EP3305908A1 - Flüssiges nährmedium für die kultivierung käsereischädlicher clostridien und verfahren zu deren nachweis - Google Patents

Flüssiges nährmedium für die kultivierung käsereischädlicher clostridien und verfahren zu deren nachweis Download PDF

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EP3305908A1
EP3305908A1 EP16192488.1A EP16192488A EP3305908A1 EP 3305908 A1 EP3305908 A1 EP 3305908A1 EP 16192488 A EP16192488 A EP 16192488A EP 3305908 A1 EP3305908 A1 EP 3305908A1
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EP
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nutrient medium
milk
cheese
incubation
clostridia
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Johanna Brändle
Konrad Domig
Manfred Schinkinger
Wolfgang Stocker
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Sy Lab Vertriebsgesellschaft M B H
Sy-Lab Vertriebsgesellschaft mbH
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Sy Lab Vertriebsgesellschaft M B H
Sy-Lab Vertriebsgesellschaft mbH
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to a liquid nutrient medium for the cultivation of cheese-destroying clostridia and to a method for the selective detection of butyric acid-producing anaerobic spore-formers of the genus Clostridium in milk and cheese.
  • the accurate recording of spore counts is also important in those areas in which the number of spores in raw milk is considered a quality parameter and thus has an influence on the price of milk. Furthermore, a statement about the type of roughage used (hay, grass or silage) can be made about the number of anaerobic spore formers in the raw milk.
  • Butyric acid-producing clostridia belongs to the large and very heterogeneous genus Clostridium (Blaschek, 1999).
  • the butterchureproduentialden Clostridien be assigned to a separate cluster, cluster 1, Clostridium senso stricto (Rainey, 2009).
  • These are gram-positive rod bacteria that can grow only under strictly anaerobic conditions.
  • the G + C content of their nucleic acids varies between 22 and 35%, and the similarity in their 16s rRNA sequences is between 92 and 99% (Rainey 2009). They are able to produce resistant endospores that can not be inactivated by extreme temperatures (heat and cold), radiation or extreme pH levels.
  • microorganisms can colonize many different habitats with strong seasonal variations and, in addition, find ideal propagation conditions in ensiled grass. Clostridia pass through the digestive tract of ruminants unscathed, which is why the contamination of the raw milk usually takes place via fecal contamination.
  • Clostridium butyricum Clostridum sporogenes
  • Clostridum beijerinckii Clostridium tyrobutyricum
  • C. tyrobutyricum has been described as the main causative agent of cheese defects (Zangerl 1993, Julien et al., 2008).
  • MPN Most Probable Number
  • the MPN method attempts to determine the "most probable number of bacteria” statistically by multiplying the initial weightings. Each sample weighs several replicates in parallel. As the number of parallels increases, the accuracy increases. The sample is usually diluted in a series of decimal steps and from each of these serial dilutions 3 to 5 replicates are inoculated and incubated in a suitable nutrient solution. The nutrient solutions are covered with a paraffin plug and incubated anaerobically for at least 3 to 5 days. Growth is then detected via gas formation and ascent of the paraffin plug.
  • the invention seeks to overcome the above-mentioned problems and overcome the disadvantages of the prior art, and has as its object to provide a nutrient medium of the type mentioned, with which a simpler evaluation of the results is made possible and the detection time can be shortened.
  • the nutrient medium should be able to achieve a minimization of false positives.
  • MPN most Probable Number
  • the above first object is achieved by a liquid nutrient medium for culturing cheese-dense clostridia containing a per se known Clostridial Medium (RCM) for incubation with milk or cheese samples comprising neutral red as an indicator.
  • RCM Clostridial Medium
  • a color indicator system based on the redox indicator neutral red which can reduce the butterklaredenenden Clostridien and thereby changing the color from red to yellow, simplifies the determination of the growth of the target organisms in liquid nutrient media and significantly facilitates the evaluation, currently only on the gas or Ascents of the paraffin plug overlying the sample are made.
  • the concentration of neutral red in the incubation is 0.010 to 0.025 g / l, preferably 0.015 g / l.
  • the nutrient medium comprises cycloserine and trimethoprim.
  • the nutrient medium contains a combination of the antibiotics cycloserine and trimethoprim which, as shown below in the examples, are suitable for the growth of the undesired accompanying flora such as Bacillus spp. and Paenibacillus spp. suppress and at the same time the target organisms, such as Cl. tyrobutyricum, Cl. butyricum, Cl. Sporogenes, to stimulate better growth.
  • the concentration of trimethoprim in the incubation is 17 mg / l to 35 mg / l, preferably 28 mg / l.
  • Another preferred embodiment of the nutrient medium according to the invention is characterized in that the concentration of cycloserine in the incubation is 200 mg / l.
  • the primary aim of the present invention was also to develop a method for the specific detection of anaerobic spore formers in milk and milk products and, in particular, also for this method an optimized culture medium which enables the sensitive detection of even low spore quantities while simultaneously optimally suppressing the accompanying flora.
  • a further object of the invention is achieved in a method for detecting cheese-dense clostridia in milk by the "Most Probable Number" (MPN) method using the inventive liquid nutrient medium, wherein the milk is incubated with the nutrient medium, that the incubation the milk is carried out at an pH of 6.0-7.0, preferably 7.0, under anaerobic conditions and the sample is evaluated after incubation for a change in color.
  • MPN Myerable Number
  • the nutrient medium is mixed with the milk, the proportion of the milk being> 50% by volume, for example 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, particularly preferably 75% %, is.
  • the modified nutrient medium contains, as it were, the milk to be examined as the main liquid constituent and the nutrients known from the RCM medium and the indicator (and optionally the antibacterial combination cycloserine + trimethoprim) for maximum stimulation of the growth of the butyric acid-producing clostridia when incubated under exclusion of oxygen.
  • the "milk constituent" of the nutrient medium is kept comparatively low to ensure the measurement of the indicator fluorescence signal.
  • the nutrient medium for the detection of butterchureprodupressiveden Clostridien consists of the RCM nutrients tryptone, meat extract, yeast extract, starch, glucose, sodium acetate, cysteine and sodium chloride (in the literature and commercially known concentrations or concentration ranges) and neutral red, usually in the form of a liquid concentrate.
  • the nutrient components can also be replaced by comparable nutrients (in comparable concentrations).
  • the sample batch has a strong turbidity and the detection of turbidity can not be used as an indicator of the growth of microorganisms. Also, if no paraffin overlaying the sample suspension is used, the gas formation associated with the paraffin-plug shift may also not be used as a growth indicator.
  • the redox indicator neutral red used according to the invention is reduced by clostridia (Jonsson (1990) and can therefore be both a simple color change of red after yellow as well as via a fluorescence signal (excitation at 450-470 nm and emission at 550-590 nm) can be used as evidence for the growth of the target germs.
  • the test sample for incubation with the nutrient medium in the indicator system according to the invention When using> 50% by volume, e.g. 3 parts, the test sample for incubation with the nutrient medium in the indicator system according to the invention, the detection only on the color change is possible.
  • the option of fluorescence detection is due to the intrinsic fluorescence of the sample (milk) only when using smaller amounts of sample, so if the nutrient medium with the sample in a larger volume ratio, i. E. 9: 1 or greater, mixed, possible.
  • the liquid nutrient media currently used for the detection of clostridia in the MPN method are based on the RCM medium described above, which contains the basic growth components needed for growth. Unwanted accompanying flora is suppressed in standard RCM-based procedures by laboratory pasteurization at 80-85 ° C and the aerobic accompanying flora additionally by incubation with the exclusion of oxygen by layering the nutrient media with paraffin. However, both measures are usually not sufficient to effectively suppress the unwanted accompanying flora, and the spore counts are often falsified due to the growth of the accompanying flora.
  • the combination of cycloserine and trimethoprim comes as a preferred combination of the selective components of the nutrient medium for the suppression of the accompanying flora, essentially Bacillus spp. and Paenibacillus spp., for use.
  • the combination of these substances has no adverse effect on the growth of the target organisms. It has even been found that the addition of trimethoprim in the preferred concentration range surprisingly accelerates the growth of the target organisms.
  • Table 1 As can be seen from this table, the detection times for the target organisms (Cl. tyrobutyricum, Cl. butyricum, Cl. sporogenes and Cl. beijerinkii) can be significantly and partially reduced by half.
  • trimethoprim is suitable for the suppression of Paenibacillus thermophilus, which is present in a large number of samples of raw milk cheeses and can lead to false positive results in the Bryant and Burkey method. As shown below, trimethoprim was able to suppress the growth of Paenibacillus thermophilus and Paenibacillus barengoltzii at concentrations of 17.5 ⁇ g / ml, 28 ⁇ g / ml and 35 ⁇ g / ml and had no adverse effect on the target organisms.
  • the detection method is based on incubating a series of replicates of serial sample dilutions in the nutrient media composition provided over a period of time to allow the target germs to grow.
  • an incubation time of 48 hours under strictly anaerobic conditions in a mixture of 80% CO 2 , 10% N 2 and 10% H 2 sufficient to in the case of growth of the target germs in the medium let redox incubator turn from red to yellow and thus demonstrate the growth of the target germs.
  • To achieve anaerobic conditions can also commercially available gas generation kits are used in appropriate incubation systems.
  • the color change can be determined without corresponding apparatus with the naked eye or by means of corresponding photo-optical evaluation systems.
  • a fluorescence evaluation system is required for measuring the fluorescence signals.
  • the detection method is carried out at a final pH of the nutrient medium (including the test sample) of 6.0 to 7.2, preferably 6.5 to 7.2, most preferably at pH 7.0.
  • the detection method according to the invention makes it possible to reliably detect spore counts of 75 to 59,000 spores per liter of milk. By using appropriate microtiter systems, the detection limit of the process can even be reduced to ⁇ 30 spores per liter.
  • composition of the nutrient medium according to the invention is given in Table 3: ⁇ b> Table 3: ⁇ / b> ⁇ u> Composition of nutrient medium (as a 4-fold concentrate) ⁇ / u> Basic Medium (RCM) concentration tryptone 20g / l meat extract 40g / l yeast extract 12 g / l Strength 4 g / l D (+) glucose 20 g / l Na acetate 12 g / l Cysteine HCl 2 g / l NaCl 20 g / l additions neutral 0.060 g / l D-cycloserine 800 mg / l trimethoprim 112 mg / l
  • a commercially available RCM medium can also be used.
  • the components are weighed out with the exception of cycloserine and trimethoprim in any order and dissolved in distilled water.
  • Trimethoprim and D-cycloserine are prepared as stock solution and added to the basal medium + indicator before use.
  • D-cycloserine is distilled at a concentration of 0.9 g in 18 ml. Dissolved water and then sterile filtered through a sterile filter with a pore size of 0.2 microns.
  • basal medium + indicator (4X concentrate)
  • Trimethoprim is prepared as stock solution in dimethyl sulphoxide (126 mg trimethoprim to 4.5 ml DMSO).
  • To 100 ml of finished basal medium + indicator (4-fold concentrate), 0.4 ml of the stock solution is added.
  • standard 96 well microtiter plates are used. These plates each have 8 recesses arranged in 12 vertical rows. The first 4 rows (32 wells) are loaded with 0.24 ml each of the test sample (milk or milk samples homogenized in sterile milk, which were previously pasteurized by incubation for 20 min at 80 ° C) and 0.08 ml per well provided a sterile concentrate of the nutrient medium according to the invention.
  • test sample milk or milk samples homogenized in sterile milk, which were previously pasteurized by incubation for 20 min at 80 ° C
  • 0.08 ml per well provided a sterile concentrate of the nutrient medium according to the invention.
  • the 32 wells of rows 5-8 each with 0.12 ml sample or sample homogenate and 0.04 ml each of a sterile concentrate of the culture medium according to the invention and the 32 wells of rows 9-12 with 0.06 ml sample or sample homogenate and each with 0.02 ml of the sterile concentrate (4-fold) of the nutrient medium provided.
  • the loading of the microtiter plates with sample and nutrient medium can be done with automatic pipettes or fully automatically by a suitable robot system for the Charging of microtiter plates done.
  • nutrient medium and sample can already be mixed in the ratio 1: 3 before pipetting and pipetted together in the above-mentioned amounts and gradations into the individual wells of the microtiter plates.
  • the microtiter plates are then incubated at 37 ° C under anaerobic conditions (10% CO 2 , 10% H 2 and 80% N 2 mixture) for 48 hours.
  • the color changes (red to yellow) or a fluorescence signal are detected, and the "most probable bacterial count" is preferably calculated via appropriate software for calculating MPN results on the basis of the sample dilutions used and the number of replicates used.
  • the use of 32 replicates per dilution stage and the small gradation of the concentrations used (serial 2-fold dilution) allows a very high precision of the statistical calculation.
  • Table 4 shows a method comparison in the investigation of the preferred method of the subject invention with the currently commonly used in the routine method according to Bryant and Burkey. It can be seen that the spore numbers according to Bryant and Burkey, due to the lower selectivity of this method, usually significantly higher than the determined with the inventive method actual spore counts.
  • non-target microorganisms such as Staphylococcus pasteuri, Bacillus thuringensis, Bacillus toyonensis, Staphylococcus petrasii, by molecular biological methods and the detection of Clostridium tyrobutyricum, Streptococcus mitis or Clostridum subterminale, detected.
  • non-target organisms are able to show positive evidence (growth with gas formation) in the Bryant and Burkey method.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein flüssiges Nährmedium für die Kultivierung käsereischädlicher Clostridien, welches mit Milch- oder Käseproben inkubiert wird, wobei das Nährmedium ein an sich bekanntes Clostudien-Medium ("Reinforced Clostridial Medium" - RCM) enthält und Neutralrot als Indikator umfasst, sowie ein Verfahren zum Nachweis käsereischädlicher Clostridien, bei dem das flüssige Nährmedium verwendet wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein flüssiges Nährmedium für die Kultivierung käsereischädlicher Clostridien sowie ein Verfahren für den selektiven Nachweis von buttersäureproduzierenden anaeroben Sporenbildnern der Gattung Clostridium in Milch und Käse.
    • HINTERGRUND
  • Wenn Käsereimilch mit Clostridiensporen belastet ist, so entsteht während der Reifung von Hartkäse durch das Auskeimen dieser Sporen ein charakteristischer Käsefehler, die sogenannte Spätblähung. Die Gruppe der käsereischädlichen Clostridien umfasst insbesondere die buttersäurebildenden Clostridien. Die Anwesenheit der ranzig riechenden Buttersäure und die starke Gasentwicklung resultieren in einer unerwünschten Sensorik, in Rissbildungen und unregelmäßigen Lochungen und führen zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Da bereits einige wenige Sporen pro Liter Rohmilch diese Käsefehler verursachen können, ist ein verlässlicher quantitativer Nachweis essentiell für die Käseerzeugung. Die genaue Erfassung der Sporenzahlen ist darüber hinaus auch in jenen Gegenden von Bedeutung, in denen die Sporenzahl in der Rohmilch als Qualitätsparameter gilt und somit Einfluss auf den Milchpreis hat. Weiters kann über die Anzahl der anaeroben Sporenbildner in der Rohmilch eine Aussage über die Art des verwendeten Rauhfutters (Heu, Gras bzw. Silage) getroffen werden.
  • Buttersäure produzierende Clostridien gehören zu der großen und sehr heterogenen Gattung Clostridium (Blaschek, 1999). Die buttersäureproduzierenden Clostridien werden dabei einem eigenen Cluster, Cluster 1, Clostridium senso stricto zugeordnet (Rainey, 2009). Es handelt sich dabei um gram-positive Stäbchenbakterien, die nur unter strikt anaeroben Bedingungen wachsen können. Der G+C-Gehalt ihrer Nukleinsäuren variiert zwischen 22 und 35%, und die Ähnlichkeit in ihren 16s rRNA-Sequenzen beträgt zwischen 92 und 99% (Rainey 2009). Sie sind in der Lage, resistente Endosporen zu produzieren, welche weder durch extreme Temperaturen (Hitze und Kälte) noch Strahlung oder extreme pH-Werte inaktiviert werden können. Diese Mikroorganismen können außerdem viele verschiedene Habitate mit starken jahreszeitlichen Schwankungen besiedeln und sie finden darüber hinaus ideale Vermehrungsbedingungen in siliertem Gras. Clostridien passieren den Verdauungstrakt von Wiederkäuern unbeschadet, weshalb die Kontamination der Rohmilch in aller Regel via fäkaler Verunreinigung erfolgt.
  • Bei jenen 4 Species, die am häufigsten aus Milch und Käse isoliert worden sind, handelt es sich um Clostridium butyricum, Clostridum sporogenes, Clostridum beijerinckii und Clostridium tyrobutyricum, wobei C. tyrobutyricum als Hauptverursacher der Käsefehler beschrieben worden ist (Zangerl 1993, Julien et.al. 2008).
  • Damit auch geringe Mengen an Käsereischädlingen überhaupt nachgewiesen werden können, erfolgt derzeit der Nachweis über das "Most Probable Number" (MPN)-Verfahren. Das MPN-Verfahren versucht, auf statistischem Weg durch mehrfachen Ansatz der Einwaagen die "wahrscheinlichste Keimzahl" zutreffend zu bestimmen. Dabei werden von jeder Einwaage mehrere Replikate parallel untersucht. Mit steigender Zahl der Parallelen nimmt dabei die Genauigkeit zu. Die Probe wird dazu meist in einer Reihe von Dezimalschritten verdünnt und von jeder dieser seriellen Verdünnungen werden 3 bis 5 Replikate in einer entsprechenden Nährlösung überimpft und bebrütet. Die Nährlösungen werden mit einem Paraffinpfropfen überschichtet und anaerob mindestens 3 bis 5 Tage bebrütet. Wachstum wird danach über die Gasbildung und das Aufsteigen des Paraffinpfropfens festgestellt. Aus der Anzahl der positiven Röhrchen in jeder der drei Verdünnungsstufen ergibt sich eine Zahlenkombination (=Stichzahl), der man mit statistischen Methoden eine "wahrscheinlichste Keimzahl" (MPN) pro Liter Probe zuordnen kann. Die MPN - Stichzahl kann dabei einfach über entsprechende statistische Tabellen (MPN-Tabellen) in die wahrscheinlichste Keimzahl (Sporenzahl) überführt werden. (Bergere J. and Sivelä S.,1990).
  • Von Brändle et.al. (2016) werden die aktuell verfügbaren und für den Nachweis von käsereischädlichen Clostridien verwendeten Nährmedien im Detail beschrieben. Am häufigsten kommen dabei Rezepturen zum Einsatz, die auf der Verwendung des von Hirsch und Grinstead (1954) entwickelten "Reinforced Clostridial Medium" (RCM) basieren. RCM enthält im Wesentlichen die folgenden Komponenten:
    • Trypton bzw. Peptron
    • Fleischextrakt
    • Hefeextrakt
    • Stärke
    • Glucose
    • Natriumacetat
    • Cystein (gewöhnlich in Form von Cystein-HCl)
    • Natriumchlorid
  • All diese für den Nachweis von käsereischädlichen Clostridien verwendeten Nährmedien nutzen meist einen Laborpasteurisationsschritt, um die nicht sporenbildende Begleitflora zu eliminieren. Weiters wird häufig Laktat zugesetzt, um das Wachstum der käsereischädlichen Clostridien zu fördern. Trotz dieser Vorkehrungen und einer strikt anaeroben Bebrütung können aber auch andere in der Probe vorhandene, thermostabile und unter anaeroben Bedingungen vermehrungsfähige Mikroorganismen anwachsen und das Vorhandensein von Käsereischädlingen vortäuschen und hierdurch das Ergebnis verfälschen. Weil keines der bekannten Nährmedien eine ausreichende Sicherheit für den verlässlichen und vergleichbaren Nachweis gewährleistet, war es bisher jedoch nicht möglich, eine entsprechende Standardmethode für den Nachweis zu entwickeln.
  • Die derzeit verfügbaren Methoden für den Nachweis von käsereischädlichen Clostridien sind darüber hinaus auch extrem arbeits- und zeitintensiv. Nach der MPN-Methode müssen beispielsweise mindestens 3 sequentielle Probenverdünnungen in jeweils 5 Replikaten untersucht werden, wobei die Ergebnisse in der Regel erst nach 3 bis 10 Tagen Bebrütung vorliegen.
  • Die Erfindung versucht, die oben genannten Probleme zu beseitigen sowie die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden, und stellt sich die Aufgabe, ein Nährmedium der eingangs genannten Art bereitzustellen, mit dem eine einfachere Auswertung der Ergebnisse ermöglicht wird und die Nachweiszeit verkürzt werden kann. Außerdem soll das Nährmedium in der Lage sein, eine Minimierung von falschen Positivergebnissen zu erreichen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis von käsereischädlichen Clostridiensporen in Milchproben nach der "Most Probable Number" (MPN) - Methode bereitzustellen, welches mithilfe des neuen Nährmediums für eine schnellere und zuverlässigere Quantifizierung der Clostridiensporen sorgt.
    • KURZFASSUNG
  • Die oben genannte erste Aufgabe wird durch ein flüssiges Nährmedium für die Kultivierung käsereischädlicher Clostridien, enthaltend ein an sich bekanntes Clostridien-Medium ("Reinforced Clostridial Medium" - RCM), zur Inkubation mit Milch- oder Käseproben gelöst, welches Neutralrot als Indikator umfasst.
  • Ein Farbindikatorsystem auf Basis des Redoxindikators Neutralrot, den die buttersäurebildenden Clostridien reduzieren können und der dabei die Farbe von Rot nach Gelb ändert, vereinfacht die Feststellung des Wachstums der Zielorganismen in flüssigen Nährmedien und erleichtert wesentlich die Auswertung, die derzeit nur über die Gasbildung bzw. das Aufsteigen des Paraffinpropfens, mit dem die Probe überschichtet wird, erfolgt.
  • Vorzugsweise beträgt die Konzentration von Neutralrot bei der Inkubation 0,010 bis 0,025 g/l, vorzugsweise 0,015 g/l.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nährmedium Cycloserin und Trimethoprim.
  • Das Nährmedium enthält eine Kombination der Antibiotika Cycloserin und Trimethoprim, die sich, wie nachstehend in den Beispielen gezeigt wird, dazu eignen, das Wachstum der unerwünschten Begleitflora wie Bacillus spp. und Paenibacillus spp. zu unterdrücken und gleichzeitig die Zielorganismen, wie Cl. tyrobutyricum, Cl. butyricum, Cl. Sporogenes, zu besserem Wachstum zu stimulieren.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration von Trimethoprim bei der Inkubation 17 mg/l bis 35 mg/l, vorzugsweise 28 mg/l. Eine andere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nährmediums ist dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Cycloserin bei der Inkubation 200 mg/l beträgt.
  • Primäres Ziel der vorliegenden Erfindung war es zudem, für den spezifischen Nachweis von anaeroben Sporenbildnern in Milch und Milchprodukten ein Verfahren und insbesondere auch für dieses Verfahren ein optimiertes Kulturmedium zu entwickeln, das den sensitiven Nachweis auch geringer Sporenmengen unter gleichzeitiger optimaler Unterdrückung der Begleitflora ermöglicht.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung wird bei einem Verfahren zum Nachweis von käsereischädlichen Clostridien in Milch nach der "Most Probable Number" (MPN) - Methode unter Verwendung des erfinderischen flüssigen Nährmediums, wobei die Milch mit dem Nährmedium inkubiert wird, dadurch gelöst, dass die Inkubation der Milch bei einem pH-Wert von 6,0-7,0, vorzugsweise 7,0, unter anaeroben Bedingungen durchgeführt und die Probe nach der Inkubation hinsichtlich einer Farbänderung ausgewertet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Nährmedium dabei mit der Milch gemischt, wobei der Anteil der Milch >50 Vol.%, zum Beispiel 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, besonders bevorzugt 75%, beträgt.
  • Das modifizierte Nährmedium enthält dabei die zu untersuchende Milch sozusagen als flüssigen Hauptbestandteil und die aus dem RCM-Medium bekannten Nährstoffe sowie den Indikator (und gegebenenfalls die Antibiotikakombination Cycloserin + Trimethoprim) zur maximalen Stimulation des Wachstums der buttersäureproduzierenden Clostridien bei Inkubation unter Sauerstoffausschluss.
  • Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Inkubation mittels mehrfacher Replikate von seriellen Probenverdünnungen in Mikrotiterplatten durchgeführt und die Auswertung mittels Fluoreszenzmessung vorgenommen, wobei das Nährmedium mit der Milch in einem Volumenverhältnis Nährmedium:Milch = 9:1 oder größer gemischt wird. In dieser Ausführungsform wird der "Milchbestandteil" des Nährmediums vergleichsweise gering gehalten, um die Messung des Indikatorfluoreszenzsignals zu gewährleisten.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Das Nährmedium für den Nachweis von buttersäureproduzierenden Clostridien besteht erfindungsgemäß aus den RCM-Nährstoffen Trypton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Stärke, Glucose, Natriumacetat, Cystein und Natriumchlorid (in den an sich literaturbekannten und handelsüblichen Konzentrationen bzw. Konzentrationsbereichen) sowie Neutralrot, zumeist in Form eines flüssigen Konzentrats. Die Nährstoffkomponenten können auch durch vergleichbare Nährstoffe (in vergleichbaren Konzentrationen) ersetzt werden.
  • Werden beim Nachweisverfahren größere Mengen der Untersuchungsprobe, d.h. Milch oder mit UHT-Milch versetzter Probe (Käseisolat), zur Inkubation mit dem Nährmedium verwendet, hat der Probenansatz eine starke Eigentrübung und die Feststellung einer Trübung kann nicht als Indikator für das Anwachsen der Mikroorganismen herangezogen werden. Wird auch auf eine Überschichtung der Probensuspension mit Paraffin verzichtet, kann die Gasbildung, die mit der Verschiebung des Paraffinpfropfens einhergeht, ebenfalls nicht als Wachstumsindikator verwendet werden.
  • Der erfindungsgemäß eingesetzte Redoxindikator Neutralrot wird hingegen von Clostridien reduziert (Jonsson (1990) und kann daher sowohl über eine einfache Farbänderung von Rot nach Gelb als auch über ein Fluoreszenzsignal (Anregung bei 450-470 nm und Emission bei 550-590 nm) als Nachweis für das Anwachsen der Zielkeime verwendet werden.
  • Bei der Verwendung von >50 Vol.%, also z.B. 3 Teilen, der Untersuchungsprobe zur Inkubation mit dem Nährmedium ist beim erfindungsgemäßen Indikatorsystem der Nachweis nur über die Farbänderung möglich. Die Option der Fluoreszenzdetektion ist aufgrund der Eigenfluoreszenz der Probe (Milch) ausschließlich bei Verwendung kleinerer Probenmengen, also wenn das Nährmedium mit der Probe in einem größeren Volumenverhältnis, d.h. 9:1 oder größer, gemischt wird, möglich.
  • Die für den Nachweis von Clostridien im MPN-Verfahren derzeit verwendeten flüssigen Nährmedien basieren auf dem oben beschriebenen RCM-Medium, welches die grundlegenden, für die Anzucht benötigten Wachstumskomponenten enthält. Unerwünschte Begleitflora wird bei den gängigen, auf RCM basierenden Verfahren durch eine Laborpasteurisation bei 80 - 85°C und die aerobe Begleitflora zusätzlich durch eine Bebrütung unter Ausschluss von Sauerstoff durch Überschichten der Nährmedien mit Paraffin unterdrückt. Beide Maßnahmen reichen aber in der Regel nicht aus, um die unerwünschte Begleitflora wirksam zu unterdrücken, und die ermittelten Sporenzahlen werden, bedingt durch das Durchwachsen der Begleitflora, häufig verfälscht.
  • In zahlreichen Arbeiten wurden bereits Versuche beschrieben, bei denen durch Zusatz verschiedener Antibiotika das Wachstum der unerwünschten Begleitflora unterdrückt wurde. Ohne Anspruch auf Vollständigkeit in der Aufzählung kamen dabei die Antibiotika Polymyxin B, Sulfadizin, Cycloserin und Trimethoprim, zumeist in Kombination von 3 bis 4 der genannten Komponenten, zum Einsatz (Abgrall. et al (1985), Bourgeois et al. (1984), Batina et al. (1997), Jonsson (1990), Roux and Raoult (2004)). Dabei hat sich aber auch gezeigt, dass es meist zu einer unerwünschten Hemmung der nachzuweisenden Clostridienkultur selbst kam.
  • Die Kombination von Cycloserin und Trimethoprim kommt als bevorzugte Kombination der Selektivkomponenten des Nährmediums zur Unterdrückung der Begleitflora, im Wesentlichen Bacillus spp. und Paenibacillus spp., zum Einsatz. Die Kombination dieser Substanzen hat dabei keinen nachteiligen Einfluss auf das Wachstum der Zielorganismen. Es wurde sogar festgestellt, dass durch den Zusatz von Trimethoprim im bevorzugten Konzentrationsbereich das Wachstum der Zielorganismen überraschenderweise noch beschleunigt wird. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Wie aus dieser Tabelle ersichtlich, konnten die Nachweiszeiten für die Zielorganismen (Cl. tyrobutyricum, Cl. butyricum, Cl. sporogenes und Cl. beijerinkii) deutlich und teilweise bis um die Hälfte reduziert werden. Tabelle 1: Vergleich der Detektionszeit (Zeit bis zum Auftreten eines sichtbaren Farbumschlags) während der Bebrütung mit bzw. ohne Zusatz von Trimethoprim.
    Code Spezies Stamm ohne Trimethoprim mit Trimethoprim
    Arithm. Mittelwert [h]
    Cl 2 Cl. sporogenes Uni Graz 8260 30.8 15.0
    Cl 3 Cl. tyrobutyricum NCDO 1759 43.0 33.0
    Cl 9 Cl. sporogenes LMG 8421; ATCC 3584; DSM 795 37.0 19.0
    Cl 12 Cl. sporogenes ATCC 19404 15.9 12.5
    Cl 13 Cl beijerinckii IMB 4132 202 28.5 21.5
    Cl 14 Cl. tyrobutyricum DSM 663 31.6 21.5
    Cl 15 Cl. tyrobutyricum DSM 664 24.5 20.0
    Cl 16 Cl. tyrobutyricum IMB 4132 2020 35.0 23.0
    Cl 17 Cl. butyricum DSM 2477 4P1 15.3 7.5
    Cl 18 Cl. butyricum DSM 2478 MMP3 24.8 19.0
    Cl 19 Cl. butyricum DSM 10702; ATCC 19398 11.0 8.0
    Cl 20 Cl. tyrobutyricum DSM 2637 45.7 41.0
    Cl 22 Cl. beijerinckii IMB 4132 2008 28.5 12.5
    Cl 24 Cl. beijerinckii IMB 4132 2007 17.8 12.0
    Cl 25 Cl. tyrobutyricum IMB 4132 2022 46.8 28.0
    Cl 26.2 Cl. beijerinckii IMB 4132 2023 - 31.5
    Cl 29.2 Cl. tyrobutyricum IMB 4132 2010 30.0 28.0
    Cl 31 Cl. beijernickii IMB 4132 2014 35.5 29.0
    Cl 33 Cl. tyrobutyricum IMB 4132 2018 40.5 26.0
    Cl 34 Cl. beijerinckii DSM-1820 31.5 24.0
    Cl 36 Cl. beijernickii DSM-791 35.3 25.0
    Cl 37 Cl. acetobutylicum LMG 5710; DSM 792 - 37.5
    Cl 40 Cl. beijerinckii LMG 1219; ATCC 6015 28.3 22.5
    Cl 201 Cl. beijernickii IMB 4132 201 28.5 14.5
    Cl 1904 Cl. sporogenes IMB 4132 1904 19.3 10.0
    Cl 2002 Cl. beijerinckii IMB 4132 2002 26.8 18.0
    Cl 2013 Cl. tyrobutyricum IMB 4132 2009 29.0 24.0
    Cl 2016 Cl. beijerinckii IMB 4132 2016 18.0 13.0
    Cl 2021 Cl. tyrobutyricum IMB 4132 2021 18.0 14.5
    118 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 27.8 19.0
    119 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 25.0 19.0
    120 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 36.0 19.0
    122 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 26.5 18.0
    123 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 31.5 19.0
    152 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 31.5 19.0
    153 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 31.5 22.0
    154 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 31.5 19.0
    156 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 30.0 19.0
    157 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 40.5 37.0
    162 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 42.0 28.0
    163 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 42.0 35.5
    K 6.5 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 48.0 27.0
    K 8.1 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 30.8 19.0
    K 11.2 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 27.0 27.0
    K 13.2 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 31.5 24.5
    K 13.5 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 31.5 19.0
    K 16.3 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 27.0 19.0
    K 18.1 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 22.5 18.0
    K 18.2 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 29.3 24.5
    K 25.1 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 46.0 39.0
    K 26.1 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 37.0 22.0
    K 27.1 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 37.0 27.5
    K 27.9 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 39.0 24.0
    K 28.5 Cl. tyrobutyricum Käseisolat 33.5 24.0
  • Es wurde darüber hinaus festgestellt, dass Trimethoprim zur Unterdrückung von Paenibacillus thermophilus geeignet ist, welcher in einer Vielzahl von untersuchten Proben aus Rohmilchkäsen vorkommt und zu falsch positiven Ergebnissen in der Methode nach Bryant und Burkey führen kann. Wie nachfolgend gezeigt wird, konnte Trimethoprim in den Konzentrationen 17,5µg/ml, 28 µg/ml sowie 35µg/ml das Wachstum von Paenibacillus thermophilus sowie Paenibacillus barengoltzii unterdrücken und hatte keinen nachteiligen Einfluß auf die Zielorganismen. (Tabelle 2) Tabelle 2: Ergebnisse der erfindungsgemäßen Nährmedienzusammensetzung bei verschiedenen Trimethoprimkonzentrationen
    Isolat Wachstum mit Farbumschlag Trimethoprimkonzentration
    0 17,5µg/ml 28 µg/ml 35µg/ml
    Clostridium tyrobutylicum + + + +
    Clostridium butyricum + + + +
    Paenibacillus thermophilus + - - -
    Paenibacillus barengoltzii + - - -
    Paenibacillus peoriae - - - -
  • Das Nachweisverfahren beruht auf einer Inkubation einer Serie von Replikaten von seriellen Probenverdünnungen in der bereitgestellten Nährmedienzusammensetzung über einen bestimmten Zeitraum, um das Anwachsen der Zielkeime zu ermöglichen. Wie von den Erfindern festgestellt wurde, reicht beim erfindungsgemäßen Verfahren eine Inkubationszeit von 48 Stunden unter strikt anaeroben Bedingungen in einem Gemisch von 80% CO2, 10% N2 und 10% H2 aus, um im Falle des Anwachsens der Zielkeime den im Medium enthaltenen Redoxinkubator von Rot nach Gelb umschlagen zu lassen und somit das Wachstum der Zielkeime nachzuweisen. Zur Erzielung von anaeroben Bedingungen können auch kommerziell erhältliche Gas-Generation-Kits in entsprechenden Bebrütungssystemen eingesetzt werden.
  • Die Farbänderung kann ohne entsprechende Apparate mit freiem Auge oder aber durch entsprechende fotooptische Auswertesysteme festgestellt werden. Für die Messung der Fluoreszenzsignale ist ein Fluoreszenzauswertesystem erforderlich.
  • Erfindungsgemäß wird das Nachweisverfahren bei einem End-pH-Wert des Nährmediums (inklusive der Untersuchungsprobe) von 6,0 bis 7,2, vorzugsweise 6,5 bis 7,2, am meisten bevorzugt bei pH 7,0, durchgeführt.
  • Durch das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist es möglich, Sporenzahlen von 75 bis 59.000 Sporen pro Liter Milch verlässlich nachzuweisen. Durch Einsatz entsprechender Mikrotitersysteme kann die Nachweisgrenze des Verfahrens sogar auf <30 Sporen pro Liter reduziert werden.
  • Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert.
    • BEISPIELE
  • Ein bevorzugtes Beispiel für eine Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Nährmediums ist in Tabelle 3 angeführt: Tabelle 3: Zusammensetzung Nährmedium (als 4-fach Konzentrat)
    Basismedium (RCM) Konzentration
    Trypton 20g/l
    Fleischextrakt 40g/l
    Hefeextrakt 12 g/l
    Stärke 4 g/l
    D(+) Glucose 20 g/l
    Na-Acetat 12 g/l
    Cystein-HCl 2 g/l
    NaCl 20 g/l
    Zusätze
    Neutralrot 0,060 g/l
    D-Cycloserin 800 mg/l
    Trimethoprim 112 mg/l
  • Für die Herstellung des erfindungsgemäßen Nährmediums bzw. für das erfindungsgemäße Verfahren kann auch ein handelsübliches RCM-Medium verwendet werden.
    • Herstellung des Nährmediums (Untersuchungsmedium):
  • Die Komponenten werden mit Ausnahme von Cycloserin und Trimethoprim in beliebiger Reihenfolge eingewogen und in destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wird mit 5 M Natronlauge auf pH=8,0 eingestellt und das Basismedium (RCM) + Indikator (Neutralrot) 15 min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren beträgt der pH-Wert 7,3 und erreicht nach Zugabe der Probe (3 Teile Milch) den für die Untersuchung vorgesehenen pH-Wert von 7,0.
  • Trimethoprim und D-Cycloserin werden als Stocklösung hergestellt und dem Basismedium + Indikator erst vor der Verwendung zugegeben. D-Cycloserin wird in einer Konzentration von 0,9 g in 18 ml dest. Wasser gelöst und anschließend über einen Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm sterilfiltriert. Zu 100 ml Basismedium + Indikator (4-fach Konzentrat) werden 1,6 ml der Cycloserinlösung zugesetzt. Trimethoprim wird als Stocklösung in Dimethylsulfoxid (126 mg Trimethoprim auf 4,5 ml DMSO) hergestellt. Zu 100 ml fertigem Basismedium + Indikator (4-fach Konzentrat) werden 0,4 ml der Stocklösung zugesetzt.
    • Durchführung des Nachweisverfahrens
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungform werden Standard-96 Well-Mikrotiterplatten verwendet. Bei diesen Platten sind in je 12 vertikalen Reihen je 8 Vertiefungen angeordnet. Die ersten 4 Reihen (32 Wells) werden dabei mit je 0,24 ml der Untersuchungsprobe (Milch oder in steriler Milch homogenisierte Käseproben, die davor durch Inkubation über 20 min bei 80°C pasteurisiert wurden) beschickt und je Well mit 0,08 ml eines sterilen Konzentrats des erfindungsgemäßen Nährmediums versehen.
  • In gleicher Weise werden die 32 Wells der Reihen 5-8 mit je 0,12 ml Probe bzw. Probenhomogenat und je 0,04 ml eines sterilen Konzentrats des erfindungsgemäßen Nährmediums sowie die 32 Wells der Reihen 9-12 mit je 0,06 ml Probe bzw. Probenhomogenat und mit je 0,02 ml des sterilen Konzentrats (4-fach) des Nährmediums versehen. Die Beschickung der Mikrotiterplatten mit Probe und Nährmedium kann dabei mit automatischen Pipetten oder vollautomatisch durch ein geeignetes Robotersystem für die Beschickung von Mikrotiterplatten erfolgen. Ebenso können Nährmedium und Probe bereits vor dem Pipettieren im Verhältnis 1:3 gemischt und gemeinsam in den oben angeführten Mengen und Abstufungen in die einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatten pipettiert werden. Die Mikrotiterplatten werden anschließend bei 37°C unter anaeroben Bedingungen (10% CO2, 10% H2 und 80% N2 Gemisch) für 48 Stunden inkubiert.
  • Je nach vorhandenem Kontaminationsgrad ergibt sich nach der Bebrütung in den Replikaten eine bestimmte Verteilung positiver und negativer Wells, welche über ihre Farbe (rot = negativ; gelb = positiv) oder über ein entsprechendes Fluoreszenzsignal (positiv) bzw. Fehlen des Fluoreszenzsignals (negativ) auswertbar sind. Mittels statistischer Berechnung lässt sich jeder möglichen Verteilung an bewachsenen und unbewachsenen Vertiefungen innerhalb der untersuchten Verdünnungsstufen eine wahrscheinlichste Keimzahl (MPN Sporenzahl) zuordnen.
  • Bei der Auswertung der einzelnen Vertiefungen werden die Farbumschläge (Rot nach Gelb) oder ein Fluoreszenzsignal detektiert und die "wahrscheinlichste Keimzahl" vorzugsweise über eine entsprechende Software zur Berechnung von MPN-Ergebnissen anhand der eingesetzten Probenverdünnungen und der Anzahl der verwendeten Replikate berechnet. Die Verwendung von 32 Replikaten pro Verdünnungsstufe sowie die geringe Abstufung der eingesetzten Konzentrationen (serielle 2-fach-Verdünnung) ermöglicht dabei eine sehr hohe Präzision der statistischen Berechnung.
  • Im oben beschriebenen Beispiel wurden insgesamt 13,44 ml Probe in 3 seriellen 2-fach-Verdünnungsstufen untersucht. Auf diese Weise konnten Sporenzahlen von 75 bis 59.000 Sporen pro Liter Milch verlässlich nachgewiesen werden.
  • Tabelle 4 zeigt einen Methodenvergleich bei der Untersuchung der bevorzugten Methode der gegenständlichen Erfindung mit der aktuell in der Routine häufig eingesetzten Methode nach Bryant und Burkey. Daraus ist ersichtlich, dass die Sporenzahlen nach Bryant und Burkey, bedingt durch die geringere Selektivität dieses Verfahrens, meist signifikant höher liegen als die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten tatsächlichen Sporenzahlen.
  • Zumindest für die Proben Nr. 5, 21, 24, 31 und 34 wurden dabei mittels molekularbiologischer Verfahren neben dem Nachweis von Clostridium tyrobutyricum auch das Vorhandensein von nicht zu den Zielorganismen zählenden Mikroorganismen, wie Staphylococcus pasteuri, Bacillus thuringensis, Bacillus toyonensis, Staphylococcus petrasii, Streptococcus mitis oder Clostridum subterminale, nachgewiesen. Diese Nicht-Zielorganismen sind in der Lage, bei der Methode nach Bryant und Burkey zu einem positiven Nachweis (Wachstum mit Gasbildung) zu führen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Isolate beim erfindungsgemäßen Verfahren bzw. durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Cycloserin und Trimethoprim enthaltenden Nährmediums im Wachstum unterdrückt werden und keinen Farbumschlag auslösen können. Tabelle 4: Vergleich der Ergebnisse bei der Untersuchung von 39 Rohmilchproben mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Methode nach Bryant und Burkey.
    Mittelwert Mittelwert
    Probe (erfindungsgemäßes Verfahren) nach 48 Stunden (Bryant und Burkey) nach 7 Tagen
    1 5485 >16000
    2 4063 9200
    3 1170 2600
    4 10698 >16000
    5 1587 2950
    6 2860 10700
    7 4980 >16000
    8 344 2050
    9 7647 7300
    10 6603 12600
    11 114 <180
    12 7955 >16000
    13 <75 315
    14 <75 <180
    15 <75 495
    16 <75 <180
    17 >58700 >16000
    18 <75 190
    19 <75 190
    20 5070 9200
    21 550 1500
    22 878 3250
    23 6865 12600
    24 9520 >16000
    25 353 495
    26 113 620
    27 1345 6350
    28 2285 4450
    29 1565 4450
    30 466 2850
    31 190 620
    32 2310 10700
    33 897 1075
    34 3700 12600
    35 1870 1245
    36 1335 4450
    37 4455 12600
    38 <30 <180
    39 <30 <180
    • LITERATUR
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    • Zangerl P. (1993), Deutsche Milchwirtschaft Vol. 19, 936-940

Claims (8)

  1. Flüssiges Nährmedium für die Kultivierung käsereischädlicher Clostridien, enthaltend ein an sich bekanntes Clostridien-Medium ("Reinforced Clostridial Medium"-RCM), zur Inkubation mit Milch- oder Käseproben, dadurch gekennzeichnet, dass es Neutralrot als Indikator umfasst.
  2. Flüssiges Nährmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Neutralrot bei der Inkubation 0,010 bis 0,025 g/l, vorzugsweise 0,015 g/l, beträgt.
  3. Flüssiges Nährmedium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es Cycloserin und Trimethoprim umfasst.
  4. Flüssiges Nährmedium nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Trimethoprim bei der Inkubation 17 mg/l bis 35 mg/l, vorzugsweise 28 mg/l, beträgt.
  5. Flüssiges Nährmedium nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Cycloserin bei der Inkubation 200 mg/l beträgt.
  6. Verfahren zum Nachweis von käsereischädlichen Clostridien in Milch nach der "Most Probable Number" (MPN) - Methode unter Verwendung eines flüssigen Nährmediums nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die Milch mit dem Nährmedium inkubiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation der Milch bei einem pH-Wert von 6,0-7,2, vorzugsweise 7,0, unter anaeroben Bedingungen durchgeführt und die Probe nach der Inkubation hinsichtlich einer Farbänderung ausgewertet wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium mit der Milch gemischt wird, wobei der Anteil der Milch >50 Vol.%, vorzugsweise 75%, beträgt.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation mittels mehrfacher Replikate von seriellen Probenverdünnungen in Mikrotiterplatten durchgeführt und die Auswertung mittels Fluoreszenzmessung vorgenommen wird, wobei das Nährmedium mit der Milch in einem Volumenverhältnis Nährmedium: Milch = 9:1 oder größer gemischt wird.
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