completamente
en el búfer orgánico original que contenía 5% de etanolamina para
retirar el exceso del agente de reticulación. Finalmente, las
microesferas se lavaron en el solvente orgánico y se secaron al
vacío para retirar cualquier solvente residual. La magnitud de
insolubilización puede variarse entre 5-100% por
este método que resulta en la extensión de la vida media ecogénica
in vitro desde 1-2 minutos hasta más de una
hora.
Ejemplo preparativo general
7
Pueden combinarse los dos pasos independientes de
formación de las microesferas e insolubilización de la corteza en
un solo proceso. En este ejemplo, la formación de las microesferas
y la insolubilización del material polimérico se logran
simultáneamente durante el proceso del secado por spray.
Una solución de rHA se alimentó por la bomba
peristáltica a una cámara pequeña de reacción, con una línea
separada de alimentación que proporciona una solución al 5% del
agente conveniente de reticulación, por ejemplo, glutaraldehído,
cloruro de diftaloílo o formaldehído. El tiempo de residencia en la
cámara de reacción era tal que fue lograda la formación del aducto
inicial entre el agente de reticulación y la proteína, pero fue
prevenida la reticulación intraproteína. La salida de la vasija de
reacción se dispuso directamente en los atomizadores de boquillas
para dos fluidos montados en una unidad de secado por spray
especialmente adaptada, capaz de manejar solventes volátiles. Las
condiciones de secado por spray fueron como se precisó en el
Ejemplo 1. Las microesferas se incubaron en seco a temperatura
ambiente para permitir que tenga lugar la reticulación
intraproteína y luego se suspendieron en etanol que contenía 5% de
etanolamina para extinguir cualquier agente de reticulación
remanente. Fue realizado el lavado completo de las microesferas y
finalmente las microesferas fueron secadas al vacío para retirar el
solvente residual.
Ejemplo preparativo general
8
Un volumen de 1ml de etanol se agregó a 100 mg de
microesferas en una botella de vidrio de 20 ml y se sometieron al
ultrasonido durante 30 segundos. A esta suspensión se le agregaron
19 ml de H_{2}O.
La mezcla se centrifugó en una Microfuge de banco
(Gilson) durante 20 segundos y se ensayó la fracción transparente.
El ensayo se realizó cargando automáticamente 50 ml de la fracción
dentro de un cromatógrafo líquido Shimadzu LC6A HPLC y se
cromatografió en una columna TSK de permeación por gel a una
velocidad de flujo de 1 ml * minuto^{-1}, usando un búfer de
fosfato de sodio (pH 7,0).
Se grabaron las alturas máximas que representan
el monómero de rHA y se determinó la concentración del monómero,
usando una curva normalizada entre 1 y 10 mg*ml^{-1} monómeros de
rHA.
El % de rHA monomérica libre se calculó midiendo
la concentración del monómero en las microesferas fijadas y
representando este valor como un porcentaje de la concentración del
monómero en las microesferas sin fijar. Los resultados se dan en la
Figura 2.
Calentar en un horno (como está descrito en el
Ejemplo 1) las microesferas secadas por spray resulta en una
disminución de la cantidad de monómero que se puede detectar (véase
la Figura 2). Esta disminución de la rHA monomérica detectable es
debida a la desnaturalización y reticulación de la rHA monomérica a
polímeros insolubles que no se pueden ensayar por el método
mencionado de HPLC.
Usando el método de HPLC para evaluar los niveles
de verificación de la rHA, queda claro de la Figura 2 que después
de una incubación de 15 minutos no hay presente ninguna rHA
monomérica libre en las microesferas de rHA. Sin embargo todavía es
posible reticular aún más las microesferas de rHA calentándolas
durante períodos más largos.
Este calentamiento prolongado resultó en un nivel
incrementado de reticulación de las microesferas que a su vez
produce microesferas de resistencia creciente que son
correspondientemente de una mayor resistencia a la presión.
Por el control cuidadoso de la temperatura y del
tiempo de incubación, es posible producir microesferas con un
intervalo controlado de reticulación (y de su resistencia a la
presión y velocidad de biodegradación).
Ejemplo preparativo general
9
Un lote de microesferas de rHA del paso inicial
de secado por spray del proceso fue dividido en alícuotas de 5 g y
calentado a 175ºC para diferentes duraciones de tiempo como se ha
mostrado en la Figura 3.
A continuación de la fijación por calentamiento,
fue determinada la cantidad de monómero libre tal como se ha
descrito en el Ejemplo 8. Para cada una de las incubaciones
mostradas, no se encontró ninguna rHA monomérica detectable.
Las microesferas fijadas por calor se
desagregaron usando un molino centrífugo Fritsch (como se ha
descrito anteriormente) y las microesferas intactas, conteniendo
aire, se recuperaron por la técnica de flotación ya mencionada. Las
microesferas recuperadas fueron suspendidas en H_{2}O conteniendo
Pluronic F68 (1 mg*ml^{-1}) a una concentración de 0,5 x 10^{8}
cápsulas * ml^{-1}.
Las microesferas conteniendo aire se
resuspendieron y se sometieron a una presión atmosférica aumentada,
aplicando la presión con una jeringa de 50 ml, mientras que se
contenía esta suspensión en un recipiente cerrado (recipiente de
poliestireno de 25 ml).
Para cada una de las presiones evaluadas, la
suspensión individual de microesferas se presurizó a la presión
seleccionada y se mantuvo a esta presión durante 5 segundos antes
de liberar la presión. Para cada suspensión analizada el aumento de
presión se realizó 3 veces. La presión en el recipiente cerrado se
evaluó por un manómetro portátil
RS.
RS.
A continuación de la presurización, las
suspensiones de las microesferas se evaluaron por microscopía
visible y análisis de imagen y se evaluó el % de microesferas
conteniendo aire respecto a las que no contenían aire. Este
análisis se realiza ya que sólo las microesferas conteniendo aire
son funcionales en la mejora del contraste ecográfico del
ultrasonido.
Como puede verse en la Figura 3, las microesferas
que fueron fijadas durante 60 minutos a 175ºC, como se ha descrito
en el Ejemplo 1, son estables a todas las presiones a las que se
sometieron en este experimento.
Por el control cuidadoso de la duración de la
incubación a esta temperatura particular (175ºC) es posible
producir lotes de microesferas con diferentes grados de
reticulación, las que a su vez son resistentes a diferentes grados
de incremento de la presión.
Usando este control cuidadoso de reticulación por
el ajuste de la duración y de la temperatura de incubación es
posible producir lotes de microesferas conteniendo aire diseñadas
para resistir a un aumento de presión designado
específicamente.
La temperatura usada para reticular las
microesferas pueden variar infinitamente, como también lo puede la
duración del tiempo de incubación.
Ejemplo preparativo general
10
Una ventaja del proceso de la presente invención
es que permite controlar el tamaño promedio y distribución del
tamaño de las microesferas. Sin embargo, se pueden seleccionar los
tamaños aún más deseados si se desea, por ejemplo por flotación. En
una dispersión homogénea de microesferas, las partículas mayores
subirán más rápidamente a la superficie, que las partículas menores,
debido a la inferior densidad (más aire encapsulado) de las
partículas mayores. Así que cuando se permite que la dispersión
esté en reposo, la distribución del tamaño de partículas cambiará
en cualquier nivel de la solución con respecto al tiempo.
Se dispersaron las microesferas en 2000 ml de
solución acuosa que contenía 6% p/v de cloruro de sodio y 0,1% p/v
de Pluronic F68 en una botella de vidrio que presenta una columna
líquida de aproximadamente 165 mm. Un tubo de muestreo se colocó a
50 mm por debajo de la superficie superior del líquido para permitir
la retirada de muestras a determinados intervalos de tiempo.
Al variar el tiempo de reposo y la concentración
del cloruro de sodio, fue posible producir una variedad de
distribuciones de tamaño de partículas y clasificar las
microesferas por debajo de 2 \mum.
Otras técnicas vía húmeda para la clasificación
incluyen cromatografía hidrodinámica y fraccionamiento por flujo de
campo. Las "Técnicas vía Seca", que usan los principios de
elutriación y separación por flujo transversal, están
comercialmente disponibles en forma de los aparatos clasificadores
Microsplit (British Rem.), Zigzag (Alpine) yTurbo (Nissuin). El
clasificador de codo a chorro producido por Nitettsu Mining Co usa
un principio diferente (Efecto Coanda) que también podría lograr
buenos resultados en la clasificación de microesferas.
Ejemplo específico
1
Una solución de albúmina humana (5% p/v) fue
secada por spray a una temperatura de entrada de 220ºC y una
presión atmosférica de 1,5 bar como en el Ejemplo Preparativo
General 1. Las partículas resultantes son fijadas por calor durante
un período de 20 minutos a 175ºC en un horno de aire. Las muestras
fueron deaglomeradas moliendo con manitol, y las partículas fueron
resuspendidas en una solución de 10 mg/ml de manitol y 0,06 mg/ml de
Pluronic F68. Las partículas intactas se volvieron cremosas y se
recogieron; la suspensión de microesferas se deshidrató por
congelación.
Se produjeron partículas predominantemente de
10-20 \mum que contenían aire y eran
sustancialmente resistentes a la presión.
Ejemplo específico
2
Fue resuspendida polilisina a una concentración
de 5% p/v con las microesferas del Ejemplo Preparativo General 2
(100 x 10^{6} partículas/ml) y se incubaron toda la noche a 20ºC.
Se les agregaron manitol y Pluronic F68 a la concentración descrita
en el Ejemplo Específico 1 y a continuación la suspensión se sometió
a congelación instantánea y se deshidrató por congelación.
Ejemplo específico
3
Ácido hialurónico a una concentración de 5% p/v
se incubó durante toda la noche con microesferas resuspendidas,
preparadas como en el Ejemplo Preparativo General 1 a 20ºC (100 x
10^{6} microesferas/ml). Se agregaron manitol y Pluronic F68, a
una concentración de 10 y 0,06 mg/ml respectivamente, y la
suspensión luego se sometió a congelación instantánea y se
deshidrató por congelación.
Ejemplo específico
4
Las microesferas fueron resuspendidas según el
Ejemplo Preparativo General 3 en una solución de DMF
(Dimetilformamida) a una concentración de 100 x 10^{6}
partículas/ml. Fue agregado anhídrido acético para dar una
concentración final del anhídrido ácido de 100 mg/ml. La mezcla de
microesferas se incubó luego a 20ºC durante 1 hora, diluida con agua
y se filtró y lavó con agua en exceso sobre un período de 1 hora.
Las microesferas se formularon en Manitol y Pluronic F68 como se ha
descrito anteriormente. Este método imparte carga negativas.
Ejemplo específico
5
Las microesferas fueron resuspendidas según el
Ejemplo Preparativo General 1 en una solución acuosa en una
concentración de 100 x 10^{6} partículas/ml. Se agregó una
solución acuosa de carbodiimida a la suspensión de las microesferas
para dar una concentración final de 100 mg/ml. Después de una
incubación durante 16 horas a 20ºC, el exceso de reactivo se
eliminó por adición de glicina a una concentración equivalente, y se
realizó una incubación adicional durante 16 horas a 20ºC. Las
microesferas se lavaron luego con agua formulada como se ha
descrito anteriormente. Este procedimiento elimina las carga
negativas.
Ejemplo específico
6
Las microcápsulas del método del Ejemplo
Preparativo General 2 se formularon con poloxámero 407 y manitol a
una concentración de 0,1 y 10 mg/ml respectivamente.
Ejemplo específico
7
Se agregó
Poli-L-lisina (15-25
kDa) a la alimentación de rHA (20% p/v) para una concentración
final de 0,5% p/v antes del secado en spray. Fue seguido el método
del Ejemplo Preparativo General 2 para obtener en la corteza de las
microcápsulas un incremento de carga positiva.
Ejemplo específico
8
Se agregó
Poli-L-glutamato
(15-30 kDa) a la alimentación de rHA (20% p/v) para
una concentración final de 0,5% p/v antes del secado en spray. Fue
seguido el método del Ejemplo Preparativo General 2 para obtener en
la corteza de las microcápsulas un incremento de carga
negativa.
Ejemplo específico
9
Las microesferas del Ejemplo Específico 1 pueden
usarse en un análisis in vivo para establecer la viabilidad
de delinear territorios de perfusión en el miocardio de un corazón
de cerdo.
Un cerdo Yorkshire de 25 kg se anestesió y se
ventiló totalmente según la metodología perfilada en Ten Cate et
al (1992) Cardiovascular Research 26,
32-39. A 5. Se insertó un catéter 5 French vía la
arteria femoral, aorta ascendente y raíz aórtica dentro del
ventrículo izquierdo. Se realizó una inyección de 4 millones de
microcápsulas del Ejemplo Específico 1, y para evaluar la perfusión
regional se usó la ecocardiografía transtorácica bidimensional en
el plano del eje corto usando un Hewlett Packard sono 1000, provisto
con un transductor de 3,5 MHz. Fue observada una opacificación
intensa del miocardio (véase la Figura 5), mostrando que no ocurrió
ninguna redistribución de microcápsulas huecas sobre un período de
2 horas. Las inyecciones posteriores de microcápsulas en el
ventrículo izquierdo produjeron una aclaración secuencial del
miocardio, dependiente de las dosis. Se supervisaron los parámetros
hemodinámicos y éstos no mostraron ningún efecto adverso de la
inyección a estos bajos niveles de microcápsulas.
Ejemplo específico
10
Se inyectaron las microcápsulas del Ejemplo
Específico 6 en la vena de la oreja de un conejo de Nueva Zelanda
(4,5 kg), ligeramente sedado, a una concentración de 300 millones
de partículas/ml. Se evaluaron las señales Doppler de la arteria
femoral usando un aparato Interspect modelo 7000, equipado con un
transductor de 10 MHz. Fueron obtenidas las señales básicas antes
de contrastar la inyección para posibilitar la comparación de las
señales Doppler de antes y después de la inyección del contraste.
Una vez que se obtuvieron las señales básicas, no fueron alterados
los controles temporales de ganancia de intensidad del
instrumento.
A continuación de la inyección del contraste, fue
obtenida una mejora visible, prolongada, de la representación
Doppler del miocardio, durando durante varios instantes o varios
minutos en dependencia del tamaño de la dosis administrada del
agente de contraste.
Fue determinado T½ por la videodensitometría de
las señales espectrales Doppler como sigue. Los valores de ganancia
fueron ajustados para hacer las señales escasamente visibles antes
de la inyección del contraste. Cuando el contraste entró en la
arteria femoral la señal aumentó, tomó forma de máximo y luego
decayó. La videodensitometría se realizó sobre los máximos
individuales de flujo y se construyó una gráfica de intensidad
tiempo. Se calculó T½ como el tiempo tardado por el efecto del
contraste para disminuir hasta la mitad de su máximo valor. La
videodensitometría de las señales espectrales Doppler mostró un
efecto reproducible de contraste a continuación de la inyección
intravenosa de las microcápsulas, el cual fue significativamente
prolongado respecto a las señales producidas por las microcápsulas
formuladas según la solicitud PCT/GB92/00643.
Claims (24)
1. Microcápsulas huecas, en las que más de 30% de
las microcápsulas tiene un diámetro dentro de un intervalo de 2
\mum y por lo menos 90% tiene un diámetro dentro del intervalo
10,1 a 19,9 \mum.
2. Microcápsulas huecas, en las que los
intervalos de intercuartiles de los diámetros es 2 \mum o menos y
el diámetro mediano está entre 10,1 \mum y 19,9 \mum,
inclusivos.
3. Microcápsulas huecas con paredes proteináceas,
en las que por lo menos 90% de las de las microcápsulas tiene un
diámetro en el intervalo 1,0-8,0 \mum; por lo
menos 90% de las microcápsulas tiene un espesor de pared de
40-500 nm; por lo menos 50% de la proteína en las
paredes de las microcápsulas está tan reticulada como para ser
resistente a la extracción en HCl 1% durante 2 min.; y sea que las
microcápsulas tengan un t_{1/2} in vivo por lo menos de 5
minutos, o sea que estén adaptadas para un direccionamiento
selectivo a un área de cuerpo humano o animal.
4. Microcápsulas huecas según la Reivindicación
3, en las que por lo menos 95% de la proteína está reticulada como
ha sido dicho.
5. Microcápsulas huecas predominantemente de
1,0-10,0 \mum de diámetro, por lo menos 10% de
las microcápsulas, cuando se suspenden en agua, son capaces de
sobrevivir durante 0,25 seg. a la aplicación de una presión de 2,66
x 10^{4} Pa sin estallar, colapsar o llenarse de agua, en donde
sea que las microcápsulas tengan un t_{1/2} in vivo por lo
menos de 5 minutos, o sea que estén adaptadas para un
direccionamiento selectivo a un área de cuerpo humano o animal.
6. Microcápsulas huecas, en las que más de 30% de
las microcápsulas tienen un diámetro dentro de un intervalo de 2
\mum y por lo menos 90% tienen un diámetro dentro del intervalo
1,0-8,0 \mum, y sea que las microcápsulas tengan
un t_{1/2} in vivo por lo menos de 5 minutos, o sea que
estén adaptadas para un direccionamiento selectivo a un área de
cuerpo humano o animal.
7. Microcápsulas huecas, en las que los
intervalos de intercuartiles de los diámetros es 2 \mum o menos,
el diámetro mediano está entre 2,0 \mum y 8,0 \mum inclusivos,
y sea que las microcápsulas tengan un t_{1/2} in vivo por
lo menos de 5 minutos, o sea que estén adaptadas para un
direccionamiento selectivo a un área de cuerpo humano o animal.
8. Un método para generar una imagen para
posterior inspección, que comprende (a) inyectar microcápsulas en
el cuerpo de un mamífero según cualquiera de las Reivindicaciones 1
hasta 7, (b) someter el mamífero o parte de éste a una radiación
ultrasónica conveniente y (c) detectar la radiación ultrasónica
reflejada, transmitida, resonada o de frecuencia modulada por dichas
microcápsulas.
9. Una composición farmacéutica conveniente para
administración intraarterial, comprendiendo microcápsulas huecas
predominantemente de diámetro 10,1 hasta 19,9 \mum.
10. Un método para generar una imagen para
posterior inspección, que comprende (a) inyectar en el cuerpo de un
mamífero microcápsulas predominantemente de diámetro 10,1 hasta
19,9 \mum, (b) someter el mamífero o parte de éste a una
radiación ultrasónica conveniente y (c) detectar la radiación
ultrasónica reflejada, transmitida, resonada o de frecuencia
modulada por dichas microcápsulas.
11. Un proceso que comprende el paso de atomizar
una solución o dispersión de un material para formación de pared en
un portador líquido dentro de un gas para obtener microcápsulas
huecas por evaporación del portador líquido, en donde las
microcápsulas son de 10,1-19,9 \mum de diámetro, o
sea que tengan un t_{1/2} de circulación en humano por lo menos
de 5 minutos, o sea que estén adaptadas para el direccionamiento
selectivo a un área de cuerpo humano o animal.
12. Un proceso según la Reivindicación 11, en el
que el producto así obtenido se somete a un paso adicional de
reducir la solubilidad en agua de por lo menos la parte exterior de
las microcápsulas.
13. Un proceso según la Reivindicación 11 o 12,
en el que el material para la formación de la pared es una proteína
tal, como el colágeno, gelatina o albúmina de suero, por ejemplo,
la albúmina de suero humano, o análoga, o un fragmento de ésta,
derivada de suero o preparada por técnicas de ADN recombinante.
14. Un proceso según la Reivindicación 13, en el
que la solución o dispersión de proteína comprende
10,0-30,3%.
15. Un proceso según cualquiera de las
Reivindicaciones 11 y 14, en el que el producto del proceso de la
Reivindicación 11 comprende 96-98% de proteína
monomérica.
16. Un proceso según cualquiera de las
Reivindicaciones 13 hasta 15 cuando son dependiente de la
Reivindicación 12, en el que el producto del paso de la
Reivindicación 12 comprende no más de 5% de proteína monomérica.
17. Un proceso según cualquiera de las
Reivindicaciones 12 hasta 14, en el que las condiciones del paso de
la Reivindicación 11 son tales como, para lograr esencialmente el
paso de la Reivindicación 12 simultáneamente.
18. Microcápsulas obtenibles por un proceso según
cualquiera de las Reivindicaciones 11 hasta 17.
19. El uso de microcápsulas huecas de las que por
lo menos 90% tienen un diámetro entre 10,1 y 19,9 \mum en la
preparación de una composición farmacéutica para administración
intraarterial a un humano o animal de forma tal que las
microcápsulas se depositan en la vasculatura.
20. El uso como en la Reivindicación 19, en el
que las microcápsulas depositadas delinean áreas infraperfusas de
microcirculación.
21. El uso como en la Reivindicación 19 o 20, en
el que las microcápsulas se introducen vía un catéter en una
arteria coronaria o en el ventrículo izquierdo del corazón.
22. El uso como en cualquiera de Reivindicaciones
19 a 21, en el que el humano o el animal a continuación se somete
al ultrasonido y se obtiene una imagen, usando las microcápsulas
depositadas como un agente de contraste ecogénico.
23. Un proceso de formar microcápsulas que
comprende el paso de atomizar una solución o dispersión de un
material para formación de pared en un portador líquido dentro de
un gas para obtener microcápsulas huecas por evaporación del
portador líquido, en el que las paredes de las microcápsulas tienen
en éstas o sobre éstas una sustancia policatiónica como la
polisina.
24. Un proceso según cualquiera de las
Reivindicaciones11 hasta 17 y la 23, en el que el portador líquido
es acuoso.
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