ES2173966T5

ES2173966T5 - Composiciones de esteroles a partir de jabon formado de la trituracion de pasta papelera.

Info

Publication number: ES2173966T5
Application number: ES95932593T
Authority: ES
Inventors: Egon Novak; James P. Kutney; Peter J. Jones
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1994-09-29
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2015-09-29
Also published as: EP1148062A2; LT97074A; LV11900B; PL186441B1; CZ92797A3; ATE216395T1; MD970178A; NO971304D0; SK284250B6; EP0783514A1; RU2165431C2; CA2201328A1; NO322293B1; CN1166174A; EE9700073A; NO20011062D0; NZ293210A; GEP20022657B; DK0783514T3; PL319384A1

Abstract

Uso de una composición que reduce el colesterol que comprende beta-sitosterol, campesterol y que comprende además estigmastanol, en la que el campesterol y el estigmastanol juntos comprenden al menos 50% de la concentración de beta-sitosterol y en el que la relación de beta-sitosterol es 1, 0, el campesterol está entre 0, 2 y 0, 4, y el estigmastanol está entre 0, 2 y 0, 5 en la fabricación de un medicamento para uso en un método de reducción de la concentración en plasma de colesterol lipoproteínico de baja densidad.

Description

Composiciones de esteroles a partir de jabón formado de la trituración de pasta papelera.

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Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de composiciones de esteroles derivadas de jabones formados a partir de la trituración de pasta papelera como agentes para reducir la concentración en plasma de colesterol lipoproteínico de baja densidad.

Antecedentes de la invención

La causa directa del ataque al corazón y la angina es un procedimiento degenerativo conocido como ateroesclerosis. La ateroesclerosis resulta de un número de factores heredados (genéticos) y medioambientales integrados. La interconexión de estos factores, de los cuales la dieta en nuestra civilización parece ser el más importante, conduce al desarrollo de ateroesclerosis. El crecimiento de placas de ateroesclerosis rellenas de colesterol, en último lugar, corta el suministro sanguíneo al músculo cardíaco, o alternativamente al cerebro o las piernas, dependiendo de la localización de la placa en el árbol arterial.

Uno de los factores principales de riesgo para la ateroesclerosis, que es potencialmente modificable, es el nivel de colesterol en sangre. Un gran número de estudios bien documentados han demostrado que el nivel de colesterol en sangre es, de hecho, un factor de predicción importante para el riesgo de ataque cardíaco y también para apoplejías. La relación entre la concentración de colesterol en sangre y el riesgo de estos trastornos está graduada (cuanto mayor es el nivel, más probable es la enfermedad) continuamente (se amplía a lo largo de todos los niveles de colesterol) sin umbral aparente (incluso reduciendo los denominados niveles bajos, se puede disminuir adicionalmente el riesgo de la enfermedad). Por ejemplo, en personas de 40 años de edad, un nivel de colesterol en sangre de 7,0 mmol/l presenta un riesgo de enfermedad arterial coronaria tres a cuatro veces la asociada con niveles por debajo de 5,0 mmol/l. La relación se hace especialmente exorbitada cuando los niveles están por encima de 5,2 mmol/l. Por ejemplo, la tasa de mortalidad entre hombres con niveles de colesterol de 8,0 mmol/l fue casi seis veces la existente entre hombres con niveles de 4,0 mmol/l. Estos hallazgos más recientes son consistentes con estudios más tempranos.

Otros grandes ensayos clínicos han demostrado claramente que reduciendo los niveles altos de colesterol, se puede reducir el riesgo de infartos de miocardio fatales y no fatales, angina, cambios en electrocardiogramas y en cirugía de derivación en arterias coronarias. El más conocido y el primero de estos ensayos fue en Lipid Research Clinics en cuyos ensayos de prevención primaria de enfermedades coronarias mostraron que con cada 1% de reducción en el nivel de colesterol total en sangre había una reducción del 2% en el riesgo de enfermedad arterial coronaria.

Para que cualquier terapia preventiva a largo plazo de hipercolesterolemia tenga éxito, se ha de comenzar a una edad relativamente temprana, y continuar indefinidamente. Aunque una dieta baja en grasas es la piedra angular de tal terapia a largo plazo, hasta un 60% de pacientes no la cumplen después de seis meses. La dificultad en el no cumplimiento es destacable en muchos países occidentales por una dieta general que es rica en grasa. El perfil de colesterol pobre de muchos pacientes está exacerbado por el predominio de factores de riesgo adicionales para enfermedad cardiovascular, tal como tensión arterial alta, diabetes, obesidad y habito de fumar.

La modificación dietética como terapia para la ateroesclerosis y otras enfermedades cardiovasculares se ha refinado significativamente a lo largo de los últimos 10 a 15 años. En particular, los investigadores reconocen que los esteroles de plantas (fitosteroles) son efectivos reduciendo los niveles de colesterol en plasma: Lees et al. Atherosclerosis, 28 (1977) 325-338; Kudehodkar et al., Atherosclerosis, 23 (1976) 239; Day. Artery, 18(3):125-132 (1991).

Los fitosteroles son compuestos similares a esteroles, sintetizados en plantas con valor no nutritivo para los seres humanos. En las plantas se requieren para la función celular de manera similar a como se requiere el colesterol en seres humanos. La dieta occidental media contiene hasta 360 mg de fitosteroles por día. Recientemente estos esteroles dietéticos de plantas han recibido una gran atención debido a sus posibles propiedades anticancerígenas, y a su capacidad para disminuir los niveles de colesterol cuando se suministran como alimentos a un número de especies mamíferas, incluyendo los seres humanos.

Químicamente, los fitosteroles se parecen mucho al colesterol en estructura. Los fitosteroles principales son beta-sitosterol, campesterol y estigmasterol. Otros incluyen estigmastanol (beta-sitostanol), sitostanol, desmosterol, calinasterol, poriferasterol, clionasterol y brasicasterol. Las estructuras químicas de beta-sitosterol, campesterol y estigmastanol son las siguientes:

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El mecanismo por el cual los fitosteroles reducen el colesterol en sangre en los animales no está claro, pero parece que implica la inhibición de la absorción del colesterol por el yeyuno próximo, compitiendo con el colesterol en sitios de captación específicos. Los datos de investigación también han sugerido que algunos fitosteroles no son absorbidos en absoluto (sitostanol) en el yeyuno próximo y, cuando hay absorción (beta-sitosterol), es en cantidades muy limitadas.

Basándose en estos hallazgos de investigación, se ha investigado ampliamente el uso de fitosteroles como un suplemento dietético para reducir la absorción del colesterol. Lees et al., supra; Pollak, Pharmac. Ther., 31 (1985) 177-208; Raicht et al, Biochimica et Biophysica Acta, 388 (1975) 374-384.

En Lees et al., supra, se realizó una comparación entre los efectos de preparaciones de sitosterol a partir de dos fuentes, esteroles de soja y esteroles de taloil, sobre el colesterol en plasma. Se encontró que las preparaciones de esteroles de plantas eran efectivas para tratar pacientes con hipercolesterolemia. Pollak, supra, es un artículo de revisión de fitosteroles y su efecto sobre lípidos del suero. Raicht, supra, describe además el efecto de beta-sitosterol en el equilibrio de esteroles y enzimas que limitan la velocidad del metabolismo de los esteroles.

Se acepta generalmente que los fitosteroles ofrecen una combinación única de seguridad, eficacia y versatilidad a largo plazo en el tratamiento de seres humanos. El reto que continua con respecto a los fitosteroles es en su aislamiento y purificación a partir de fuentes vegetales, y en la determinación de fuentes adicionales que son costosamente efectivas, manipulables a gran escala y que exhiban efectos hipocolesterémicos.

Tradicionalmente, los fitosteroles se han aislado a partir de fuentes como aceite de maíz, aceite de germen de trigo, brea de haba de soja y brea de aceite de maíz. De forma similar, se ha usado brea de taloil, que se obtiene durante el procedimiento de preparación de papel a partir de madera, particularmente madera de pino, como fuente de fitosteroles. Generalmente, en este procedimiento, las virutas de madera se digieren con sosa cáustica para producir una pasta o "jabón". El jabón se destila entonces para eliminar los materiales volátiles dejando una "brea" como residuo. Es a partir de esta brea que los investigadores han aislado los fitosteroles.

Estas fuentes tradicionales de fitosteroles presentan algunas desventajas destacables. La brea de taloil es un material extremadamente complejo que comprende resinas, ácidos grasos, productos de oxidación, materiales esterificados y fitosteroles. Aunque la brea es barata por cuanto es el resto sobrante de diverso procedimientos de fabricación, es muy difícil de recuperar esteroles de alto peso molecular a partir de ella con buenos rendimientos y con las purezas elevadas requeridas para los usos farmacéuticos.

La patente US nº 3.840.570, de Jullan, proporciona un procedimiento para preparar esteroles a partir de brea de taloil por extracción en una mezcla de agua-alcohol-hidrocarburo, seguido de la saponificación y purificación subsiguiente. El material de partida en este procedimiento es brea de taloil, a partir de la que se extraen fitosteroles y diversas impurezas. Se reconoce que, en cualquier procedimiento de purificación de brea de taloil, el alcohol de cadena larga e impurezas de ácido son particularmente difíciles de separar de los esteroles (los cuales, por sí mismos, son alcoholes de alto peso molecular).

Otros investigadores han apuntado la cuestión de la purificación de esteroles a partir de brea de taloil: la patente US nº 2.835.682 de Steiner y Fritz; la patente US nº 2.573.891 de Christenson. Es importante observar que en cada uno de estos procedimientos de purificación conocidos, el material de partida fue brea de taloil, que tiene los problemas de recuperación expuestos anteriormente.

Es un objetivo de la presente invención obviar o mitigar las desventajas anteriores.

En el documento US-A-3965085 se trata un jabón, formado a partir de la trituración de pasta papelera de productos madereros, para eliminar compuestos neutros no saponificables, mezclando el jabón con cetona y luego con un disolvente inmiscible en agua, tal como hidrocarburos del petróleo. La fase del disolvente se separa, y el disolvente se recupera de ella para dar una mezcla de compuestos neutros tales como esteroles.

Sumario de la invención

El procedimiento dado a conocer proporciona el uso de un producto en la fabricación de un medicamento para el uso en un método de reducción de la concentración en plasma de colesterol lipoproteínico de baja densidad, en el que el producto es una composición de fitosterol obtenible mediante un procedimiento para purificar y preparar composiciones de fitosteroles a partir de jabón formado por la trituración de pasta papelera, que comprende:

En una primera fase, mezclar el jabón formado por la trituración de pasta papelera con una mezcla de disolventes que comprende una cetona seleccionada del grupo que tiene la estructura general RCOR^{1} en la que R y R^{1} son grupos alquilo, un hidrocarburo alifático seleccionado de hidrocarburos C_{5}-C_{10}, y agua, y que no tiene alcohol, a una temperatura generalmente de 25ºC a 150ºC para formar un precipitado cremoso; y en una segunda fase, purificar una composición de fitosterol a partir del precipitado cremoso.

La presente invención como se reivindica en la reivindicación 1 y la reivindicación 7 también proporciona composiciones únicas que son efectivas para prevenir o tratar dislipidemias, y que comprenden beta-sitosterol, campesterol y estigmastanol, en las que el campesterol y el estigmastanol comprenden juntos al menos el 50% de la concentración de beta-sitosterol. Las composiciones de fitosterol proporcionadas en esta memoria descriptiva son significativamente diferentes de las encontradas en plantas, alimentos y aceites. En particular, la provisión de estigmastanol parece que aumenta la eficacia. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente diversos compuestos concurrentes, que pueden ser o no fitosteroles. En particular, estos compuestos concurrentes pueden incluir triterpenos, alcoholes de cadena larga y otros compuestos orgánicos solubles en alcoholes.

La presente invención proporciona además el uso de las composiciones descritas en esta memoria descriptiva en la fabricación de un medicamento para uso en un método de reducción de la concentración en plasma de colesterol lipoproteínico de baja densidad, por ejemplo para prevenir o tratar dislipidemias primarias y secundarias, y aterosclerosis, incluyendo enfermedad coronaria, enfermedad vascular periférica y apoplejías, en seres humanos y animales.

Las composiciones únicas de la presente invención han mostrado excelentes resultados reduciendo el colesterol total (TC) y el colesterol lipoproteínico de baja densidad (LDL) en sangre. Además, y de forma bastante sorprendente, se encontró que las composiciones de la presente invención, en diferentes especies animales, mantienen o elevan los niveles en plasma del colesterol lipoproteínico de alta densidad (HDL) en sangre. Esta característica de la presente invención es importante de forma crítica por el hecho de que la investigación ha mostrado que, independientemente de los niveles de TC, a medida que disminuye el nivel de HDL en plasma, aumenta el riesgo de aterosclerosis. Los fitosteroles aislados de brea de taloil, haba de soja y otras fuentes, no han mostrado, a juicio de los presentes inventores, este efecto único del HDL.

Se cree que el efecto sorprendente de las composiciones de las composiciones usadas en la presente invención es debido, al menos parcialmente, al uso del jabón formado por la trituración de pasta papelera como el material de partida, y al procedimiento de separación único.

Breve referencia a los dibujos

Se ilustrarán, mediante los siguientes dibujos no limitantes, diversos aspectos de la invención, en los que:

la figura 1 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de Forbes-1 y Forbes-2 sobre la concentraciones de TC en ratas;

la figura 2 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de Forbes-1 y Forbes-2 sobre las concentraciones de colesterol LDL en ratas;

la figura 3 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de Forbes-1 y Forbes-2 sobre las concentraciones de colesterol HDL en ratas;

la figura 4 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de Forbes-3 sobre TC en suero en hámsters;

la figura 5 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de Forbes-3 sobre colesterol LDL en suero en hámsters;

la figura 6 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de Forbes-3 sobre colesterol HDL en suero en hámsters;

la figura 7 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de diversos tratamientos dietéticos sobre niveles de colesterol en hámsters machos y hembras;

la figura 8 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de diversos tratamientos dietéticos sobre niveles de colesterol en plasma en hámsters machos;

la figura 9 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de diversos tratamientos dietéticos sobre niveles de colesterol en plasma en hámsters hembras;

la figura 10 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de diversos tratamientos dietéticos sobre niveles de triglicéridos en plasma en hámsters machos y hembras;

la figura 11 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de diversos tratamientos dietéticos sobre relaciones HDL/apo-B en hámsters machos y hembras;

la figura 12 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de tratamientos dietéticos sobre colesterol total en un estudio de 45 días en hámsters;

la figura 13 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de tratamientos dietéticos sobre la correlación del colesterol con sitostanol;

la figura 14 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de tratamientos dietéticos sobre niveles de HDL en hámsters a lo largo de 45 días;

la figura 15 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de tratamientos dietéticos sobre relaciones no-apoA/apoA en hámsters a lo largo de 45 días; y

la figura 16 representa un diagrama de barras que ilustra los efectos de tratamientos dietéticos sobre esteroles no-apoA en hámsters a lo largo de 45 días.

Realizaciones preferidas de la invención

El procedimiento para obtener las composiciones usadas en la presente invención comprende las etapas siguientes:

(A): obtener o preparar el material de partida, un jabón formado por la trituración de pasta papelera derivado de plantas;

(B): extraer del jabón un precipitado cremoso usando un disolvente apropiado; y

(C): purificar una composición de fitosterol a partir del precipitado cremoso.

Hay numerosas fuentes posibles del jabón formado por la trituración de pasta papelera derivado de plantas. Generalmente, en un procedimiento conocido (el procedimiento "Kraft"), se tratan virutas de madera con sosa cáustica para producir un jabón. Las virutas de madera pueden derivar de cualquier variedad de árbol de madera dura o madera blanda incluyendo, pero sin limitarse a, abeto, cedro, pino, picea, roble, tsuga y tulipanero. Lo más preferible, las virutas derivan de cualquier variedad de maderas procedentes de bosques europeos o americanos del Pacífico
noroccidental.

En la fase de extracción el jabón se mezcla con una cetona y una disolución de agua. Se usa un disolvente de hidrocarburo para extraer los esteroles. Esta etapa se lleva a cabo a temperaturas generalmente de alrededor de 25ºC a alrededor de 150ºC, pero lo más preferiblemente de alrededor de 50ºC a alrededor de 100ºC. Lo más preferiblemente, esta fase de extracción se continúa durante 15 a 24 horas. Es importante observar que el uso de alcohol ni se requiere ni se sugiere durante la fase de extracción. El procedimiento de extracción de la presente invención se realiza usando un disolvente de cetona-agua-hidrocarburo.

La cetona se selecciona del grupo que tiene la estructura general RCOR^{1} en la que R y R^{1} son grupos alquilo. Preferiblemente, los grupos alquilo son grupos C_{1}-C_{6}. Lo más preferiblemente, la cetona es 2-propanona (acetona). El hidrocarburo se selecciona del grupo que comprende todos los hidrocarburos de C_{5}-C_{10}. De forma más preferida, el hidrocarburo es hexano.

Como se representa en la figura 1, el producto de la fase de extracción es un precipitado o residuo cremoso a partir del que se purifica la composición de fitosterol. Esta fase de purificación se puede realizar por cristalización, separación cromatográfica, o por cualesquiera otros procedimientos adecuados. Los mas preferiblemente, el precipitado cremoso se disuelve en alcohol, se enfría lentamente, luego se filtra y se lava con alcohol frío. El residuo se seca, y el producto resultante es una composición de fitosterol.

En una forma preferida, el alcohol usado en la fase de purificación se selecciona del grupo que tiene las estructuras generales R-CHOHR, R-CH_{2}OH, y RCOH, en las que R es un grupo alquilo C_{1-}C_{4}. Lo más preferiblemente, el alcohol es metanol. La fase de enfriamiento se puede efectuar a temperaturas de -10ºC a 0ºC, lo más preferiblemente de 3 a 4ºC durante 24 horas.

Las composiciones de fitosterol que resultan de los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva se pueden incorporar directamente en suplementos alimentarios y formulaciones vitamínicas, y en fármacos para un tratamiento continuado y preventivo de aterosclerosis y sus consecuencias, apoplejías, ataques cardíacos y enfermedad bascular periférica. Además, se contempla dentro de una realización de la presente invención que las composiciones de fitosterol descritas en esta memoria descriptiva se proporcionen en forma de medicamentos con adyuvantes o vehículos adecuados. Por ejemplo, estas composiciones se pueden incorporar o prescribir concurrentemente con agentes reductores de lípidos seleccionados, para disminuir la dosis necesaria, y por tanto la toxicidad, de estos últimos compuestos.

Las composiciones de fitosterol usadas según la presente invención han mostrado una capacidad destacable para modificar lipoproteínas, incluso a concentraciones de fitosterol menores que en formulaciones conocidas. Sin embargo, más sorprendente ha sido el efecto de estas composiciones aumentando los niveles en plasma de lipoproteínas de alta densidad (HDL), un efecto hasta ahora no asociado con ninguna otra composición de fitosterol derivada de taloil. Se cree que este efecto único puede ser debido al uso de jabones formado por la trituración de pasta papelera como material de partida, o a la provisión de estigmastanol como un elemento de la composición.

Según la presente invención, las composiciones usadas en esta memoria descriptiva comprenden una relación de fitosteroles de forma que el campesterol y estigmastanol representan juntos al menos el 50% de la concentración total de beta-sitosterol, y la siguiente relación: beta-sitosterol (1); campesterol (0,2-0,4) y estigmastanol (0,2-0,5). Las nuevas composiciones de la siguiente invención comprenden la siguiente relación de fitosteroles comparada con fitosteroles derivados de haba de soja:

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La composición y pureza de otros dos extractos dentro del alcance de la presente invención son las siguientes:

5

En cada composición descrita en esta memoria descriptiva puede haber compuestos adicionales presentes, que pueden ser o no fitosteroles. Por ejemplo, se ha encontrado que puede estar presente el campestanol, otro fitosterol, en una cantidad relativamente pequeña. Además, puede haber alcoholes grasos de cadena lineal, tales como alcohol behenílico (C22) y lignocerílico (C24). A fin de determinar la naturaleza de estos compuestos concurrentes, se ha realizado un análisis de cromatografía gas-líquido en cada una de las composiciones más preferidas de la presente invención.

Otra composición preferida dentro del alcance de la presente invención comprende los siguientes componentes:

: Campesterol 14,1%

: Campestanol 3,5%

: B-sitosterol 62,8%

: Estigmastanol 16,9%

para una concentración total de fitosterol de 97,3%.

Ejemplo 1

Extracción y purificación

Se obtuvo, de B.C. Chemicals Inc., un lote de 3 kg de jabón formado por la trituración de pasta papelera. Se preparó una mezcla de 3 l de acetona y 1,5 l de agua, a la que se añadió el jabón. La mezcla se extrajo continuamente con 4,5 l de hexano, a 50ºC durante 24 horas, usando un evaporador de 18 l. Entonces el producto de extracción resultante se secó sobre sulfato de sodio, y se dejo evaporar. Esto produjo 460 g de residuo o precipitado cremoso.

El precipitado cremoso se calentó y se agitó usando una barra magnética, y se añadieron lentamente 460 ml de metanol. La mezcla se puso a reflujo con agitación durante 15 minutos, y se enfrió lentamente durante 3-5 horas. La mezcla se refrigeró a 3-4ºC toda la noche, y entonces se filtró y se lavó (dos veces) con 150 ml de metanol frío. Finalmente, la mezcla se mantuvo a vacío dos días, produciendo 100 g de mezcla con una pureza de 82% (es decir, 82 g de fitosteroles).

Ejemplo 2

Evaluación de los efectos de composiciones de fitosterol en ratas

Se dividieron noventa ratas Wistar macho (80-100 g) en tres módulos experimentales: composición Forbes-1; composición Forbes-2; y haba de soja. Las treinta ratas dentro de cada modulo se dividieron adicionalmente en cinco regímenes dietéticos, según se indica en la Tabla 2. Las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz invertido, y se alimentaron durante diez días con una dieta basal semipurificada (Tabla 1) suplementada con cantidades diferentes de colesterol y fitosterol (Tabla 2). Dentro de cada uno de los cinco grupos dietéticos, se le administró la composición Forbes-1 a dos ratas; la composición Forbes-2 se administró a dos ratas; y se administró fitosterol derivado de haba de soja (Sigma) a otras dos ratas.

TABLA 1

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Alazor y manteca de cerdo mezclados en una relación 1:3

TABLA 2

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Al final del período de alimentación, se inyectó intraperitonealmente a las ratas con óxido de deuterio (0,4 ml), y se les privó de comida y agua durante al menos 2 horas. Entonces se anestesió a las ratas con halotano. Se extrajeron muestras de sangre del corazón. Se retiraron rápidamente muestras de hígado, intestino delgado y músculo, se pesaron, se pusieron en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80ºC hasta la determinación de la síntesis de colesterol. Se determinó el colesterol total, colesterol LDL y HDL, con un kit comercial (Biopacific Diagnostic Inc.).

Los resultados de los efectos de las composiciones de fitosterol sobre colesterol total, LDL y HDL se representan en las Figuras 1, 2 y 3, respectivamente. La eficacia de las Forbes-1 y Forbes-2 es evidente a partir de la reducción en el colesterol LDL mostrada en la Figura 2, y en el incremento en el colesterol HDL mostrado en la Figura 3, particularmente por la Forbes-1. En la Figura 1, la adición de colesterol (grupo dietético 2) a la dieta base (grupo 1) dio como resultado un aumento en las concentraciones de colesterol circulante. La adición progresiva de niveles crecientes de fistosteroles (grupos 3-5) dio como resultado una normalización de los niveles de colesterol en los grupos alimentados con Forbes-2 y Forbes-1, pero no con fitosteroles de haba de soja, según se determina por análisis de regresión. La Figura 2 muestra que los fitosteroles de Forbes-2 y Forbes-1 poseen una mejor eficacia reductora del colesterol que los fitosteroles de haba de soja, para LDL. La Figura 3 demuestra la mayor capacidad, para elevar HDL, de las composiciones preferidas de la presente invención, particularmente Forbes-1, comparada con los fitosteroles de haba de soja.

Ejemplo 3

Evaluación de los efectos de composiciones de fitosterol en hámsters

El presente estudio fue para examinar el efecto de composiciones de fitosterol dietético de la presente invención sobre la elevación, inducida por el colesterol dietético, de las concentraciones de colesterol en suero, en hámsters.

Se alimentó con comida para roedores a un total de 40 hámsters machos (80-100 g), enjaulados individualmente en jaulas de malla de acero inoxidable, y se aclimataron durante tres días en una habitación acondicionada con aire (20-22ºC, luces encendidas de 1700-0500). Entonces los hámsters se dividieron en cinco grupos de 8 animales cada grupo, y se alimentaron durante 34 días con una dieta semipurificada basal (Tabla 3) suplementada con diferentes cantidades de colesterol y una de las composiciones de fitosterol de la presente invención (Forbes-3) (Tabla 4).

TABLA 3

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TABLA 4

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Al final del período de alimentación, se inyectó intraperitonealmente a los animales con óxido de deuterio (0,4 ml), y se les privó de comida y agua durante al menos 2 horas. Entonces se anestesió a los hámsters con halotano. Se extrajeron muestras de sangre del corazón. Se retiraron rápidamente otras muestras de tejidos, incluyendo hígado, intestino delgado y músculo, se pesaron, se pusieron en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80ºC hasta la determinación de la síntesis de colesterol. Se determinó el colesterol total, colesterol LDL y HDL, usando un kit comercial. Los resultados se evaluaron estadísticamente con análisis de una sola vía del procedimiento de varianza (SYSTAT).

Los hámsters alimentados con la dieta alta en colesterol tuvieron una cantidad significativamente mayor de colesterol total en suero y de colesterol LDL que aquellos a los que se les alimentó con la dieta de colesterol normal (0,025%). La suplementación de fitosterol a niveles de 0,5% y 1% suprimió notablemente estos incrementos inducidos por el consumo elevado de colesterol (Figuras 4 y 5). La concentración de colesterol LDL en el grupo 5 fue menor, comparada con los niveles en hámsters alimentados con dietas normales que contienen colesterol (Figura 5). Además, hubo una asociación de regresión negativa del colesterol total y el colesterol LDL con el nivel de fitosterol añadido en la dieta (Figura 6).

La suplementación de fitosterol provocó un ligero incremento en HDL, pero sin producir una diferencia significativa (Figura 6).

Ejemplo 4

Evaluación de los efectos de la composición de fitosterol en hámsters - ensayo de 90 días

Se alimentó a seis grupos de 20 hámsters (10 machos, 10 hembras) con dietas semipurificadas que contienen 30% de grasa (relación de grasa poliinsaturada/saturada = 0,3) durante 90 días. La dieta 1 estaba exenta de colesterol. Las dietas 2-6 contenían 0,25% (p/p) de colesterol dietético. Las dietas 3 y 4 contenían fitosteroles Forbes (de pureza de más de 90%) a 0,5 y 1%, respectivamente. Las dietas se hicieron a partir de ingredientes primarios cada semana. Se determinaron los niveles de grasa, fitosterol y colesterol mediante cromatografía de gas-líquido. Todos los animales tuvieron libre acceso a agua y dietas durante el período experimental. Se pesó semanalmente a los animales. También se determinó cada día la ingesta de alimentos, y se promedió por semana pesando copas de alimentos antes y después de cada 24 h del período de alimentación. Después de 90 días de alimentación, se sacrificó a los animales usando halotano, y se recogió sangre para los análisis del perfil de lipoproteínas. Se determinaron las partículas que contienen apoB totales circulantes, y los niveles de colesterol HDL y de triglicéridos. También, justo antes de sacrificarlos, se determinó las velocidades de absorción y síntesis de colesterol, usando métodos de desaparición de colesterol ^{14}C del intestino, y de incorporación de deuterio en colesterol de tejidos, respectivamente. También se examinó la ingestión de fitosteroles en el intestino y en otros tejidos. Además, se almacenaron muestras de intestino e hígado para proporcionarlos a Bio-Search Laboratories de Senneville, Québec, para los análisis histopatológicos, de carcinogenicidad y de función enzimática.

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Resultados

Los resultados se muestran en las Figuras 7-11. Los grupos en estas Figuras a menudo se dan como un número, que corresponde al de los descritos en el Diseño Experimental. Las letras encima de las barras, en los gráficos de barras, identifican diferencias significativas entre grupos. Allí donde se den letras, las barras que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, mientras que aquellas con letras diferentes son diferentes a un nivel estadístico de p<0,05.

Mostrados en la Figura 7-9 están los datos de colesterol circulante para hámsters machos y hembras que consumen las dietas de ensayo durante 90 días. Se observaron efectos significativos de sexo en niveles de colesterol total circulante para animales que consumen la dieta 2, la dieta base sin colesterol añadido solo, y la dieta 5 que contiene colesterol + fitosteroles de haba de soja. Las hembras, aunque no diferentes de los machos en los niveles de colesterol en la dieta basal (grupo 1), mostraron una mayor respuesta al colesterol añadido solo, comparada con los machos. La adición de fitosteroles anuló esta diferencia, con la excepción del grupo 5.

En las Figuras 8 y 9 se muestran los datos de los niveles de colesterol separados por sexos. Para los machos (Figura 8), la adición de colesterol solo a la dieta basal dio como resultado un aumento significativo del nivel de colesterol total circulatorio. La adición de fitosteroles Forbes al 0,5 por ciento dio como resultado una tendencia a la disminución del nivel de colesterol; sin embargo, la adición de fitosteroles Forbes al 1% provocó una reducción estadísticamente significativa en el colesterol, hasta aproximadamente los mismos niveles del grupo de control sin colesterol añadido. Cuando se añadieron fitosteroles de haba de soja a la dieta a 0,5 ó 1%, no hubo un decrecimiento significativo en el nivel de colesterol total circulante, en machos. Para HDL, se observó un efecto diferencial de Forbes frente a haba de soja: mientras que la alimentación con Forbes no produjo cambio en los niveles de HDL del grupo al que se le dio colesterol solo (grupo 2), sin embargo, la alimentación con haba de soja dio como resultado una disminución significativa en los valores de HDL en ambos niveles ensayados (grupos 5 y 6). No hubo diferencias significativas en las partículas de colesterol que contienen apoB; sin embargo, hubo una tendencia hacia niveles menores con la alimentación de colesterol Forbes a 1%, comparada con otros grupos.

Los datos de las hembras se muestran en la Figura 9. Para el colesterol total y HDL, hubo una influencia pronunciada de la adición de colesterol dietético solo. La adición de cualquier tipo de fuente de fitosterol al 1% dio como resultado disminuciones significativas y similares en las concentraciones de colesterol total y HDL. Los niveles de partículas que contienen apoB no se vieron influidos por la dieta.

En la Figura 10 se muestran los niveles de triglicéridos circulantes en hámsters que consumen las dietas de ensayo durante 90 días. Hubo un aumento en los niveles de triglicéridos circulantes en animales hembras a los que se les dio la dieta basal con colesterol y Forbes 0,5%, comparado con la dieta basal sola; sin embargo, no se observó ninguna otra diferencia entre grupos en ninguno de los sexos. En machos, no hubo ningún efecto o tendencia de la dieta sobre las concentraciones de triglicéridos.

En forma de resumen, la clasificación de los resultados de los machos en las dietas de ensayo son las siguientes:

TABLA 5

10

Se puede ver claramente la ventaja de las composiciones Forbes (aquellas de la presente invención). Además, se encontraron clasificaciones similares para la relación HDL:ApoB en machos (Figura 11):

11

También se encontró que la relación HDL:LDL para las composiciones Forbes fue casi el doble de la de \beta-sitosterol solo.

Ejemplo 5

Efectos de la composición de fitosterol en conejos

En este estudio, se analizaron dos conejos durante 43 días con relación a los efectos de una de las composiciones de la presente invención (Forbes 1% en la dieta) sobre sus perfiles de colesterol total. Los resultados son los siguientes:

TABLA 6

12

Se puede ver una disminución en el colesterol total, tanto en conejos A como B, durante las dos semanas de administración de composición de fitosterol (Forbes 1%). Este efecto continuó incluso después de que se descontinuase la Forbes 1%. Los efectos de las composiciones de la presente invención sobre la reucción del colesterol total persistieron más allá de la fase de administración inicial.

Ejemplo 6

Efectos de la composición de fitosterol en ratones deficientes en Apo-E (Referencia)

Animales: Se compraron noventa ratones machos de 5 semanas, deficientes en Apo-E, de Jackson Laboratory, EE.UU. Los animales se dividieron al azar en 2 grupos, 9 animales en el grupo de control y 10 ratones en el grupo de Forbes experimental. Después de 5 días como período de adaptación, se sangraron por la cola en tubos capilares, y el plasma se separó por centrifugación de la sangre. Se calcularon los lípidos del plasma.

Dieta: Se compró, de Jamieson's Pet Food Distributors Ltd., Vancouver, B.C., comida para ratones baja en grasas y baja en colesterol. Se extrajeron los fitosteroles derivados del taloil a partir de jabón de taloil, usando el procedimiento descrito en la presente invención. Se analizó la pureza y porcentaje de cada fitosterol individual en la mezcla de producto final, mediante cromatografía de gas-líquido. El producto final mostró hasta 95% de pureza, y contenía 69% de sitosterol, 15% de campesterol y 16% de estigmastanol. La comida para ratones se molió hasta un estado de polvo fino. A este polvo se le añadió 0,15% (p/p) de colesterol (Sigma), y se mezcló bien. Se volvió a hacer peletes una porción de esta dieta suplementada con colesterol, se secó, y se usó para la alimentación del grupo de control de ratones; y otra porción de ella se suplementó con 2% (p/p) de fitosteroles extraídos de taloil, se volvió a hacer peletes, se secó y se usó para alimentar al grupo experimental de ratones.

Ensayos bioquímicos: Se midió el colesterol total y triglicéridos en plasma usando un kit enzimático (Boehringer Mannheim), y se calculó el HDL-colesterol mediante un método de precipitación previamente publicado, usando polietileglicol 6000.

Peso corporal y consumo de alimento: Se midió semanalmente el peso corporal de los ratones y el consumo de alimento.

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TABLA 7

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TABLA 8

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Otros hallazgos: No se observaron efectos secundarios con relación a las nuevas dietas. Todos los animales de ambos grupos parecían normal, con costumbres normales, incluyendo la frecuencia en la defecación. Se encontró muerto a un ratón del grupo de control, el 11/07/95. Puesto que no se conservó el cuerpo del ratón, no se realizó la autopsia. Se encontró a otro ratón, del grupo Forbes, deshidratado con pérdida de peso corporal. Se sacrificó al animal, y se encontró que la razón de su enfermedad era debida a oclusión dental defectuosa (crecimiento excesivo de los dientes).

Análisis estadístico: Los resultados se analizaron usando un test t de dos muestras, suponiendo varianzas iguales.

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Resultados

Los resultados hasta el momento actual se resumen en las siguientes Tablas.

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TABLA 9

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TABLA 10

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TABLA 11

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Se puede ver a partir de los resultados que el grupo de la composición Forbes mostró una disminución significativa (33%) en el colesterol total, un aumento insignificante en triglicéridos, y un aumento significativo en HDL-colesterol (>100%).

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Ejemplo 7

Efecto de la composición de fitosterol en hámsters - ensayo de 45 días

Se alojaron cincuenta hámsters GS durante dos semanas en una instalación para el cuidado de animales antes de alimentarlos con una dieta semipurificada durante 45 días. Se dividieron en cinco grupos alimentados con 0,25% de colesterol junto con una de las cuatro mezclas de esteroles de plantas: haba de soja, taloil, sitostanol puro, y mezcla artificial que representa fitosteroles de taloil. El grupo de control sólo recibió 0,25% de colesterol. Su ingesta de alimentos se monitorizó durante el período de estudio cada tres días. Se midió su peso corporal cada semana, y al final de la recogida de tejido. Tres días antes de sacrificar a los hámsters GS, se anestesiaron ligeramente con éter dietílico, y se les inyectó de forma intravenosa, a través de la vena yugular, 0,4 ml de Intralipid que contiene 0,18 mg de colesterol ^{13}C. Directamente después de la inyección, se alimentó a los animales, por intubación al estómago, 0,6 ml de mezcla de lípidos (aceites de coco, de oliva y de alazor) que contiene 0,44 mg de ^{18})-colesterol. Entonces, los hámsters GS se mantuvieron en sus jaulas de alambre durante 72 horas, y se les proporcionó agua y alimento a discreción.

En el día del sacrificio, se inyectó i.p. a cada hámster GS con 1 ml de agua deuterada, y se dejaron durante una hora antes de sacrificarlos. Los animales se anestesiaron con éter dietílico, y se recogieron muestras de sangre mediante punción cardiaca. Se recogió el hígado, la vesícula biliar, el intestino delgado, el intestino grueso y el corazón, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenaron en el congelador a -80ºC. Sus carcasas y heces se almacenaron a -20ºC para análisis adicional de lípidos totales y esteroles.

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Medidas de la ingesta de alimentos, peso corporal y peso del hígado

Se midió cada tres días la ingesta de alimentos de los hámsters GS. El análisis estadístico no muestra diferencia significativa entre los cinco grupos en su consumo de alimentos. La ingesta media diaria en los cinco grupos varió de 8,84 a 9,34 g por día, valor de p = 0,4. Los animales mostraron un incremento significativo en su peso corporal, de alrededor de 25 a 40 g durante el período de estudio, valor de p < 0,05 (test t pareado). La medida final de su peso corporal osciló de 112,5 a 154,3 g. No se observó significación estadística entre los diferentes grupos de tratamiento, valor de p = 0,43.

Los pesos de los hígados variaron significativamente entre las diferentes divisiones. El grupo tratado con sitostanol mostró los pesos más ligeros de los hígados, comparados con el control y otros grupos alimentados con 0,25% de colesterol y diferentes fitosteroles, respectivamente. Además, el grupo tratado con haba de soja presentó una diferencia significativa similar al del tratado con sitostanol, cuando los datos se analizan estadísticamente usando el test de Newman-Keuls. En general, todos los grupos alimentados con esteroles de plantas mostraron un menor peso del hígado, comparado con el control, alimentado con 0,25% de colesterol, valor de p = 0,01. Los hámsters GS alimentados con esteroles de taloil y con sitostanol tuvieron un peso medio del hígado de 15% y 20% menos que el del control, respectivamente. El taloil natural y el taloil preparado artificialmente demostraron valores similares de pesos del hígado, sugiriendo que el compuesto que falta en el esterol de plantas de haba de soja, el sitostanol, juega un papel primordial en la disminución del contenido de esterol en el hígado.

Análisis de lípidos I. Colesterol total

Se determinaron los valores del colesterol total usando unos kits de reactivos enzimáticos comerciales en un autoanalizador VP. Las muestras de sangre se midieron dos veces, y el promedio de los dos valores se usó en el análisis estadístico final. Se usaron los métodos de ANOVA de una sola vía, de Newman-Keuls, y de Bonferroni, para el análisis de los diferentes lípidos. El sitostanol disminuyó significativamente, en un 34%, el nivel de colesterol total en el plasma de hámsters GS, comparado con el control. El valor medio para el grupo de control fue 226,9 mg/dl, y el del grupo tratado con sitostanol fue 151,2 mg/dl, valor de p = 0,007. Los fitosteroles de taloil, y las mezclas de taloil artificiales mostraron una disminución similar en el colesterol del plasma (17,5%), 118,4 mg/dl y 186,1 mg/dl, respectivamente. Sin embargo, los fitosteroles de taloil (Forbes) mostraron una disminución significativa en el valor de colesterol total (175,2 mg/dl) cuando se excluyó del análisis un valor fuera de escala de la muestra, valor de p < 0,02 en el grupo del taloil, comparado con el grupo de control (0,25% de colesterol sólo). La correlación entre la presencia de sitostanol y el menor nivel del plasma fue significativa, valor de p < 0,0001, y r=0,46.

II. HDL-colesterol

La porción apoA de las lipoproteínas presentes en el HDL-colesterol no mostró cambios significativos en sus valores entre los cinco grupos diferentes, valor de p = 0,18. Se observó una disminución no significativa del 15% en el valor medio de HDL, en el grupo tratado con sitostanol. No obstante, este elemento no afectó a la disminución significativa en el colesterol total, que fue de 34%. La relación de las lipoproteínas no apoA a las lipoproteínas apoA (HDL) no varió significativamente entre los grupos. El efecto desconcertante de los valores más bajos no significativos de HDL en los grupos de sitostanol y de taloil contribuyó a crear un resultado no significativo en los valores no-apoA/apo A (HDL). En general, los diferentes tipos de fitosteroles no variaron el nivel de HDL-colesterol en el plasma de hámsters GS.

III. LDL y/o esteroles no apoA

El sitostanol fue eficiente disminuyendo los esteroles no apoA en el plasma. Se mostró una disminución de 55% en las lipoproteínas no apoA, valor de p = 0,02. De forma similar a su efecto en el colesterol total, el taloil y el taloil de la mezcla artificial disminuyeron los esteroles no apoA en un 21%, respectivamente, sugiriendo nuevamente una fuerte correlación existente entre el contenido de sitostanol en los fitosteroles y sus efectos beneficiosos disminuyendo los niveles de colesterol en el plasma de hámsters GS. Sin embargo, esta disminución no fue estadísticamente significativa debido a la variabilidad en los valores de los triglicéridos.

IV. Triglicérido

Cuando se aplica el método de ANOVA de una sola vía a los niveles de TG, no pasaron el test de normalidad. Los hámsters GS se sacrificaron en un estado de falta de ayuno (status importante para la futura síntesis de colesterol, la cinética, y el análisis de absorción). Debido a tal situación, hubo diferentes valores fuera de escala. Con ANOVA en Rangos, los niveles de TG no mostraron diferencia estadística entre los grupos. Los esteroles de plantas no afectaron a los niveles de TG en el plasma en hámsters GS.

TABLA 12

18

En conclusión, el uso de la composición derivada de jabón de taloil según la presente invención mostró el perfil más favorable debido al incremento en el HDL-colesterol, y a la disminución en el colesterol total. Este efecto en el HDL no se observó en la composición de taloil artificial. De forma similar, el efecto global de sitostanol no es favorable debido a la disminución significativa en HDL.

Aunque no está completamente claro, parece que, con respecto a los esteroles de plantas, los esteroles relativamente hidrófobos inhiben más la absorción de colesterol total, mientras que los esteroles relativamente hidrófilos tienen más influencia en el nivel de HDL. Las composiciones de fitosteroles de la presente invención son únicas por cuanto se conservan ambos de estos efectos.

Claims

1. Uso de una composición que reduce el colesterol que comprende beta-sitosterol, campesterol y que comprende además estigmastanol, en la que el campesterol y el estigmastanol juntos comprenden al menos 50% de la concentración de beta-sitosterol y en el que la relación de beta-sitosterol es 1,0, el campesterol está entre 0,2 y 0,4, y el estigmastanol está entre 0,2 y 0,5 en la fabricación de un medicamento para uso en un método de reducción de la concentración en plasma de colesterol lipoproteínico de baja densidad.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la relación de beta-sitosterol es 1,0, y o bien

a) el campesterol es 0,354 y el estigmastanol es 0,414, o

b) el campesterol es 0,330 y el estigmastanol es 0,203, o

c) el campesterol es 0,268 y el estigmastanol es 0,299.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el método es para prevenir o tratar dislipidemias primarias o secundarias, y aterosclerosis.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición comprende fitosteroles y compuestos concurrentes seleccionados de triterpenos, alcoholes de cadena larga y otros compuestos orgánicos solubles en alcohol.

5. Medicación que comprende beta-sitosterol, campesterol y que comprende además estigmastanol, en la que el campesterol y el estigmastanol juntos comprenden al menos 50% de la concentración de beta-sitosterol, y en la que la relación de beta-sitosterol es 1,0, el campesterol está entre 0,2 y 0,4, y el estigmastanol está entre 0,2 y 0,5, y un vehículo farmacéuticamente efectivo para ella.

6. Medicación según la reivindicación 5, en la que la relación de beta-sitosterol es 1,0, y o bien

a) el campesterol es 0,354 y el estigmastanol es 0,414, o

b) el campesterol es 0,330 y el estigmastanol es 0,203, o

c) el campesterol es 0,268 y el estigmastanol es 0,299.

7. Composición que comprende beta-sitosterol, campesterol y que comprende además estigmastanol, en la que el campesterol y el estigmastanol juntos comprenden al menos 50% de la concentración de beta-sitosterol, y en la que la relación de beta-sitosterol es 1,0, y o bien

a) el campesterol es 0,354 y el estigmastanol es 0,414, o

b) el campesterol es 0,330 y el estigmastanol es 0,203, o

c) el campesterol es 0,268 y el estigmastanol es 0,299.