NO310293B1 - Fremgangsmåte for isolering av en fytosterolsammensetning fra en massesåpe, anvendelse av en slik sammensetning, og farmasöytiskpreparat basert på denne - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte fremstilling og rensing av sterolsammensetninger fra massesåpe, anvendelse av disse sammensetningene og derivater derav som midler for å hindre eller behandle primære og sekundære dyslipidemier, samt farmasøytisk preparat basert på nevnte sterolsammensetninger.

Den direkte årsak til hjertesvikt og angina er en degenerativ prosess kjent som aterosklerose. Aterosklerose er resultat av et antall integrerte arvede (genetiske) og miljømessige faktorer. Samspillet mellom disse faktorene, og av disse synes dietten i vår sivilisasjon å være mest viktig, leder til utvikling av aterosklerose. Vekst av kolesterolfylte atherosklerotiske plakk kutter til slutt blodtilførselen til hjertemuskelen, eller alternativt til hjerne eller ben, avhengig av lokaliseringen av plakk i det arterielle treet.

En av hovedrisikofaktorene for aterosklerose som er potensiell modifiserbar er nivået av blodkolesterol. Et antall veldokumenterte studier har vist at blodkolesterolnivået er en viktig indikator for risiko for hjertesvikt og også slag. Forhold mellom blodkonsentrasjon av kolesterol og risiko for disse forstyrrelsene er kontinuerlig (strekker seg over alle kolesterolnivåene) i radert (dess høyere nivå, dess mer sannsynlighet for sykdom) uten noen åpenbar terskel (selv ved å senke de såkalte lave nivåer, kan man ytterligere minske risiko for sykdom). Mennesker i 40 års alderen med f.eks. et blodkolesterolnivå på 7,0 mmol/L innehar en risiko for coronar arteriesykdom som er tre til fire ganger det som er forbundet med nivåer under 5,0 mmol/L. Forholdet er særlig tydelig når nivået er over 5,2 mmol/L. Dødsraten blant menn med kolesterol ved nviåer 8,0 mmol/L var f.eks. nesten seks ganger den til menn med nivåer på 4,0 mmol/L. Disse senere funnene er i overensstemmelse med tidligere studier.

Andre store kliniske prøver har vist klart at ved å senke de høye kolesterolnivåene, kan man redusere risiko for dødelig og ikke-dødelige myokardinfarkter, angina, endringer i elektrokardiogram og i koronararterie-bypasskirurgi. Den best kjente og den første av disse undersøkelsene var ved Lipid Research Clinics der Coronary Primary Prevention Trials viste at med hver 1% reduksjon i total blodkolesterolnivå, var den en 2% reduksjon i risiko for coronar arteriesykdom.

For at enhver preventativ langtidsterapi av hyperkolesterolemi skal være vellykket, må den starte ved en relativt tidlig alder og fortsette hele tiden. Selv om diett med lavt fettinnhold er hjørnestenen i en slik langtidsterapi, blir opptil 60% av pasientene ikke-samtykkende etter seks måneder. Vanskeligheten vedrørende non-compliance er markert i mange vestlige land med en generell diett som har høyt innhold av fett. Den dårlige kolesterolprofilen hos mange pasienter blir forverret ved utbredelse av ytterligere risikofaktorer for kardiovaskulær sykdom slik som høyt blodtrykk, diabetes, overvekt og røyking.

Diettmodifikasjon som terapi for aterosklerose og andre kardiovasklære sykdommer har blitt betydelig forbedret i løpet av de 10 til 15 siste år. Det har særlig blitt anerkjent av forskere at plantesteroler (fytosteroler) er effektive ved senking av plasmakolesterolnivåer: Lees et al. Atherosclerosis, 28 (1977) 325-338; Kudehodkar et al., Atherosclerosis, 23 81976) 239; Day. Artery, 18(3): 125-132 (1991).

Fytosteroler er sterol-lignende forbindelser som blir syntetisert i planter uten noe ernæringsmessig verdi for mennesker. I planter er de nødvendig for cellefunksjon på en måte som tilsvarer kolesterol som er nødvendig i mennesker. Den gjennomsnittlige vestlige dietten inneholder opptil 360 mg fytosteroler pr. dag. I det siste har disse diettplantesterolene oppnådd stor oppmerksomhet på grunn av deres mulige anti-cancer egenskaper og deres evne til å minske kolesterolnivåer når de blir tilført et antall pattedyrarter inkludert mennesker.

Kjemisk ligner fytosteroler nært kolesterol i struktur. De viktige fytosterolene er beta-sitosterol, kampesterol og stigmasterol. Andre innbefatter stigmastanol (beta-sitostanol), sitostanol, desmosterol, chalinasterol, poriferasterol, clionasterol og brassicasterol. De kjemiske strukturene av beta-sitosterol, kampesterol og stigmasterol er som følger: Mekanismene som fytosterolene senker blodkolesterol i pattedyr er uklare, men synes å involvere hemming av kolesterolabsorpsjon fra proksimal jejunum ved å konkurrere med kolesterol ved spesifikke opptakssteder. Forskningsdata antyder også at noen fytosteroler ikke blir absorbert i proksimal jejunum i det hele tatt (sitostanol), og når det er absorpsjon (beta-sitosterol) skjer det i meget begrensede mengder.

Basert på disse forskningsfunn har anvendelse av fytosteroler som et diettsupplement for å redusere sterolabsorpsjon blitt undersøkt. Lees et al., Pollak, Pharmac. Ther., 31

(1985) 177-208; Raicht et al., Biochimica et Biophusica Acta, 388 (1975) 374-384.

I Lees et al., over, har det blitt gjort en sammenligning mellom effektene av siterosterol preparater fra to kilder, soyasteroler og talloljesteroler på plasmakolesterol. Plantesterol-preparater ble funnet å være effektiv i behandling av pasienter med hyperkolesterolemi. Pollak, over, er et oversiktlig dokument av fytosteroler og deres effekt på serumlipidet. Raicht, over, beskriver ytterligere effekter av beta-sitosterol på sterolbalanse og hastig-hets-begrensende enzymer av sterolmetabolisme.

Det er generelt akseptert at fytosteroler innebærer en unik kombinasjon av langtids-sikkerhet, effekt og allsidighet i human behandling. Den pågående utfordringen med hensyn på fytosteroler gjelder deres isolering og rensing fra plantekilder og i bestemmelse av ytterligere kilder som er kostnadseffektive, oppnåelig i stor skala og som utviser hypokolesteremiske effekter.

Fytosteroler har tradisjonelt blitt isolert fra kilder slik som maisolje, hvetekimolje, soyabønnerest («pitch») og maisoljerest. Talloljerest, som på tilsvarende måte ble oppnådd under prosessen ved fremstilling av papir fra tre, særlig furutre, har blitt anvendt som en fytosterolkilde. I denne prosessen blir generelt trestykker spaltet med kaustikk soda for å produsere en masse eller «såpe». Denne såpen blir deretter destillert for å fjerne flyktige materialer og det blir igjen en «rest» («pitch») som rest. Det er fra denne resten at forskere har isolert fytosteroler.

Det er noen markerte ulemper ved disse tradisjonelle fytosterolkildene. Talloljeresten er et ekstremt komplekst materiale som omfatter harpikser, fettsyrer, oksidasjonsprodukter, forestrede materialer og fytosteroler. Selv om resten er rimelig ved at det er noe som er igjen fra forskjellige fremstillingsprosesser, er det meget vanskelig å utvinne steroler av høy molekylvekt i godt utbytte og ved de høye renhetene som er nødvendig for farma-søytiske anvendelser.

US-patent nr. 3.840.570 til Julian angår en fremgangsmåte for fremstilling av steroler fra talloljerest ved ekstraksjon i en vann-alkohol-hydrokarbonblanding etterfulgt av forsåpning og etterfølgende rensing. Utgangsmaterialet i denne prosessen er talloljerest fra hvilken det ble ekstrahert fytosteroler og forskjellige urenheter. Det skal bemerkes at i en hvilken som helst talloljerest-renseprosess, er langkjedet alkohol og syreurenheter særlig vanskelig å separer fra steroler (som i seg selv er alkoholer av høy molekylvekt).

Andre forskere som er rettet mot sterolrensing fra talloljerest: US-patent nr. 2.835.682 til Steiner og Fritz; US-patent nr. 2.715.638 til Albrecht og Herrlinger; US-patent nr. 2.573.891 til Christenson. Det er viktig å legge merke til at i hver av disse kjente renseprosessene er utgangsmaterialet talloljerest som har de utvinningsproblemene som er diskutert over.

Det er mål med foreliggende oppfinnelse å unngå eller mildne ulempene som er nevnt over.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for isolering av en fytosterolsammensetning fra massesåpe, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den innbefatter: ekstrahering fra massesåpen av en kremaktig utfelling ved anvendelse av en oppløsnings-middelblanding omfattende vann, et keton og et hydrokarbon; og

rensing ved krystallisering av den kremaktige utfellingen for dannelse av fytosterolsammensetningen.

Det er fordelaktig at massesåpen fremstilles fra treflis valgt fra gruppen omfattende ceder, edelgran, furu, vanlig gran, eik, hemlock og poppel.

Dessuten tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en fytosterolsammensetning, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den omfatter: koking av treflis med kaustisk soda for dannelse av en massesåpe;

ekstrahering fra massesåpen av en kremaktig utfelling ved anvendelse av en oppløsnings-middelblanding omfattende vann, keton og et hydrokarbon; og

rensing ved krystallisering av den kremaktige utfellingen for dannelse av fytosterolsammensetningen.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også tilveie unike sammensetninger eller preparater som er effektive i å forebygge eller behandle dyslipidemier og som omfatter beta-sitosterol, kampesterol og stigmastanol. Fytosterolsammensetningene eller -preparatene som her blir tilveiebrakt er betydelig forskjellig fra de som finnes i planter, matvarer og olje. Tilveiebirngelsen av stigmastanol synes særlig å forbedre effekten. Disse sammensetningene kan i tillegg omfatte forskjellige samtidig forekommende forbindelser, som kan være eller ikke er fytosteroler. Disse samtidig frekommende forbindelsene kan særlig innbefatte triterpener, langkjedede alkoholer og andre alkoholoppløselige organiske forbindelser.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringer således oppfinnelsen et farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved at det omfatter P-sitosterol, kampesterol og videre stigmastanol, hvor kampesterol og stigmastanol sammen omfatter minst 50 % av konsentrasjonen av P-sitosterol og en farmasøytisk effektiv bærer for dette.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved at det omfatter P-sitosterol, kampesterol og stigmastanol, hvor forholdet for P-sitosterol er 1,0, kampesterol er mellom 0,2 og 0,4 og stigmastanol er mellom 0,2 og 0,5.

I sistnevnte preparat er det foretrukket at forholdet for P-sitosterol er 1,0, og enten

a) kampesterol er 0,354 og stigmastanol er 0,414, eller

b) kampesterol er 0,330 og stigmastanol er 0,203, eller

c) kampesterol er 0,268 og stigmastanol er 0,299.

Oppfinnelsen tilveiebringer et ytterligere farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved

at det omfatter P-sitosterol, kampesterol og videre omfattende stigmastanol, hvor kampesterol og stigmastanol sammen omfatter minst 50 % av konsentrasjonen av P-sitosterol, og hvor forholdet for P-sitosterol er 1,0, og enten

a) kampesterol er 0,354 og stigmastanol er 0,414, eller

b) kampesterol er 0,330 og stigmastanol er 0,203, eller

c) kampesterol er 0,268 og stigmastanol er 0,299.

Foreliggende oppfinnelse angår dessuten anvendelse av de fremstilte sammensetningene

for å forebygge eller behandle primære og sekundære dyslipidemier og aterosklerose inkludert koronar hjertesykdom, perifer vaskulær sykdom og slag hos mennesker og dyr.

Således tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av en kolesterolsenkende sammensetning omfattende P-sitosterol, kampesterol og videre omfattende stigmastanol, hvor kampesterol og stigmastanol sammen omfatter minst 50 % av konsentrasjonen av P-sitosterol i fremstillingen av et legemiddel for bruk til nedsettelse av plasmakonsentrasjonen av lipoprotein-kolesterol av lav densitet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av en kolesterolsenkende sammensetning

omfattende p-sitosterol, kampesterol og videre omfattende stigmastanol, hvor forholdet for P-sitosterol er 1,0, kampesterol er mellom 0,2 og 0,4 og stigmastanol er mellom 0,2 og 0,5, i fremstillingen av et legemiddel for bruk til nedsettelse av plasmakonsentrasjonen av lipoprotein-kolesterol av lav densitet.

I forbindelse med sistnevnte anvendelse er det foretrukket at forholdet for P-sitosterol er 1,0, og enten

a) kampesterol er 0,354 og stigmastanol er 0,414 eller

b) kampesterol er 0,330 og stigmastanol er 0,203, eller

c) kampesterol er 0,268 og stigmastanol er 0,299.

Foretrukne trekk ved foreliggende anvendelser fremgår fra medfølgende krav 7 og 8.

De unike sammensetningene i foreliggende oppfinnelse utviser ypperlige resultater ved senking av total (TC) og lavtetthetslipoprotin (LDL) blodkolesterol. Det ble i tillegg relativt overraskende funnet at sammensetningene i foreliggende oppfinnelse i forskjellige animalske arter, opprettholder eller hever plasmanivåene av høytetthet-lipoprotein (HDL) blodkolesterol. Dette trekket ved foreliggende oppfinnelse er kritisk viktig ut fra det faktum at forskning har vist at, uavhengig av TC-nivåer, når plasma HDL nivået minsker, øker risiko for aterosklerose. Fytosteroler isolert fra talloljerest, soyabønne eller andre kilder har ikke ut fra foreliggende oppfinneres kunnskap,vist denne unike HDL effekten.

Selv om det er kjent å produsere noen typer fytosteroler fra resten destillert fra såpe av trebehandling, har fytosterolsammensetninger til nå blitt fremstilt fra massesåpe-komponenten fra treflisbehandlingsprosessen. Talloljeresten er betydelig forskjellig i sammensetning fra massesåpe. Det antas at den overraskende effekten ved sammensetningen i foreliggende oppfinnelse skyldes i det minste delvis anvendelse av massesåpe som utgangsmateriale og den unike separasjonsprosessen.

Forskjellige trekk ved oppfinnelsen vil bli illustrert ved følgende tegninger, der

Fig. 1 er en gass-kromatografi profil av en sammensetning (heretter Forbes-2)

fra foreliggende oppfinnelse;

Fig. 2 viser profilen i fig. 1 fra 35 til 35 min. retensjonstid; Fig. 3 viser profilen i fig. 1 fra 22 til 27 min. retensjonstid; Fig. 4 er en indeks av gass-kromatografiprofilen av fig. 1; Fig. 5 er en gass-kromatografiprofilen for en annen sammensetning (heretter Forbes-3) fra foreliggende oppfinnelse; Fig. 6 viser profilen i fig. 5 fra 32 til 48 min. retensjonstid; Fig. 7 er en indeks av gass-kromatografiprofilen av fig. 5; Fig. 8 representerer en søylegraf som illustrerer effektene av Forbes-1 og Forbes-2 på TC-konsentrasjoner i rotter; Fig. 9 viser en søylegraf som illustrerer effekten av Forbes-1 og Forbes-2 på LDL-kolesterolkonsentrasjoner i rotter;

Fig. 10 viser en søylegraf som illustrerer effektene av Forbes-1 og Forbes-2 på

HDL-kolesterolkonsentrasjoner i rotter,

Fig. 11 viser en søylegraf som illustrerer effektene av Forbes-3 på serum TC i

hamstere;

Fig. 12 viser en søylegraf som illustrerer effektene av Forbes-3 på serum

LDL-kolesterol i hamstere; Fig. 13 viser en søylegraf som illustrerer effektene av Forbes-3 på serum HDL kolesterol i hamstere; Fig. 14 viser en søylegraf som illustrerer effektene av forskjellige diettbehandlinger på kolesterolnivåer i hamsterhanner og -hunner; Fig. 15 viser en søylegraf som illustrerer effektene av forskjellige diettbehandlinger på plasmakolesterolnivåer i hamsterhanner; Fig. 16 viser en søylegraf som illustrerer effektene av forskjellige diettbehandlinger på plasmakolesterolnivåer i hamsterhunner; Fig. 17 viser en søylegraf som illustrerer effektene av forskjellige diettbehandlinger på plasmatriglyseridnivåer i hamsterhanner og -hunner; Fig. 18 viser en søylegraf som illustrerer effektene av forskjellige diettbehandlinger på HDL/apo-B forhold i hamsterhanner og -hunner; Fig. 19 viser en søylegraf som illustrerer effektene av diettbehandlinger på

totalkolesterol i hamster 45 dagers studie;

Fig. 20 viser en søylegraf som illustrerer effektene av diettbehandlinger på

kolesterolkorrelasjon med sitostanol;

Fig. 21 viser en søylegraf som illustrerer effektene av diettbehandlinger på

HDL nivåer i hamstere i løpet av 45 dager;

Fig. 22 viser en søylegraf som illustrerer effektene av diettbehandlinger på

ikke-apoA/apoA forhold i hamstere i løpet av 45 dager; og

Fig. 23 viser en søylegraf som illustrerer effektene av diettbehandlinger på

ikke-apoA steroler i hamstere i løpet av 45 dager.

Fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse omfatter trinnene med:

(A) oppnåelse og preparering av utgangsmaterialer, en plante-avledet massesåpe; (B) ekstrahering fra såpen en kremaktig utfelling ved anvendelse et passende

oppløsningsmiddel; og

(C) rensing fra den kremaktige utfellingen en fytosterolsammensetning.

Det er tallrike mulige kilder for plante-avledede massesåpe. I en kjent prosess («Kraft»

prosessen) blir generelt trestykker behandlet med kaustisk soda for å produsere en såpe. Trestykkene kan komme fra et hvilket som helst hardt tre eller mykt tre av varierende art, men er ikke begrenset til gran, ceder, furu, gran, eik, hemlock og poppel. Det er mest å foretrekke at stykkene kommer fra en hvilken som helst Stillehavs nordvest amerikansk eller europeisk trevariant.

I ekstraksjonsfasen blir fasen blandet med et keton og vannoppløsning. Et hydrokarbon-oppløsningsmiddel blir anvendt til å ekstrahere sterolene. Dette trinnet kan bli gjennomført ved temperatuerer generelt fra 25°C til 150°C, men mest å foretrekke fra 50°C til 100°C. Det er mest å foretrekke at denne ekstraksjonsfasen fortsetter over 15 til 24 timer. Det er viktig å legge merke til at anvendelse av alkohol er nødvendig og foreslått under ekstraksjonsfasen. Ekstraksjonsprosessen i foreliggende oppfinnelse blir gjennomført ved å anvende et keton-vann-hydrokarbon oppløsningsmiddel.

Ketonet blir valgt fra gruppen som har generell struktur RCOR<1> der R og R<1> er alkylgrupper. Alkylgruppene er fortrinnsvis C1-C6 grupper. Det er mest å foretrekke at ketonet er 2-propanon (aceton). Hydrokarbonet kan bli valgt fra gruppen som omfatter alle C5-C10 hydrokarbonene. Det er mest å foretrekke at hydrokarbonet er heksan.

Som vist i fig. 1 er produktet fra ekstraksjonsfasen en kremaktig utfelling eller rest og fra denne blir fytosterolsammensetningen renset. Denne rensefasen kan bli gjennomført ved krystallisasjon, kromatisk separasjon eller ved en hvilken som helst annen egnet prosedyre. Det er mest å foretrekke at den kremaktige utfellingen blir oppløst i alkohol, langsomt avkjølt, deretter filtrert og vasket med kald alkohol. Resten blir tørket og det resulterende produktet er en fytosterolsammensetning.

I en foretrukket form blir alkoholen som blir anvendt i rensefasen valgt fra gruppen som har generelle strukturer R-CHOHR, R-CH2OH og RCOH der R er en CrC4 alkylgruppe. Det er mest å foretrekke at alkoholen er metanol. Avkjølingsfasen kan bli gjennomført ved temperaturer fra 10°C til 0°C, mest å foretrekke 3 til 4°C i 24 timer.

Fytosterolsammensetningene som resultat av prosessen som her er beskrevet kan bli inkorporert direkte i mattilskudd og vitaminformuleringer og i medikamenter for pågående og preventiv behandling av aterosklerose og dens konsekvenser, slag, hjerteattak og perifer vaskulær sykdom. Det er i tillegg innbefattet i en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse at fytosterolsammensetningen som her er beskrevet blir tilveiebrakt i form av medikamenter med egnede adjuvanser eller bærere. Disse sammensetningene kan f.eks. bli inkorporert eller foreskrevet samtidig med utvalgte lipid-senkende midler, for å minske nødvendig dose og således toksisitet av disse sistnevnte forbindelser.

Fytosterolsammensetningene i foreliggende oppfinnelse har utvist en markert evne til å modifisere lipoproteiner, selv ved lavere fytosterolkonsentrasjoner enn i kjente

formuleringer. Mer overraskende har imidlertid vært effekten av disse sammensetningene på økende plasmanivåer av høy tetthetslipoproteiner (HDL), en effekt som til nå ikke har vært forbundet med noen andre tallolje-avledede fytosterol-sammensetninger. Det antas

at denne unike effekten kan skyldes anvendelse av massesåper som utgangsmateriale eller tilveiebringelse av stigmastanol som et element i sammensetningen.

I en foretrukket form omfatter sammensetningene i foreliggende oppfinnelse følgende forhold av fytosteroler: beta-siterosterol (1); campesterol (0,2-0,4) og stigmastanol (0,2-0,5). Campesterol og stigmastanol representerer sammen minst 50% av total konsentrasjon av beta-sitosterol. I en mest foretrukket form omfatter sammensetningene i foreliggende oppfinnelse følgende forhold av fytosteroler sammenlignet med soyabønne-avledede fytosteroler:

Sammensetning og renhet av to andre ekstrakter innenfor rekkevidden av foreliggende oppfinnelse er som følger:

I hver sammensetning som er beskrevet, kan det være tilleggsforbindelser som er tilstede og disse kan eller kan ikke være fytosteroler. Det har f.eks. blitt funnet at campestanol, en annen fytosterol kan være tilstede i en relativt liten mengde. I tillegg kan rettkjedede fettalkoholer, slik som behenyl (C22) og lignocerylalkohol (C24) være tilstede. For å bestemme egenskapene til disse sam-forekommende forbindelsene, har det blitt gjennom-ført gassvæskekromatografianalyse på hver av de mest foretrukkede sammensetningene av foreliggende oppfinnelse.

Gasskromatografi kjøringsbetingelsene for fytosterolene var: begynnende temperatur 80°C som ble holdt i 1 min.; heving til 120°C med 20°C pr. min., som ble holdt i 7 min.; endring til 24°C ved 20°C pr. min. som ble holdt i 15 min.; og endring til 269°C med 20°C pr. minutt som ble holdt i 25 min. På slutten av hver kjøring ble temperaturen endret til 320°C og holdt i minimum 5 min. Injeksjonstemperaturen var 300°C og detektortemperaturen var 320°C. Kolonnestrømhastigheten var 1 ml pr. minutt og den splittede ventilasjonsstrømhastigheten var 4 ml minutt.

Renseventilasjonsstrømhastigheten var 4,5 ml minutt. Bæregassen var helium.

Resultatene av gassvæskekromatografianalyse for to av de mest foretrakkede sammensetningene i foreliggende oppfinnelse er vist i fig. 1-7.

Under henvisning til Forbes-2 sammensetningene, synes de kjente sterolene å være i 35-45 minutt området i fig. 1 og 2. Beta-sitosterol er angitt ved topp 87; campesterol er angitt i topp 81 og stigmastanol er angitt i topp 84. Toppene 65, 66 og 77 i fig. 2 er sam-forekommende forbindelser som kan utvise hypokolesterolemiske effekter. Det er mulig imidlertid at disse sam-forekommende forbindelsene kan ha en synergistisk effekt på virkningen av kjente fytosteroler i sammensetningen. På tilsvarende måte i fig. 5 og 6 blir campesterol, stigmastanol og beta-sitosterol representert ved henholdsvis topper 6, 7 og 8.

En annen foretrukket sammensetning som omfattes av foreliggende oppfinnelse omfatter følgende komponenter:

med en total fytosterolkonsentrasjon på 97,3 %.

Eksempel 1 - Ekstraksjon og rensing

En sats av 3 kg massesåpe ble oppnådd fra B.C. Chemicals Inc. En blanding av 3 1 aceton og 1,5 1 vann ble fremstilt og til hvilken ble såpen tilsatt. Blandingen ble ekstrahert kontinuerlig med 4,5 1 heksan ved 50°C i 24 timer ved å anvende en 18 1 inndamper. Det resulterende ekstraksjonsproduktet ble deretter tørket over natriumsulfat og fikk ajJedning til å inndampe. Dette produserte 460 g av resten eller en kremaktig utfelling.

Den kremaktige utfellingen ble oppvarmet og omrørt ved å anvende en magnetisk rørestav og 460 ml metanol ble langsomt tilsatt. Blandingen ble tilbakestrømmet under omrøring i 15 minutter og deretter avkjølt langsomt i 3-5 timer. Blandingen ble avkjølt ved 3-4°C over natten og deretter filtrert g vasket to (ganger) med 150 ml kald metanol. Til slutt ble blandingen holdt i en vakuum i 2 dager og gir 100 g av blandingen med en renhet på 82 % (dvs. 82 g av fytosteroler).

Eksempel 2 - Evaluering av effektene av fytosterolsammensetningene i rotter

Nitti Wistarrotter-hannrotter (80-100 g) ble delt i 3 eksperimentelle moduler: Forbes-1 sammensetning; Forbes-2 sammensetning og soyabønne. Tredve rotter i hver modul ble videre delt i 5 diettsystemer som angitt i tabell 2. Rottene ble holdt på revers lyssyklus, og foret i 10 dager ved en basal halv-rensetn diett (tabell 1) supplert med forskjellige mender kolesterol og fytosterol (tabell 2). I hver av de 5 diettgruppene, ble 2 rotter administrert Forbes-1 sammensetning, 2 roter ble administrert Forbes-2 sammensetning og 2 rotter ble administrert soyabønne-avledet fytosterol (Sigma).

På slutten av foringsperioden ble rottene injisert interperitonalt med deuteriumoksid (0,4 ml) og fratatt mat og vann i minst 2 timer. Rottene ble deretter anestesert med halotan. Blodprøver ble tatt fra hjertet. Prøver av lever, tynntarm og muskel ble raskt fjernet, oppveid, anbrakt i flytende nitrogen og lagret ved 80°C inntil bestemmelse av kolesterolsyntese. Total kolesterol, LDL, og HDL kolesterol ble bestemt med et kommersielt sett (Biopacific Diagnostic Inc.).

Resultatene av effektene av fytosterolsammensetningene på totalkolesterol, LDL og HDL er representert i hhv. fig. 8, 9 og 10. Effekt av Forbes-1 og Forbes-2 er åpenbart fra reduksjon i LDL-kolesterol som er vist i fig. 9 og i økning av HDL-kolesterol som er vist i fig. 10, særlig av Forbes-1.1 fig. 8 resulterte tilsetning av kolesterol (diettgruppe 2) til basisdiett (gruppe 1) i en økning i sirkulerende kolesterolkonsentrasjoner. Progressiv tilsetning av økende nivåer av fytosteroler (gruppe 3-5) resulterte i en normalisering av kolesterolnivåer i grppene foret med Forbes-2 og Forbes-1, men ikke soyabønnefytosteroler, slik det ble bestemt ved regressjonsanalyse. Fig. 9 viser at Forbes-2 og Forbes-1 fytosteroler innehar bedre kolesterol-senkende effekt enn soyabønnefytosteroler for LDL. Fig. 10 viser større HDL-økende evne av foretrukkede sammensetninger i foreliggende oppfinnelse, særlig Forbes-1 sammenlignet med soyabønnefytosteroler.

Eksempel 3 - Evaluering av effketer av fytosterolsammensetninger i hamstere.

Foreliggende studie var for å undersøke effekt av diettfytosterolsammensetninger fra foreliggende oppfinnelse på diettkolesterol indusert heving av serumkolesterol konsentrasjoner i hamstere.

Totalt 40 hamsterhanner (80-100 g) som ble holdt individuelt i rustfrie nettingbur ble foret med gnagermat og akklimatisert tre dager i et luftkondisjoneringsrom (20-22°C), lys på 1700-0500). Hamstrene ble deretter delt i fem grupper av åtte dyr i hver gruppe, og foret i 34 dager, på en basal halv-rensediett (tabell 3) supplert med forskjellige mengder kolesterol og en av fytosterolsammensetningene i foreliggende oppfinnelse (Forbes-3) (tabell 4).

På slutten av foringsperioden ble dyrene injisert interperitonalt med deuteriumoksid (0,4 ml) og fratatt mat og vann i minst 2 timer. Hamstrene ble deretter anestesert med halotan. Blodprøver ble tatt fra hjertet. Andre vevsprøver inkludert lever, tynntarm og muskel ble raskt fjernet, oppveid, anbrakt i flytende nitrogen og lagret ved -80°C inntil bestemmelse av kolesterolsyntese. Total kolesterol, HDL, og LDL kolesterol ble bestemt med et kommersielt sett. Resultatene ble statistisk evaluert med ONEWAY analyse av variansprosedyren (SYSTAT).

Hamstere foret med høykolesteroldiett hadde betydelig høyere serum total kolesterol og LDL kolesterol enn de som ble foret med normal kolesteroldiett (0,025%). Supplering av fytosterol ved nivåer på 0,5 og 1 % oppveiet i betydelig grad disse økningene indusert ved høy kolesterol forbruk (fig. 11 og 12). LDL kolesterolkonsentrasjon i gruppe 5 var lavere sammenlignet med nivåene i hamstere foret med normal kolesterol inneholdende dietter (fig. 12). Videre var det en negativ regressjonsassosiasjon av total kolesterol og LDL kolesterol til nivå av fytosteroltilsatt i diett (fig. 13).

Supplering av fytosterol foråsaket ved en svak økning i HDL, men uten å gi en signifikant forskjell (fig. 13).

Eksempel 4 - Evaluering av fytosterolsammensetningseffekter i hamstere -

90 dagers forsøk

Seks grupper av 20 hamstere (10 hanner, 10 hunner) ble foret med halv-rensede dietter inneholdende 30% fett (flerumettet/mettet fettforhold = 0,3) i 90 dager. Diett 1 var kolesterolfri. Diettene 2-6 inneholdt 0,25% (vekt/vekt) diettkolesterol. Diettene 3 og 4 inneholdt Forbes fytosteroler (mer enn 90% renhet) ved hhv. 0,5 og 1 %. Dietter ble laget fra primære ingredienser hver uke. Fett, fytosterol og kolesterolnivåer ble bestemt ved gassvæske kromatografi. Alle dyrene hadde fri tilgang på vann og dietter i løpet av hele eksperimentperioden. Dyrene ble veid hver uke. Inntak av mat ble også bestemt hver dag og gjennomsnitt pr. uke ved oppveiing av matskåler før og etter hver 24 timers foringsperiode. Etter 90 dagers foring, ble dyrene tatt livet av ved å anvende halotan og blodet ble samlet for lipoprotein profilanalyse. Sirkulerende total, apoB inneholdende partikler og HDL kolesterol og triglyseirdnivåer ble bestemt. Rett før dyrene ble tatt livet av, ble også kolesterolabsorpsjon og syntese størrelser bestemt ved å anvende hhv. 14C-kolesterolfjerning fra tarm og deuterium inkorperering i vevskolesterolsmetoder. Opptak av fytosteroler i tynntarm og annet vev ble også undersøkt. Prøver av tynntarm og lever ble i tillegg lagret for levering til Bio-Research Laboratories of Senneville, Quebec, for histopatologiske, karcinogenesitets- og enzymfunksjonsanalyser.

Resultater.

Resultatene er vist i fig. 14-18. Grupper i disse figurene blir ofte referert til ved tall, som tilsvarer de som er beskrevet i eksperimentell utforming. Bokstaver over søylene i søyle-grafer identifiserer signifikante forskjeller mellom grupper. Der bokstaver er gitt, er søyler som deler samme bokstav ikke signifikant forskjellig, mens de med forskjellige bokstaver er forskjellige ved et statistisk nivå på å < 0,005.

Det blir i fig. 14-16 vist sirkulerende kolesteroldata for hannlige og hunnlige hamstere som konsumerer testdietter i løpet av 90 dager. Signifikante effekter av kjønn ble observert i totalsirkulerende kolesterolnivåer for dyr som konsumerer diett 2, basisdiett med bare tilsatt kolesterol, og diett 5 inneholder kolesterol + soyabønnefytosteroler. Hunner som selv om det ikke var noe forskjell fra hanner i kolesterolnivåer på basal diett (gruppe 1), utviste en høyere respons til tilsatt kolesterol alene sammenlignet med hanner. Tilsetning av fytosteroler opphevet denne forskjell med unntagelse for gruppe 5.

Kolesterolnivådata brudt ned til kjønn er vist i fig. 15 og 16. For hanner (fig. 15) resulterte tilsetning av kolesterol alene til basaldietten i en signifikant økning i total sirkulatorisk kolesterolnivå. Tilsetning av Forbes fytosteroler ved 0,5 prosent resulterte i en tendens mot en nedgang i kolesterolnivå, imidlertid utløste tilsetning av Forbes fytosteroler ved 1 % i en statistisk signifikant reduksjon i kolesterol, til tilnærmet samme nivå av kontrollgruppen uten tilsatt kolesterol. Når soyabønne fytosteroler ble tilsatt dietten ved 0,5 og 1 %, var det ingen signifikant minskning i sirkulerende total kolesterolnivåer i hanner. For HDL ble det observert en forskjellig effekt av Forbes versus soyabønne, hvor Forbes foring ikke produserte noe endring i HDL nivåer i gruppen som ble gitt kolesterol alene (gruppe 2), imidlertid resulterte foring av soyabønne i en signifikant nedgang i HDL verdier i begge de undersøkte nivåene (gruppe 5 og 6). Det var ingen signifikante forskjeller over apoB inneholdende kolesterolpartikler, imidlertid var det en tendens mot lavere nivåer med foring av kolesterol Forbes ved 1 % sammenlignet med andre grupper.

Data for hunner er vist i fig. 16. For total og HDL kolesterol, var det en utalt påvirkning av tilsetning av diettkolesterol alene. Tilsetning av en fytosterolkilde ved 1 % resulterte i betydelig og ved tilsvarende nedgang i total HDL kolesterolkonsentrasjoner. ApoB innholdende partikkelnivåer ble ikke påvirket av dietten.

Sirkulerende triglyseridnivåer i hamstere som konsumerer testdietter i 90 dager er vist i fig. 17. Det var en økning i sirkulerende triglyseirdnivåer i hunndyr som ble gitt basaldiett kolesterol og Forbes 0,5 % sammenlignet med basaldiett alene, imidlertid ble det ikke observert andre inter-gruppeforskjeller i noen av kjønnene. Hos hanner var det ingen effekt eller tendens av diett på triglyseridkonsentrasjoner.

Oppsummert er rangering av resultater for hanner på testdiettene som følger:

Fordelen ved Forbes-sammensetningene (de i foreliggende oppfinnelse) kan tydelig sees. I tillegg ble tilsvarende rangeringer funnet for HDL: ApoB forhold hos hanner (fig 18):

Det ble også funnet at HDL:LDL-forholdet for Forbes sammensetningene var nesten dobbelt av de til P-sitosterol alene.

Eksempel 5 - Effekter av fytosterolsammensetninger på kaniner

I denne studien ble to kaniner vurdert i løpet av 43 dager med hensyn på effekter av en av sammensetningene i foreliggende oppfinnelse (Forbes 1 % i diett) på deres totale kolesterolprofiler. Resultatene er som følger:

En nedgang i total kolesterol kan sees hos begge kaninene A og B under to ukers fysosterolsarnmensetningsadministrering (Forbes 1 %). Denne effekten fortsetter selv etter avslutning av Forbes 1 %. Effektene av sammensetningene fra foreliggende oppfinnelse på total kolesterolsenking blir over den initielle administreringsfasen.

Eksempel 6 - Effekter av fytosterolsammsetning på Apo-E manglende mus

Dyr:

Nitten 5-uker gamle Apo-E manglende hannmus ble innkjøpt fra Jackson Laboratory, USA. Dyrene ble tilfeldig delt i 2 grupper, 9 dyr i kontrollgruppen og 10 mus i den eksperimentelle Forbes gruppen. Etter 5 dager som en tilpasningsperiode ble musene blodtappet fra halen i kapillærrær og plasma ble separert ved sentrifugering av blod. Musplasmalipider ble estimert.

Diett:

Lav-fett, lav-kolesterolmusfor ble innkjøpt fra Jamiesons Pet Food Distributørs Ltd., Vancouver, B.C. Fytosteroler fra tallolje ble ekstrahert fra talloljesåpe, ved å anvende prosessen som beskrevet i foreliggende oppfinnelse. Renhet og prosentdeler av hver individuell fytosterol i blanding og sluttproduktet ble vurdert ved gassvæskekromato-grafi. Den endelige prosedyren viste opptil 95 % renhet og inneholdt 69 % sitosterol, 15 % kampesterol og 16 % stigmasterol. Museforet ble oppmalt til et fint pulver. Til dette pulveret ble 0,15 % (w/w) kolesterol (Sigma) tilsatt og blandet grundig. En del av denne kolesterolsupplerte dietten ble pelletisert på nytt, tørket og anvendt for for-kontrollgruppen av mus, og en annen del av den ble supplert med 2 % (w/w) tallolje-ekstrahert fytosteroler, pelletisert på nytt, tørket og anvendt i foring av den eksperimentelle gruppen av mus.

Biokjemisk analyse:

Plasma total kolesterol og triglyserid ble målt ved å anvende enzymatisk sett (Boehringer Mannheim) og HDL-kolesterol ble stimulert ved den tidligere publiserte utfellings/etoden ved å anvende polyetylenglykol 6000.

Kroppsvekt og forkonsum:

Muselegements vekt og forkonsum ble målt hver uke.

Andre funn:

Ingen bivirkninger ble observert med hensyn på nye dietter. Alle dyrene fra begge gruppene så normale ut, med normale vaner inkludert tarmvane. En mus i kontrollgruppen ble funnet død den 11/07/95. Siden muselegement ikke ble beholdt, ble det ikke gjennomført autopsi. En annen mus fra Forbes-gruppen ble funnet hydratisert med tap av kroppsvekt. Dyret ble tatt livet av på grunn av sykhet og årsaken var funnet å være malokklusjon (tannovervekt).

Statistisk analyse:

Resultatene ble analysert ved å anvende t-test med to-prøver ved å anta like varianser.

Resultater:

Resultatene opptil nå er oppsummert i følgende tabeller.

Man kan se fra resultatene at Forbes-sammensetningsgruppen viste en signifikant (33 %) nedgang i total kolesterol, en innsignifikant økning i triglyserider og en signifikant økning i HDL-kolesterol (>100 %).

Eksempel 7 - Effekt av fytosterolsammensetning på manstere - 45 dagers forsøk

Femti GS-hamstere ble innkvartert i to uker i en dyrepleiefasilitet før foring med halv-renset diett i 45 dager. De ble delt i fem grupper foret med 0,25 % kolesterol sammen med en av fire balndinger av plantesteroler: soyabønner, tallolje, ren sitostanol og kunstig blanding representerende kaldoljefytosteroler. Kontrollgruppen mottok bare 0,25 % kolesterol. Deres matinntak ble overvåket under studieperioden hver tredje dag. Kropps-vekter ble målt hver uke og ved tidspunktet for vevssamling. Tre dager før GS-hamstrene ble tatt livet av, ble de lett anestesert med dietyleter og injisert intravenøst gjennom halsvenen med 0,4 ml Intralipid inneholdende 0,18 mg <13>C-kolesterol. Direkte etter injeksjon ble dyrene foret ved a de ble gitt 0,6 ml lipidblanding (koksnøtt, oliven og safranolje) inneholdende 0,44 mg <18>)-kolesterol. Deretter ble GS-hamstrene holdt i nettingburene i 72 timer, og de fikk vann og mat ad libitum.

Den dagen dyrene ble drept ble hver GS-hamster injisert i.p. med 1 ml deuterert vann, og fikk være i 1 time før de ble avlivet. Dyrene ble anestesert med dietyleter, og blodprøver ble samlet ved kardio-punktering. Lever, galleblære, tynntarm, tykktarm og hjerte ble samlei frosset i flytende nitrogen og lagret i fryser ved -80°C. De døde kroppene og faeces ble lagret ved -20°C for ytterligere total lipid og stereoanalyse.

Matinntak, kroppsvekt og levervektmålinger:

GS-hamstermatinntak ble målt hver tredje dag. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskjell blant de fem gruppene når det gjaldt deres matkonsum. Det daglige gjennomsnittlige inntak i de fem gruppene varierte fra 8,84 til 9,34 g pr dag, p-verdi = 0,4. Dyrene viste en signifikant økning i kroppsvekt fra ca 25 til 40 g i løpet av studieperioden, p-verdi <0,05 (parret t-test). Den endelige målingen av kroppsvekten var fra 112,5 til 154,3 g. Ingen statistisk signifikans ble notert blant de forskjellige behandlings-gruppene, p-verdi = 0,43.

Vekt av lever varierte signifikant blant de foskjellige gruppene. Sitostanolbehandlet gruppe viste laveste levervekter sammenlignet med kontroll og andre grupper foret med 0. 25 % kolesterol og forskjellige fytosteroler. I tillegg innebar soyabønnebehandlet gruppe tilsvarende signifikant forskjell til sitostanolbehandlet når data analyseres statistisk ved å anvende Newman-Keuls test. Alle gruppene som var foret med plantesteroler viste generelt lavere levervekt sammenlignet med kontrollforet med 0,25 % kolesterol, p-verdi = 0,01. Talloljesteroler og sitostanolforede GS-hamstere hadde en gjennomsnittlig levevekt på henholdsvis 15 % og 20 % mindre enn kontrollen. Naturlig tallolje og kunstig fremstilt tallolje viste tilsvarende verdier for levervekter og antyder at den manglende forbindelsen i soyabønneplantesterol, sitostanol, spiller en viktig rolle i senking av sterolinnhold i leveren.

Lipidanalyse:

1. Total kolesterol:

Totale kolesterolverdier ble bestemt ved å anvende et kommersielt enzymatisk reagenssett på en VP-autoanalysator. Blodprøver ble målt to ganger, og gjennomsnitt av de to verdiene ble anvendt i de endelige statistiske analysene. ANOVA med Newman-Keuls og Bonferroni metoder ble anvendt for forskjellig lipidanalyser. Sitostanol minsket betydelig totalkolesterolnivå i GS-hamsterplasma med 34 % sammenlignet med kontroll. Gjennomsnittsverdien for kontrollgruppen var 226,9 mg/dl, og den for sitostanolbehandlet gruppe var 151,2 mg/dl, p-verdi = 0,007. Talloljefytosteroler og kunstige talloljeblandinger viste tilsvarende nedgang i plasmakolesterol (17,5 %), henholdsvis 118,4 mg/dl og 186,1 mg/dl. Talloljefytosteroler (Forbes) viste imidlertid signifikant nedgang i total kolesterolverdi (175,2 mg/dl) når en prøveverdi som var utenfor skalaen ble ekstruldert fra analysen, p-verdi <0,01 i talloljegruppen sammenlignet med kontroll (bare 0,25 % kolesterol). Korrelasjon mellom tilstedeværelse av sitostanol og lavere plasmanivå var signifikant, p-verdi < 0,0001 og r = 0,46.

n. HDL-koIesterol:

ApoA-delen av lipoproteiner som er tilstede i HDL-kolesterolen viste ingen signifikante endringer i verdiene blant de fem forskjellige gruppene, p-verdi = 0,18. En ikke-signifikant nedgang på 15 % i gjennomsnittlig HDL-verdi i den sitostanolbehandlede gruppen ble observert. Dette elementet påvirket ikke desto mindre den signifikante nedgangen i total kolesterol som var 34 %. Forholdet mellom ikke-apoA lipoproteiner til apoA (HDL) lipoproteiner varierte ikke signifikant blant gruppene. Den forvirrede effekten av ikke-signifikante lavere verdier av HDL i sitostanol og talloljegrupper bidro til skaping av et ikke-signifikant resultat ikke apoA/apoA verdiene (HDL). Forskjellige typer fytosteroler varierte generelt ikke HDL-kolsetrolnivå i GS-hamsterplasma.

in. LDL og/eller ikke-apoA steroler:

Sitostanol var effektiv i å senke ikke-apoA steroler i plasma. En 55 % nedgang i ikke-apoA lipoproteiner ble vist, p-verdi = 0,02. Tilsvarende på deres effekt på total kolesterol, minsket tallolje og kunstig blanding tallolje ikke-apoA steroler med henholdsvis 21 %, igjen antyder dette en sterk korrelasjon som eksisterer mellom sitostanolinnhold i fytosteroler og deres fordelaktige effekter ved senking av kolesterol-nivået i GS-hamsterplasma. Denne nedgangen var imidlertid ikke statistisk signifikant på grunn av variasjon i triglyseridverdier.

IV. Triglyserid:

Når man anvender enveis ANC*VA metoden på TG-verdiene, passerer de ikke normalitetstesten. GS-hamstere ble tatt livet av i en ikke-fastende tilstand (viktig status for fremtidig kolesterolsyntese, kinetikk og absorpsjonsanalyse). Op grunn av situasjonen var forskjellige verdier utenfor skalaen. Med ANOVA på Ranks, viste TG-verdiene ingen statistisk forskjell i gruppene. Plantesterolene påvirket ikke plasma TG-nivåer i GS-hamstere.

Som konklusjon viste talloljesåpe-avledet sammensetning fra foreliggende oppfinnelse den mest gunstige profilen på grunn av økning i HDL-kolesterol og nedgang i total kolesterol. Denne HDL-effekten kunne man ikke se i den kunstige talloljesammen-setningen. Den samlede effekten av sitostanol er ikke begunstiget på tilsvarende måte på grunn av den signifikante nedgangen i HDL.

Selv om det er helt klart synes det, med hensyn på platensteroler, at de relativt hydrofobe sterolene hemmer med total kolesterol absorpsjon mens de relativt hydrofile sterolene har mer påvirkning på nivå av HDL. Fytosterolsammensetningene i foreliggende oppfinnelse er unik ved at begge disse effektene blir bevart.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for isolering av en fytosterolsammensetning fra en massesåpe, karakterisert ved at den omfatter: ekstrahering fra massesåpen av en kremaktig utfelling ved anvendelse av en oppløsnings-middelblanding omfattende vann, et keton og et hydrokarbon; og rensing ved krystallisering av den kremaktige utfellingen for dannelse av fytosterolsammensetningen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at massesåpen fremstilles fra treflis valgt fra gruppen omfattende ceder, edelgran, furu, vanlig gran, eik, hemlock og poppel.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en fytosterolsammensetning, karakterisert ved at den omfatter: koking av treflis med kaustisk soda for dannelse av en massesåpe; ekstrahering fra massesåpen av en kremaktig utfelling ved anvendelse av en oppløsnings-middelblanding omfattende vann, keton og et hydrokarbon; og rensing ved krystallisering av den kremaktige utfellingen for dannelse av fytosterolsammensetningen.

4. Anvendelse av en kolesterolsenkende sammensetning omfattende P-sitosterol, kampesterol og videre omfattende stigmastanol, hvor kampesterol og stigmastanol sammen omfatter minst 50 % av konsentrasjonen av P-sitosterol i fremstillingen av et legemiddel for bruk til nedsettelse av plasmakonsentrasjonen av lipoprotein-kolesterol av lav densitet.

5. Anvendelse av en kolesterolsenkende sammensetning omfattende P-sitosterol, kampesterol og videre omfattende stigmastanol, hvor forholdet for P-sitosterol er 1,0, kampesterol er mellom 0,2 og 0,4 og stigmastanol er mellom 0,2 og 0,5, i fremstillingen av et legemiddel for bruk til nedsettelse av plasmakonsentrasjonen av lipoprotein-kolesterol av lav densitet.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor forholdet for P-sitosterol er 1,0, og enten d) kampesterol er 0,354 og stigmastanol er 0,414 eller e) kampesterol er 0,330 og stigmastanol er 0,203, eller f) kampesterol er 0,268 og stigmastanol er 0,299.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 4-6, hvor bruken er for forebyggelse eller behandling av primære og sekundære dislipidemier og aterosklerose.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 4-7, hvor sammensetningen omfatter fytosteroler og samtidig forekommende forbindelser valgt fra triterpener, langkjedete alkoholer og andre alkoholoppløselige organiske forbindelser.

9. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter p-sitosterol, kampesterol og videre stigmastanol, hvor kampesterol og stigmastanol sammen omfatter minst 50 % av konsentrasjonen av P-sitosterol og en farmasøytisk effektiv bærer for dette.

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter P-sitosterol, kampesterol og stigmastanol, hvor forholdet for P-sitosterol er 1,0, kampesterol er mellom 0,2 og 0,4 og stigmastanol er mellom 0,2 og 0,5.

11. Farmasøytisk preparat ifølge krav 10, karakterisert v e d at forholdet for P-sitosterol er 1,0, og enten d) kampesterol er 0,354 og stigmastanol er 0,414, eller e) kampesterol er 0,330 og stigmastanol er 0,203, eller f) kampesterol er 0,268 og stigmastanol er 0,299.

12. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter P-sitosterol, kampesterol og videre omfattende stigmastanol, hvor kampesterol og stigmastanol sammen omfatter minst 50 % av konsentrasjonen av P-sitosterol, og hvor forholdet for P-sitosterol er 1,0, og enten d) kampesterol er 0,354 og stigmastanol er 0,414, eller e) kampesterol er 0,330 og stigmastanol er 0,203, eller f) kampesterol er 0,268 og stigmastanol er 0,299.