PL186441B1

PL186441B1 - Kompozycja obniżająca poziom cholesterolu, jej zastosowanie i zawierający ją produkt farmaceutyczny

Info

Publication number: PL186441B1
Application number: PL95319384A
Authority: PL
Inventors: Egon Novak; James P. Kutney; Peter J. Jones
Original assignee: Univ British Columbia
Priority date: 1994-09-29
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2004-01-30
Also published as: NO20011062D0; ATE216395T1; ES2464465T3; DK1707572T3; NZ293210A; CN1057768C; NO971304L; ES2173966T5; PL319384A1; CZ298622B6; US5770749A; EP1707572A2; CN1166174A; EP0783514B2; EP1148062A3; ES2173966T3; EP0783514B1; LT4305B; TJ302B; LV11900A

Abstract

1P 3/06 Kompozycja obnizajaca poziom cholesterolu, jej zastosowanie i zawierajacy ja produkt farmaceutyczny (30) Pierwszenstwo: 29.09.1994,US,314945 (43) Zgloszenie ogloszono: 04.08.1997 BUP 16/97 (45) O udzieleniu patentu ogloszono: 30.01.2004 WUP 01/04 (7 3 ) Uprawniony z patentu: THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, Vancouver, CA ( 7 2 ) Twórcy wynalazku: Egon Novak, Richmond, CA James P. Kutney, Vancouver, CA Peter J. Jones, Anne-de-Bellevue, CA (74) Pelnomocnik: Plotczyk Leokadia, POLSERVICE 1. Kompozycja obnizajaca poziom cholesterolu, znamienna tym, ze zawiera nie wiecej niz 70% wagowych beta-sitosterolu, co najmniej 10% wagowych kampesterolu i co najmniej 10% wagowych stigmastanolu. PL PL PL PL PL

Description

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja obniżająca poziom cholesterolu, jej zastosowanie i zawierający ją produkt farmaceutyczny jako środek do zapobiegania i leczenia pierwotnych i wtórnych dysj^^^]^i<d^imii.

Tło wynalazku

Bezpośrednią przyczyną ataku serca i dusznicy jest zwyrodniający proces znany jako miażdżyca tętnic. Miażdżyca tętnic wynika z połączenia wielu czynników odziedziczonych (genetycznych) i środowiskowych. Wzajemne oddziaływanie tych czynników, z których dieta w naszej cywilizacji wydaje się być najważniejsza, prowadzi do rozwoju miażdżycy tętnic. Wzrost płytek miażdżycowych wypełnionych cholesterolem ostatecznie odcina dopływ krwi

186 441 do mięśnia sercowego, albo kolejno do mózgu lub nóg, w zależności od umiejscowienia płytki w drzewie tętniczym.

Jednym z głównych czynników ryzyka miażdżycy tętnic, potencjalnie zmiennym, jest poziom cholesterolu we krwi. Wiele dobrze udokumentowanych badań wykazało, że poziom cholesterolu we krwi jest rzeczywiście ważnym zwiastunem ryzyka ataku serca, a także udarów. Powiązanie pomiędzy stężeniem cholesterolu we krwi, a ryzykiem tych schorzeń jest ciągłe (obejmuje wszystkie poziomy cholesterolu), stopniowane (wyższy poziom, choroba bardziej prawdopodobna), bez wyraźnego progu (nawet przez obniżenie do tak zwanych niskich poziomów, można zmniejszyć ryzyko choroby). Przykładowo u ludzi po 40 roku życia, poziom cholesterolu we krwi 7,0 mmol/litr wyraża ryzyko choroby naczyń wieńcowych trzy do czterech razy większe, od związanego z poziomem poniżej 5 mmol/litr. Związek ten staje się zwłaszcza wyraźny, gdy poziomy są wyższe od 5,2 mmol/litr. Dla przykładu, częstość śmierci wśród mężczyzn z poziomem cholesterolu 8,0 mmol/litr była prawie sześć razy większa niż wśród mężczyzn z poziomem 4,0 mmol/litr. Te nowsze odkrycia są zgodne z wcześniejszymi badaniami.

Inne szerokie kliniczne doświadczenia wykazały jasno, że obniżając wysokie poziomy cholesterolu można zredukować ryzyko śmiertelnych lub nie śmiertelnych uszkodzeń mięśnia sercowego, dusznicy, zmian w elektrokardiogramach i przy zabiegu bypassu tętnicy wieńcowej. Najlepiej poznane i pierwsze z tych doświadczeń miało miejsce w Klinice Badań Lipidów, w której doświadczenia podstawowej prewencji wieńcowej wykazały, że z każdym 1% redukcji poziomu całkowitego cholesterolu we krwi, następowało 2% zmniejszenia ryzyka chorób tętnic wieńcowych.

Aby zapewnić powodzenie każdej długoterminowej terapii zapobiegającej hipercholesterolemii, należy ją rozpocząć w odpowiednio wczesnym wieku i kontynuować przez czas nieokreślony. Gdy dieta niskotłuszczowa stanowi podstawę takiej długoterminowej terapii, po sześciu miesiącach aż do 60% pacjentów staje się nie podatnych na chorobę. Trudność w uzyskaniu niepodatności na chorobę stanowi, w wielu zachodnich krajach, ogólna dieta bogata w tłuszcz. Zły profil cholesterolowy wielu pacjentów pogarszają rozpowszechnione, dodatkowe czynniki ryzyka schorzeń naczyń sercowych, takie jak wysokie ciśnienie krwi, cukrzyca, otyłość i palenie.

Zmianę diety jako terapię miażdżycy i innych schorzeń naczyń sercowych udoskonalono znacznie ponad 10 do 15 lat temu. Badacze rozpoznali zwłaszcza, że sterole roślinne (fitosterole) skutecznie obniżają poziom cholesterolu w osoczu: Lees i in., Atherosclerosis, 28 (1977) 325-338; Kudehodkar i in., Atherosclerosis, 23 (1976) 239; Day, Artery, 18(3) ,125-132 (1991).

Fitosterole są związkami sterolopodobnymi syntetyzowanymi w roślinach bez wartości odżywczych dla ludzi. W roślinach są one wymagane do pełnienia funkcji komórkowych w sposób podobny, w jaki cholesterol jest konieczny u ludzi. Przeciętna zachodnia dieta zawiera do 360 mg fitosteroli na dzień. Ostatnio, te dietetyczne fitosterole zwróciły na siebie wiele uwagi, z powodu ich prawdopodobnych właściwości przeciwnowotworowych i ich możliwości redukowania poziomu cholesterolu, gdy podaje się je wielu gatunkom ssaków, włączając ludzi.

Chemicznie, fitosterole pod względem struktury bardzo przypominają cholesterol. Głównymi fitosterolami są beta-sitosterol, kampesterol i stigmasterol. Inne obejmują stigmastanol (betasitostanol), sitostanol, desmosterol, chalinasterol, poriferasterol, klionasterol i brassikasterol. Struktury chemiczne beta-sitosterolu, kamjpjsteeolu i stigmaateeolu są następujące:

beta-sitosterol

HO

186 441

Mechanizm, dzięki któremu fitosterole obniżają cholesterol we krwi u zwierząt jest niejasny, lecz wydaje się, że związany jest z hamowaniem wchłaniania cholesterolu z proksymalnej części jelita czczego, przez współzawodniczenie z cholesterolem w specyficznych miejscach wychwytu. Dane badawcze zasugerowały także, że niektóre fitosterole nie są w ogóle absorbowane w proksymalnej części jelita czczego B (sitostanol) i, jeśli zachodzi absorbcja (beta-sitostanol), występuje ona w bardzo ograniczonych ilościach.

Opierając się na tych odkryciach badawczych, zastosowanie fitosteroli jako dodatku dietetycznego, w celu zredukowania absorbcji cholesterolu było szeroko badane. Lees i in., jak wyżej; Pollak, Pharmac. Ther, 31(1985) 177-208; Raich i in., Biochemica et Biophysica Acta, 388(1975) 374-384.

Lees i in., jak wyżej, dokonali porównania wpływu preparatów sitosterolu z dwóch źródeł, steroli soi i steroli z oleju talowego, na cholesterol osocza. Okazało się, że preparaty sterolu roślinnego były skuteczne w leczeniu pacjentów z hipercholesterolemią. Pollak, jak wyżej, podaje ogólny przegląd fitosteroli i ich efektów działania na lipidy surowicy. Raicht, jak wyżej, opisuje dalej efekty działania beta-sitosterolu na równowagę sterolową i enzymy ograniczające szybkość reakcji enzymatycznych metabolizmu steroli.

Generalnie przyjmuje się, że fitosterole oferują wyjątkowe połączenie długookresowego bezpieczeństwa, skuteczności i delikatności w leczeniu ludzi. Wciąż istnieje wyzwanie odnośnie fitosteroli jeśli chodzi o ich wyodrębnienie i oczyszczenie z materiałów roślinnych i w określeniu dodatkowych źródeł, które są efektywne w kosztach, wykonalne na wielką skalę i które wykazują działanie wobec hipocholesterolemii.

Tradycyjnie, fitosterole wyodrębnia się ze źródeł, takich jak olej kukurydziany, olej z zarodków pszennych, smoła (pitch) z nasion soi i smoła z oleju kukurydzianego. Podobnie, jako źródła fitosterolu użyto smoły z oleju talowego, którą otrzymuje się podczas procesu wytwarzania papieru z drewna, zwłaszcza drewna sosny. Generalnie, w tym procesie, wióry drewniane trawi się sodą kaustyczną, aby wytworzyć miazgę lub „mydło”. Następnie mydło destyluje się, aby usunąć substancje lotne, uchodzące ze „smoły” jako pozostałości. Z tej właśnie smoły badacze wyodrębnili fitosterole. Te tradycyjne źródła fitosteroli posiadają kilka znacznych wad. Smoła z oleju talowego jest niezwykle złożoną substancją, obejmującą żywice, kwasy tłuszczowe, produkty utleniania, substancje zestryfikowane i fitosterole. Mimo, że

186 441 smoła jest niedroga przez to, że jest odpadem odrzuconym przy różnych procesach wytwórczych, jest bardzo trudno odzyskać z niej sterole o wysokiej masie cząsteczkowej, z dobrą wydajnością i o wysokich czystościach, wymaganych dla zastosowań farmaceutycznych.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3 840 570 Juliana dotyczy procesu wytworzania steroli ze smoły z oleju talowego przez ekstrakcję w mieszaninie woda-alkohol-węglowodór, po której następuje zmydlanie i następnie oczyszczanie. Materiałem wyjściowym w tym procesie jest smoła z oleju talowego, z której ekstrahuje się fitosterole i różne zanieczyszczenia. Okazało się, że w każdym procesie oczyszczania smoły z oleju talowego, szczególnie kłopotliwe jest oddzielenie alkoholi długołańcuchowych i zanieczyszczeń kwasowych od steroli (które same są alkoholami o wysokiej masie cząsteczkowej).

Inni badacze zwrócili uwagę na kwestię oczyszczania steroli ze smoły z oleju talowego: opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 2 835 682 Steinera i Fritza; opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 2 715 638 Albrechta i Herrlingera; opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 2 573 891 Christensona. Należy zauważyć, że w każdym z tych znanych procesów oczyszczania, materiałem wyjściowym była smoła z oleju talowego, wobec której istnieją trudności związane z odzyskiwaniem, omawiane powyżej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ominięcie lub zmniejszenie powyższych niedogodności.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja obniżająca poziom cholesterolu, charakteryzująca się tym, że zawiera nie więcej niż 70% wagowych beta-sitosterolu, co najmniej 10% wagowych kampesterolu i co najmniej 10% wagowych stigmastanolu.

Korzystnie kampesterol i stigmastanol razem stanowią co najmniej 50% stężenia betasitosterolu.

Korzystnie udział beta-sitosterolu wynosi 1.0, kampesterolu wynosi 0.2-0.4 oraz stigmastanolu wynosi 0.2-0.5.

W korzystnych rozwiązaniach udział beta-sitosterolu wynosi 1.0, kampesterolu wynosi 0.354, a stigmastanolu wynosi 0.414, albo udział beta-sitosterolu wynosi 1.0, kampesterolu wynosi 0.330, a stigmastanolu wynosi 0.203, lub udział beta-sitosterolu wynosi 1,0, kampesterolu 0.268, stigmastanolu 0.299.

Przedmiotem wynalazku są również produkty terapeutycznie skuteczne do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, charakteryzujące się tym, że obejmują określone wyżej kompozycje i odpowiedni farmaceutycznie skuteczny nośnik.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie określonej wyżej kompozycji do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy oraz produkt terapeutycznie skuteczny do zastosowania do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub, wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, charakteryzujący się tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 2 i farmaceutycznie skuteczny nośnik.

Sposób oczyszczania i wytwarzania kompozycji fitosterolowych z masy mydlanej stanowiących przedmiot niniejszego wynalazku obejmuje ekstrakcje z masy mydlanej osadu o konsystencji śmietanki i oczyszczenie tego osadu w celu wytworzenia unikatowej kompozycji fitosterolowej. Ściślej, śmietankowy osad ekstrahuje się z masy mydlanej, stosując procedurę ekstrakcji przy użyciu rozpuszczalników. Następnie ostateczną kompozycję otrzymuje się, oczyszczając śmietankowy osad przez krystalizację.

Niniejszy wynalazek dotyczy unikatowych kompozycji, które są skuteczne w zapobieganiu lub leczeniu dyslipidemii i które obejmują beta-sitosterol, kampesterol i stigmastanol. Podane tu kompozycje fitosterolowe różnią się znacznie od tych znalezionych w roślinach, pożywieniu i olejach. W szczególności, zaopatrzenie w stigmastanol przejawia się podniesieniem skuteczności. Kompozycje te mogą dodatkowo zawierać różne współuczestniczące związki, które mogą być fitosterolami lub nie. W szczególności, te współuczestniczące związki mogą obejmować triterpeny, alkohole o długim łańcuchu i inne związki organiczne rozpuszczalne w alkoholu.

186 441

Niniejszy wynalazek dotyczy dalej zastosowania opisanych tu kompozycji, w celu zapobiegania lub leczenia pierwotnych i wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, włączając chorobę naczyń wieńcowych serca, chorobę naczyń obwodowych oraz udary u ludzi i zwierząt.

Unikatowe kompozycje według niniejszego wynalazku wykazały wspaniałe efekty obniżania cholesterolu całkowitego (TC) i liproprotein niskiej gęstości (LDL) cholesterolu we krwi. Dodatkowo i całkiem niespodzianie, odkryto, że kompozycje według wynalazku u różnych gatunków zwierząt zachowują lub podnoszą w osoczu poziomy lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) cholesterolu we krwi. Ta cecha niniejszego wynalazku jest nadzwyczaj istotna z uwagi na to, że, jak wykazały badania, bez względu na poziomy TC, gdy poziom HDL osocza zmniejsza się, ryzyko miażdżycy rośnie. Fitosterole wyodrębnione ze smoły z oleju talowego, nasion soi i innych źródeł nie wykazywały, zgodnie z wiedzą niniejszych wynalazców, tych unikatowych skutków działania na HDL.

Mimo, że znane jest wytwarzanie niektórych typów fitosteroli ze smoły destylowanej z mydła, otrzymanego z obróbki wiórów drewnianych, kompozycje fitosterolowe nie były dotychczas produkowane z komponentu masy mydlanej w procesie traktowania wiórów drewnianych. Smoła z oleju talowego różni się znacznie w składzie od masy mydlanej. Uważa się, że zaskakujące efekty kompozycji według niniejszego wynalazku spowodowane są, przynajmniej częściowo, zastosowaniem masy mydlanej jako materiału wyjściowego i do unikatowego procesu oddzielania. Krótki opis rysunków:

Różne aspekty wynalazku ilustruje się przez następujące nie ograniczające rysunki, w których:

Figura 1 jest profilem chromatografii gazowej dla jednej kompozycji (w dalszym ciągu Forbes-2) wchodzącej w zakres niniej szego wynalazku;

Figura 2 jest przedstawieniem profilu z fig. 1 od 35 do 45 minut czasu retencji;

Figura 3 jest przedstawieniem profilu z fig. 1 od 22 do 27 minut czasu retencji;

Figura 4 jest indeksem profilu chromatografii gazowej fig. 1;

Figura 5 jest profilem chromatografii gazowej dla innej kompozycji (w dalszym ciągu Forbes-3) wchodzącej w zakres niniejszego wynalazku;

Figura 6 jest przedstawieniem profilu z fig. 5 od 32 do 48 minut czasu retencji;

Figura 7 jest indeksem profilu chromatografii gazowej fig. 5;

Figura 8 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania Forbes-1 i Forbes-2 na stężenie TC u szczurów;

Figura 9 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania Forbes-1 i Forbes-2 na stężenie cholesterolu LDL u szczurów;

Figura 10 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki A działania Forbes-1 i Forbes-2 na stężenie cholesterolu HDL u szczurów;

Figura 11 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania Forbes-3 na TC surowicy u chomików;

Figura 12 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania Forbes-3 na cholesterol LDL surowicy u chomików;

Figura 13 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania Forbes-3 na cholesterol HDL surowicy u chomików;

Figura 14 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania różnego traktowania dietetycznego na poziomy cholesterolu u samców i samic chomików;

Figura 15 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania różnego traktowania dietetycznego na poziomy cholesterolu osocza u samców i samic chomików;

Figura 16 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania różnego traktowania dietetycznego na poziomy cholesterolu osocza u samic chomików;

Figura 17 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania różnego traktowania dietetycznego na poziomy tri-glicerydów osocza u samców i samic chomików;

Figura 18 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania różnego traktowania dietetycznego na stosunki HDL/apo-B u samców i samic chomików;

Figura 19 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania traktowania dietetycznego na całkowity cholesterol u chomików 45 dnia badania;

186 441

Figura 20 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania traktowania dietetycznego na korelację cholesterolu z sitostanolem;

Figura 21 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania traktowania dietetycznego na poziomy HDL u chomików ponad 45 dni;

Figura 22 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania traktowania dietetycznego na stosunki bez-apoA/apoA u chomików ponad 45 dni;

oraz fig. 23 przedstawia wykres słupkowy, ilustrujący skutki działania traktowania dietetycznego na sterole bez-apoA u chomików ponad 45 dni.

Kompozycję według niniejszego wynalazku można otrzymać sposobem, który obejmuje kolejne etapy:

(A) otrzymywania lub wytwarzania materiału wyjściowego, masy mydlanej, pochodzenia roślinnego;

(B) ekstrakcji z mydła śmietankowego osadu, przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika; oraz (C) oczyszczania śmietankowego osadu, z otrzymaniem kompozycji fitosterolowej. Istnieje wiele możliwych źródeł masy mydlanej pochodzenia roślinnego. Generalnie, w znanym procesie (procesie „Kraft”) wióry drewniane traktuje się sodą kaustyczną, w celu wytworzenia mydła. Wióry drewniane mogą pochodzić z każdej odmiany drzewa o drewnie twardym lub miękkim, włączając, lecz w sposób nie ograniczający, jodłę, cedr, sosnę, świerk, dąb, choinę kanadyjską i topolę. Najkorzystniej, wióry pochodzą od każdej odmiany drewna z lasu pacyficzno północno-zachodnio amerykańskiego lub europejskiego.

W fazie ekstrakcji, mydło miesza się z roztworem ketonu i wody. W celu wyekstrahowania steroli używa się rozpuszczalnika węglowodorowego. Etap ten można przeprowadzić przy temperaturach, generalnie od około 25°C do około 150° C, ale najbardziej korzystnie od około 50°C do około 100°C. Najkorzystniej, tę fazę ekstrakcji kontynuuje się ponad 15 do 24 godzin. Należy zauważyć, że użycie alkoholu nie jest wymagane i też nie jest proponowane podczas fazy ekstrakcji. Sposób ekstrakcji według niniejszego wynalazku przeprowadza się przy użyciu rozpuszczalnika ketonowo-wodno-węglowodorowego.

Keton wybiera się z grupy, posiadającej ogólny wzór RCOR-L, gdzie R i R¹ oznaczają grupy alkilowe. Korzystnie grupy alkilowe posiadają 1-6 atomów węgla. Najkorzystniej, ketonem jest 2-propanon (aceton). Węglowodór można wybrać z grupy, zawierającej wszystkie węglowodory o 5-10 atomach węgla. Najkorzystniej, węglowodorem jest heksan.

Jak opisano na fig. 1, produktem fazy ekstrakcji jest śmietankowy osad lub pozostałość, z której oczyszcza się kompozycję fitosterolową. Fazę oczyszczania można przeprowadzić, stosując krystalizację, rozdzielanie chromatograficzne lub każde inne odpowiednie procedury. Najkorzystniej, śmietankowy osad rozpuszcza się w alkoholu, powoli chłodzi, następnie przesącza i przemywa zimnym alkoholem. Pozostałość suszy się, a otrzymany produkt jest kompozycją fitosterolową.

Alkohol użyty w fazie oczyszczania wybiera się z grupy, posiadającej ogólny wzór RCHOHR, RH2OH i RCOH, gdzie R oznacza grupę alkilową o 1 - 4 atomach węgla. Najkorzystniej alkoholem jest metanol. W fazie chłodzenia działa się przy temperaturach od 10°C do 0°C, najkorzystniej przy 3 do 4°C przez 24 godziny.

Kompozycję fitosterolową otrzymaną w wyniku opisanych tutaj sposobów można włączać bezpośrednio do dodatków do pożywienia i preparatów witaminowych oraz do leków, w celu trwającego i zapobiegawczego leczenia miażdżycy i jej konsekwencji, udarów, ataków serca oraz choroby naczyń obwodowych. Ponadto, kompozycje fitosterolowe tutaj opisane są przewidziane w postaci lekarstw z odpowiednimi środkami pomocniczymi lub nośnikami. Np. kompozycje te można włączyć lub przepisać równolegle z wybranymi środkami obniżającymi poziom lipidów, aby zmniejszyć konieczną dawkę i przez to toksyczność, tych ostatnich związków.

Kompozycje fitosterolowe według niniejszego wynalazku wykazały znaczącą zdolność do modyfikowania lipoprotein, nawet przy niższych stężeniach fitosterolu niż w znanych preparatach. Jednak, bardziej zaskakujący był skutek działania tych kompozycji na zwiększanie poziomów w osoczu lipoprotein wysokiej gęstości (HDL), skutek dotychczas nie związany z żadną inną kompozycją fitosterolową, pochodną oleju talowego. Uważa się, że ten unikalny

186 441 skutek może wynikać z użycia masy mydlanej jako materiału wyjściowego albo dostarczenia stigmastanolu jako elementu kompozycji.

Kompozycje według niniejszego wynalazku obejmują następujące proporcje fitosteroli: beta-sitosterol (1); kampesterol (0,2-0,4) i stigmastanol (0,2-0,5). Korzystniej, kampesterol i stigmastanol razem stanowią co najmniej 50% całkowitego stężenia beta-sitosterolu. W postaci najbardziej zalecanej, kompozycje według niniejszego wynalazku obejmują następujące proporcje fitosteroli w porównaniu z fitosterolami, pochodzącymi z nasion soi:

Proporcje znanych fitosteroli

Przybliżona czystość(%)	B-Sitosteeol	Kampeteerol	Stigmastanol
Nasiona soi	1	0,640	0,005
Forbes-1 91,0	1	0,354	0/114
Forbes-2 77,0	1	0,330	0,203
Forbes-3 90,0	1	0,268	0,299

Skład i czystość dwóch innych ekstraktów wchodzących w zakres niniejszego wynalazku są następujące:

Skład (%)

Przybliżona czystość(%)	B-Sitosteeol	Kampesterol	Stigmastanol
Forbes-4	99,0	62,6	16,6	23,2
Forbes-5	98,3	64,7	16,4	17,2

W każdej kompozycji tutaj opisanej, mogą być obecne dodatkowe związki, które mogą być fitosterolami lub nie. Np. odkryto, że kampestanol, inny fitosterol, może być obecny we względnie małej ilości. Ponadto, mogą być obecne alkohole tłuszczowe o prostych łańcuchach, takie jak alkohol behenylowy (C22) i alkohol lignostearylowy (C24). W celu określenia charakteru tych współuczestniczących związków, przeprowadzano analizę chromatograficzną gaz-ciecz dla każdej z najbardziej zalecanych kompozycji według niniejszego wynalazku.

Warunkami przebiegu chromatografii gazowej dla fitosteroli były: temperatura początkowa 80°C, utrzymywana przez 1 minutę; podwyższenie temperatury do 120°C o 20°C na minutę, utrzymywane przez 7 minut; podwyższenie do 240°C o 20°C na minutę, utrzymywane przez 15 minut; i podwyższenie do 269°C o 20°C na minutę, utrzymywane przez 25 minut. Przy końcu każdego przejścia podwyższano temperaturę do 320°C i utrzymywano przez minimum 5 minut. Temperaturą wstrzyknięcia było 300°C, a temperaturą detekcyjną było 320°C. Natężenie przepływu przez kolumnę wynosiło 1 ml na minutę, a natężenie przepływu przez otwór rozdzielający wynosiło 4 ml na minutę. Natężenie przepływu przez otwór oczyszczający wynosił 4,5 ml na minutę. Gazem nośnym był hel.

Wyniki analizy chromatografii gaz-ciecz dla dwóch najbardziej zalecanych kompozycji według niniejszego wynalazku opisano w fig. 1-7.

Jeśli chodzi o kompozycję Forbes-2, znane sterole pojawiają się w obszarze 35-45 minuty w fig. 12. Beta-sitosterol wykrywa się przy piku 87; kampesterol wykrywa się przy piku 81, a stigmastanol wykrywa się przy piku 84. Piki 65, 66 i 77 w fig. 2 są związkami współuczestniczącymi, mogącymi wykazywać wpływ na hipocholesterolemię. Jednak możliwy jest synergiczny wpływ współuczestniczących związków na działanie znanych fitosteroli w kompozycjach. Podobnie, w fig. 5 i 6, kampesterol, stigmastanol i beta-sitosterol są oznaczone odpowiednio przez piki 6,7 i 8.

Inna zalecana kompozycja, wchodząca w zakres niniejszego wynalazku obejmuje następujące komponenty:

Kampesterol 14,1 %

Kampestanol 3,5% β-sitosterol 62,8%

Stigmastanol 16 , 9% d dla całego stężenia fitosterolu 97,3%.

186 441

Przykład 1- Ekstrakcja i oczyszczanie

Z B.C. Chemicals Inc. otrzymano partię 3 kg masy mydlanej. Sporządzono mieszaninę 3 litrów acetonu i 1,5 litra wody i dodano do niej mydło. Mieszaninę ekstrahowano w sposób ciągły, stosując 4,5 litra heksanu w temperaturze 50°C przez 24 godziny, przy użyciu wyparki o objętości 18 litrów. Następnie produkty otrzymane w wyniku ekstrakcji suszono nad siarczanem sodu i pozostawiono do odparowania. W ten sposób wytworzono 460 g pozostałości lub śmietankowego osadu.

Śmietankowy osad ogrzewano i mieszano z użyciem mieszadła magnetycznego i powoli dodano 460 ml metanolu. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przy mieszaniu przez 15 minut i powoli chłodzono przez 3-5 godzin. Mieszaninę chłodzono przez noc w temperaturze 3-4°C, a następnie przesączono i przemyto (dwukrotnie) 150 ml zimnego metanolu. Na koniec, mieszaninę utrzymywano pod zmniejszonym ciśnieniem przez 2 dni, uzyskując 100 g mieszaniny o czystości 82% (to jest 82 g fitosteroli).

Przykład 2 - Ocena skutków działania kompozycji fitosterolowych u szczurów

Dziewięćdziesiąt samców szczurów Wistar (80-100 g) podzielono na 3 grupy doświadczalne: kompozycja Forbes-1; kompozycja Forbes-2 i nasiona soi. Trzydzieści szczurów w każdej grupie podzielono dalej na 5 reżimów dietetycznych jak zaznaczono w tabeli 2. Szczury utrzymywano w odwrotnym cyklu świetlnym i żywiono przez 10 dni dietą podstawową częściowo oczyszczoną (tabela 1) uzupełnioną różnymi ilościami cholesterolu i fitosterolu (tabela 2). W każdej z 5 grup dietetycznych 2 szczurom podawano kompozycję Forbes-1, 2 szczurom podawano kompozycję Forbes-2 i 2 szczurom podawano fitosterol pochodzący z nasion soi (Sigma).

Tabela 1. Skład diety doświadczalnej

Składniki	%
Kazeina	20
Skrobia kukurydziana	21,5
Sacharoza	35
Stały olej*	18
Metionina	0,5
Mieszanka mineralna	4,00
Mieszanka witaminowa	1,00
*Szafran i smalec zmieszany w stosunku 1:3

Tabela 2. Reżimy dietetyczne

Grupy	Sterole dodane do diety podstawowej (%)
Cholesterol	Fitosterol
1	0	0
2	1	0
3	1	0,2
4	1	0,5
5	1	1

Na końcu okresu żywienia, szczurom wstrzyknięto śródotrzewnowo tlenek deuteru (0,4 ml) i pozbawiono ich pożywienia i wody na co najmniej 2 godziny. Następnie szczury uśpiono halotanem. Próbki krwi pobrano z serca. Próbki wątroby, jelita cienkiego i mięśni szybko usunięto, zważono, włożono do ciekłego azotu i przechowywano w temperaturze -80°C aż do

186 441 określenia syntezy cholesterolu. Określono cholesterol całkowity, cholesterol LDL i HDL, przy użyciu handlowego zestawu (Biopacific Diagnostic Inc).

Wyniki działania kompozycji fitosterolowych na cholesterol całkowity, LDL i HDL przedstawiono odpowiednio na fig. 8, 9 i 10. Skuteczność Forbes-1 i Forbes-2 jest ewidentna w redukcji cholesterolu LDL pokazanej na fig. 9 i we wzroście cholesterolu HDL pokazanym na fig. 10, zwłaszcza dla Forbes-1. Na fig. 8 dodatek cholesterolu (grupa dieteyczna 2) do diety podstawowej (grupa 1) dało w efekcie wzrost stężeń krążącego cholesterolu. Stopniowe dodawanie wzrastających poziomów fitosteroli (grupy 3-5) dało w efekcie normalizację poziomów cholesterolu w grupach żywionych Forbes-1 i Forbes-2, ale nie dla fitosteroli nasion soi, jak określono przez analizę regresji. Fig. 9 pokazuje, że fitosterole Forbes-2 i Forbes-3 posiadają lepszą skuteczność obniżania cholesterolu LDL niż fitosterole nasion soi. Fig. 10 demonstruje większą zdolność podnoszenia HDL przez zalecane kompozycje według niniejszego wynalazku, zwłaszcza Forbes-1, w porównaniu z fitosterolami nasion soi.

Przykład 3 - Ocena skutków działania kompozycji fitosterolowych u chomików

Niniejszą, próbę przeprowadzono, aby zbadać rezultaty działania dietetycznego kompozycji fitosterolowych według niniejszego wynalazku na podniesienie stężenia cholesterolu surowicy u chomików, wywołane dietą cholesterolową.

samców chomików (80-100 g), utrzymywanych indywidualnie w klatkach z nierdzewną siatką, żywiono karmą dla gryzoni i przyzwyczajano przez trzy dni w klimatyzowanym pomieszczeniu (20-22°C, światła włączone w godz. 17-05°°). Następnie chomiki podzielono na pięć grup po 8 zwierząt w każdej grupie i żywiono przez 34 dni podstawową częściowo oczyszczoną dietą (tabela 3) wzbogaconą różnymi ilościami cholesterolu oraz jedną z kompozycji fitosterolowych według niniejszego wynalazku (Forbes 3) (tabela 4). ’

Tabela 3. Skład diety doświadczalnej

Składniki	% wagowe
Kazeina	20
Skrobia kukurydziana	28
Sacharoza	36,3
Olej kukurydziany	5,0
Celuloza	5,0
Metionina D1	0,5
Mieszanka mineralna	4,00
Mieszanka witaminowa	1,00
Diwi^ian choliny	0,2
Cholesterol	0,025, 0,25

Tabela 4. Reżimy dietetyczne

Grupa	Cholesterol dodany do diety kontrolnej	Fitosterol dodany do diety kontrolnej
	%	%
1	0,25	brak
2	0,25	brak
3	0,25	0,25
4	0,25	0,5
5	0,25	1,0

186 441

Na końcu okresu żywienia zwierzętom wstrzyknięto śródotrzewnowo tlenek deuteru (0,4 ml) i pozbawiono pożywienia i wody na co najmniej 2 godziny. Chomiki następnie uśpiono halotanem. Próbki krwi pobrano z serca. Inne próbki tkankowe, włączając wątrobę, jelito cienkie i mięśnie szybko usunięto, zważono, umieszczono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C aż do określenia syntezy cholesterolu. Określono cholesterol całkowity, cholesterol HDL i LDL, przy użyciu handlowego zestawu. Wyniki oceniono statystycznie za pomocą procedury analizy wariancji ONEWAY (SYSTAT).

Chomiki żywione dietą wysoko cholesterolową posiadały znacznie wyższy poziom cholesterolu całkowitego surowicy i cholesterolu LDL, niż żywione dietą o normalnym poziomie cholesterolu (0,025%). Uzupełnienie fitosterolu na poziomach 0,5% i 1% w znacznym stopniu znosiło te wzrosty wywołane spożyciem dużych ilości cholesterolu (fig. 11 i 12). Stężenie cholesterolu LDL w grupie 5 było niższe w porównaniu z poziomami u chomików żywionych dietami o normalnej zawartości cholesterolu (fig. 12). Ponadto, istniał związek negatywnej regresji cholesterolu całkowitego i cholesterolu LDL z poziomem fitosterolu w diecie (fig. 13).

Uzupełnienie fitosterolu spowodowało lekki wzrost HDL, ale nie dało znacznej różnicy (fig· 13)·

Przykład 4 - Ocena skutków działania kompozycji fitosterolowych u chomików doświadczenie 90 dniowe

Sześć grup po 20 chomików (10 samców, 10 samic) żywiono częściowo oczyszczoną dietą, zawierającą 30% tłuszczu (stosunek tłuszczu wielonienasyconego/nasyconego = 0,3) przez 90 dni. Dieta 1 była wolna od cholesterolu. Diety 2-6 zawierały 0,25% (wagowo) cholesterolu dietetycznego. Diety 314 zawierały fitosterole Forbes (o czystości większej niż 90%) odpowiednio 0,5 i 1%. Diety sporządzano każdego tygodnia z podstawowych składników. Poziomy tłuszczu, fitosterolu i cholesterolu określono przez chromatografię gaz-ciecz. Wszystkie zwierzęta miały przez okres doświadczenia wolny dostęp do wody i paszy. Co tydzień zwierzęta ważono. Określano także codzienne zużycie paszy i uśredniano, ważąc miseczki z pożywieniem przed i po każdym 24 godzinnym okresie karmienia. Po 90 dniach karmienia, zwierzęta uśmiercono przy użyciu halotanu i zebrano krew, w celu przeanalizowania profilu lipoproteinowego. Określono poziomy cholesterolu całkowitego krążącego, cząsteczek, zawierających apoB oraz cholesterolu HDL i triglicerydów. Tuż przed uśmierceniem, określono także prędkości absorpcji i syntezy cholesterolu, stosując, odpowiednio, metodę węgla 04 dla zanikania cholesterolu w jelicie i metodę włączania deuteru do cholesterolu tkankowego. Zbadano także pobranie fitosteroli w jelicie i innych tkankach. Dodatkowo, próbki jelita i wątroby przechowano, dla dostarczenia do Bio-Research Laboratories of Senneville, Quebec, do analiz histopatologicznych, pod względem rakotwórczości i funkcji enzymatycznych.

Wyniki:

Wyniki pokazano w fig. 14 - 18. Grupy w tych fig. często przypisane są numerom, które odpowiadają tym opisanym w opisie doświadczalnym. Litery nad słupkami w wykresach słupkowych oznaczają istotne różnice między grupami. Tam, gdzie podaje się litery, słupki, posiadające te same litery nie różnią się istotnie, podczas gdy te z różnymi literami różnią się na poziomie statystycznym p < 0,05.

W fig. 14 - 16 pokazano dane cholesterolu krążącego samców i samic chomików, spożywających diety testowe ponad 90 dni. Zaobserwowano wyraźne skutki płci w cholesterolu całkowitym krążącym dla zwierząt, spożywających dietę 2, dietę podstawową tylko z dodanym cholesterolem, i dietę 5, zawierającą cholesterol + fitosterole nasion soi. Samice, mimo, że nie różniły się w poziomach cholesterolu w diecie podstawowej od samców (grupa 1), wykazały wyższą odpowiedź na sam dodany cholesterol w porównaniu z samcami. Dodanie fitosteroli anulowało tę różnicę, z wyjątkiem grupy 5.

Dane poziomu cholesterolu zafałszowane płcią pokazano w fig. 15 i 16. Dla samców (fig. 15), dodatek samego cholesterolu do diety podstawowej dał w efekcie znaczny wzrost poziomu całego cholesterolu krążącego. Dodatek 0,5 procent fitosteroli Forbes dał w wyniku trend opadający poziomu cholesterolu, jednak dodanie 1% fitosteroli Forbes wywołuje istotną statystycznie redukcję cholesterolu, w przybliżeniu do takiego samego poziomu, jak grupa

186 441 kontrolna bez dodanego cholesterolu. Gdy do diety dodawano 0,5 lub 1% fitosteroli nasion soi, nie było istotnego wzrostu w poziomie całkowitego krążącego cholesterolu u samców. Dla HDL, obserwowano zróżnicowane rezultaty Forbes w porównaniu z nasionami soi, gdzie żywienie Forbes nie powodowało zmiany w poziomach HDL w grupie, której podawano sam cholesterol (grupa 2), jednak karmienie nasionami soi dało w efekcie znaczny spadek wartości HDL na obu testowanych poziomach (grupy 5 i 6). Nie było istotnych różnic dla cząstek cholesterolu, zawierających apoB, jednak istniała tendencja do obniżania poziomów przy żywieniu 1 % Forbes grupy z cholesterolem, w porównaniu z innymi grupami.

Dane dla samic pokazano na fig. 16. Dla cholesterolu całkowitego i HDL, nie było wyraźnego wpływu dodania samego cholesterolu do diety. Dodanie 1% fitosterolu z obu typów źródeł dało w rezultacie istotny i podobny spadek w stężeniach cholesterolu całkowitego i HDL. Dieta nie wpływała na poziomy cząsteczek, zawierających apoB.

Poziomy krążących triglicerydów u chomików, spożywających diety testowe przez 90 dni, pokazano na fig. 17. Poziomy krążących triglicerydów wzrastały u samic karmionych dietą podstawową z cholesterolem i 0,5% Forbes, w porównaniu z samą dietą podstawową, jednak nie obserwowano innych wewnątrzgrupowych różnic u obu płci. Samce nie wykazywały skutków lub tendencji wpływu diety na stężenia triglicerydów.

W skrócie, uszeregowanie wyników samców, będących na diecie testowej są następujące:

Tabela 5

	Cholesterol całkowity	LDL	HDL
0,5% Forbes	4	2	1
10% Forbes	1	1	2
0,5% Soi	2	3-4	4
1,0% Soi	3	4-3	3

Korzyści z kompozycji Forbes (tych według niniejszego wynalazku) można wyraźnie zobaczyć. W dodatku, podobne uszeregowania odkryto dla stosunku HDLrApoB u samców (fig. 18):

0,5% Forbes 2

0,2% Forbes 1

0,5% Soi 4

1,0% Soi 3

Odkryto także, że stosunek HDL : LDL dla kompozycji Forbes był prawie dwukrotnie taki jak dla kompozycji z samym β-sitosterolem.

Przykład 5 - Skutki działania kompozycji fitosterolowych na króliki.

W tym badaniu, oceniano ponad 43 dni, dwa króliki, pod względem skutków działania jednej z kompozycji według niniejszego wynalazku (1% Forbes w diecie) na ich profile całkowitego cholesterolu. Wyniki są następujące:

Tabela 6: Profile całkowitego cholesterolu u królików (mg/decylitr)

Data	Królik A	Królik B
1	2	3
14/06/95	95	215
18/06/95	129	162
26/06/95	-	Rozpoczęcie karmienia 1% Forbes
07/07/95	75	106
09/07/95	-	Rozpoczęcie karmienia 1% Forbes

186 441

c.d. tabeli 6

1	2	3
18/07/95	90	112
25/07/95	82	118
01/08/95	95	119
08/08/95	76	114

Można zauważyć spadek całkowitego cholesterolu u obu królików A i B przez dwa tygodnie podawania kompozycji fitosterolowej (1% Forbes). Efekt ten ciągnął się dalej nawet po przerwaniu podawania 1% Forbes. Skutki działania kompozycji według niniejszego wynalazku na obniżanie cholesterolu całkowitego przedłużają się poza fazę początkowego podawćmia.

Przykład 6 - Efekty działania kompozycji fitosterolowej u myszy z niedoborem Apo-E

Zwierzęta: Dziewiętnaście 5-tygodniowych samców myszy z niedoborem Apo-E nabyto z Jackson Laboratory, USA. Zwierzęta w sposób przypadkowy podzielono na 2 grupy, 9 zwierząt w grupie kontrolnej i 10 myszy w grupie doświadczalnej Forbes. Po 5 dniach okresu adaptacyjnego myszom pobrano krew z ogona do kapilar i oddzielono osocze przez odwirowanie krwi. Oszacowano lipidy osocza myszy.

Dieta: Zakupiono nisko tłuszczową, nisko cholesterolową karmę dla myszy w Jamieson's Pet Food Distributors Ltd, Vancouver, B.C. Z mydła z oleju talowego ekstrahowano fitosterole, pochodzące z oleju talowego, przy użyciu sposobu opisanego w niniejszym wynalazku. Czystość i zawartość procentową każdego pojedynczego fitosterolu w mieszaninie produktu końcowego oszacowano przez chromatografię gaz-ciecz. Końcowy produkt wykazywał do 95% czystości i zawierał 69% sitosterolu, 15% kampeettrolu i 16% stigmastenolu. Karmę dla myszy rozdrobniono do stanu drobnego proszku. Do tego proszku dodano 0,15% (wagowo) cholesterolu (Sigma) i dobrze wymieszano. Część tej uzupełnionej cholesterolem diety zgranulowano, wysuszono i użyto do karmienia grupy kontrolnej myszy, a inną jej część uzupełniono 2% (wagowo) fitosteroli ekstrahowanych z oleju talowego, granulowano, wysuszono i użyto do karmienia grupy doświadczalnej myszy'.

Testy biochemiczne: Zmierzono całkowity cholesterol osocza oraz triglicerydy, przy użyciu zestawu enzymatycznego (Boehringer Mannheim), a cholesterol HDL oszacowano poprzednio publikowaną metodą precypitacji, przy użyciu glikolu polietylenowego 6000.

Ciężar ciała i zużycie paszy: Ciężar ciała myszy i zużycie paszy mierzono co tygodniowo.

Tabela 7: Średni ciężar ciała myszy (g) (przedstawiono tylko miesięczne pomiary)

Data	Grupa Forbes	Grupa kontrolna
20/06/95	21,42	21,02
24/07/95	29,82	28,00
22/08/95	32,12	29,73
12/09/95	34,16*	30,78
*p < 0,05

Tabela 8: Średnie tygodniowezużycie paszy (g) (przedstawiono tylko pomiary miesięczne)

Data	Grupa Forbes	Grupa kontrolna
1	2	3
26/06-03/07/95	19,61	21,21
01/08-08/08/95	32,62*	29,20

186 441

c.d. tabeli 8

1	2	3
15/08-22/08/95	29,32	27,10
05/09-12/09/95	35,56	30,25
*p < 0,05

Inne odkrycia: Nie zaobserwowano skutków ubocznych w odniesieniu do nowych diet. Wszystkie zwierzęta z obu grup wyglądają normalnie, zachowują się zwyczajnie, włącznie z normalnym stolcem. Jedną mysz z grupy kontrolnej znaleziono martwą w dniu 11/07/95. Ponieważ ciała myszy nie zatrzymano, autopsja nie została przeprowadzona. Inna mysz z grupy Forbes znaleziono odwodnioną, z utratą wagi. Zwierzę uśmiercono i znaleziono przyczynę jej choroby, którą był nieprawidłowy zgryz (przerost zębów).

Analiza statystyczna: Wyniki analizowane przy użyciu testu t dla dwóch prób, przyjmując równe wariancje.

Wyniki: Wyniki do chwili obecnej streszczono w następujących tabelach.

Tabela 9: Średni poziom cholesterolu całkowitego osocza (mg/decylitr) u myszy

Data	Grupa Forbes	Grupa kontrolna
20/06/95	606,28	599,61
18/07/95	1027,96*	1622,56
06/09/95	1168,57*	1508,63
*p < 0,05

Tabela 10: Średni poziom triglicerydów osocza (mg/decylitr) u myszy

Data	Grupa Forbes	Grupa kontrolna
20/06/95	110,97	120,31
18/07/95	210,17	143,71
06/09/95	224,48	152,25

Tabela 11: Średni poziom cholesterolu HDL (mg/decylitr) u myszy

Data	Grupa Forbes (9)	Grupa kontrolna (7)
08/07/95	42,00*	18,29
*p< 0,001

Z wyników można zauważyć, że grupa kompozycji Forbes wykazała znaczny (33%) spadek w cholesterolu całkowitym, nieznaczny wzrost triglicerydów oraz znaczny wzrost cholesterolu HDL (>100%).

Przykład7 - Wynik działania kompozycji fitosterolowej u chomików - doświadczenie 45 dniowe

Pięćdziesiąt chomików GS przyzwyczajano przez dwa tygodnie w pomieszczeniu, ułatwiającym obsługę zwierząt, przed żywieniem ich częściowo oczyszczoną dietą, przez 45 dni. Podzielono je na pięć grup, karmionych 0,25% cholesterolu, każdą grupę jedną z czterech mieszanin steroli roślinnych: nasion soi, oleju talowego, czystego sitostanolu oraz sztucznej mieszaniny, składającej się z fitosteroli z oleju talowego. Grupa kontrolna otrzymywała tylko 0,25% cholesterolu. Pobranie karmy przez nie monitorowano przez okres badania, co trzy dni.

186 441

Ciężar ich ciała mierzono co tydzień i w czasie zbierania tkanki. Trzy dni przed uśmierceniem chomików GS, delikatnie je uśpiono eterem dietylowym i wstrzyknięto im dożylnie, do żyły jarzmowej, 0,4 ml Intralipidu, zawierającego 0,18 mg cholesterolu znaczonego ¹³C. Bezpośrednio po iniekcji, zwierzęta karmiono przez zgłębnik, 0,6 ml mieszaniny lipidowej (olej kokosowy, z oliwek i szafranowy) zawierającej 0,44 mg cholesterolu znaczonego ¹⁸C. Następnie chomiki GS trzymano w ich drucianych klatkach przez 27 godzin, dostarczano wodę i karmę do woli.

W dniu uśmiercenia, każdemu chomikowi GS wstrzyknięto dootrzewnowe 1 ml wody deuterowanej i pozostawiono na jedną godzinę przed zabiciem. Zwierzęta uśpiono eterem dietylowym, a próbki krwi zebrano przez nakłucie serca. Wątrobę, woreczek żółciowy, jelito cienkie, jelito grube i serce zebrano, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w zamrażarce w temperaturze -80°C. Ich ciała i stolce przechowywano w temperaturze -20°C do dalszej całościowej analizy lipidowej i sterolowej.

Pobranie paszy, pomiary ciężaru ciała i wątroby:

Pobranie paszy przez chomiki GS mierzono co trzy dni. Analiza statystyczna wykazuje brak istotnych różnic w spożyciu paszy między pięcioma grupami. Średnie dzienne pobranie paszy w pięciu grupach zmieniało się od 8,84 do 9,34 g na dzień, wartość p = 0,4. Zwierzęta wykazywały istotny wzrost ich ciężaru ciała, o około 25 do 40 g przez okres badania, wartość p < 0,5 (test t dla par). Wynik końcowego pomiaru ich ciężaru ciała rozkładał się od 112,5 do 154,3 g. Nie zanotowano istotności statystycznej między grupami różnego traktowania, wartość p = 0,43.

Ciężary wątroby różniły się istotnie między różnymi grupami. Grupa traktowana sitostanolem wykazała się niższymi ciężarami wątroby, w porównaniu z grupą kontrolną i innymi grupami karmionymi odpowiednio 0,25% cholesterolu i różnymi fitosterolami. W dodatku, po wykonaniu analizy statystycznej przy użyciu testu Newmana-Keulsa, grupa traktowana nasionami soi wykazywała znaczną różnicę, podobną do grupy traktowanej sitostanolem. Ogólnie, wszystkie grupy karmione sterolami roślinnymi wykazały niższy ciężar wątroby, w porównaniu z grupą kontrolną, karmioną 0,25% cholesterolu, wartość p = 0,01. Chomiki GS karmione sterolami z oleju talowego i sitostanolem miały średni ciężar wątroby odpowiednio 15% i 20% rmńejsty niż te z grupy kontrolnee. Natturdny olej talów/ i sztuczme wytwerrony olej talowy powodował podobne wartości ciężaru wątroby, sugerując, że sitostanol, związek, którego brak w sterolach roślinnych nasion soi, odgrywa główną rolę w zmniejszaniu zawartości steroli w wątrobie. Analiza lipidów:

I. Cholesterol całkowity:

Określono wartości cholesterolu całkowitego, używając handlowych zestawów reagentów enzymatycznych w autoanalizerze VP. Próbki krwi zmierzono dwukrotnie i średniej z dwóch wartości użyto w końcowej analizie statystycznej. W celu analizowania różnych lipidów użyto metodę jednokierunkową ANOVA, metody Newman-Keuls i Bonferroni. Sitostanol zmniejszał istotnie poziom cholesterolu całkowitego w osoczu chomików GS o 34%, w porównaniu z grupą kontrolną. Średnia wartość dla grupy kontrolnej wynosiła 226,9 mg/decylitr, a dla grupy traktowanej sitostanolem wynosiła 151,2 mg/decylitr, wartość p = 0,007. Fitosterole z oleju talowego oraz sztuczne mieszaniny oleju talowego wykazały podobny ubytek w cholesterolu osocza (17,5%), odpowiednio 118,4 mg/decylitr i 186,1 mg/decyli1r. Jednakże, fitosterole z oleju talowego (Forbes) wykazały istotne zmniejszenie wartości cholesterolu całkowitego (175,2 mg/decylitr), gdy z analizy odrzucono jedną poza skalową wartość próbki, wartość p < 0,02 w grupie oleju talowego, w porównaniu z grupą kontrolna (tylko 0,25% cholesterolu). Korelacja między obecnością sitostanolu i niższym poziomem cholesterolu osocza był znacz-ny, wartość p < 0,0001, a r = 0,46.

Ii. Cholesterol HDL:

Część apoA lipoprotein obecna w cholesterolu HDL nie wykazała żadnych znacznych zmian wartości wśród pięciu różnych grup, wartość p = 0,18. Obserwowano nie istotne zmniejszenie o 15% średniej wartości HDL w grupie traktowanej sitostanolem. Niemniej, element ten nie miał wpływu na znaczne zmniejszenie cholesterolu całkowitego, które wynosiło 34%. Stosunek lipoprotein bez ApoA do lipoprotein ApoA (HDL) nie zmieniał się istotnie wśród grup. Dodatkowy efekt nieznacznie niższych wartości HDL w grupach z sitosta16

186 441 lem i olejem talowym przyczynił się do powstania nie istotnego wyniku w wartościach bez apoA/apoA (HDL). Ogólnie, różne typy fitotteoolt nie zmieniały poziomu cholesterolu HDL w osoczu chomików GS.

III. LDL i/lub sterole bez apoA.

Skostaml był skuteczny w zmniejszaniu poziomu steroli bez apoA w osoczu. Wykazano 55% spadek w npoproteinach bez apoA, wartość p = 0,02. Podobnie do efektów dla cholesterolu całkowitego, olej talowy i sztuczna mieszanina oleju talowego zmniejszały ilość steroli bez apoA o odpowiednio 21%, sugerując znowu silną korelację istniejącą pomiędzy zawartością tteostanolu w fitosterolach, a ich korzystnymi rezultatami w obniżaniu poziomu cholesterolu w osoczu chomików GS. Jednakże, obniżenie to nie było statystycznie istotne z powodu zmienności wartości triglicerydów.

IV. Trigliceryd:

Gdy zastosowano metodę jednokierunkową ANOYA dla wartości TG, nie przeszły one testu normalności. Chomików GS nie uśmiercono na czczo (ważny stan dla przyszłej analizy syntezy, przemian i absorpcji cholesterolu). Z tego powodu różne wartości znalazły się poza skalą. Po zastosowaniu szeregów ANOYA, poziomy TG nie wykazały różnic statystycznych wśród grup. Sterole roślinne nie miały wpływu na poziomy TG osocza u chomików GS.

Tabela 12: Szereg mocy

	Cholesterol całkowity	HDL	LDL	TG
Grupa kontrolna	C	C	C	C
β-tttottanol nasion soi	4	1	3-4	1-4
Olej talowy (Forbes)	2-3	2-2	2-3	1-4
Stigmastanol sztuczny	1	4	1	1-4
Olej talowy	3-2	3-2	4-3-2	1-4

W konkluzji, kompozycja z oleju talowego, pochodzącego z mydła, według niniejszego wynalazku, wykazuje najbardziej korzystny profil związany ze wzrostem cholesterolu HDL i zmniejszeniem cholesterolu całkowitego. Wpływu takiego wobec HDL nie widać było przy kompozycji ze sztucznego oleju talowego. Podobnie, całościowy wpływ sttottanolu nie jest korzystny w związku ze znacznym spadkiem HDL.

Chociaż nie jest to całkiem jasne, wygląda na to, że w odniesieniu do steroli roślinnych, odpowiednio hydrofobowe sterole bardziej hamują wchłanianie cholesterolu całkowitego, podczas gdy odpowiednio hydrofitowe sterole mają większy wpływ na poziom HDL. Kompozycje fitosterolowe według niniejszego wynalazku są unikatowe, ponieważ zapewniają oba te efekty.

186 441

FIG 2

RTx-1 ^Lut*' ¹⁹⁹⁴

He-72-15-.84T=160-8-200-17 SS=1E-4=MBD

ODPOWIEDŹ DETEKCYJNA, Volty ODPOWIEDŹ DETEKCYJNA, Volty

FIG 3

RTx-1 ^Luty' ¹⁹⁹⁴

He=72-15-.84 T—160-8-200-17 SS=1E-4=MBD

CZAS RETENCJI, minuty (olej talowy, forb2)

186 441

FIG 4

Index	Czas Min.	Obszar V«5	T.t nta Obszar podstawowa Wysokość % V V *	Prawdziwych
73	34 65	0 039	0 051	0.016	0.005	0.800674
74	35.267	0.029	0.037	0.016	0.004	0 646175
75	36.629	0.087	0.114	0.017	0.007	1.990919
76	36.808	0.004	0.005	0.019	0.001	0.087321
77	37.054	0,093	0.121	0.017	0.011	2.113168
78	37.354	0.16	0.208	0.017	0.014	3.632553
79	37.492	0.018	0.024	0.022	0.003	0.419141
80	37.879	0.094	0.123	0.017	0.01	2.148096
81	38.688	0.615	0.798	0.017	0.057	13.93643
82	39.675	0.24	0.311	0.017	0.017	5.431366
83	39.908	0.021	0.027	0.021	0.003	0.471533
34	40.208	0,377	0 49	0.017	0.039	8.557457
85	40.675	0.269	0.35	0.017	0.02	6.112469
86	41.154	0.33	0.428	0.017	0.03	7.474677
87	42.229	1.862	2.416	0.017	0.124	42.1935
88	42.625	0.088	0.114	0.017	0.005	1.990919
89	43.646	0.039	0.05	0 017	0.004	0 87321
90	46.742	0.045	0 059	0 017	0.004	1 030388

FIG 5

ANALIZA KOMPOZYCJI FORBES3 PRZEZ GLC

Materiał Forb 3 (maj 94)

CZAS RETENCJI, minuty

186 441

FIG 6

CZAS RETENCJI, minuty

FIG 7

Linia

Czas Obszar ah _o podstawowa Wysokość

Min.	V*8	%	V	V
1	4.012	0073	3224	aOU	0033
2	4.486	0161	6648	0011	0017
3	4.775	0007	0268	0018	0004
4	32117	005	2077	0009	0011
5	32.433	0033	3.858	0009	0008
8	40217	0347	14.32S	O01	0041
7	41.579	O3S3	18084	001	0038
8	44.058	1-297	53.532	001	0074

FIG 8

SKUTKI DZIAŁANIA FITOSTEROLU NA CHOLESTEROL CAŁKOWITY

186 441

FIG 9

Skutki działania fitosterolu na cholesterol LDL

FIG 10

Skutki działania fitosterolu na HDL

120

FIG 11

Fitosterol na całkowity cholesterol osocza

Cholesterol (mg/dl)

350

□ 4

S ro ra

E

100

SO

O

3-45 θ NASIONA SOI 0 FORBE 2 * FORBE 1

186 441

FIG 12

FIG 13

Fitosterol na cholesterol LDL osocza Fitosterol na cholesterol HDL osocza

150

3 4 5

FIG 14

TOTM.

HDLF | | TOT F HDL M

Μ APO-B Μ I 1 APO-B F

186 441

FIG 15

Cholesterol (mg/dl) Cholesterol (mg/dl)

TOT M.

yg HDL M

FIG 16

300

250

APO-B M

2 3 4 5 6

TRAKTOWANIE DIETETYCZNE (W GRUPACH)

TOTF.

HDLF

APO-B F

186 441

FIG 17

201 Samica | | Samiec

FIG 18

2 3 4 5 6

TRAKTOWANIE DIETETYCZNE (W GRUPACH)

SAMCE

SAMICE

186 441

FIG 19

Grupa mieszanina jest wyraźnie różny od innych grup

FIG 20

Korelacja, sitostanolu z cholesterolem oso

250 co

E

200

190

SO

r=0.46,P< 0.0001

20 40 CO «0

Zawartość srtostanoiu (%)

00

120

186 441

FIG 21 ι«α 160 140 -

Poziomy HDL

Grupa Nasiona kontrolna soi

Olej talowy Sitostanol^Sztuczna_ mieszanina

Nie ma wyraźnych różnic między grupami

186 441

FIG 22

Bez apoA/apoA (HDL) .4 -i

Grupa kontrolna Nasiona soi Olej talowy Sitostanol Sztuczna mieszanina Grupa traktowana

Nie obserwowano istotnych odchyleń

186 441

FIG 23

Grupa z sitostanolem jest znacznie niższa niż inne grupy

186 441

FIGI

RTX'1 ^Lut*' ¹⁹⁹⁴

Ηθ=72-15-.84Τ=·160δ-200-17 SS=1E-4=MBD

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja obniżająca poziom cholesterolu, znamienna tym, że zawiera nie więcej niż 70% wagowych beta-sitosterolu, co najmniej 10% wagowych kampesterolu i co najmniej 10% wagowych stigmastanolu.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że kampesterol i stigmastanol razem stanowią co najmniej 50% stężenia beta-sitosterolu.

.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że udział beta-sitosterolu wynosi 1.0, kampesterolu wynosi 0.2-0.4 oraz stigmastanolu wynosi 0.2-0.5.
4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że udział beta-sitosterolu wynosi L0, kampesterolu wynosi 0.354, a stigmastanolu wynosi 0.414.
5. Kompozycja wedug zastrz. 1, znamienna tym, że udział beta-sitosterolu wynosi 1.0, kampesterolu wynosi 0.330, a stigmastanolu wynosi 0.203.
6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że udział beta-sitosterolu wynosi 1.0, kampesterolu 0.268, stigmastanolu 0.299.
7. Produkt terapeutycznie skuteczny do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, znamienny tym, że obejmuje kompozycję określoną w zastrz. 1 i odpowiedni farmaceutycznie skuteczny nośnik.
8. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 1, do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy.
9. Produkt terapeutycznie skuteczny do zastosowania do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, znamienny tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 2 i farmaceutycznie skuteczny nośnik.
10. Produkt terapeutycznie skuteczny do zastosowania do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, znamienny tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 3 i farmaceutycznie skuteczny nośnik.
11. Produkt terapeutycznie skuteczny do zastosowania do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, znamienny tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 4 i farmaceutycznie skuteczny nośnik.
12. Produkt terapeutycznie skuteczny do zastosowania do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, znamienny tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 5 i farmaceutycznie skuteczny nośnik.
13. Produkt terapeutycznie skuteczny do zastosowania do zapobiegania lub leczenia pierwotnych lub wtórnych dyslipidemii i miażdżycy, znamienny tym, że zawiera kompozycje określoną w zastrz. 6 i farmaceutycznie skuteczny nośnik.