EP1924711A2 - Nukleinsäure-bindende chips zur detektion von stickstoffmangelzuständen im rahmen der bioprozesskontrolle - Google Patents

Nukleinsäure-bindende chips zur detektion von stickstoffmangelzuständen im rahmen der bioprozesskontrolle

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Publication number
EP1924711A2
EP1924711A2 EP06791904A EP06791904A EP1924711A2 EP 1924711 A2 EP1924711 A2 EP 1924711A2 EP 06791904 A EP06791904 A EP 06791904A EP 06791904 A EP06791904 A EP 06791904A EP 1924711 A2 EP1924711 A2 EP 1924711A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
putative
seq
homologue
protein
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06791904A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Evers
Jörg FEESCHE
Karl-Heinz Maurer
Thomas Schweder
Michael Hecker
Birgit Voigt
Britta JÜRGEN
Le Thi Hoi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1924711A2 publication Critical patent/EP1924711A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid-binding chips for monitoring bioprocesses with a particular focus on the detection of nitrogen deficiency states and to the use of corresponding gene probes, in particular on such chips, or methods and applications based on such probes and chips
  • the monitoring of such processes is done on the one hand by observing the changing properties and requirements of the organisms under consideration during the process, which is reflected, for example, in the optical density and viscosity of the medium, in absorbed or emitted gases, in changes in the pH
  • This can also be used to measure enzymatic activities by means of suitable assays, for example the detection of activities of interest in the cultural supernatant
  • a recognition layer biological layer
  • a transducer for example an amperometric or potentiomet ⁇ sche electrode
  • an amplifier amplification / processing
  • the protein-specific chips can be disregarded.
  • MRNA-recognizing chips are usually doped with complementary DNA molecules or DNA analogs. Their preparation and use for very detailed questions, such as the differentiation of point mutations, for example, in the application WO 95/11995 A1.
  • DNA chip analyzes there are those with a PCR amplification of the target sequence and those without amplification. Furthermore, there are those with optical evaluation of the signals due to the recognition and those with electrical evaluation
  • fluorophores for example, fluorophores, Ac ⁇ diniumester or indirect detection of secondary binding processes, for example on biotin, avidin / streptavidin or digoxigenin described in the latter case, digoxigenin-specific antibodies are used for optical detection, the In this case, the enzyme activity is detected either kolo ⁇ metrisch or luminescence According to Westin et ai (2000), Nature Biotechnol, Volume 18, S 199-204, the hybridization with a PCR on the DNA chip be coupled so as to be able to carry out the entire detection reaction on a chip can ("Lab-on-a-Ch ⁇ p concept")
  • control genes can also be included to indicate when the process is developing in a direction that is not intended. In the course of this monitoring, for practical reasons, a not too high number of different genes should be observed
  • biotechnological processes with gram-positive bacteria are used especially for their ability to secretion for the industrial production of valuable materials.
  • nucleic acid-binding chips with individual of these genes are now disclosed in several publications, or at least the possibility of their production demonstrated
  • the two patent applications DE 10136987 A1 and DE 10108841 A1 each reveal a gene from Corynebacterium glutamicum, namely clpC or citB
  • Both genes are described as relevant for the amino acid metabolism, which is why a commercially interesting use of these genes should consist in inactivating or at least attenuating them in order to optimize the fermentative production of amino acids by this microorganism. Further application possibilities can then exist according to these applications. Submit probes for the relevant gene products on nucleic acid-binding chips
  • patent application WO 02/055655 A2 discloses more than 1,800 DNA sequences obtained by the complete sequencing of the Genome of the microorganism Methylococcus capsulatus have been identified
  • nucleic acid-binding chips that cover an almost complete genome or the associated transcptome (genomic DNA chips).
  • the application WO 2004/027092 A2 provides a representative cross-section with a manageable number of genes in order to identify various physiological states which an observed microorganism can undergo during cultivation.
  • these include starvation conditions for various nutrients or stress situations such as for example heat or cold shock, shear stress, oxidative stress or oxygen limitation
  • Nucleic acid-binding chips that are based on this selection of genes provide a certain, but overall rather rough overview of the respective metabolic situation. They usually are not able to particularly illuminate a single sub-problem, however, a single positive signal can be different Be situations out or even be false positive, which is why it often - and especially in such an unclear situation - makes sense to analyze a selected metabolic aspect separately
  • electrically readable nucleic acid-binding chips which have the advantage of a timely analysis, the Number of simultaneously assignable places limited, so that can not be easily applied additional gene probes to detect additional, specific metabolic situations
  • nucleic acid-binding chips for monitoring bioprocesses with a special focus on the detection of phosphate deficient states or glucose deficiency states respectively carry a limited number of probes to indicate these specific stress situations
  • a metabolic situation which can be critical for microorganisms and thus critical for a corresponding bioprocess, is that of nitrogen deficiency because nitrogen is an essential element for nucleic acids and amino acids and thus for proteins, which in turn represent the main function and building materials of biological organisms a lack of building material supply and can rapidly lead to the death of the cells or at least prevent the achievement of higher cell densities
  • a nitrogen deficiency also affects the product formation rate
  • a chip to carry out a based, timely analysis and to be able to intervene punctually and thus more purposefully in the ongoing bioprocess due to the result that can be obtained quickly
  • nucleic acid-containing chips with gene probes for single or several of these genes and thereby arrive at nucleic acid-binding chips that reliably indicate the signal "nitrogen deficiency" in the course of a monitored bioprocess (nitrogen deficiency sensors) was particularly suitable for those nucleic acid-binding chips whose number of assignable sites is comparatively low due to their design, in particular the electrically evaluable For these, on the other hand, have the advantages of rapid readability and thus enable an / A - // ne analysis This ensures if necessary early intervention in order to optimize the bioprocess concerned with regard to the supply of building materials
  • Such a DNA-binding chip should be usable for several comparable processes and be adapted to specific application possibilities with comparatively slight variations.
  • it should be based on bioprocesses on the basis of saccharomyces, in particular B subtilis, B amyloliquefaciens, B lentus, B globign, and be especially geared to ß licheniformis Bioprocesses focused on fermentations, in particular the technical production of products, especially overexpressed proteins
  • a nitrogen deficiency sensor should allow appropriate methods for measuring the physiological state of the cells under consideration, as well as appropriate uses for monitoring the biological processes under consideration
  • Table 1 shows all of the 210 genes of Bacillus lichemformis DSM13 identified in Example 1, the induction of which was observed under nitrogen deficiency, with a factor of at least three being considered significant. Of these, in table 2, all 49 genes are assembled whose induction by nitrogen deficiency is any of those measured Time points have been at least the factor 8 and where it could be concluded from parallel, not shown here studies that they were relatively specific for this signal. These are listed in Table 3 again in terms of strength of their observed maximum induction their DNA and amino acid sequences listed in the sequence listing for the present application, wherein the odd-numbered numbers for DNA and the subsequent even-numbered for the respective deduced amino acid sequences stand on these sequences also refer to the respective SEQ ID numbers in Tables 2 and 3 acts these are the following genes, in order of decreasing strength of the nitric-depleted induction (see Tables 2 and 3) - Gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homolog to SEQ ID
  • - pckA phosphoenolpyruvate carboxykinase, SEQ ID NO 43, 44
  • - trpE anthranilate synthase, SEQ ID NO 67, 68
  • - nasB electro transfer subunit of assimilatory nitrate reductase, SEQ ID NO 33
  • -nasC catalytic subunit of the assimilatory nitrate reductase, SEQ ID NO 35, 36
  • -ycdH unknown function - similar to the binding protein of the ABC transporter, SEQ ID NO 35, 36
  • SEQ ID NO 85, 86 gene encoding a putative protein (putative serine protease) (homologue to SEQ ID NO 9,
  • trpF phospho-tosyl-anthranilate isomerase
  • glnR transcriptional repressor of the glutamine synthetase gene, SEQ ID NO 11, 12
  • nrgB nitrogen-regulated Pll-like protein, SEQ ID NO 3, 4
  • Example 5 Further investigations (see Example 5) showed that the following gene is also suitable according to the invention as an indicator
  • tnrA (a global transcriptional regulator involved in nitrogen metabolism regulation, SEQ ID NO 99, 100)
  • a solution of the problem is thus in a nucleic acid-binding chip, doped with probes for at least three of the following genes kdgR, citA, for a putative protein (putative ABC transporter / amino acid permease) coding gene (homolog to SEQ ID NO 91), MrA, ycnI, gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homolog to SEQ ID NO 41), gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homolog to SEQ ID NO 53), yppF, yqjN, ggt, as R, glnA, nrgA, yciC, yvtA, nrgB, gene encoding a conserved hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 19), gene encoding a putative protein (ATP binding protein of a putative ABC transporter) (homologue
  • homologues it can be assumed that in species other than B. licheniformis the homologous genes are activated under nitrogen deficiency In a species of interest for one of these genes, there are several homologs capable of transcoding in vivo, the term "homologue to SEQ ID NO" refers to the closest of these various candidate genes
  • At least three of these genes are selected in order to obtain as reliable a statement as possible, that is, to exclude a single false-positive signal due to only one type of probe
  • a nucleic acid-comprising chip means all articles which are provided with nucleic acid-specific probes and in each case deliver an evaluable signal upon binding of one or more specifically recognized nucleic acids
  • RNA is isolated by methods known per se, for example cell disruption and use of a denaturing buffer. in particular mRNA isolated.
  • the strength of the hybridization signal over a certain range - optionally to be optimized in individual cases - is proportional to the number of specific mRNA present in the sample at the time of sampling in this way the strength of the signal provides a direct measure of the activity of the gene in question at the time of sampling
  • the time interval between sampling and measurement should be kept as short as possible, for example via a largely automated sampling, their processing and management via / through the sensor
  • probes are to be understood as meaning all molecules which are capable of reacting (binding) with nucleic acids.
  • binding binding
  • chip this interaction is exploited to provide a signal which can be assigned to a significant extent to obtain
  • a probe according to the invention is usually a compound capable of binding mRNA molecules or nucleic acids derived therefrom via hydrogen bonds, as for example also in the interaction of the two strands of a DNA or the DNA RNA
  • This may, for example, be a DNA which is more stable to hydrolysis than RNA
  • other molecules are known in the prior art, in particular chemically synthesized biomimetic allow the same interaction, but are more stable than DNA, for example, in that the phosphate ester bonds of the backbone have been exchanged for less hydrolysempfmdliche bonds
  • Such nucleic acid analog Preferred probes of the present application (see below)
  • the specific probes in question were to be synthesized according to the example of the sequence listing associated with this application. This is in contrast to the aspect that chips according to the invention should advantageously be usable several times, in particular during a single observed process, in the course of which constant monitoring is desirable
  • the degree of homology between the probe provided and the mRNA or the nucleic acid derived therefrom, which is to be recognized by hybridization, is ultimately limiting for the usefulness of a probe.
  • the degree of hybridization of the probe with the mRNA to be detected is decisive (see above).
  • sequences obtainable from ⁇ licheniformis are given in the Sequence Listing of the present application (SEQ ID NOs. 1 to 100), wherein the odd-numbered sequences are While the DNA sequences can be used directly for the production of probes (see above), the amino acid sequences serve, for example, via sequence data base sequences and DNA sequences which are each higher by a number higher sequences around the respectively derived amino acid sequences. Comparisons of gene function testing can also be used to generate similar nuclear acid-detecting probes through backward translation of the genetic code
  • Example 1 As shown in Example 1, numerous different gene transcripts, that is, mRNA molecules, in particular those of which participation in nitrogen metabolism was well known, were investigated. These mRNA molecules became a nitrogen deficient state at various times during the transition from B licheniformis DSM13 In Example 1 it is also described how the concentration increase of this mRNA in the cell interior of B licheniformis was determined experimentally. Alternative determination possibilities for this may be established in the prior art.
  • Table 1 (Example 2) is crucial to the understanding of the present invention shows the concentration changes associated with the transition for a total of 210 mRNAs. The following threshold values for the ratio of the amount of RNA of the respective gene to the control value were regarded as significant.
  • Example 3 there are 67 genes with at least ⁇ -fold induction at any of the observed time points under the conditions of the nitrogen deficiency described in Example 1. Of these, 18 may not be considered specific, so that, surprisingly, only those described in U.S. Pat These 49 genes are considered according to the invention as representative indicators of a nitrogen deficiency state Further information on these genes, for example on their function or deviating start codons are shown in Tables 2 and 3 and the sequence listing , the respective German-language names for the associated proteins have already been listed above, in the order of the statements in Table 3
  • the separately identified gene tnrA shows according to Example 5 30 min after the transition into the nitric acid-induced Staiffphase a more than 15-fold induction, so that this gene can be used to implement the teaching of the invention and is accordingly preferred
  • strain S licheniformis DSM 13 is available from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany (http://www.dsmz.de/) Generally available at the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.cc.org/), the accession number ATCC 14580
  • genes from other organisms corresponding to the abovementioned 50 genes are to a large extent likewise stored in generally accessible databases, for example for the well-characterized species B subtilis and E. coli, which are generally regarded as model organisms of gram-positive and / or gram-negative bacteria
  • B subtilis and E. coli which are generally regarded as model organisms of gram-positive and / or gram-negative bacteria
  • the databases of the Institut Pasteur, 25.28 rue du Do Budapest Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France which are available on the Internet at http // genolist pasteur fr / Colib ⁇ / (for E.
  • nuclease acid-binding chip In the production of a nuclease acid-binding chip according to the invention for an organism not mentioned here, the associated homologous genes must therefore be identified for at least some of the genes mentioned for B lichemformis, for example by comparing the DNA sequences known for the organism concerned with those indicated here Sequences These or parts thereof (see below) can then serve as probes or as templates for the synthesis of corresponding probes, which are applied to a nucleic acid-binding chip by methods known per se
  • An essential feature of the present invention is then that the total number of different nitrogen metabolism-specific different probes does not exceed 80. This feature correlates with the stated task, according to which it should focus on such nucleic acid-binding chips, their number of assignable bursts due to their Type is comparatively low These are in particular the electrically analyzable chips
  • nitrogen-specific-change-specific probes may be, for example, those that are induced by a nitrogen excess, possibly also others that are apparently not directly related to the nitrogen metabolism, but due to this inducibility can be defined as such
  • a chip also gives a evaluable and useful in the process considered information when the lack of nitrogen, for example, has been overcome by taking appropriate countermeasures
  • nucleic acid-specific probes are usually only fragments of the complete genes (see below). In individual cases, for example in the case of regulation via splicing or large, multi-functional polypeptides, it may therefore be useful to use one and the same gene with two or more Thus, corresponding embodiments may be characterized by more than 50 probes which, however, respond to no more than these 50 genes
  • probes for further genes or gene products can also be contained on chips according to the invention (see below).
  • the core of the invention lies precisely in the specificity of the particular chip with which a specific metabolic situation should be detected.
  • the chips can be used with numerous different probes or with a representative cross section of various potentially relevant situations, such as they are provided with the application WO 2004/027092 A2, a rough overview about the state of the organism in question while a chip according to the invention is consulted for control when there is a concern that the cells in question may enter a nitrogen deficiency state
  • nucleic acid-binding chip according to the invention, which is increasingly preferably doped with the probes specified above in the order given there
  • TnrA lies between trpC and trpB according to example 5 and is accordingly preferred
  • it is a nucleic acid-binding chip according to the invention, wherein at least one, more preferably two or three of the probes are selected from the following 34 genes / are genes coding for a conserved hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 19), for a putative protein (ATP B ⁇ ndungsprote ⁇ n a putative ABC transporter) encoding gene (homologue to SEQ ID NO 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, for a putative protein (putative hydrolase) encoding gene (homolog to SEQ ID NO 47), trpF, ydfS, trpD, gene coding for a putative protein (putative phage capsid protein) (homologue to SEQ ID NO 21), ycnK, trpB, trpC, for a putative protein (putative transcription protein).
  • a conserved hypothetical protein of unknown function
  • Regulator (homologue to SEQ ID NO 17), coding for a putative protein (putative sennprotease) encoding gene (homologue to SEQ ID NO 9), for a putative protein (putative glycosylhydrolase / lysozyme) of the gene (homolog to SEQ ID NO 85), for a putative protein (putative malate synthase, EC 4 1 3 2) coding gene (homolog to SEQ ID NO 45), for a putative protein (putative Na (+) - linked D- Alanine glycine permease) (homologue to SEQ ID NO 49), gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 95), nasD, for a putative protein (putative ammonium Transporter) (homologue to SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, for a hypothetical protein (close homolog to aldehyde dehydrogenase DhaS)
  • nucleic acid-binding chips wherein at least one, more preferably two or three of the probes are / are selected from the following 20 genes
  • UpC gene coding for a putative protein (putative transcriptional regulator) (homologue to SEQ ID NO 17), gene coding for a putative protein (homologous to SEQ ID NO 9), for a putative protein (putative glycosylhydrolase / Lysozyme) gene (homologue to SEQ ID NO 85), for a putative protein (putative malate synthase, EC 4 1 3 2) encoding gene (homologue to SEQ ID NO 45), for a putative protein (putative Na (+) - linked D-alanine glycine permease) (homologue to SEQ ID NO 49), gene encoding a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 95), nasD, gene coding for a putative protein (putative ammonium transporter) (homolog to SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, gene encoding a hypothetical protein (close homolog to aldehyde dehydrogena
  • nucleic acid-binding chips wherein at least one, more preferably two or three of the probes are selected from the following 12 genes / nasD, gene coding for a putative protein (putative ammonium transporter) (homologue to SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, gene encoding a hypothetical protein (close homolog to aldehyde dehydrogenase DhaS) (homologue to SEQ ID NO 15), nasB, trpE, pckA putative protein (putative nitrogen regulatory protein P-II) encoding gene (homologue to SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 81)
  • nucleic acid-binding chips wherein at least one, increasingly preferably two or three of the probes are selected from the following 4 genes / are genes coding for a putative protein (putative nitrogen regulatory protein P-II) (homolog to SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 81)
  • nucleic acid-binding chips according to the invention with at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 or 50 doped for the present invention, that is, in this sense called probes doped
  • the total number of all different probes is increasingly preferably not more than 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 or 10
  • the probes referred to as being relevant to the invention are those which respond to the relevant or most highly homologous, in vivo transcribable genes from the organism selected for the bioprocess, preferably those from the relevant or most highly homologous , In vivo transc ⁇ bierbaren genes are derived just this organism
  • the genes closely related in the organism in question are used to derive corresponding probes
  • the genes closely related in the organism in question are used to derive corresponding probes
  • the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, Gram-positive or Gram-negative bacteria
  • the unicellular eukaryotes are protozoa or fungi, including in particular yeast, very particularly Saccharomyces or Schizosaccharomyces
  • the object also includes chips according to the invention, which are directed to the monitoring of the course, in particular the growth of cell cultures of higher eukaryotes, such as rodents or humans They can be understood in some respects as at least largely single-celled eukaryotes, in particular in the Immunology have significant commercial importance, for example for the production of monoclonal antibodies
  • the gram-positive bacteria are Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B agaradherens, B stearothermophilus, B globign or lentus, and especially B licheniformis
  • the gram-negative bacteria are those of the genera E. coli or Klebsiella, in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and more particularly derivatives of the strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf)
  • nucleic acid-binding chips In preferred embodiments of nucleic acid-binding chips according to the invention, at least one, more preferably more, of the probes mentioned in connection with the invention described herein are / derived from the sequences which are listed in the Sequence Listing under the numbers SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 and 99 are listed
  • nucleic acid-binding chips are those which are additionally doped with at least one probe for an additional gene, in particular one which is in a metabolic-related relationship to the process-related additionally-expired gene (s) , especially for one of them or this one
  • the processes under observation serve a technical interest, often associated with other specific genes.
  • the gene for that protein and, in the case of a low molecular weight compound
  • other cell-specific genes such as metabolic genes, which must be increasingly formed during the production of the product, for example a cell-derived oxidoreductase, if this is to be produced
  • Product should be obtained from a reactant or an intermediate via oxidation or reduction
  • the gene additionally expanded by the process is that for a commercially useful protein, in particular an amylase, cellulase, lipase, oxidoreductase, a hemicellulase or protease, or one which has a synthesis route for a low molecular weight chemical compound or at least partially regulated
  • bioprocesses especially fermentations, in which the said proteins are produced.
  • bioprocesses especially fermentations, in which the said proteins are produced.
  • These are commercially particularly important enzymes which are used, for example, in the food industry or the detergent industry. In the latter case, in particular for the removal of Soils caused by amylases, cellulases, lipases, hemicellulases and / or proteases are hydrolyzable, for the treatment of the materials in question, in particular by cellulases or to provide an oxidative based on an oxidative enzymatic bleaching system
  • nucleic acid-binding chips according to the invention, one, preferably several, of the probes mentioned in connection with the invention described here is / are provided in single-stranded form in the form of the codogenic strand
  • This embodiment has the aim to improve the hybridization between the probe and the sample to be detected. This is especially true in the case where the content of the relevant mRNA is actually determined from the sample because it is single-stranded and in its sequence with the coding strand the DNA matches, should an optimal hybridization with the complementary, that is the codogenic strand done
  • nucleic acid-binding chips according to the invention, one, preferably several, of the probes called relevant to the invention in the form of a DNA or of a nucleic acid analog, preferably of a nucleic acid analog, is / are made available
  • nucleic acid-binding chips according to the invention comprise / comprise one, preferably several, of the probes called relevant to the invention Gene regions which are transcribed into mRNA by the organism to be examined, in particular the gene regions which are close to the 5 'end of the mRNA
  • the aspect is taken into account that in many cases the regulatory DNA segments are also assigned to a specific gene.
  • the chip according to the invention should be used to detect the mRNA actually present in the observed cells, so that for the purpose considered here the first
  • the coding region is interrupted by sections that are not translated into mRNA Probes containing introns, therefore, were not allowed or
  • hybridization is often not necessary for the detection of an mRNA over the entire length of time. Therefore, the specific probes generally only need to comprise a smaller of the gene transcribed into mRNA. A selection of a region close to the 5 'end is advantageous for this purpose the mRNA is located, as it is first transcribed into mRNA and thus is the first to be detected after activation of the gene. This precludes timely detection
  • one or more of the probes called relevant to the invention are / are responsive to fragments of the relevant nucleic acids, in particular to those which have a low degree of secondary folding in the relevant mRNA, based on the respective total mRNA
  • one, preferably several, of the probes called relevant to the invention has a length of increasingly preferably less than 200, 150, 125 or 100 nucleotides, preferably from 20 to 60 nucleotides, particularly preferably from 45 to 55 nucleotides on
  • the probes used for the detection reaction need only to include parts of the mRNA to be detected, if the signal available on them is still specific enough This specificity, the distinctness of different mRNA sets the lower limit for the length of the respective probes and must be experimentally if necessary in preliminary experiments be determined
  • an electrical signal is triggered by the binding of the mRNA to the probe in question as being relevant to the invention
  • the time from sampling to measuring the signal for optically analyzable chips is approximately 24 hours.
  • the time required is currently less than 2 hours (see Figure 1).
  • the number of simultaneously analyzable samples is electrical evaluable chips currently in the double-digit range, but a rapid development suggests that this magnitude can be exceeded in Briefly limiting the electronic evaluation units for the various signals
  • a method for mRNA quantification established in the prior art is, for example, the RT-PCT.
  • This is described in the article "Quantification of Bacte ⁇ al mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System "(2003) by S Tobisch, T Koburger, B Jürgen, S Leja, M Hecker and T Schweder in BIOCHEMICA, Volume 3, pages 5 to 8
  • the detection of electrical chips has another advantage, namely the higher reliability of the data, since these have significantly lower fluctuation ranges compared to RT-PCR
  • the mode of operation of electrically readable chips of a particularly preferred embodiment can be described as follows:
  • the gene-specific probes are covalently bound to magnetic carriers (beads) in known manner, which are located in chambers of the chips provided for this purpose.
  • the specific hybridization of the corresponding mRNA to the respective mRNA The beads are held in this chamber by a magnet.
  • a washing step is carried out to eliminate the non-beaded DNA probes. bound RNA, so that in the incubation only specific hybrids are still present, bound to the magnetic beads
  • a detection probe is introduced into the incubation chamber labeled with a biotin extravidin-linked alkaline phosphatase. This probe binds to a second free region of the hybridized mRNA. This hybrid is then washed again and with the alkaline phosphatase substrate para-aminophenol phosphate (pAPP) incubated The enzymatic reaction in the incubation chamber leads to the release of the redox-active product para-aminophenol (pAP) This is now passed over the Red / Ox electrode on the electrical chip and sent the signal to a potentiostat
  • System-specific software eg, MCDDE32
  • MCDDE32 reads the data obtained, and the results can be evaluated and displayed on another computer using another program (for example, Origin)
  • the detection reaction can also be carried out by another, but preferably a redox reaction because of the electrical measurement principle
  • a separate subject of the invention is thus the simultaneous use of nucleic acid or nucleic acid analog probes for at least three of the following genes kdgR, citA, for a putative protein (putative ABC transporter / amino acid permease) encoding gene (homolog to SEQ ID NO 91), htrA, ycnI, gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 41), gene coding for a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 53), yppF, yqjN, ggt, as R, glnA, nrgA, y ⁇ C, yvtA, nrgB, gene encoding a conserved hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO 19), gene coding for a putative protein (ATP digestion protein of a putative ABC transporter) (homologue to SEQ ID NO 55), ycnJ, glnR, yvIA
  • these genes are selected so as to give an idea of the situation of the nitrogen metabolism of the organism under consideration, because they are as described in Examples 1 to 3 and 5 in the transition of the gram-positive bacterium to the nitrogen-deficient state be induced significantly and comparatively specifically Statements are to be expected also for other organisms, which have the homologous genes or proteins with essentially the same metabolically relevant properties
  • nucleic acid or nucleic acid analogue probes are increasingly preferred - use, wherein at least one, more preferably two or three, of the nucleic acid or nucleic acid analogue probes for genes from the following 34 genes is / are specific for a conserved hypothetical protein of unknown function gene (homologue to SEQ ID NO 19), for a putative protein (ATP B ⁇ ndungsprote ⁇ n a putative ABC T ranspor- ters) coding gene (homologue to SEQ ID NO 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, for a putative protein (putative hydrolase) encoding gene (homologue to SEQ ID NO 47), trpF, ydfS, trpD, for a putative protein (putative phage capsid protein) encoding gene ( Homolog to SEQ ID NO 21), ycnK, t
  • ycdH for a hypothetical protein (close homolog to aldehyde dehydrogenase DhaS) encoding gene (homologue to SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, gene encoding a putative protein (putative nitrogen regulatory protein P-II) (homologue to SEQ ID NO: 93), nasF, yrkC, gene encoding a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO. 81), tnrA;
  • genes from the following 20 genes trpC, for a putative protein (putative transcriptional regulator) encoding gene (homologue to SEQ ID NO. 17), for a putative protein (putative serine protease) coding gene (homolog to SEQ ID NO 9), a gene coding for a putative protein (putative glycosyl hydrolase / lysozyme) (homologue to SEQ ID NO: 85), gene coding for a putative protein (putative malate synthase, EC 4.1.3.2) (homologue to SEQ ID NO ) gene encoding a putative protein (putative Na (+) - linked D-alanine-glycine permease) (homologue to SEQ ID NO: 49), gene encoding a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO: 95), nasD, gene encoding a putative protein (putative ammonium transporter) (homologue to SEQ
  • nasB for a putative protein n (putative nitrogen regulatory protein P-II) coding gene (homolog to SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, gene encoding a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO: 81), tnrA;
  • genes from the following 12 genes nasD, for a putative protein (putative ammonium transporter) coding gene (homologue to SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, for a hypothetical protein (close homolog to aldehyde DhaSha gene encoding gene (homologue to SEQ ID NO: 15), nasB, trpE, pckA, gene coding for a putative protein (putative nitrogen regulatory protein P-II) (homologue to SEQ ID NO: 93), nasF, yrkC, gene encoding a hypothetical protein of unknown function (homologue to SEQ ID NO: 81);
  • genes from the following 4 genes gene encoding a putative protein (putative nitrogen regulatory protein P-II) (homologue to SEQ ID NO: 93), nasF, yrkC, gene coding for a hypothetical protein of unknown function (Homologue to SEQ ID NO. 81).
  • they are preferably uses according to the invention of simultaneously at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40 , 45 or 50 of said probes.
  • they are preferably uses according to the invention, wherein the total number of all different probes is increasingly preferably not more than 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 or 10
  • probes are derived from the sequences which are listed in the sequence listing under the numbers SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 and 99 are listed
  • a separate subject of the invention are methods of determining the physiological state of an organism passing through a biological process by using a nucleic acid-binding chip according to the invention
  • nucleic acid-binding chips apply correspondingly to the method of determining the physiological state of an organism passing through a biological process
  • a change in the nitrogen metabolism of the organism passing through the biological process is determined, preferably a nitrogen deficiency state
  • the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, Gram-positive or Gram-negative bacteria
  • the unicellular eukaryotes are protozoa or fungi, including in particular yeast, especially Saccharomyces or Schizosaccharomyces
  • the gram-positive bacteria being Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B lichemformis, B amyloliquefaciens , B agaradherens, B stearothermophilus, B globign or Lentus, and especially B lichenemis
  • the Gram-negative bacteria being those of the genera E. coli or Klebsiella, in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and more particularly derivatives of strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf)
  • such methods according to the invention are preferred, using those of the named probes which are of the SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 given in the sequence listing.
  • such methods according to the invention are preferred, wherein the determination of the physiological state is carried out at different points in time of the same process, preferably using a plurality of identically constructed nucleic acid-binding chips, particularly preferably the same nucleic acid-binding chip
  • such processes according to the invention are furthermore preferred, the process being a fermentation, in particular the fermentative production of a commercially useful product, more preferably the production of a protein or a low-molecular chemical compound
  • the low-molecular chemical compound is a natural substance, a food supplement or a pharmaceutically relevant compound
  • the protein is an enzyme, in particular one of the group of ⁇ -amylases, proteases, cellulases, lipases, oxidoreductases, peroxidases, laccases, oxidases and hemicellulases
  • nucleic acid-binding chips according to the invention, as described in detail above, for determining the physiological state of an organism passing through a biological process
  • nucleic acid-binding chips apply correspondingly to the uses described herein for the determination of the physiological state of an organism passing through a biological process According to the above, such uses according to the invention are preferred, wherein a change in nitrogen metabolism of the organism passing through the biological process is determined, preferably a nitrogen deficiency state
  • the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, Gram-positive or Gram-negative bacteria
  • the unicellular eukaryotes being protozoa or fungi, in particular yeast, especially Saccharomyces or Schizosaccharomyces
  • the Gram-positive bacteria being Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B agaradherens, B stearothermophilus, B globign or B lentus, and especially B licheniformis
  • the Gram-positive bacteria being Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B agaradherens, B stearothermophilus, B globign or B lentus, and especially B licheniformis
  • the Gram-negative bacteria being those of the genera E. coli or Klebsiella, in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and more particularly derivatives strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf)
  • the process being a fermentation, in particular the fermentative production of a commercially useful product, more preferably the production of a protein or a low-molecular chemical compound
  • the low-molecular chemical compound is a natural substance, a food supplement or a pharmaceutically relevant compound
  • the protein is an enzyme, in particular one from the group of ⁇ -amylases, proteases, cellulases, lipases, oxidoreductases, peroxidases, laccases, oxidases and hemicellulases
  • the cell disruption was carried out with the "Hybaid RiboLyser TM Cell Disruptor” (Fa Thermo Electron Corporation, Dreieich, Germany) This method is based on the mechanical destruction of the cell wall and the cell membrane with the help of 0.1 mm small glass beads (Sartonus BBI, Melsungen , Germany)
  • the cells to be disrupted which had previously been resuspended in lysis buffer II (3 mM EDTA, 200 mM NaCl), together with the glass beads, were placed in a glass
  • acidic phenol was added to avoid degradation of the RNA by RNases. This tube was then clamped into the ribo-lyser, whereby under heavy debris, the glass beads collided with the cells, causing cell disruption
  • RNA-containing aqueous phase is separated by centrifugation from the protein and cell fragments, the chromosomal DNA and the glass beads, and from this the RNA is purified using the instrument KmgFisher ml_ (Thermo Electron Corporation, Dreieich, Germany) using the MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Fa Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) isolated This purification is based on the binding of RNA to magnetic glass particles in the presence of chaotropic salts, which also cause the inactivation of RNases.
  • the magnetic particles serve as transport of RNA between different reaction vessels filled with binding, washing and elution buffers
  • the used KmgFisher mL is a type of pipetting robot that uses magnets to transport the particles with the bound RNA between the vessels and also uses them for mixing the samples
  • the RNA is separated from the magnetic Particles dissolved and is purified
  • RNA 6000 Nano Kit from Agilent
  • ⁇ bosomal RNA (16 S and 23 S rRNA) is detected. These sites appear as clear bands It can be assumed that the RNA was not degraded in the course of processing and is therefore intact and can be introduced into the subsequent investigations. In addition, the exact concentration is also determined
  • the transcriptome analyzes were carried out using genomic slicheniformis DSM13 DNA microarrays, which had been prepared in a conventional manner (for example according to WO 95/11995 A1) and can be evaluated by an optical system. On these DNA microarrays, almost every gene was from B licheniformis in duplicate, so that two samples could be analyzed in parallel on the same chip and the values obtained could be averaged
  • the principle of the measurement carried out is that the respective mRNA molecules are transcribed from the sample removed in vitro via reverse transcription into DNA, wherein one of the added deoxynucleotides carries a color marker.
  • DUTP was chosen for this labeling, which was labeled with the fluorescent dye cyanine 3 or with cyanine 5.
  • the fluorescent dye cyanine 3 Fa Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany
  • 25 ⁇ g total RNA of the respective stress test transient phase, 30, 60, 90 and 120 mm
  • the fluorescent dye cyanine 5 GE Healthcare, Freiburg, Germany
  • the DSMIS DNA microarray was performed for at least 16 hours at 42 ° C
  • the optical readout of the arrays was performed using the ScanArray® Express Laser Scanner (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Jugesheim, Germany). All hybridizations were repeated using the samples with the other dye The quantitative evaluation of the arrays was performed using the ScanArray® Express software (available from PerkinElmer Life and Analytical Sciences Rodgau-Jugesheim, Germany) according to the manufacturer's instructions and under standard parameters
  • the arrays were normalized and evaluated With the help of this "score card", which serves to control the efficiency and quality of the hybridization, were according to the manufacturer's information known control DNA and so-called spikes in the form of oligos were applied to the array and hybridized with complementary sequences in the hybridization Thus, one could control the success of hybridization and incorporation of the dyes after scanning
  • the controls should be present in both samples in the same amount and thus after appear yellow or have a ratio between both channels of 1, respectively.
  • the spikes are specific to the respective sample and are applied in different dilutions, ie they appear red or green after scanning for the respective sample
  • mean values from the two hybridizations and the respective standard deviations were calculated.
  • the following threshold values for the ratio of the amount of RNA of the respective gene to the control value are considered:
  • the genes whose RNA has a ratio of> 3 (ie at least one tripling) are considered as induced; clearly repressed are genes with an RNA ratio ⁇ 0.3 (that is, a lowering to less than 30%).
  • Table 1 below lists all the 210 genes of Bacillus licheniformis DSM13 determined in Example 1 whose induction (amounting to at least the factor 3) was observed under the conditions of the nitrogen deficiency described in Example 1.
  • the respective name of the derived protein or (if available) its abbreviation are given; the "BLi number” corresponds to the "locusjag" of entry AE017333 (bases 1 to 4,222,645) in the GenBank database (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http: // /www.ncbi.nlm.nih.gov, as of December 2, 2004) of the entire genome of ß. licheniformis; This is followed by the factors observed at the times indicated above for increasing the concentration of the respectively associated mRNAs.
  • Example 1 The determined in Example 1 210 genes of Bacillus licheniformis DSM13, whose (at least the factor of 3 amounts) induction was observed under nitrogen deficiency (for explanations: see text).
  • Example 1 Under the conditions of the nitrogen deficiency described in Example 1 at any of the measured times, a total of 67 of the Bacillus licheniformis DSM 13 genes examined in Example 1 were induced by at least a factor of 8 have been induced to lack at least one other compound (data not shown) and therefore can not be considered as specific signals for nitrogen deficiency
  • Table 3 The 49 genes of Bacillus licheniformis DSM13 determined in Example 1 whose nitrogen-induced induction at any of the measured times was at least 8 times, in descending order of the maximum value measured in each case (last column).
  • Example 1 and Example 2 For this purpose, dilutions of known concentrations of / n-wfro transc ⁇ ten the mRNA determined in Example 1 and Example 2 were measured using the LightCycler and then using the device-specific software created the standard curve For this purpose, had to be selected in advance for each mRNA to be examined specific primer (with the help of the software "Array Designer", available from PREMIER Biosoft International, Paolo Alto, USA), which enable synthesis of / n-prtro transcripts and PCR amplification in the LightCycler.
  • Array Designer available from PREMIER Biosoft International, Paolo Alto, USA
  • the measurement started in the LightCycler.
  • two different dilutions were used for each sample to be analyzed.
  • the specific transcript was then amplified with the respective primers and the incorporation of the dye was measured.
  • TnrA is that shown in SEQ ID NO. 99 shown gene for a global, on the nitrogen metabolism regulation involved transcriptional regulator (indication in the sequence protocol: tnrA - transcriptional pleiotropic regulator involved in global nitrogen regulation - BLi 01490).
  • This 333 bp gene is from ß. licheniformis DSM 13 and recorded in the above database under number BLi 01490.
  • the deduced amino acid sequence is shown under SEQ ID NO. 100 indicated.
  • the gene-specific primers were derived using the Array Designer 2.0 program (PREMIER Biosoft International, Paolo Alto, USA) and purchased from Invitrogen (Karlsruhe, Germany).
  • Array Designer 2.0 program PREMIER Biosoft International, Paolo Alto, USA
  • Invitrogen Karlsruhe, Germany
  • an external standard curve was generated by means of an / n-weekly transcript.
  • the generation of the / nw ' fro transcript was carried out using a T7 polymerase, the gene-specific PCR product and the "DIG RNA Labeling" kit (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) / ⁇ -wfro transcripts were determined photometrically.
  • a dilution series (1 ng to 100 fg final concentration) of the / nw ' fro transcript was prepared and with MS2 RNA (final concentration 0.5 ⁇ g / ⁇ l; Roche Diagnostics) the forward and reverse primers and the LightCycler RNA master -SYBR Green 1 kit (Roche Diagnostics) as master mix, according to manufacturer's instructions, mixed.
  • the standard curve for the specific gene was generated using the manufacturer's protocol for the RNA master SYBRGreen I kit (Amplification, Segment 2, Temperature: 57 ° C; Amplification, segment 3, incubation time: 16 s).
  • the result of the LightCycler run was evaluated using the LightCycler software and the second-derivative-maximum method, and the quality of the RT-PCR products was checked by melting point determination.
  • RNA samples For the measurements of the RNA samples, dilution levels of 500 ng to 5 ng of the total RNA were prepared and with MS2-RNA (final concentration 0.5 ⁇ g / ⁇ l), the specific primer pairs and the LightCycler-RNA-Master-SYBR-Green I -Kit mixed. For the real-time RT-PCR run with the LightCycler device, the same conditions were used as those used to create the standard curve.
  • the negative control was RNase-free water with MS2 RNA at a final concentration of 0.5 ⁇ g / ⁇ l. A selected dilution of a sample from the standard curve was carried during each LightCycler run.
  • the evaluation of the LightCycler measurements was carried out with the LightCycler-specific software. Using the standard curve and the second-derivative-maximum method, it was possible to determine the molecular amounts of the specific RNA in the sample measured.
  • Table 4 Real-time RT-PCR quantification of the genes glnA, nrgB and tnrA with the entry of a nitrogen deficiency and the associated transition into the stationary phase
  • Figure 1 Schematic representation of / W - // ⁇ e monitoring a bioprocess with electrical DNA chips according to the invention
  • nucleic acids for example DNA
  • nucleic acid analogs for example, compounds which are difficult to hydrolyze, analogously constructed

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion von Stickstoffmangelzuständen. Sie tragen Sonden für mindestens drei der folgenden 50 Gene: kdgR, citA, htrA, ycnl, yppF, trpB, ggt, alsR, glnA, nrgA, yciC, yvtA, nrgB, ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, trpF, ydfS, trpD, ycnK, trpB, trpC, nasD, ycdH, nasC, nasB, trpE, pckA, nasF, yrkC und tnrA oder Homologen zu SEQ ID NO. 91 , 41 , 53, 19, 55, 47, 21 , 17, 9, 85, 45, 49, 95, 63, 15, 93 oder 81 bei maximal 80 für den Stickstoff-Stoffwechsel spezifischen unterschiedlichen Sonden. Ferner betrifft diese Anmeldung die Verwendung entsprechender Gensonden, insbesondere auf solchen Chips, beziehungsweise entsprechende Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten.

Description

Nukleinsäure-bindende Chips zur Detektion von Stickstoffmangelzuständen im Rahmen der
Bioprozeßkontrolle
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion von Stickstoffmangelzuständen sowie die Verwendung entsprechender Gensonden, insbesondere auf solchen Chips, beziehungsweise Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten, die auf derartigen Sonden und Chips beruhen
Bei der technischen Nutzung biologischer Prozesse stellt sich das sehr grundlegende Problem, deren Verlauf zu überwachen, um zum gewünschten Ergebnis zu gelangen, um Ressourcen zu schonen und/oder um in einer gegebenen Zeit ein optimales Ergebnis zu erzielen Unter biologischen Prozessen sind beispielsweise die Kultur von Mikroorganismen auf einer Agarplatte oder in Schuttelkultur zu verstehen, insbesondere aber deren Fermentation, beziehungsweise die Gewinnung von Rohstoffen über die Fermentation von Mikroorganismen Hierzu gibt es einen reichhaltigen Stand der Technik, sowohl was einzellige Eukaryonten wie Hefen oder Streptomyceten, als auch was gramnegative oder grampositive Bakterien angeht
Die Überwachung derartiger Prozesse (Monitoring) geschieht einerseits durch die Beobachtung der sich im Laufe des Prozesses wandelnden Eigenschaften und Anforderungen der betrachteten Organismen, was sich beispielsweise in der optischen Dichte und Viskosität des Mediums, in aufgenommenen oder abgegebenen Gasen, in Änderungen des pH-Werts oder sich wandelnden Nahrstoffbedurfnissen niederschlagt Hierzu kann man auch die Messung enzymatischer Aktivitäten über geeignete Assays rechnen, beispielsweise den Nachweis interessierender Aktivitäten im Kulturuberstand
Andererseits sind in den letzten Jahren verschiedene Techniken entwickelt worden, um die Stoffwechselprozesse der betreffenden Organismen auf der Ebene der Genexpression zu verfolgen Eine gangige Methode hierfür ist die Verwendung von Genen für leicht nachzuweisende Proteine als Indikatoren für die Aktivität der Promotoren für die eigentlich interessierenden Gene (Promotor-Analyse, Genexpressions-Analyse) Hierfür sind auch entsprechende Apparaturen (sogenannte (Bιo-)Sensoren) entwickelt worden
Andere Techniken befassen sich mit dem Nachweis der interessierenden Proteine beziehungsweise der für diese Proteine codierenden mRNA Hierzu gehören (1 ) die Proteom-Analyse, das heißt die Betrachtung der Veränderung der Ausstattung der betreffenden Zellen mit Proteinen, welche zumeist über 2-dιmensιonale Gelelektrophorese der Zellysate erfolgt, (2 ) die Analyse der gebildeten mRNA (Transkπptom) über ein in analoger Weise erstelltes „genomisches DNA-Array" und (3 ) die Chip-Technologie Letztere befindet sich in einem vergleichsweise frühen Entwicklungsstadium Während die beiden zuerst genannten Methoden letztlich auf quantitativen Isolierungen und zeitaufwendigen Analysen der betreffenden Makromoleküle beruhen, hegt der Chip-Technologie das Prinzip zugrunde, auf physikalisch auslesbaren Trägern (Chips) Sonden für Proteine oder für Nukleinsäuren anzubringen, die unmittelbar auf das Vorhandensein der betreffenden Proteine, beziehungsweise Nukleinsäuren ansprechen Gegenüber den beiden zuerst genannten Technologien verspricht man sich von derartigen Chips eine zum betrachteten Prozeß zeitnahe Analyse (/W-//ne-Analyse) Em weiterer Vorteil ist der Bedarf an vergleichsweise kleinen Probenmengen
Das Prinzip von Chip-basierten Messungen wird beispielsweise in dem Artikel „Real-time electrochemical monitoπng toward green analytical chemistry" von J Wang (Acc Chem Res , ISSN 0001-4842, Rec Sept 12, 2001 , Seiten A - F) schematisch in Figur 2 vorgestellt Demnach wird die zu analysierende Probe mit einer Erkennungsschicht (biorecognition layer) in Kontakt gebracht, bei der es sich beispielsweise um Enzym, Antikörper, Rezeptor oder DNA handeln kann, das hierüber empfangene Signal wird über einen Umwandler (Transducer), beispielsweise eine amperometrische oder potentiometπsche Elektrode, über einen Verstarker (amplification/processing) als elektrische Spannung oder als elektrisches Potential ausgegeben In der betreffenden Arbeit werden auch optische Systeme angesprochen, denen gegenüber die elektronisch auswertbaren Systeme hinsichtlich der Miniatuπsierbarkeit und anderer Vorteile dem Autor gunstiger erschienen
Aufgrund der vorliegenden Erfindung können die Protein-spezifischen Chips außer Betracht bleiben mRNA erkennende Chips sind in der Regel mit komplementären DNA-Molekulen oder DNA-Analoga dotiert Deren Herstellung und Nutzung zu sehr detaillierten Fragestellungen wie beispielsweise der Differenzierung von Punktmutationen wird beispielsweise in der Anmeldung WO 95/11995 A1 beschrieben Unter den DNA-Chip-Analysen gibt es solche mit einer PCR-Ampli- fikation der Zielsequenz und solche ohne Amplifikation Ferner gibt es solche mit optischer Auswertung der auf die Erkennung zurückzuführenden Signale und solche mit elektrischer Auswertung
Die optischen Detektionsmethoden erfordern zum Teil einen Verstarkungsmechanismus der Signale Hierfür werden zum Beispiel Fluorophore, Acπdiniumester oder eine indirekte Detektion über sekundäre Bindungsvorgänge, zum Beispiel über Biotin, Avidin/Streptavidin oder Digoxigenin beschrieben Im letzteren Falle werden zum optischen Nachweis Digoxigenin-spezifische Antikörper eingesetzt, die mit einem Enzym markiert werden Dabei wird die Enzymaktivität entweder koloπmetrisch oder über Lumineszenz nachgewiesen Nach Westin et ai (2000), Nature Biotechnol , Band 18, S 199-204, kann die Hybridisierung mit einer PCR auf dem DNA-Chip gekoppelt werden, um so die gesamte Nachweisreaktion auf einem Chip durchfuhren zu können („Lab-on-a-Chιp-Konzept")
Weitere Arbeiten beschreiben die Entwicklung von DNA-Chips, die das Prinzip der Kapillarelektrophorese zur DNA-Sequenzierung, beziehungsweise Trennung miniaturisieren (Woolley und Mathies (1994), Proc Natl Acad Sei , Band 91 , S 11348-11352, Liu et al (2000), Proc Natl Acad Sei , Band 97, S 5369-5374)
Elektrisch auslesbare DNA-Chips sind in einigen Publikationen prinzipiell bereits vorgestellt worden (Hoheisel (1999), DECHEMA Jahresbericht 1999 , S 8-11 , Hintsche et al (1997), EXS, Band 80, S 267-283) Wπght et al (2000, Anal Biochem , Band 282, S 70-79) nutzten einen „lon-Channel- Sensor" (ICS) zur DNA-Detektion, wie er erstmalig von Cornell et al (1997, Nature, Band 387, S 580-583) beschrieben wurde Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Leitfähigkeit molekularer lonenkanale durch eine Bindungsreaktion detektiert wird Im wesentlichen stellt der Sensor ein Impedanz-Element dar Cheng et al (1998, Nat Biotech nol , Band 16, S 541-546) zufolge können elektrische Impulse zu einer Verstärkung der Hybπdisierungsreaktion auf optischen DNA-Chips genutzt werden Fπtsche et al (2002, Laborwelt II) schlugen ein elektrisches Chip- System vor, das mit metallischen Nanopartikeln arbeitet, die zum Beispiel an Oligonukleotide gebunden sind Bei diesem System wird durch eine sogenannte „metallische Verstärkung" wahrend der Hybπdisierungsreaktion ein Abfall des elektrischen Widerstandes an der Elektrode ausgelöst, der dann als Signal meßbar ist
Ein weiterer Ansatz basiert auf einem elektrischen Detektionspnnzip, in dem DNA-Sonden verwendet werden, die durch die Markierung mit einem geeigneten Enzym (zum Beispiel alkalische Phosphatase) nach der Hybπdisierung zu einem elektrisch aktiven Substrat fuhren, das dann durch eine Redox-Reaktion an der Elektrode detektierbar ist (Hintsche et al (1997), EXS, Band 80, S 267-283)
Wenn man sich hinsichtlich des prinzipiellen Aufbaus und des Auswertungssystems für einen bestimmten Nukleinsaure-erkennenden Chip-Typus entschieden hat, stellt sich das konkretere Problem, welche Genaktivitaten beobachtet werden sollen Dabei ist zu bedenken, daß in der Zahl der mit einem Nukleιnsaure-Chιp-Typ gleichzeitig analysierbaren Gene technisch bedingte Grenzen bestehen So sind optisch auslesbare Chips, was die Zahl der Sonden, die auf dem Chip aufgebracht werden können, den elektrisch auswertbaren derzeit überlegen Deren Grenzen werden durch die Miniatunsierbarkeit der elektronischen Meßeinheiten gesetzt
Es stellt sich somit das biologische Problem, welche Auswahl von Genaktivitäten den betrachteten Prozeß in geeigneter Weise abbilden Hierzu gehört auch die Überwachung der Produktbildung, wenn es sich beispielsweise um eine fermentative Produktherstellung handelt Gleichzeitig können auch Kontrollgene eingeschlossen werden, die anzeigen, wenn der Prozeß sich in eine Richtung entwickelt, die nicht beabsichtigt ist Im Zuge dieses Monitoring sollte aus Praktikabihtätsgrunden eine nicht zu hohe Zahl an verschiedenen Genen beobachtet werden
Von besonderem technischen Interesse sind biotechnologische Prozesse mit grampositiven Bakterien Denn diese werden besonders aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion zur industriellen Herstellung von Wertstoffen eingesetzt Hierunter haben solche der Gattung Bacillus und hierunter wiederum die Spezies S subtihs, B amyloliquefaciens, B agaradherens, B licheniformis, B lentus und B globign derzeit die wirtschaftlich größte Bedeutung
Mit der simultanen Beobachtung der Aktivität mehrerer Gene in Bakterien (multiparametπsche Erfassung) befassen sich beispielsweise die im folgenden vorgestellten Arbeiten In dem Artikel „Monitoring of genes that respond to process-related stress in large-scale bioprocesses" von Schweder et al (1999), Biotech Bioeng , Band 65, S 151-159, wird die Veränderung der mRNA- Spiegel verschiedener durch Streß-Faktoren induzierbarer Gene, namhch clpB, dnaK (induziert bei Hitzeschock), uspA (Glucose-Mangel), proU (osmotischer Streß), pfl und frd (O2-Mangel) und ackA (Glucose-Uberschuß) im Verlauf einer Fermentation von E coli und in der nachfolgenden Konzentπerungsphase beschrieben Sie wurden über eine PCR-basierte, auf herkömmliche Weise durchgeführte Methode erfaßt Hierbei wurden unterschiedliche Expressionsraten bereits an verschiedenen Stellen des Reaktors und sekundenschnelle Reaktionen auf veränderte Bedingungen festgestellt
Eine weitere Fermentation von E coli wird in der Arbeit „Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations" von Jürgen et al (2000), Biotech Bioeng , Band 70, S 217-224, beschrieben Hierin wird die Expression der Gene Ion, dnaK, ibpB, htrA, ppiB, groEL, tig, s6, 19 und dps, teilweise auf mRNA-, teilweise auf Proteinebene, teilweise auf beiden Ebenen betrachtet Dabei erfolgte die Untersuchung über 2D-PAGE, beziehungsweise die DNA-Array-Technik Angesichts der Ergebnisse wird vorgeschlagen, rekombinante Bioprozesse wie die heterologe Protein-Herstellung über (unmittelbar) Prozeß-relevante Proteine und Reporter-Gene wie ibpB zu verfolgen
Mit einer weiteren Beobachtung des Fermentationsverlaufs bei Expression eines rekombmanten Proteins durch E coli befaßt sich die Arbeit „Genomic analysis of high-cell-density recombinant Escherichia coli fermentation and "cell conditioning" for improved recombinant protein yield" von R T GiII et al (2001 , Biotech Bioeng , Band 72, S 85-95) Hierin wird beschrieben, daß die Streß- Gene degP, uvrB, alpA, mltB, recA, ftsH, ibpA, aceA und groEL unter den genannten Bedingungen bei hoher Zelldichte gegenüber niedriger Zelldichte verstärkt expπmiert werden Der Stärke der Reaktion nach gruppierten sie sich untereinander zu gewissen Clustern Dies wurde über einen auf RT-PCR und DNA-Microarray beruhenden und durch Dot-blot-Analyse ergänzten Ansatz ermittelt, der auf Proben von zwei Zeitpunkten der Fermentation angewendet wurde, eben zu Beginn bei niedriger Zelldichte und gegen Ende bei hoher Zelldichte Hieraus wurden „Cell Conditioning"- Ansatze entwickelt, um die Streß-Antwort der Zellen herabzusetzen
Grundsätzliche Unterschiede in den Expressionsmustern grampositiver Organismen gegenüber denen von gramnegativen Bakterien werden mit der Arbeit „Proteome and transcnptome based analysis of Bacillus subtilis cells overproducing an insoluble heterologous protein" von Jürgen et al (2001), Appl Microbiol Biotechnol , Band 55, S 326-332 aufgedeckt Darin wird die Expression unter anderem der Gene dnaK, groEL, grpE, cIpP, clpC, clpX, rpsB und rplJ in B subtilis beschrieben, wie sie über die DNA-macro-array-Technik, beziehungsweise über zweidimensionale PoIy- acrylgelelektrophorese ermittelt werden können Hiernach werden in grampositiven zur Uberex- pression eingesetzten Bakterien die Gene für die Purin- und die Pyπmidin-Synthese sowie die bestimmter nbosomaler Proteine starker expπmiert, als aufgrund der Erkenntnisse an gramnegativen Bakterien zu erwarten war Ein weiterer Unterschied betrifft die Proteasen Lon und CIp
Einzelne dieser Gene oder sogar Nukleinsaure-bindende Chips mit einzelnen dieser Gene werden inzwischen in mehreren Publikationen offenbart oder zumindest die Möglichkeit ihrer Herstellung aufgezeigt So offenbaren beispielsweise die beiden Patentanmeldungen DE 10136987 A1 und DE 10108841 A1 jeweils ein Gen aus Corynebacteπum glutamicum, nämlich clpC beziehungsweise citB Beide Gene werden als relevant für den Aminosäure-Stoffwechsel beschrieben, weshalb eine kommerziell interessante Nutzung dieser Gene darin bestehen soll, sie zu inaktivieren oder zumindest abzuschwächen, um die fermentative Herstellung von Aminosäuren durch diesen Mikroorganismus zu optimieren Weitere Anwendungsmoghchkeiten können nach diesen Anmeldungen dann bestehen, Sonden für die betreffenden Gen-Produkte auf Nukleinsäure- bindenden Chips vorzulegen
Auf der anderen Seite werden zunehmend mehr Genomdaten verschiedener Organismen publiziert, die eine solche Fülle von Sequenzdaten enthalten, daß hieraus eine repräsentative Auswahl wünschenswert erscheint So offenbart die Patentanmeldung WO 02/055655 A2 mehr als 1 800 DNA-Sequenzen, die durch die vollständige Sequenzierung des Genoms des Mikroorganismus Methylococcus capsulatus ermittelt worden sind
Inzwischen ist beispielsweise auch das komplette Genom des grampositiven Bacillus lichemformis sequenziert worden Es wird in der Publikation „The Complete Genome Sequence of Bacillus lichemformis DSM 13, an Organism with Great Industπal Potential" (2004) von B Veith et al in J Mol Microbiol Biotechnol , Band 7 (4), Seiten 204 bis 211 , beschrieben und ist zusätzlich unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4 222 645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, http //www ncbi nlm nih gov, Stand 2 12 2004) zugänglich
Unter Verwendung der Technik optisch auswertbarer Chips ist es inzwischen sogar möglich, Nukleinsaure-bindende Chips herzustellen, die ein nahezu vollständiges Genom beziehungsweise das zugehörige Transkπptom abdecken (genomische DNA-Chips)
Mit der Anmeldung WO 2004/027092 A2 wird ein repräsentativer Querschnitt mit einer überschaubaren Anzahl von Genen zur Verfugung gestellt, um verschiedene physiologische Zustände, die ein beobachteter Mikroorganismus im Laufe der Kultivierung durchlaufen kann, zu identifizieren Hierzu gehorten beispielsweise Hungerzustande gegenüber verschiedenen Nährstoffen oder Streßsituationen wie beispielsweise Hitze- oder Kalteschock, Scherstreß, oxidativer Streß oder Sauerstofflimitierung Es handelt sich dabei um die folgenden Gene acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, cIpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF Aus dieser Anmeldung gehen auch die zugehörigen DNA-Sequenzen aus ß subtihs, E coli und/oder B licheniformis hervor Dadurch ist es möglich geworden, auch entsprechende Nukleinsaure- bindende Chips herzustellen, die bei der Überwachung eines auf Mikroorganismen, insbesondere grampositiven oder gramnegativen Bakterien beruhenden Bioprozesses Änderungen der diesen Prozeß kennzeichnenden Stoffwechselaktivitaten anzeigen
Nukleinsaure-bindende Chips, die auf dieser Auswahl von Genen beruhen, liefern einen gewissen, insgesamt aber eher nur groben Überblick über die jeweilige Stoffwechselsituation Sie vermögen in der Regel nicht, ein einzelnes Teilproblem besonders zu beleuchten, allerdings kann sich ein einzelnes positives Signal aus verschiedenen Situationen heraus ergeben oder auch nur falschpositiv sein, weshalb es oft - und insbesondere in einer solchen unklaren Situation - sinnvoll ist, einen ausgewählten Stoffwechselaspekt separat zu analysieren Andererseits ist gerade bei elektrisch auslesbaren Nukleinsaure-bindenden Chips, welche den Vorteil einer zeitnahen Analyse besitzen, die Zahl der gleichzeitig belegbaren Platze begrenzt, so daß zur Erfassung zusätzlicher, spezieller Stoffwechselsituationen nicht einfach zusätzliche Gensonden aufgebracht werden können
Aus den nicht vorveröffentlichten Anmeldungen DE 102004061664 7 und DE 102005022145 9 gehen Nukleinsaure-bindende Chips zur Überwachung von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion von Phosphatmangelzuständen beziehungsweise Glucosemangelzuständen hervor Sie tragen jeweils eine begrenzte Anzahl von Sonden, um diese speziellen Streßsituationen anzuzeigen Eine Stoffwechselsituation, die für Mikroorganismen kritisch und somit für einen entsprechenden Bioprozeß limitierend sein kann, ist die des Stickstoffmangels Denn Stickstoff ist ein wesentliches Element für Nukleinsäuren und für Aminosäuren und damit für Proteine, welche ihrerseits die Hauptfunktionsträger und Baustoffe biologischer Organismen darstellen Stickstoffmangel steht also für eine mangelhafte Baustoffversorgung und kann rasch zum Absterben der Zellen fuhren oder zumindest das Erreichen höherer Zelldichten verhindern Insbesondere bei der fermentativen Herstellung von Proteinen, wie beispielsweise technischen Enzymen, wirkt sich ein Stickstoffmangel auch auf die Produktbildungsrate aus Somit besteht ein besonderer Bedarf, diesbezüglich eine Chip-basierte, zeitnahe Analyse durchzufuhren und aufgrund des hierdurch rasch zu erhaltenden Ergebnisses punktuell und damit noch zielgerichteter in den laufenden Bioprozeß eingreifen zu können Dadurch wird einem Verlust an Ausbeute vorgesorgt, der sich durch einen nicht oder zu spat erkannten Stickstoff-Engpaß ergeben wurde
Es stellte sich somit die Aufgabe, Gene zu identifizieren, die bei Organismen, insbesondere Mikroorganismen möglichst eindeutig mit dem Streß-Signal des Stickstoffmangels in Verbindung gebracht werden können Ziel war es, Sonden für diese Gene zu entwickeln, um sie für die Überwachung entsprechender Bioprozesse einsetzen zu können
Damit sollte es möglich sein, Nukleinsaure-bmdende Chips mit Gensonden für einzelne oder mehrere dieser Gene zu belegen und hierdurch zu Nukleinsaure-bindenden Chips zu gelangen, die im Verlaufe eines überwachten Bioprozesses zuverlässig das Signal „Stickstoffmangel" anzeigen (Stickstoffmangel-Sensoren) Diese Aufgabe stellte sich insbesondere für solche Nukleinsaure- bindenden Chips, deren Anzahl an belegbaren Plätzen aufgrund ihrer Bauart vergleichsweise gering ist, insbesondere die elektrisch auswertbaren Denn diese weisen andererseits die Vorteile einer raschen Auslesbarkeit auf und ermöglichen damit eine /Af-//ne-Analyse Dies gewahrleistet ein gegebenenfalls frühzeitiges Eingreifen, um den betreffenden Bioprozeß hinsichtlich der Baustoffversorgung zu optimieren
Solch ein DNA-bindender Chip sollte für mehrere miteinander vergleichbare Prozesse einsetzbar und mit vergleichsweise geringfügigen Variationen an spezifische Einsatzmoglichkeiten anzupassen sein Vorzugsweise sollte er auf Bioprozesse auf der Grundlage von Sac///us-Spezιes, insbesondere ß subtilis, B amyloliquefaciens, B lentus, B globign, und ganz besonders auf ß licheniformis ausgerichtet sein Unter Bioprozessen standen Fermentationen, insbesondere die technische Herstellung von Produkten, ganz besonders von uberexprimierten Proteinen im Vordergrund Ferner sollte solch ein Stickstoffmangel-Sensor entsprechende Verfahren zur Messung des physiologischen Zustands der betrachteten Zellen sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten zur Überwachung der betrachteten biologischen Prozesse ermöglichen
Zur Losung dieser Aufgabe wurde eine Vielzahl von Genen aus dem biotechnologisch wichtigen Bakterium B lichemformis hinsichtlich ihrer Aktivierbarkeit durch den Übergang der betreffenden Kultur in einen Stickstoffmangelzustand untersucht (Beispiel 1) Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, daß bei weitem nicht alle Gene, die am Stickstoffstoffwechsel beteiligt sind, ein diesbezüglich eindeutiges Signal liefern Zusatzlich wurde - ebenso überraschend - eine Aktivierung von solchen Genen beobachtet, die zuvor nicht ohne weiteres mit dem Stickstoffstoffwechsel in Verbindung gebracht worden sind, beispielsweise das Gen für eine putative Malatsynthase, oder solche, die für Proteine mit noch unbekannter Funktion codieren Ferner waren davon diejenigen Gene abzuziehen, die eindeutig auf mehr als nur dieses eine Streß-Signal ansprechen Die auf diese Weise identifizierten Gene sollen nun, gegebenenfalls unabhängig von ihrer bislang bekannten Funktion, erfindungsgemaß als Stickstoffstoffwechselgene angesehen werden Dies belegt Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung Dabei wurden sehr unterschiedlich starke Induktionen beobachtet Der Lehre der vorliegenden Erfindung zufolge sollen Gene umso mehr als Indikatoren geeignet sein, je starker diese Antwort ausfallt Erfindungsgemaß werden deshalb solche Gene als Stickstoffmangel-Indikatoren ausgewählt, die ein deutliches, signifikant über einem bestimmten Schwellenwert liegendes Signal ergeben Je weiter das Ergebnis darüber liegt, desto mehr sind sie als Teile der Lösungen der erfindungsgemaßen Aufgabe anzusehen, womit sich eine entsprechende Staffelung der bevorzugten Erfindungsapekte erklart (siehe unten)
Tabelle 1 zeigt alle in Beispiel 1 ermittelten 210 Gene von Bacillus lichemformis DSM13, deren Induzierung unter Stickstoffmangel beobachtet wurde, wobei ein Faktor von mindestens drei als signifikant angesehen wurde Hiervon sind in Tabelle 2 alle 49 Gene zusammengestellt, deren Induzierung durch Stickstoffmangel zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 8 betragen hat und bei denen aus parallelen, hier nicht gezeigten Untersuchungen geschlossen werden konnte, daß sie vergleichsweise spezifisch für dieses Signal waren Diese sind in Tabelle 3 noch einmal hinsichtlich der Starke ihrer beobachteten maximalen Induktion aufgelistet Ihre DNA- und Aminosäuresequenzen werden im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung aufgeführt, wobei die ungeradzahhgen Nummern für DNA- und die nachfolgenden geradzahligen für die jeweils abgeleiteten Aminosäuresequenzen stehen Auf diese Sequenzen verweisen auch die jeweiligen SEQ ID-Nummern in den Tabellen 2 und 3 Dabei handelt es sich um folgende Gene, in der Reihenfolge abnehmender Stärke der durch Stickstoffmangel ausgelosten Induktion (vergleiche Tabelle 2 und 3) - Für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO 81 , 82),
-yrkC (unbekannte Funktion - ähnlich zu Proteinen unbekannter Funktion, SEQ ID NO 83, 84), - nasF (Uroporphyπn-Ill C-Methyltransferase, SEQ ID NO 39, 40), - für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 93, 94),
-pckA (Phosphoenolpyruvate-Carboxykinase, SEQ ID NO 43, 44), - trpE (Anthranilat-Synthase, SEQ ID NO 67, 68), - nasB (Electronen-Transfer-Untereinheit der assimilatorischen Nitratreductase, SEQ ID NO 33,
34), - für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO 15, 16),
-nasC (katalytische Untereinheit der assimilatorischen Nitratreductase, SEQ ID NO 35, 36), -ycdH (unbekannte Funktion - ähnlich zum Bindungsprotein des ABC-T ransporters, SEQ ID
NO 65, 66), - für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ
ID NO 63, 64),
- nasD (Untereinheit der assimilatorischen Nitπtreductase, SEQ ID NO 37, 38), - für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO 95, 96), - für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanιne-Glycιnpermease) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO 49, 50), -für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4 1 3 2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ
ID NO 45, 46), -für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu
SEQ ID NO 85, 86), -für ein putatives Protein (putative Sennprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 9,
10), -für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ
ID NO 17, 18),
- trpC (lndol-3-Glycerιnphosphat-Synthase, SEQ ID NO 71 , 72), - tφB (Beta-Untereinheit der Tryptophansynthase, SEQ ID NO 75, 76), -ycnK (unbekannte Funktion - ahnlich zum Transkriptions-Regulator der DeoR-Famihe, SEQ ID
NO 31 , 32), -für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protem) codierendes Gen (Homolog zu SEQ
ID NO 21 , 22), - trpD (Anthranilat-Phosphoπbosyl-Transferase, SEQ ID NO 69, 70), -ydfS (unbekannte Funktion - ähnlich zu Proteinen unbekannter Funktion, SEQ ID NO 79, 80),
- trpF (Phosphoπbosyl-Anthranilat-Isomerase, SEQ ID NO 73, 74),
- für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 47, 48),
-yvlB (unbekannte Funktion - ähnlich zu Proteinen unbekannter Funktion, SEQ ID NO 89, 90),
-yncE (unbekannte Funktion, SEQ ID NO 87, 88),
-yvIA (unbekannte Funktion, SEQ ID NO 97, 98),
- glnR (Transkriptions-Repressor des Glutaminsynthetase-Gens, SEQ ID NO 11 , 12),
-ycnJ (unbekannte Funktion - ähnlich zum Kupfer-Export-Protein, SEQ ID NO 29, 30),
-für ein putatives Protein (ATP-Bιndungsproteιn eines putativen ABC-T ransporters) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO 55, 56), - für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu
SEQ ID NO 19, 20),
- nrgB (Stickstoffreguliertes Pll-ahnhches Protein, SEQ ID NO 3, 4),
-yvtA (unbekannte Funktion - ähnlich zur HtrA-ahnlichen Seπnprotease, SEQ ID NO 23, 24), -yciC (unbekannte Funktion - ahnlich zu Proteinen unbekannter Funktion, SEQ ID NO 57, 58), - nrgA (Ammonium-Transporter, SEQ ID NO 5, 6), -glnA (Glutaminsynthetase, SEQ ID NO 13, 14),
- alsR (Transkπptionsregulator des Alpha-Acetolactat-Operons, SEQ ID NO 61 , 62), - ggt (gamma-Glutamyltranspeptidase, SEQ ID NO 51 , 52), -yqjN (unbekannte Funktion - ähnlich zum Ammosaure-Abbau, SEQ ID NO 1 , 2), -yppF (unbekannte Funktion, SEQ ID NO 77, 78), -für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO 53, 54), - für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO 41 , 42),
-ycnl (unbekannte Funktion - ähnlich zu Proteinen unbekannter Funktion, SEQ ID NO 27, 28), - htrA (Sennprotease Do, Hitzeschockprotein, SEQ ID NO 7, 8), - für ein putatives Protein (putativer ABC-Transporter / Ammosäure-Permease) codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO 91 , 92), - citA (Neben-Citratsynthase I, SEQ ID NO 59, 60), - kdgR (Transknptionsrepressor des Pectin-Abbau-Operons, SEQ ID NO 25, 26)
Über weitere Untersuchungen (siehe Beispiel 5) wurde festgestellt, daß sich auch das folgende Gen erfindungsgemäß als Indikator eignet
- tnrA (ein globaler, an der Stickstoff-Stoffwechsel-Regulation beteiligter Transkriptionsregulator, SEQ ID NO 99, 100) Eine Losung der gestellten Aufgabe besteht somit in einem Nukleinsäure-bindenden Chip, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 50 Gene kdgR, citA, für ein putatives Protein (putativer ABC-T ransporter / Aminosaure-Permease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 91), MrA, ycnl, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 41), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 53), yppF, yqjN, ggt, alsR, glnA, nrgA, yciC, yvtA, nrgB, für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 19), für ein putatives Protein (ATP-Bindungsprotem eines putativen ABC-Transporters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protem) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 21 ), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 17), für ein putatives Protein (putative Sennprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4 1 3 2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanιne-Glycιnpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stιckstoff-Re- gulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 81), tnrA, wobei die Gesamtzahl aller für den Stickstoff-Stoffwechsel spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 80 liegt
Detaillierte Informationen zu diesen Genen gehen aus den Beispielen 1 bis 3 und den Tabellen 1 bis 3 der vorliegenden Anmeldung hervor Im Sequenzprotokoll werden diese Gene offenbart, wie sie aus ß licheniformis DSM 13 erhältlich sind Die meisten davon sind auch aus anderen Spezies beschrieben (siehe unten) Bei einigen handelt es sich jedoch um putative (angenommene/- vermutliche) Gene oder um Gene, die für putative (angenommene/vermutliche) Enzyme codieren Diese werden erfindungsgemäß soweit wie möglich aufgrund von Datenbankvergleichen als solche mit einer putativen (angenommenen) Funktion und zusätzlich als Homologe zu den gefundenen B Iicheniformis-Genen definiert Hierzu muß zweierlei erläutert werden
- Zum einen könnte sich bei dem einen oder anderen durch eine biochemische Analyse herausstellen, daß diese putative Funktion nicht mit der wirklichen Funktion übereinstimmt Dann wird nicht an der putativen Funktion festgehalten Vielmehr stellen diese Erkenntnisse die Erfindung insofern nicht in Frage, als es erfindungsgemaß lediglich auf die Beobachtung der verstärkten Transkription im Zusammenhang mit dem Stickstoffmangel ankommt, so daß die betreffende Genaktivität unabhängig von der letztlich ausgeübten Enzymaktivität durchaus als Indikator für Stickstoffmangel dienen kann
- Zum anderen ließ sich für diese in Ermangelung eines Gennamens keine passendere Definition als die über das Gen selbst finden Deshalb wird von Homologen gesprochen So ist anzunehmen, daß in anderen Spezies als ß licheniformis unter Stickstoffmangel die homologen Gene aktiviert werden Sollte sich herausstellen, daß in einer betrachteten Spezies zu einem dieser Gene mehrere Homologe existieren, die in vivo zur Transknptbildung befähigt sind, so bezieht sich die Angabe „Homolog zu SEQ ID NO " auf das jeweils nachstähnliche dieser verschiedenen in Frage kommenden Gene
Erfindungsgemäß werden mindestens drei dieser Gene ausgewählt, um eine möglichst zuverlässige Aussage zu erhalten, das heißt um ein einzelnes, auf nur einen Sondentyp zurückzuführendes falsch-positives Signal auszuschließen
Unter einem Nukleinsaure-bmdenden Chip sind erfindungsgemäß alle Gegenstande zu verstehen, die mit Nukleinsäure-spezifischen Sonden versehen sind und bei Bindung einer oder mehrerer spezifisch erkannter Nukleinsäuren jeweils ein auswertbares Signal liefern
Aus dem einleitend dargestellten Stand der Technik ist die Gestaltung von Chips bekannt, die mit Nukleinsäuren als Sonden dotiert sind Prinzipiell können sie alle für Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung genutzt werden Sie basieren auf dem Prinzip der Nukleinsäure- Hybndisierung der zu detektierenden mRNA (oder einem hiervon abgeleiteten Molekül) mit der auf dem Chip vorgelegten Sonde Je nach System zur Auswertung des durch die Hybridisierung ausgelosten Signals wird zwischen Chips mit einem optischen und mit einem elektrischen Analysesystem unterschieden Erfindungsgemäß sind prinzipiell beide Systeme anwendbar
Solche Chips werden folgendermaßen zur Kontrolle (Monitoring) des jeweils betrachteten Bioprozesses eingesetzt Aus dem Prozeß wird zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Probe mit dem zu analysierenden biologischem Material entnommen Aus diesem wird nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise unter Zellaufschluß und Verwendung eines denaturierenden Puffers RNA, insbesondere mRNA isoliert Diese wird selbst markiert oder als Ausgangsmolekul für ein in die Messung eingebrachtes Molekül eingesetzt (zum Beispiel durch reverse Transkription erhaltene cDNA) und die erhaltenen Moleküle vorteilhafterweise in einem Puffer über/durch den Chip geleitet Bei Hybridisierung (Sandwich-Markierung) einer präparierten RNA beziehungsweise deren Derivat mit der homologen (das heißt hinsichtlich ihrer Sequenz kongruenten) auf dem Chip bereitgestellten Sonde (Target-Nukleinsäure, beispielsweise Target-DNA oder Target- Nukleinsäureanalog) ergibt sich ein entsprechendes optisch oder elektronisch auswertbares Signal Dieses beruht beispielsweise auf der Markierung der bindenden mRNA oder einem Transkript davon mit einem Färb- oder Fluoreszenzmarker, einer Hybridisierung mit einer zweiten Sonde oder auf einer sekundären Nachweisreaktion, etwa über eine RT-PCR
Da von derselben Sonde in der Regel jeweils mehrere Moleküle an den Chip gebunden sind, ist die Starke des Hybπdisierungssignal über einen gewissen - im Einzelfall gegebenenfalls zu optimierenden - Bereich proportional zur Zahl der zum Zeitpunkt der Probennahme in der Probe vorhandenen spezifischen mRNA Auf diese Weise ist die Starke des Signals ein direktes Maß für die Aktivität des betreffenden Gens zu dem Zeitpunkt der Probennahme
Die Zeitspanne zwischen Probennahme und Messung sollte dabei so kurz wie möglich gehalten werden, beispielsweise über eine weitgehend automatisierte Probennahme, deren Aufarbeitung und Leitung über/durch den Sensor
Als mithilfe eines erfindungsgemäßen Chips betrachtete (monitoπerte) Organismen kommen prinzipiell alle Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen in Frage, insbesondere solche, die kommerziell genutzt werden So geht beispielsweise aus der Anmeldung DE 19860313 A1 mit dem Titel „Verfahren zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene" hervor, daß es in Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen Stoffwechselsituationen gibt, die beobachtet werden müssen Ebenso können beispielsweise Nutztiere oder Labortiere beobachtet werden Von nicht geringem kommerziellen Interesse sind eukaryontische Zellkulturen, etwa bei der Herstellung monoklonaler Antikörper, und insbesondere die fermentative Herstellung von Lebensmitteln, etwa über die von Hefen betriebene alkoholische Garung Bakterien werden insbesondere zur technischen Herstellung von Proteinen oder niedermolekularen Wertstoffen (Biotransformation), etwa von Vitaminen oder Antibiotika genutzt
Unter Sonden sind erfindungsgemäß alle Moleküle zu verstehen, die in der Lage sind, mit Nukleinsäuren eine jeweils weitgehend spezifische Wechselwirkung einzugehen (sie zu binden) Diese Wechselwirkung wird erfindungsgemäß ausgenutzt, um im Rahmen einer entsprechenden Anordnung (Chip) ein weitgehend eindeutig zuzuordnendes, auswertbares Signal zu erhalten
Chemisch gesehen handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Sonde zumeist um eine Verbindung, die in der Lage ist, über Wasserstoffbruckenbmdungen mRNA-Molekule oder hiervon abgeleitete Nukleinsäuren zu binden, so wie dies beispielsweise auch bei der Wechselwirkung der beiden Strange einer DNA oder der DNA-RNA-Wechselwirkung erfolgt Dies kann beispielsweise eine DNA sein, welche gegenüber Hydrolyse stabiler ist als RNA Im Stand der Technik sind darüber hinaus weitere Moleküle bekannt, insbesondere chemisch synthetisierte, die biomimetisch dieselbe Wechselwirkung ermöglichen, aber stabiler als DNA sind, beispielsweise dadurch, daß die Phophatester-Bindungen des Ruckgrats gegen weniger hydro- lyseempfmdliche Bindungen ausgetauscht worden sind Solche Nukleinsäure-Analogon-Sonden kennzeichnen bevorzugte Ausfuhrungsformen der vorliegenden Anmeldung (siehe unten) Die betreffenden spezifischen Sonden waren, etwa nach dem Vorbild des mit dieser Anmeldung verbundenen Sequenzprotokolls entsprechend zu synthetisieren Dies kommt dem Aspekt entgegen, daß erfindungsgemaße Chips vorteilhafterweise mehrmals verwendbar sein sollten, insbesondere wahrend eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine standige Überwachung erstrebenswert ist
Limitierend für die Brauchbarkeit einer Sonde ist jeweils das Maß der Homologie zwischen der bereitgestellten Sonde und der mRNA oder der davon abgeleiteten Nukleinsäure, die über Hybπdi- sierung erkannt werden soll Letztlich entscheidet das Maß an Hybπdisierung der Sonde mit der zu detektierenden mRNA (siehe oben) über deren Brauchbarkeit als Sonde und muß im Einzelfall experimentell optimiert und/oder über Anpassung der Signalauswertung berücksichtigt werden Es muß unter den durch den Aufbau der Meßapparatur, und sonstigen Einflüssen vorgegebenen Bedingungen eine Hybridisierung erfolgen, die spezifisch nur auf das interessierende Gen zurückgeführt werden kann, ausreichend stark ist, um ein positives Signal zu ergeben, und andererseits nicht zu stark ist, als daß das erkannte Molekül nach Erzeugung des Signals wieder abdiffundiert, um die Bindungsstelle für das nächste Molekül freizumachen, beziehungsweise ein Abklingen des Signals zu ermöglichen, letzteres gegebenenfalls über einen entsprechenden Waschschritt
Allerdings ist es notig, vor Verwendung erfindungsgemäßer Chips für einen interessierenden Organismus das Maß der Homologie zwischen den betreffenden Genen abzuschätzen, bei nicht ausreichender Affinität der zu detektierenden mRNAs zu den vorgelegten Sonden solche über dieselben erfindungsgemaßen Gene aus näher verwandten Spezies auf dem Chip zu verankern und Kalibπerungsmessungen durchzufuhren, um verläßliche Aussagen darüber zu erhalten, welche Signalstarke welcher Konzentration an spezieller mRNA entspricht
Die Identifizierung der für die vorliegende Erfindung wesentlichen 50 Gene ist in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben Deren aus ß licheniformis erhältlichen Sequenzen sind im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung angegeben (SEQ ID NO 1 bis 100), wobei es sich bei den Sequenzen mit ungeradzahhgen Nummern um DNA-Sequenzen und bei den jeweils um einen Zahlwert höheren Sequenzen um die jeweils davon abgeleiteten Aminosauresequenzen handelt Während die DNA-Sequenzen unmittelbar für die Herstellung von Sonden genutzt werden können (siehe oben), dienen die Aminosauresequenzen beispielsweise über Sequenzdatenbank- Vergleiche der Überprüfung der Genfunktion und können ferner dazu dienen, um etwa über Rückübersetzung des genetischen Codes ähnliche Nuklemsäuren-erkennende Sonden zu generieren
Wie in Beispiel 1 dargestellt ist, wurden zahlreiche verschiedene Gentranskripte, das heißt mRNA- Molekule untersucht, insbesondere solche, von denen eine Beteiligung am Stickstoffstoffwechsel allgemein bekannt war Diese mRNA-Molekule wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während des Übergangs von B licheniformis DSM 13 in einen Stickstoffmangelzustand isoliert In Beispiel 1 wird ebenfalls beschrieben, wie der Konzentrationsanstieg dieser mRNA im Zellinneren von B licheniformis experimentell ermittelt wurde Alternative Bestimmungsmoglichkeiten hierzu mögen im Stand der Technik etabliert sein, entscheidend für das Verstandis der vorliegenden Erfindung ist die Zusammenstellung in Tabelle 1 (Beispiel 2) Sie zeigt die mit dem Übergang verbundenen Konzentrationsanderungen für insgesamt 210 mRNAs Dabei wurden folgende Schwellenwerte für das Verhältnis der RNA-Menge des jeweiligen Gens gegenüber dem Kontrollwert als signifikant angesehen Als induziert gelten erfindungsgemaß die Gene, deren RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens eine Verdreifachung) aufweist, eine deutliche Induktion liegt bei einem Verhältnis von > 10 vor, deutlich repπmiert sind Gene mit einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem Absenken auf weniger als 30%) Bei den in Tabelle 1 aufgeführten 210 Genen wurde zu irgendeinem der betrachteten Zeitpunkte mindestens eine Verdreifachung beobachtet
Unter den genannten 210 Genen befinden sich, wie Beispiel 3 belegt, 67 Gene mit einer mindestens δfachen Induktion zu irgendeinem der beobachteten Zeitpunkte unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Stickstoffmangels Hiervon können 18 als nicht besonders spezifisch angesehen werden, so daß überraschenderweise lediglich die in Tabelle 2 aufgeführten 49 Gene als speziell unter Stickstoffmangel deutlich induzierte Gene verbleiben Diese 49 Gene werden erfindungsgemaß als repräsentative Indikatoren eines Stickstoffmangelzustands angesehen Weitere Angaben zu diesen Genen, beispielsweise über deren Funktion oder abweichende Start-Codons sind den Tabellen 2 und 3 und dem Sequenzprotokoll zu entnehmen, die jeweiligen deutschsprachigen Bezeichnungen für die zugehörigen Proteine sind bereits oben, in der Reihenfolge der Angaben in Tabelle 3 aufgeführt worden
Das gesondert identifizierte Gen tnrA zeigt gemäß Beispiel 5 30 min nach dem Übergang in die durch Stickstoffmangel induzierte Staionarphase eine mehr als 15fache Induktion, so daß auch dieses Gen zur Umsetzung der erfindungsgemäßen Lehre genutzt werden kann und entsprechend bevorzugt ist
All diese Gene sind jeweils für sich im Stand der Technik beschrieben Sie können für die verschiedenen Organismen aus allgemein zuganglichen Datenbanken entnommen werden Wie oben erwähnt sind die im Sequenzprotokoll für B licheniformis DSM 13 angegebenen Sequenzen aus diesem Mikroorganismus ermittelt worden und stimmen praktisch mit den in der Publikation „The Complete Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with Great Industnal Potential" (2004) von B Veith et al in J Mol Microbiol Biotechnol , Band 7 (4), Seiten 204 bis 211 , beschriebenen und zusatzlich unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4 222 645) in der Datenbank GenBank (siehe oben) zuganglichen Angaben uberein Der Stamm S licheniformis DSM 13 ist über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http //www dsmz de) allgemein erhältlich Er tragt bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209, USA (http //www atcc org) die Hinterlegungsnummer ATCC 14580
Die zu den genannten 50 Genen entsprechenden Gene aus anderen Organismen sind zu einem Großteil ebenfalls in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt, beispielsweise für die gut charakterisierten Spezies B subtilis und E coli, die allgemein als Modellorganismen der grampositiven, beziehungsweise gramnegativen Bakterien angesehen werden Die entsprechenden Sequenzen können beispielsweise den Datenbanken des Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Frankreich, entnommen werden, welche über die Internet- Adressen http //genolist pasteur fr/Colibπ/ (für E coli), beziehungsweise http //genolist pasteur fr/SubtιLιst/ (für B subtilis) zugänglich sind (Stand 2 12 2004) Weitere hierfür geeignete Datenbanken sind die des EMBL-European Biomformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien (http //www ebi ac uk), Swiss-Prot (Geneva Biomformatics (GeneBio) S A , Genf, Schweiz, http //www genebio com/sprot html) oder GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)
Unter diesen „entsprechenden Genen" sind diejenigen zu verstehen, die jeweils für die Proteine codieren, die im betrachteten Organismus dieselbe chemische Reaktion katalysieren oder an demselben physiologischen Vorgang wie die genannten 50 Proteine in B licheniformis DSM 13 beteiligt sind Die meisten davon tragen für andere Organismen ähnliche Namen und Abkürzungen wie die, die in den Tabellen 1 , 2 und 3 für ß licheniformis angegeben sind, weil diese Namen für die jeweilige Funktion stehen Im Zweifelsfall geben sie sich über ihre Sequenz zu erkennen, welche aus dem betreffenden Organismus die zu den hier genannten jeweils nächstähnliche (am stärksten homologe) ist Bei der Funktionszuordnung kommt es vor allem auf die Ähnlichkeit der Aminosauresequenzen zueinander an, weil die Aminosäuren die Funktionstrager des Proteins darstellen und aufgrund der Degeneπertheit des genetischen Codes verschiedene Nukleotidsequenzen für dieselbe Aminosäuresequenz codieren können
Besonders hohe Verwandtschaftsgrade bestehen zwischen nahe verwandten Spezies So kann prinzipiell davon ausgegangen werden, daß sich zu den meisten der genannten 50 Gene Homologe in allen Spezies finden lassen, auch in Cyanobakteπen, in eukaryontischen Zellen wie etwa Pilzen, oder gramnegativen Spezies wie E coli oder Klebsiella Noch hoher ist diese Wahrscheinlichkeit für grampositive Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus, weil es sich bei B lichemformis DSM 13, von dem die im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen stammen, um ein solches grampositives Bakterium handelt Zudem ist davon auszugehen, daß in zunehmend verwandten Organismen die homologen Gene auch zunehmend denselben oder gleichwirkenden Regulationsmechanismen unterworfen sind, somit sollten diese Homologen auch dieselbe Stoffwechselsituation, insbesondere einen Stickstoffmangel anzeigen Insofern ist B lichemformis ein glücklich gewählter Beispielorganismus, weil die kommerziell ebenfalls besonders wichtigen Spezies ß subtilis, B amyloliquefaciens, B lentus, B globigu ebenfalls Bacilh und damit grampositiv sind Damit wird dem diesbezüglichen Aspekt der gestellten Aufgabe entsprochen
Es sei angemerkt, daß zum Nacharbeiten der Erfindung für eine bestimmte Spezies nicht alle genannten 50 Gene bekannt sein müssen, sondern lediglich einige davon (siehe unten) ausreichen, um den Stickstoff-Stoffwechsel abzubilden und insbesondere den Übergang in einen Stickstoff- mangelzustand detektieren zu können Gleichwohl steigt mit zunehmender Zahl von Sonden die Verläßlichkeit der Aussage über den Stickstoff-Versorgungsszustand Sind mehrere prinzipiell aufgrund der vorliegenden Offenbarung geeignet erscheinende Gene bekannt, empfiehlt es sich, vor Herstellung eines entsprechenden Chips eine Expressionsstudie durchzufuhren, um ähnlich der Darstellung in Beispiel 1 oder auch über eine Northem-Analyse zu überprüfen, ob die betreffenden Gene tatsächlich signifikante Aussagen erlauben Je weniger die betrachtete Spezies mit B lichemformis verwandt ist, desto eher mögen sich Verschiebungen hinsichtlich des durch Stickstoffmangel hervorgerufenen Expressionsnieaus ergeben, so daß sich (gegebenenfalls andere als die unten zusammengestellten) Unterguppen dieser 50 Gene als besonders geeignet und damit als bevorzugt herausstellen
Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Nuklemsaure-bindenden Chips für einen hier nicht genannten Organismus müssen also zu zumindest einzelne der für B lichemformis genannten Gene die zugehörigen homologen Gene identifiziert werden, beispielsweise durch einen Vergleich der für den betreffenden Organismus bekannten DNA-Sequenzen mit den hier angegebenen Sequenzen Diese oder Teile davon (siehe unten) können sodann an sich als Sonden oder als Vorlage zur Synthese entsprechender Sonden dienen, welche nach an sich bekannten Methoden auf einen Nuklemsaure-bindenden Chip aufgebracht werden
Sollten einzelne homologe Sequenzen nicht in Datenbanken hinterlegt sein, ist es dem Fachmann möglich, anhand der im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen jeweilige Sonden zu synthetisieren, um mit deren Hilfe eine für den gewünschten Organismus erstellte Genbank (genomisch oder vorzugsweise auf der Basis der cDNA) nach allgemein üblichen Methoden nach dem betreffenden Homolog zu durchsuchen Alternativ hierzu ist es auch möglich, anhand der im Sequenzprotokoll angegebenen DNA-Sequenzen Ohgonukleotide zu synthetisieren, die als PCR-Primer dienen, um die betreffenden Gene oder als Sonden brauchbare Teile davon aus einer gesamtgenomischen DNA-Praparation oder einer cDNA-Praparation des interessierenden Organismus herauszuamphfizieren Diese oder Teile davon (siehe unten) können als Sonden auf erfindungsgemaßen Nukleinsaure-spezifischen Chips eingesetzt werden
Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht dann, daß die Gesamtzahl aller Stickstoffstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 80 hegt Dieses Merkmal korreliert mit der gestellten Aufgabe, wonach sie schwerpunktmäßig auf solche Nuklemsaure- bindenden Chips ausgerichtet sein sollte, deren Anzahl an belegbaren Platzen aufgrund ihrer Bauart vergleichsweise gering ist Dies sind insbesondere die elektrisch auswertbaren Chips
Unter den weiteren Stickstoffstoffwechsel-spezifischen Sonden können beispielsweise solche sein, die durch einen Stickstoffuberschuß induziert werden, evtl auch weitere, die mit dem Stickstoffstoffwechsel scheinbar in keinem direkten Zusammenhang stehen, aufgrund dieser Induzierbarkeit aber als solche definiert werden können Damit ergibt solch ein Chip auch eine auswertbare und im betrachteten Prozeß brauchbare Information, wenn der Stickstoffmangel, beispielsweise durch Ergreifen entsprechender Gegenmaßnahmen überwunden worden ist
Ferner handelt es sich bei Nukleinsaure-spezifischen Sonden in der Regel jeweils nur um Fragmente der kompletten Gene (siehe unten) In Einzelfällen, beispielsweise bei einer Regulation über Spleißen oder großen, mehrfachfunktionellen Polypeptiden kann es deshalb sinnvoll sein, ein und dasselbe Gen mit zwei oder mehr verschiedenen Sonden zu detektieren Somit sind entsprechende Ausfuhrungsformen gegebenenfalls durch mehr als 50 Sonden gekennzeichnet, die jedoch auf nicht mehr als diese 50 Gene ansprechen
Je nach zu beobachtendem Prozeß können auf erfindungsgemaßen Chips auch Sonden für weitere Gene beziehungsweise Genprodukte enthalten sein (siehe unten)
Zum anderen besteht der Kern der Erfindung gerade in der Spezifität des betreffenden Chips, mit dem eine spezielle Stoffwechselsituation erfaßt werden sollte Die Herstellung eines Chips mit mehr als 80 auf verschiedene Gene ansprechenden Sonden oder sogar eines Chips, der einen Großteil des Genoms eines Organismus abbildet, ist bei einer solch spezifischen Fragestellung wegen des damit verbundenen Aufwands nicht Teil der hier beschriebenen Erfindung Vielmehr können beide Arten von Chips in einem beobachteten Bioprozeß sinnvoll nebeneinander eingesetzt werden So können die Chips mit zahlreichen verschiedenen Gensonden oder mit einem repräsentativen Querschnitt verschiedener möglicherweise relevanter Situationen, wie sie mit der Anmeldung WO 2004/027092 A2 zur Verfugung gestellt werden, einen groben Überblick über den Zustand des betreffenden Organismus liefern, während ein erfindungsgemäßer Chip zur Kontrolle hinzugezogen wird, wenn Anlaß zur Sorge besteht, die betreffenden Zellen könnten in einen Stickstoffmangelzustand eintreten
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Nukleinsaure-bindenden Chip, der zunehmend bevorzugt mit den oben angegebenen Sonden in der dort angegebenen Reihenfolge dotiert ist
Hiermit sind die in Tabelle 3 aufgeführten Gene in umgekehrter Reihenfolge gemeint Demnach sind Chips mit Sonden zum Gen kdgR (Transkπptionsrepressor des Pectin-Abbau-Operons, SEQ ID NO 25, 26) unter den erfindungsgemaßen Chips hinsichtlich der Genauswahl zur Bildung von Sonden noch am wenigsten bevorzugt, weil dieses unter den 50 genannten, durch Stickstoffman- gel signifikant verstärkt transkribierten Genen am schwächsten induziert worden ist Demgegenüber sind solche mit einer Sonde für das für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierende Gen (Homolog zu SEQ ID NO 81 , 82) hinsichtlich der Genauswahl am stärksten bevorzugt Denn dieses zeigte gegenüber dem Ausgangsniveau eine mehr als 146fache Induktion und damit die stärkste von allen gemessenen Genen Das hiermit verbundene Signal sollte also von allen untersuchten Genen am besten dazu geeignet sein, die Stoffwechselsituation „Stickstoffmangel" anzuzeigen
tnrA liegt gemäß Beispiel 5 zwischen trpC und trpB und ist entsprechend bevorzugt
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich um einen erfindungsgemaßen Nukleinsaure-bindenden Chip, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Sonden aus den folgenden 34 Genen ausgewählt ist/sind für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 19), für ein putatives Protein (ATP-Bιndungsproteιn eines putativen ABC- Transporters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 17), für ein putatives Protein (putative Sennprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4 1 3 2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanιne-Glycιnpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium- Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 81), tnrA
Denn diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B licheniformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 und 5 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 10 erhöht waren Entsprechend bevorzugte Ausfuhrungsformen sind also durch die ersten 33 der in Tabelle 3 aufgeführten Gene gekennzeichnet
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Sonden aus den folgenden 20 Genen ausgewählt ist/sind
UpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 17), für ein putatives Protein (putative Seπnprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4 1 3 2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)- verbundene D-Alanιne-Glycιnpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd- Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 81), tnrA
Denn diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von S licheniformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 und 5 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 15 erhöht waren
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Sonden aus den folgenden 12 Genen ausgewählt ist/sind nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd- Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 81)
Denn diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B lichemformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 20 erhöht waren
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemaßen Nuklemsaure-bindenden Chips, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Sonden aus den folgenden 4 Genen ausgewählt ist/sind für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 81)
Denn diese zeigten bei den in den Beispielen anhand von S lichemformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 30, im Fall von yrkC um mehr als 60 und im zuletztgenannten Fall sogar um deutlich mehr als den Faktor 100 erhöht waren
In bevorzugten Ausfuhrungsformen sind erfindungsgemäße Nukleinsaure-bindende Chips mit mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 50 der für die vorliegende Erfindung kennzeichnenden, das heißt in diesem Sinne genannten Sonden dotiert
Denn je mehr dieser Sonden auf ein entsprechendes Signal ansprechen, desto zuverlässiger ist die hiermit verbundene Aussage über die augenblickliche Stickstoffversorgung beziehungsweise - Unterversorgung So ist es auch sinnvoll, die besonders aussagekräftigen und somit bevorzugte Ausfuhrungsformen kennzeichnenden Sonden mit scheinbar weniger aussagekraftigen zu kombinieren, um falsch-positive Signale ausschließen zu können Ferner ist es vorteilhaft, entsprechend den Angaben in Tabelle 2 solche Sonden miteinander zu kombinieren, die zu unterschiedlichen der dort angegebenen Zeitpunkte unterschiedlich starke Signale ergeben So kann man zu einer Abschätzung darüber gelangen, wie lange vor Probennahme der Eintritt des Stickstoffmangels zurückliegt und ob er - unter Protokollierung der Kultivierungsbedingungen - möglicherweise auf einen bestimmten Umwelteinfluß zurückzuführen ist
Hinsichtlich ihrer konkreten Sequenzen verschiedene Sonden, die aber auf dieselbe mRNA ansprechen, beispielsweise Fragmente, die mit unterschiedlichen Bereichen derselben mRNA hybridisieren (siehe unten), können zur Erhöhung der Auslesesicheheit mehrmals vertreten sein, werden im Sinne dieses Erfindungsaspekts aber nur einmal gezählt, weil sie im besten Fall gleichstark auf dasselbe Signal ansprechen und prinzipiell gegeneinander austauschbar wären
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nukleinsäure-bmdender Chips liegt die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10
Dies entspricht dem oben ausgeführten Erfindungsgedanken, wonach mit den hier beschriebenen Chips ein spezieller Stoffwechselaspekt monitoriert werden soll, so daß eine größere Zahl von Sonden als zum Erfassen dieser Situation notwendig nicht auf den betreffenden Chips aufgebracht zu werden braucht Davon bleibt die Situation unberührt, daß es in Einzelfallen sinnvoll sein kann, mehr als eine Sonde zur Detektion derselben mRNA einzusetzen und/oder einzelne Sonden aufzubringen, die mit der Herstellung eines interessierenden Wertstoffs in Verbindung stehen Insgesamt bewegt sich die vorliegende Erfindung in dem genannten Rahmen, um Chips mit technisch bedingt nur wenigen Bindungsstellen in den Schutzbereich einschließen zu können
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nukleinsaure-bindender Chips handelt es sich bei den als erfindungsrelevant genannten Sonden um solche, die auf die betreffenden, beziehungsweise hochsthomologen, in vivo transkribierbaren Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche die von den betreffenden, beziehungsweise hochsthomologen, in vivo transkπbierbaren Genen eben dieses Organismus abgeleitet sind
Hierzu ist bereits oben ausgeführt worden, daß die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen aus B licheniformis erhalten worden sind und sich aufgrund der allgemein bekannten Verwandtschaftsverhaltnisse insbesondere zum Überwachen von verwandten Spezies, insbesondere solchen der Gattung Bacillus eignen sollten Dies gilt sowohl für die identifizierten Gene, denen aufgrund von Datenbankvergleichen konkrete Funktionen zugewiesen werden konnten und die in anderen Spezies prinzipiell für dieselbe Funktion codieren sollten, als auch für diejenigen, die nur über ihre Sequenzen definiert worden sind Hierzu werden erfindungsgemäß die im betrachteten Organismus nachstverwandten Gene zur Ableitung entsprechender Sonden verwendet Dabei ist jedoch darauf zu achten, daß keine Sonden zu Pseudogenen erzeugt werden, sondern zu solchen, die tatsächlich unter /n-two-Bedιngungen in mRNA umgeschrieben werden, das heißt die zu einem im Cytoplasma meßbaren Nukleinsaure-Signal fuhren
Statistisch gesehen sollte solch ein Chip jedoch umso erfolgreicher einsetzbar sein, je besser die gewählten Sonden mit den zu messenden Nukleinsäuren mteragieren Somit steigt vor allem bei abnehmendem Verwandtschaftsgrad zu B licheniformis die Notwendigkeit, sich bei dieser Hybπdi- sierung nicht auf die angegebenen Sequenzen zu verlassen sondern - sofern Sequenzunter- schiede bestehen - die für die homologen Gene aus den betreffenden Spezies einzusetzen Wie erläutert können diese über an sich bekannte Verfahren, insbesondere Genbank-Screenmg oder PCR mit Primern, die an den hier offenbarten Sequenzen orientiert sind (gegebenenfalls in Form sogenannter Mismatch-Pπmer mit gewissen, statistischen Sequenzvariationen), erhalten werden
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsaure-bindender Chips handelt es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien
Denn in diese Gruppen fallen die kommerziell am stärksten eingesetzen Organismen, insbesondere wenn es sich bei dem zu beobachtenden Bioprozeß um eine Fermentation handelt Hierzu zahlen beispielsweise Garprozesse, etwa zur Herstellung von Wein oder Bier, oder die biotechnologische Herstellung von Wertstoffen wie Proteinen oder niedermolekularen Verbindungen
Abhangig von der Art des gewünschten Produkts werden für ein biotechnologisches Verfahren verschiedene Organismen gewählt Hierunter sind im Sinne der Erfindung nicht allein die Produktionsstamme zu verstehen sondern auch alle dem Produktionsprozeß vorgeschalteten Organismen, beispielsweise zur Klonierung entsprechender Gene oder zur Auswahl geeigneter Expressionsvektoren Der Bedarf, eine Stickstoff lim itation zu erfassen, besteht dabei pπnzipell wahrend jedes Teilprozesses
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nukleinsaure-bindender Chips handelt es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces
Denn diese werden neben der Herstellung alkoholischer Getränke und weiterer durch Garung erhaltener Lebensmittel intensiv als Wirtszellen insbesondere für die Genprodukte von Eukaryonten eingesetzt Letzteres ist dann besonders vorteilhaft, wenn diese Genprodukte spezielle, nur durch diese Stamme durchfuhrbare Modifikationen erfahren sollen, wie beispielsweise Glykosylierungen von Proteinen
Unter diesen Gegenstand fallen auch erfindungsgemaße Chips, die auf die Überwachung des Verlaufs, insbesondere des Wachstums von Zellkulturen höherer Eukaryonten, etwa von Nagetieren oder von Menschen ausgerichtet sind Sie können in gewisser Hinsicht ebenfalls als, zumindest weitgehend einzellige Eukaryonten verstanden werden, die insbesondere in der Immunologie eine erhebliche kommerzielle Bedeutung besitzen, beispielsweise für die Herstellung monoklonaler Antikörper In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemäßer Nuklemsaure-bindender Chips handelt es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakteπen oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacteπum glutamicum, Bacillus subtilis, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B agaradherens, B stearothermophilus, B globign oder ß lentus, und ganz besonders um B licheniformis
Denn dies sind technisch besonders wichtige Produktionsstamme Sie werden insbesondere zur Produktion niedermolekularer chemischer Verbindungen, etwa von Vitaminen oder von Antibiotika oder zur Produktion von Proteinen, insbesondere Enzymen eingesetzt Hierbei sind besonders Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen und Proteasen besonders hervorzuheben Die besondere Ausrichtung auf B licheniformis erklart sich daraus, daß die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus dieser Spezies erhalten worden sind und wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben nachweislich mit dem Übergang in einen Stickstoffmangel in Verbindung gebracht werden konnten
In nicht minder bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nuklemsaure-bindender Chips handelt es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E coli oder Klebsiella, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E coli RV308, E coli DH5α, E coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf)
Denn diese dienen sowohl im Labormaßstab beispielsweise der Klonierung und Expressionsanalyse als auch im großtechnischen Maßstab der Herstellung biologischer Wertstoffe
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nuklemsaure-bindender Chips ist/sind mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 und 99 aufgeführt sind
Denn diese Gene konnten, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, bei S licheniformis nachweislich mit dem Übergang in einen Stickstoffmangel in Verbindung gebracht werden Insbesondere wenn B licheniformis oder andere, vor allem verwandte Bacillus-Spezies überwacht werden sollen, sollte deshalb auf diese Sequenzen zurückgegriffen werden In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich um solche, die zusätzlich mit mindestens einer Sonde für ein zusatzliches Gen dotiert sind, msbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich expnmierten Gen(en) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst
Wie oben ausgeführt dienen die beobachteten Prozesse einem technischen Interesse, das oft mit weiteren spezifischen Genen verbunden ist Hierbei handelt es sich beispielsweise in dem Fall, daß ein Protein hergestellt werden soll, um das Gen für dieses Protein und in dem Fall, daß eine niedermolekulare Verbindung hergestellt werden soll, um ein oder mehrere Genprodukte, die auf dem Syntheseweg der betreffenden Verbindung liegen oder diesen regulieren Es können auch andere zelleigene Gene betroffen sein, etwa Stoffwechselgene, die im Zuge der Produktherstellung verstärkt gebildet werden müssen, beispielsweise eine zelleigene Oxidoreduktase, wenn das Produkt aus einem Edukt oder einem Zwischenprodukt über Oxidation oder Reduktion erhalten werden soll
Zudem werden für bestimmte biologische Prozesse, insbesondere die Bildung gewerblich relevanter Verbindungen durch Mikroorganismen in der Regel nicht die Wildtyp-Stämme eingesetzt, sondern solche, die auf den betreffenden Prozeß ausgerichtet sind Hierzu gehört neben der Transformation mit den für die eigentliche Produktherstellung verantwortlichen Genen das Versehen mit Selektionsmarkem oder weitere Anpassungen des Stoffwechsels, bis hin zu Auxotrophien Derartige Stamme besitzen ein besonderes Anforderungsprofil an die Wachstumsbedingungen und besitzen zum Teil Stoffwechselgene, die gegenüber den Wildtypgenen mutiert sind Da erfmdungs- gemaße Chips vorteilhafterweise auf eben diese Stamme, ganz besonders den betrachteten Bioprozeß ausgerichtet sein sollen, sollten diese Stamm-spezifischen Eigenheiten berücksichtigt werden und können sich in der Wahl der betreffenden Sonden widerspiegeln
In bevorzugten Ausfuhrungsformen derartiger erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich expnmierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase, eine He- micellulase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert
Diese sind dann besonders auf diejenigen Bioprozesse, vor allem Fermentationen ausgerichtet, in denen die genannten Proteine hergestellt werden Bei diesen handelt es sich um kommerziell besonders wichtige Enzyme, die beispielsweise in der Lebensmittelindustrie oder der Waschmittel- industne Verwendung finden Im zuletztgenannten Fall insbesondere zur Entfernung von Anschmutzungen, die von Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Hemicellulasen und/oder Proteasen hydrolysierbar sind, zur Behandlung der betreffenden Materialien, insbesondere durch Cellulasen beziehungsweise zur Bereitstellung eines auf einer Oxidoreduktase beruhenden enzymatischen Bleichsystems
Die zuletzt genannte Variante fallt in den Bereich der Biotransformation, wonach bestimmte, gegebenenfalls zusätzlich eingeführte Stoffwechselaktivitaten von Mikroorganismen zur Synthese chemischer Verbindungen ausgenutzt werden
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung genannten Sonden einzelstrangig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt
Diese Ausfuhrungsform verfolgt das Ziel, die Hybridisierung zwischen der Sonde und der zu detektierenden Probe zu verbessern Dies gilt insbesondere für den Fall, daß aus der Probe tatsächlich der Gehalt an der relevanten mRNA bestimmt wird Da diese einzelstrangig ist und in ihrer Sequenz mit dem codierenden Strang der DNA übereinstimmt, sollte eine optimale Hybridisierung mit dem komplementären, das heißt dem codogenen Strang erfolgen
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nukleinsäure-bindender Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden in Form einer DNA oder eines Nuklemsaureanalogs vorzugsweise eines Nukleinsaureanalogs zur Verfugung gestellt
Diese Ausfuhrungsform verfolgt das Ziel, die Haltbarkeit und mehrmalige Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Chips zu verbessern Dieses Bedürfnis ergibt sich insbesondere wahrend eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung erstrebenswert ist Die Haltbarkeit erfindungsgemaßer Chips, insbesondere gegenüber Nukleinsäure- hydrolysierenden Enzymen wird bereits durch die Bereitstellung der Sonden in Form einer DNA erhöht, da diese an sich weniger hydrolyseempfindlich als etwa eine RNA ist Noch haltbarer sind Nukleinsaureanaloga, in denen beispielsweise das Phosphat des Zucker-Phosphatsruckgrats gegen einen chemisch anderen Baustein ersetzt ist, welcher beispielsweise durch natürliche Nukleasen nicht hydrolysierbar ist Derartige Verbindungen sind prinzipiell im Stand der Technik bekannt und werden für gewünschte, jeweils anzugebende Sequenzen von hierauf spezialisierten Firmen auf Wunsch kommerziell synthetisiert Die betreffenden Sonden sind etwa nach dem Vorbild der im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen zu synthetisieren
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips umfaßt/umfassen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden Genbereiche, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen
Hiermit wird dem Aspekt Rechnung getragen, daß vielfach auch die regulatorischen DNA- Abschnitte einem speziellen Gen zugeordnet werden In der Tat soll der erfindungsgemaße Chip jedoch dem Nachweis der in den beobachteten Zellen tatsächlich vorhandenen mRNA eingesetzt werden, so daß für den hier betrachteten Zweck erst der Genabschnitt von Bedeutung ist, der tatsächlich in mRNA übersetzt wird Zum anderen ist zu berücksichtigen, daß insbesondere bei Eukaryonten Introns auftreten, das heißt der codierende Bereich von Abschnitten unterbrochen ist, die nicht in mRNA übersetzt werden Sonden, die Introns enthalten, durften deshalb nicht oder nur schlecht auf die betreffenden mRNA ansprechen Zur Realisierung dieses Aspekts ist es ratsam, nicht auf genomische DNA-Sequenzen sondern auf cDNA-Seqenzen zurückzugreifen, das heißt auf solche, die anhand der tatsächlichen mRNA erhalten worden sind
Des weiteren ist zum Nachweis einer mRNA oft keine Hybridisierung über die ganze Seqzuenz- lange erforderlich Die spezifischen Sonden brauchen deshalb in der Regel nur einen kleineren des in mRNA umgeschriebenen Gens zu umfassen Vorteilhaft ist hierfür eine Auswahl eines Bereichs, der nahe dem 5'-Ende der mRNA liegt, da dieser zuerst in mRNA transkribiert wird und somit nach Aktivierung des Gens als erstes nachweisbar ist Dies kommt einem zeitnahen Nachweis entgegen
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nukleinsäure-bindender Chips spricht/sprechen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren an, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundarfaltung aufweisen
Dies ist ein weiterer Aspekt, um die Hybridisierung zwischen den Sonden und den zu detektierenden mRNA zu optimieren Denn mRNA-Molekule hegen oft in einer Sekundärstruktur vor, die auf Hybridisierung einzelner mRNA-Bereiche mit eigenen, anderen Bereichen beruht So kommt es beispielsweise zu Loop- oder Stem-Ioop-Strukturen Solche Bereiche hybridisieren in der Regel jedoch weniger leicht mit anderen Nukleinsauremolekulen, auch wenn diese homolog sind Derartige Bereiche können recht genau von hierauf ausgerichteten Computerprogrammen (siehe unten) errechnet werden Zur Realisierung dieses Aspekts sollte man also das Gen, dessen Aktivität man für einem interessierenden Organismus bestimmen möchte, von solch einem Programm analysieren lassen und zur Gewinnung einer geeigneten - in der Regel nur einen Teilbereich umfassenden (siehe unten) - Sonde auf Abschnitte zurückgreifen, für die ein nur geringes Maß an mRNA-Sekundärstrukturen vorhergesagt wird In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemäßer Nuklemsäure-bindender Chips weist/weisen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden eine Lange von zunehmend bevorzugt weniger als 200, 150, 125 oder 100 Nukleotiden, vorzugsweise von 20 bis 60 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden auf
Denn die für die Nachweisreaktion eingesetzten Sonden brauchen nur Teile der zu detektierenden mRNA zu umfassen, sofern das über sie erhältliche Signal noch spezifisch genug ist Diese Spezifität, die Unterscheidbarkeit verschiedener mRNA setzt die untere Grenze für die Länge der betreffenden Sonden und muß gegebenenfalls in Vorversuchen experimentell ermittelt werden
Die Identifizierung von geeigneten Sonden, auch hinsichtlich ihrer Lange und jeweils geeigneter Bereiche, ist dem Fachmann an sich bekannt und wird normalerweise unter Zuhilfenahme spezialisierter Software durchgeführt Beispiele für solche Software sind die Programme Array Designer der Fa Premier Biosoft International, USA, und Vector NTI® Suite, V 7, erhältlich von der Firma InforMax, Ine , Bethesda, USA, eine neuere Version dieses Programms wird von der Firma Invitro- gen, Carlsbad, CA, USA, vertrieben Neben den schon erwähnten Sekundärstrukturen berücksichtigen diese Softwareprogramme beispielsweise auch vorgegebene Sondenlangen sowie Schmelztemperaturen
In bevorzugten Ausfuhrungsformen erfindungsgemaßer Nuklemsäure-bindender Chips wird durch die Bindung der mRNA an die betreffende als erfindungsrelevant genannte Sonde ein elektrisches Signal ausgelost
In dem bereits erwähnten Artikel J Wang (Acc Chem Res , ISSN 0001-4842, Rec Sept 12, 2001 , S A-F) werden die Vorteile eines elektrisch auswertbaren Systems gegenüber einem optischen System diskutiert Ferner wird auf verschiedene im Stand der Technik entwickelte Ausfuhrungsformen solcher Sensoren verwiesen
So betragt zum gegenwartigen Zeitpunkt die Zeitspanne von der Probennahme bis zum Messen des Signals für optisch auswertbare Chips ungefähr 24 h Mithilfe eines elektrischen Systems liegt der Zeitbedarf momentan bei weniger als 2 h (vergleiche Figur 1) Demgegenüber liegt die Zahl der gleichzeitig analysierbaren Proben bei elektrisch auswertbaren Chips derzeit im zweistelligen Bereich, wobei jedoch eine rasche Entwicklung dafür spricht, daß diese Größenordnung in Kurze überschritten werden kann Limitierend hierfür sind die elektronischen Auswerte-Einheiten für die verschiedenen Signale
Eine im Stand der Technik etablierte Methode zur mRNA-Quantifizierung stellt beispielsweise die RT-PCT dar Diese wird in dem Artikel „Quantification of Bacteπal mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System" (2003) von S Tobisch, T Koburger, B Jürgen, S Leja, M Hecker und T Schweder in BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8 beschrieben Demgegenüber besitzt die Detektion über Elektro-Chips einen weiteren Vorteil, nämlich die höhere Zuverlässigkeit der Daten, da diese gegenüber der RT-PCR deutlich geringere Schwankungsbreiten aufweisen
Die Herstellung entsprechender elektronisch auswertbarer Chips wird beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/62048 A2, WO 00/67026 A1 und WO 02/41992 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt vollständig in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird
Die Funktionsweise elektrisch auslesbarer Chips einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform kann wie folgt beschrieben werden Die genspezifischen Sonden sind auf an sich bekannte Weise kovalent an magnetische Trager (Beads) gebunden, die sich in hierfür vorgesehenen Kammern der Chips befinden Die spezifische Hybridisierung der entsprechenden mRNA an die jeweiligen Beads erfolgt in dieser Hybπdisierungskammer, die temperierbar ist und von den betreffenden Losungen durchspult werden kann Die Beads werden in dieser Kammer durch einen Magneten festgehalten Nach der Hybridisierung der RNA-Proben an die Beads-gebundenen DNA-Sonden erfolgt ein Waschschritt zur Beseitigung der nicht-gebundenen RNA, so daß in der Inkubationskammer nur noch spezifische Hybride vorhanden sind, und zwar gebunden an den magetischen Beads
Nach dem Waschen wird eine Detektionssonde in die Inkubationskammer eingeleitet, die über eine Biotin-Extravidin-gebundene alkalische Phosphatase markiert ist Diese Sonde bindet an eine zweite freie Region der hybridisierten mRNA Dieses Hybrid wird anschließend erneut gewaschen und mit dem Substrat der alkalischen Phosphatase Para-Aminophenolphosphat (pAPP) inkubiert Die enzymatische Reaktion in der Inkubationskammer fuhrt zur Freisetzung des redoxaktiven Produkts para-Aminophenol (pAP) Dieses wird nun über die Red/Ox-Elektrode auf dem elektrischen Chip geleitet und das Signal zu einem Potentiostaten gesendet
Eine System-spezifische Software (zum Beispiel MCDDE32) liest die erhaltenen Daten, und die Ergebnisse können mit Hilfe eines weiteren Programms (zum Beispiel Origin) auf einem Computer ausgewertet und dargestellt werden
Selbstverständlich ist dieser Prozeß sowohl hinsichtlich der technischen Gestaltung der Chips als auch der Auswertung variierbar So kann beispielsweise die Nachweisreaktion auch durch eine andere, wegen des elektrischen Meßprinzips vorzugsweise jedoch eine Redoxreaktion erfolgen
Eine Leistung der vorliegenden Erfindung besteht dann, Stickstoffstoffwechsel-spezifische und insofern prozeßkritische Gene identifiziert und der Analyse über entsprechend gestaltete Biochips zugänglich gemacht zu haben Der Vorteil von Chips gegenüber konventionellen Nachweismetho- den besteht neben dem Zeitgewinn und der höheren Genauigkeit dann, daß mit der Bereitstellung mehrerer Sonden auf einem Trager gleichzeitig in derselben Probe die Aktivitäten von mehreren verschiedenen Genen nachgewiesen werden können und bei der hier beschriebenen Anwendung auf ein spezielles Problem ein solideres und detaillierteres Bild ergeben können, beispielsweise hisichtlich des Zeitpunkts, zu dem ein Stickstoffmangel eingetreten ist
Ein eigener Erfindungsgegenstand ist somit die gleichzeitige Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsaure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 50 Gene kdgR, citA, für ein putatives Protein (putativer ABC-T ransporter / Aminosäure-Permease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 91), htrA, ycnl, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 41), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 53), yppF, yqjN, ggt, alsR, glnA, nrgA, yαC, yvtA, nrgB, für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 19), für ein putatives Protein (ATP-Bιndungsproteιn eines putativen ABC-Transporters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 17), für ein putatives Protein (putative Seπnprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4 1 3 2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanιne-Glycιnpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium- Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 81), tnrA, gebunden an einen Nukleinsaure-bindenden Chip, vorzugsweise an denselben, zur Bestimmung des physiologischen Zustande eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus
Wie oben erläutert, sind diese 50 Gene so ausgewählt, daß sie ein Bild über die Situation des Stickstoffstoffwechels des betrachteten Organismus liefern, weil sie wie in den Beispielen 1 bis 3 und 5 beschrieben bei dem Übergang des grampositiven Bakteriums ß lichemformis in den Stick- stoffmangelzustand signifikant und vergleichsweise spezifisch induziert werden Eine vergleichbare Aussage ist auch für andere Organismen zu erwarten, die über die homologen Gene beziehungsweise Proteine mit im wesentlichen denselben stoffwechselrelevanten Eigenschaften verfugen
Wie ebenfalls bereits ausführlich beschrieben, können derartige Genaktivitaten prinzipiell auf verschiedene Arten bestimmt werden, beispielsweise durch Northem-Hybridisierung Die Analyse mithilfe eines Nuklemsaure-bindenden Chip, insbesondere eines oben beschriebenen, eröffnet jedoch die Möglichkeit, auf sehr effiziente Weise gleichzeitig mehrere Genaktivitaten zu bestimmen und dies zudem sehr zeitnah Dadurch können die Stoffwechselveranderungen eines Organismus, der einen biologischen Prozeß durchlauft, zeitnah beobachtet und gegebenenfalls regulatorisch eingegriffen werden
Die oben gemachten Ausfuhrungen zu Nukleinsäure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verwendungen der betreffenden Sonden entsprechend
Vorzugsweise handelt es sich dabei dementsprechend um solche Verwendungen, wobei die Gesamtzahl aller Stickstoff-Stoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 80 hegt
Weiterhin bevorzugt handelt es sich dabei dementsprechend um solche Verwendungen, wobei die zuvor als erfindungsgemäß angegebenen Sonden in der zuvor als bevorzugt angegebenen Reihenfolge (umgekehrt zur Reihenfolge in Tabelle 3 unter Einbeziehung von Beispiel 5) zunehmend bevorzugt eingesetzt werden
Entsprechend den oben gemachten Ausfuhrungen sind folgende der soeben bezeichneten Verwendungen von Nukleinsäure- oder Nuklemsaure-Analogon-Sonden zunehmend bevorzugt - Verwendung, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Nuklemsäure- oder Nuklemsaure-Analogon-Sonden für Gene aus den folgenden 34 Genen spezifisch ist/sind für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 19), für ein putatives Protein (ATP-Bιndungsproteιn eines putativen ABC-T ranspor- ters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkπptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 17), für ein putatives Protein (putative Seπnprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4 1 3 2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanιne-Glycιnpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd- Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81), tnrA;
- hierunter vorzugsweise für Gene aus den folgenden 20 Genen: trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D- Alanine-Glycinpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81), tnrA;
- hierunter besonders bevorzugt für Gene aus den folgenden 12 Genen: nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81);
- hierunter ganz besonders bevorzugt für Gene aus den folgenden 4 Genen: für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81).
Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen von gleichzeitig mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 50 der genannten Sonden. Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen, wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10 liegt
Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich weiterhin bevorzugt um erfindungsgemäße Verwendungen zur Bestimmung einer Änderung im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus, vorzugsweise zur Detektion eines Stickstoffmangelzustands
Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich weiterhin bevorzugt um erfindungsgemaße Verwendungen, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet ist/sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 und 99 aufgeführt sind
Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines erfindungsgemaßen Nukleinsaure-bindenden Chips
Diese Verfahren sehen prinzipiell so aus, daß während des Prozesses und ohne ihn zu unterbrechen, Proben des betrachteten Organismus entnommen und daraus die mRNA isoliert werden Diese oder gegebenenfalls hiervon abgleitete Verbindungen wie beispielsweise cDNA werden über einen oben beschriebenen Nukleinsaure-bindenden Chip geleitet, welcher unter Berücksichtigung der oben angegebenen Verfahrensschritte - wie etwa ausreichende Inkubationszeit oder Abwaschen unspezifisch bindender Nukleinsäuren - behandelt und schließlich dem Detektionsgerät zugeführt wird Solch ein Verfahrensprotokoll ist anhand des Beispiels elektrisch auswertbarer Chips prinzipiell in Figur 1 dargestellt
Die oben gemachten Ausfuhrungen zu Nukleinsaure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus entsprechend
Vorzugsweise handelt es sich um erfindungsgemäße Verfahren, wobei eine Änderung im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Stickstoffmangelzustand
Denn bezüglich dieses Einsatzgebiets sind die in den Beispielen beschriebenen und oben aufgeführten Gene ausgewählt worden Ihre signifikante Induktion geht zumindest bei B licheniformis mit dem Eintreten eines Stickstoffmangelzustands einher, so daß diese mit den genannten Verfahren besonders zuverlässig detektiert werden können, und zwar nicht nur bei S lichemformis sondern mit zunehmend besseren Erfolgsaussichten auch bei zunehmend verwandten Spezies (siehe oben) Zudem stellt diese Stoffwechselsituation im Lebenszyklus vieler Mikroorganismen einen kritischen Zeitpunkt dar So war in den untersuchten Beispielen (siehe unten) mit dem jeweiligen Eintritt des Stickstoffmangels immer auch ein Übergang in die stationäre Wachstumsphase verbunden Verfahren, die diesen Zeitpunkt frühzeitig zu erkennen helfen, dienen dazu, diesen Übergang zu verzogern und insbesondere bei großtechnisch genutzten Fermentationen die Phase der Produktion eines Wertstoffs zu verlängern, insbesondere wenn es sich um einen stickstoffhaltigen Wertstoff wie etwa ein Protein handelt
Eine weitere Möglichkeit der Verfahrensfuhrung bei der Kultivierung von Mikroorganismen besteht dann, neben der zuerst (und somit besser) genutzten N-Quelle eine weitere zur Verfugung zu stellen In der Phase des zuerst beobachteten Stickstoffmangels stellen sich die betreffenden Zellen, sofern sie dazu in der Lage sind, auf die Nutzung der zweiten, für sie schlechter verwertbaren N-Quelle ein Mit diesem Übergang ist in der Regel eine Verzögerung im Wachstum zu beobachten, welches frühzeitig über ein erfindungsgemaßes Verfahren erkannt werden kann
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemaßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces
Entsprechend dem oben Gesagten sind darunter auch solche erfindungsgemaßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebaktenen oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebactenum glutamicum, Bacillus subtilis, B lichemformis, B amyloliquefaciens, B agaradherens, B stearothermophilus, B globign oder ß lentus, und ganz besonders um B lichemformis
Entsprechend dem oben Gesagten sind darunter auch solche erfindungsgemäßen Verfahren nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen £ coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E coli RV308, E coli DH5α, E coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf) Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemaßen Verfahren bevorzugt, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 oder 99 abgeleitet sind
Hierunter sind wiederum diejenigen Verfahren bevorzugt, bei denen die hier genannten Sonden für die zuvor aufgeführten grampositiven Bakterien, insbesondere B lichemformis eingesetzt werden, da diese Sequenzen aus eben diesem Organismus isoliert worden sind und somit am erfolgreichsten auf diese Spezies angewendet werden können
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemaßen Verfahren bevorzugt, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsaure- bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsaure-bindenden Chips
Entsprechend dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemaßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelerganzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt
Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ auch solche erfindungsgemaßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen auch die Verwendungsmöglichkeiten erfindungsgemäßer Nuklemsaure-bindender Chips, wie sie oben eingehend beschrieben sind, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus dar
Die oben gemachten Ausfuhrungen zu Nukleinsaure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verwendungen der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus entsprechend Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei eine Änderung im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Stickstoffmangelzustand
Entsprechend dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemaßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces
Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ hierzu solche erfindungsgemaßen Verwendungen nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakteπen oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebactenum glutamicum, Bacillus subtilis, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B agaradherens, B stearothermophilus, B globign oder B lentus, und ganz besonders um B licheniformis
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E coli RV308, E coli DH5α, E coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf)
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 oder 99 abgeleitet sind
Hierunter sind wiederum aus dem bereits genannten Grund diejenigen Verwendungen bevorzugt, bei denen die hier genannten Sonden für die zuvor aufgeführten grampositiven Bakterien, insbesondere B licheniformis eingesetzt werden
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure- bmdender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips
Entsprechend dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelerganzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt
Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ dazu solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen
Die vorliegende Erfindung wird zusätzlich durch die nachfolgenden Beispiele erläutert
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fπtsch, Sambrook und Maniatis „Molecular clonmg a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind Enzyme und Baukasten (Kits) werden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt
Beispiel 1 : Identifizierung der Gensonden durch Chipanalysen
Kultivierung von Bakterien und Probengewinnung
Zellen des Stamms Bacillus hcheniformis DSM13 (erhältlich von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, http //www dsmz de) wurden in Stickstoff-Iimitiertem, synthetischem Belitsky-Minimalmedium (1 mM Endkonzentration) bei 37°C unter konstantem Schuttein bei 270 rpm kultiviert Dieses Medium weist folgende Zusammensetzung auf (1 ) Grundmedium (pH 7,5) 0,015 M (NH4J2SO4, 0,008 M MgSO4 x 7H2O, 0,027 M KCl, 0,007 M Na3Cιtrat x 2H2O1 0,050 M Tπs-HCI und 0,009 M Glutaminsäure, (2 ) Supplemente 0,2 M KH2PO4, 0,039 M L-Tryptophan-HCI, 1 M CaCI2 x 2H2O, 0,0005 M FeSO4 x 7H2O, 0,025 M MnSO4 x 4H2O und 20% (w/v) Glukose, und als (3 ) Mediumsupplementierungsschema 0,14 ml KH2PO4, 0,2 ml CaCI2, 0,2 ml FeSO4, 0,04 ml MnSO4, 1 ml Glukose Alle Werte sind beziehen sich auf 100 ml Grundmedium
Im Verlauf der Wachstumskurve wurden bei einer optischen Dichte bei 500 nm (OD50o) von 0,4 bis 0,5 die Kontrollprobe und in der transienten Wachstumsphase bei einer OD50O von 0,8 bis 0,9 eine weitere Probe („Übergang") entnommen Das oben angegebene Supplementierungsschema für das Belitzky-Minimalmedium ist so eingestellt, daß ab einer OD50O von 0,8 bis 1 ,0 Stickstoffmangel eintritt und somit die stationäre Phase eingeleitet wird Weitere Probennahmen erfolgten nach weiteren 30, 60, 90 und 120 min Die Proben wurden nach Entnahme sofort mit demselben Volumen, auf O0C gekühlten Killmg Puffer (20 mM NaN3, 20 mM Tπs-HCI, pH 7,5, 5 mM MgCI2) versetzt Nach sofortigem Abzentπfugieren des Zellpellets für 5 min bei 4°C und 15 000 rpm wurde der Überstand verworfen und das Pellet entweder bei -80°C eingefroren oder sofort weiter aufgearbeitet
Zellaufschluß
Der Zellaufschluß erfolgte mit dem „Hybaid RiboLyser™ Cell Disruptor" (Fa Thermo Electron Corporation, Dreieich, Deutschland) Diese Methode basiert auf der mechanischen Zerstörung der Zellwand und der Zellmembran mit Hilfe von ca 0,1 mm kleinen Glasperlen (Fa Sartonus BBI, Melsungen, Deutschland) Die aufzuschließenden Zellen, die zuvor in Lysis-Puffer Il (3 mM EDTA, 200 mM NaCI) resuspendiert worden waren, wurden zusammen mit den Glasperlen in ein Glas- (Stammhaltungs-)röhrchen gegeben Zusätzlich wurde saures Phenol dazugegeben, um die Degradation der RNA durch RNasen zu vermeiden Dieses Röhrchen wurde daraufhin in den RiboLyser eingespannt, wobei unter starkem Schuttein die Glassperlen mit den Zellen kollidierten, was den Zellaufschluß bewirkte
Gesamt-RNA-Isolierung
Nach dem Zellaufschluß wird die RNA-haltige wäßrige Phase durch Zentrifugation von den Protein- und Zellfragmenten, der chromosomalen DNA und den Glassperlen getrennt und daraus die RNA mit Hilfe des Geräts KmgFisher ml_ (Fa Thermo Electron Corporation, Dreieich, Deutschland) unter Verwendung des MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Fa Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) isoliert Diese Aufreinigung basiert auf der Bindung der RNA an magnetische Glaspartikel in der Gegenwart von chaotropen Salzen, welche auch die Inaktivierung von RNasen bewirken Dabei dienen die magnetischen Partikel als Transportmittel der RNA zwischen verschiedenen Reaktionsgefäßen, die mit Bindungs-, Wasch- und Elutionspuffern befullt sind Der hierfür genutzte KmgFisher mL ist eine Art Pipettterroboter, der mit Hilfe von Magneten die Partikel mit der gebundenen RNA zwischen den Gefäßen hin- und hertransportiert und auch zum Mischen der Proben genutzt wird Abschließend wird die RNA von den magnetischen Partikeln gelost und liegt gereinigt vor
RNA-Qualitats- und -Quantitätskontrolle
An die Aufreinigung der RNA schließt sich die Quahtats- und Quantitatskontrolle an Der hierfür genutzte Apparat Agilent Bιoanalyzer 2100 (Fa Agilent Technologies, Berlin, Deutschland) ermöglicht die Analyse von RNA im Lab-on-a-Chιp-Maßstab Zusammen mit dem „RNA 6000 Nano Kit" von Agilent wird die Gesamt-RNA gelelektrophoretisch aufgetrennt und bietet somit die Möglichkeit der Untersuchung der Qualltat in Hinblick auf Teilabbau und Verunreinigungen Hierbei wird πboso- male RNA (16 S- und 23 S-rRNA) detektiert Stellen diese sich als klare Banden dar, kann man davon ausgehen, daß die RNA im Verlauf der Bearbeitung nicht abgebaut wurde und somit intakt ist und in die nachfolgenden Untersuchungen eingebracht werden kann Zusätzlich wird dabei auch die genaue Konzentration bestimmt
Transkriptomanalysen
Die Transkriptomanalysen wurden mit gesamtgenomischen S licheniformis DSM13-DNA-Mιcroar- rays durchgeführt, die auf herkömmliche Weise (beispielsweise gemäß WO 95/11995 A1) hergestellt worden waren und über ein optisches System auswertbar sind Auf diesen DNA Microarrays lag nahezu jedes Gen aus B licheniformis in doppelter Ausfuhrung vor, so daß zwei Proben parallel auf demselben Chip analysiert und die erhaltenen Werte gemittelt werden konnten Das Prinzip der vorgenommenen Messung besteht dann, daß die jeweiligen mRNA-Molekule aus der entnommenen Probe In vitro über eine reverse Transkription in DNA umgeschrieben werden, wobei eines der zugesetzten Desoxynbonukleotide einen Farbmarker trägt Diese markierten Moleküle werden dann mit den bekannten, auf bekannten Stellen des Chip liegenden Sonden hybridisiert und die jeweilige Starke des an den betreffenden Stellen auf den Fluoreszenzmarker zurückzuführenden Signals optisch erfaßt Bei Verwendung zweier verschiedener Fluoreszenz- marker für eine Kontrolle und für eine eigentlich zu untersuchende Probe, die gleichzeitig zur Hybridisierung gebracht werden und somit um die Bindung an die vorgelegte Sonde konkurrieren, gelangt man zu unterschiedlichen Farbwerten, die ein Maß für das Verhältnis der Konzentration der Kontrolle zur Konzentration der Probe liefern
Für diese Markierung wurde dUTP gewählt, welches mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 oder mit Cyanin 5 markiert war So wurden jeweils 25 μg Gesamt-RNA der Kontrolle (OD50O 0,4) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 (Fa Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) und 25 μg Gesamt-RNA der jeweiligen Streßprobe (transiente Phase, 30, 60, 90 und 120 mm) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 5 (Fa GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) markiert Die kompetitive Hybridisierung der beiden Proben auf dem herkömmlichen, gesamtgenomi- schen ß //c/ien/form/s-DSMIS-DNA-Microarray erfolgte für mindestens 16 Stunden bei 42°C
Nach dem Waschen der Arrays zur Entfernung unspezifischer Bindungen erfolgte die optische Auslesung der Arrays mit Hilfe des ScanArray® Express Laser Scanners (Fa PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Jugesheim, Deutschland) Alle Hybridisierungen wurden wiederholt, wobei die Proben mit dem jeweiligen anderen Farbstoff markiert wurden (Dye-Swap-Verfahren) Die quantitative Auswertung der Arrays wurde unter Verwendung der Software ScanArray® Express (erhältlich von der Fa PerkinElmer Life and Analytical Sciences Rodgau-Jugesheim, Deutschland) nach Herstellerangaben und unter Standard-Parametern durchgeführt
Unter Zuhilfenahme der Kontrollen der Lucidea Score Card (Fa GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) wurden die Arrays normalisiert und evaluiert Mit Hilfe dieser „Score Card", welche zur Kontrolle der Effizienz und Qualität der Hybridisierung dient, waren entsprechend den Herstellerangaben bekannte Kontroll-DNA und sogenannte Spikes in Form von Oligos auf das Array aufgebracht und in der Hybridisierung mit komplementären Sequenzen versetzt worden Somit konnte man nach dem Scannen den Erfolg der Hybridisierung und des Einbaus der Farbstoffe kontrollieren Die Kontrollen sollten in beiden Proben in gleicher Menge vorhanden sein und somit nach dem Scannen gelb erscheinen beziehungsweise eine Ratio zwischen beiden Kanälen von 1 aufweisen Die Spikes sind für die jeweilige Probe spezifisch, und werden in verschiedenen Verdünnungen aufgebracht, das heißt sie erscheinen nach dem Scannen für die jeweilige Probe rot oder grün Für die Expression der Gene wurden Mittelwerte aus den zwei Hybridisierungen sowie die jeweiligen Standardabweichungen errechnet. Für eine signifikante Induktion oder eine signifikante Repression werden folgende Schwellenwerte für das Verhältnis der RNA-Menge des jeweiligen Gens gegenüber dem Kontrollwert betrachtet: Als induziert gelten die Gene, deren RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens eine Verdreifachung) aufweist; deutlich reprimiert sind Gene mit einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem Absenken auf weniger als 30%). Diese Resultate werden in Beispiel 2 aufgelistet.
Beispiel 2: Unter Stickstoffmanqel induzierte Gene
In folgender Tabelle 1 sind alle in Beispiel 1 ermittelten 210 Gene von Bacillus licheniformis DSM13 aufgeführt, deren (mindestens den Faktor 3 betragende) Induzierung unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Stickstoffmangels beobachtet wurde. In den ersten beiden Spalten sind der jeweilige Name des abgeleiteten Proteins beziehungsweise (soweit vorhanden) dessen Abkürzung abgegeben; die „BLi-Nummer" entspricht dem „locusjag" des unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) zugänglichen Gesamtgenoms von ß. licheniformis; anschließend folgen die zu den oben angegebenen Zeitpunkten beobachteten Faktoren zur Steigerung der Konzentration der jeweils zugehörigen mRNAs.
Tabelle 1 : Die in Beispiel 1 ermittelten 210 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren (mindestens den Faktor 3 betragende) Induzierung unter Stickstoffmangel beobachtet wurde (Erläuterungen: siehe Text).
Beispiel 3: Speziell unter Stickstoffmangel deutlich induzierte Gene
Wie Tabelle 1 zeigt, sind unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Stickstoffmangels zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte insgesamt 67 der in Beispiel 1 untersuchten Gene von Bacillus licheniformis DSM 13 um mindestens den Faktor 8 induziert worden Hierunter waren allerdings auch 18 Gene, die auch durch den Mangel an mindestens einer anderen Verbindung induziert worden sind (Daten nicht gezeigt) und deshalb nicht als spezifische Signale für einen Stickstoffmangel angesehen werden können
Somit verblieben 49 Gene, die zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens um den Faktor 8 induziert worden sind und die als vergleichsweise spezifisch eingestuft werden können Sie sind in folgender Tabelle 2 zusammengestellt Deren Spaltenbezeichnungen sind dieselben wie im vorangegangenen Beispiel Zusätzlich sind in der ersten Spalte die Sequenznummern angegeben, die die jeweiligen DNA- beziehungsweise Aminosäuresequenzen in dem zur vorliegenden Anmeldung gehörenden Sequenzprotokoll tragen Besonderheiten der jeweiligen Sequenzen, die im Sequenzprotokoll als freier Text auftauchen, sind unter der Rubrik Genname / Genfunktion ergänzt Tabelle 2: Die in Beispiel 1 ermittelten 62 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren speziell durch Stickstoffmangel hervorgerufene Induzierung zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 8 betragen hat (Erläuterungen: siehe Text).
In folgender Tabelle 3 sind dieselben 49 Gene noch einmal in der Reihenfolge der beobachtenen Stärke der Induktion aufgelistet. In dieser Reihenfolge werden im Beschreibungsteil die zugehörigen Bezeichnungen in deutscher Sprache angegeben. An der umgekehrten Reihenfolge orientiert sich die Staffelung der Anspruchsgegenstände.
Tabelle 3: Die in Beispiel 1 ermittelten 49 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren speziell durch Stickstoffmangel hervorgerufene Induzierung zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 8 betragen hat, in absteigender Reihenfolge des jeweils gemessenen Maximalwerts (letzte Spalte).
Beispiel 4: Real-Time-RT-PCR-Quantifizierung ausgewählter Gene
Mit Hilfe der Real-Tιme-RT-PCR ist es möglich, die absoluten Molekulzahlen von spezifischen Transkripten in einer Probe zu ermitteln Es wurde der LightCycler (Fa Roche Diagnostics, Penz- berg, Deutschland) in Verbindung mit dem "SYBR Green I"-Kιt (Fa Roche Diagnostics) genutzt Diese Methode basiert auf der Detektion der Bindung des fluoreszierenden Farbstoffs an doppelstrangige DNA Die Quantifizierung der spezifischen mRNA-Molekule erfolgte wie in Tobisch et al (2003, Quantification of Bactenal mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System, BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8) beschrieben, wobei für jede zu untersuchende mRNA eine externe Standardkurve erstellt wurde
Dazu wurden Verdünnungen bekannter Konzentrationen von /n-wfro-Transkπpten der in Beispiel 1 ermittelten und Beispiel 2 aufgelisteten mRNA mit Hilfe des LightCyclers gemessen und dann unter Verwendung der gerätespezifischen Software die Standardkurve erstellt Dazu mußten im Vorfeld für jede zu untersuchende mRNA spezifische Primer ausgewählt werden (mit Hilfe der Software „Array Designer"; erhältlich von der Firma PREMIER Biosoft International, PaIo Alto, USA), die eine Synthese von /n-vrtro-Transkripten sowie die PCR-Amplifikation im LightCycler ermöglichen.
Nach Herstellung der externen Standardkurve konnte mit der Messung im LightCycler begonnen werden. Für die Messungen wurden zwei unterschiedliche Verdünnungen für jede zu analysierende Probe eingesetzt. Im LightCycler-Lauf wurde dann mit den jeweiligen Primern das spezifische Transcript amplifiziert und die Einlagerung des Farbstoffs gemessen.
Unter Verwendung der LightCycler-Software sowie des auf der Webseite http://molbiol.ru/ger/scripts/01_07.html zugänglichen Skripts (2.12.2004) konnte die genaue Molekülzahl für ausgewählte Transkripte ermittelt werden. Mit den auf diese Weise erhaltenen Werten und deren Relationen zueinander wurden für die ausgewählten Transkripte die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Induktionswerte bestätigt.
Beispiel 5: Real-Time-RT-PCR-Quantifizierunq der Gene alnA, nrqB und tnrA
Die Gene glnA (SEQ ID NO. 13), nrgB (SEQ ID NO. 3) und tnrA wurden einer weiteren Real-Time- RT-PCR unterzogen, wie sie im vorangegangen Beispiel beschrieben ist. Bei tnrA handelt es sich um das in SEQ ID NO. 99 dargestellte Gen für einen globalen, an der Stickstoff-Stoffwechsel- Regulation beteiligten Transkriptionsregulator (Angabe im Sequenzprotokoll: <223> tnrA - transcriptional pleiotropic regulator involved in global nitrogen regulation - BLi 01490). Dieses 333 bp umfassende Gen ist aus ß. licheniformis DSM 13 erhältlich und in der oben angegebenen Datenbank unter der Nummer BLi 01490 erfaßt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID NO. 100 angegeben.
Diese Messungen wurden wiederum mit dem LightCycler-Gerät unter Verwendung des "SYBR Green detection Kit" durchgeführt. Die Gen-spezifischen Primer wurden mit dem Programm Array Designer 2.0 (PREMIER Biosoft International, PaIo Alto, USA) abgeleitet und von der Firma Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Für die Quantifizierung der spezifischen mRNA wurde eine externe Standardkurve, mit Hilfe eines /n-wϊro-Transkripts, erstellt. Die Erstellung des /n-w'fro-Transkripts erfolgte unter Verwendung einer T7 Polymerase, des Gen-spezifischen PCR- Produktes sowie des „DIG-RNA-Labeling"-Kits (Fa. Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland). Die Konzentration und Qualität des /π-wfro-Transkripts wurden photometrisch bestimmt.
Eine Verdünnungsreihe (1 ng bis 100 fg Endkonzentration) des /n-w'fro-Transkripts wurde erstellt und mit MS2-RNA (Endkonzentration 0,5 μg/μl; Roche Diagnostics) den forward-und reverse- Primern und dem LightCycler-RNA-Master-SYBR-Green 1-Kit (Roche Diagnostics) als Mastermix, laut Herstellerangaben, gemischt. Die Standardkurve für das spezifische Gen wurde anhand des Herstellerprotokolls für den RNA-Master-SYBRGreen I-Kit erstellt (Amplifikation, Segment 2, Temperatur: 57°C; Amplifikation, Segment 3, Inkubationszeit: 16 s). Das Ergebnis des LightCycler- Laufs wurde mit Hilfe der LightCycler-Software und der „Second-derivative-maximum"-Methode ausgewertet und die Qualität der RT-PCR-Produkte über die Schmelzpunktbestimmung überprüft.
Für die Messungen der RNA-Proben wurden Verdünnungsstufen von 500 ng bis 5 ng der Gesamt- RNA erstellt und mit MS2-RNA (Endkonzentration 0,5 μg/μl), den spezifischen Primerpaaren sowie dem LightCycler-RNA-Master-SYBR-Green I-Kit gemischt. Für den Real-time-RT-PCR-Lauf mit dem LightCycler-Gerät wurden dieselben Bedingungen angewendet, die auch für die Erstellung der Standardkurve genutzt wurden.
Als Negativkontrolle diente RNase-freies Wasser mit MS2-RNA in einer Endkonzentration von 0,5 μg/μl. Eine ausgewählte Verdünnung einer Probe aus der Standardkurve wurde jeweils während des LightCycler-Laufs mitgeführt.
Die Auswertung der LightCycler-Messungen erfolgte mit der LightCycler-spezifischen Software. Mit Hilfe der Standardkurve und der „Second-derivative-maximum"-Methode war es möglich die Molekülmengen der spezifischen RNA in der gemessenen Probe zu bestimmen.
Die in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellten Ergebnisse beziehen sich jeweils auf die Molekülmengen während der logarithmischen Phase, welche jeweils auf 1 gesetzt worden sind (Kontrolle). Die Probennahmen erfolgten zum Zeitpunkt des Eintritts der N-Limitierung, der wie oben erläutert mit dem Übergang in die stationäre Phase verbunden ist (Transiente Phase), sowie 30, 60 und 120 min nach diesem Übergang.
Tabelle 4: Real-Time-RT-PCR-Quantifizierung der Gene glnA, nrgB und tnrA mit dem Eintritt eines Stickstoffmangels und dem damit verbundenen Übergang in die stationäre Phase
Man erkennt, daß bei dieser Messung alle drei Gene glnA, nrgB und tnrA mit dem Eintritt eines Stickstoffmangels und dem damit verbundenen Übergang in die stationäre Phase verstärkt, im falle von tnrA bis zu 15,24fach stärker als während der exponentiellen Wachstumsphase und damit verbundener optimaler Stickstoffversorgung exprimiert werden. Sie eignen sich somit als erfindungsgemäße Markergene zum Anzeigen eines eintretenden Stickstoffmangels. Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Schematische Darstellung des /W-//πe-Monitoring eines Bioprozesses mit erfindungsgemäßen elektrischen DNA-Chips
Die zeitnahe Überwachung des Bioprozesses geschieht vorteilhafterweise über folgende Arbeitsschritte:
1. Probennahme, beispielsweise aus der Fermentation eines Mikroorganismus;
2. Zellaufschluß über Routine-Methoden;
3. RNA-Isolierung über Routine-Methoden;
4. Hybridisierung auf einem erfindungsgemäß mit Nukleinsäuren (beispielsweise DNA) oder Nukleinsäure-Analoga (beispielsweise schwer hydrolysierbaren, analog aufgebauten Verbindungen) beladenen Chip;
5. Erfassung der elektrischen Signale eines entsprechend konstruierten Elektro-Chips; alternativ wäre auch die Aufnahme optischer Signale von einem optischen DNA-Chip möglich;
6. Vorzugsweise Rechner-gestützte Datenauswertung.
Bei Einsatz elektrischer Chips ergibt sich nach derzeitigem Entwicklungsstand eine ungefähre Gesamtanalysenzeit von weniger als 2 h, bei Einsatz konventioneller optischer DNA-Chips von ca. 12 h.

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure-bindender Chip, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 50 Gene: kdgR, citA, für ein putatives Protein (putativer ABC-T ransporter / Aminosäure-Permease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 91), htrA, ycnl, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 41), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 53), yppF, yqjN, ggt, alsR, glnA, nrgA, yciC, yvtA, nrgB, für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 19), für ein putatives Protein (ATP- Bindungsprotein eines putativen ABC-T ransporters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81), tnrA, wobei die Gesamtzahl aller für den Stickstoff-Stoffwechsel spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 80 liegt.
2. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anpruch 1 , zunehmend bevorzugt dotiert mit den dort angegebenen Sonden in der dort angegebenen Reihenfolge.
3. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anpruch 1 oder 2, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Sonden aus den folgenden 34 Genen ausgewählt ist/sind: für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 19), für ein putatives Protein (ATP-Bindungsprotein eines putativen ABC- Transporters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine- Glycinpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydroge- nase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81 ), tnrA; vorzugsweise aus den folgenden 20 Genen: trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81), tnrA; besonders bevorzugt aus den folgenden 12 Genen: nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd- Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81); ganz besonders bevorzugt aus den folgenden 4 Genen: für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81).
4. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dotiert mit mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 50 der genannten Sonden.
5. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10 liegt.
6. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei den genannten Sonden um solche handelt, die auf die betreffenden, beziehungsweise höchsthomologen, in vivo transkribierbaren Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche, die von den betreffenden, beziehungsweise höchsthomologen, in vivo transkribierbaren Genen eben dieses Organismus abgeleitet sind.
7. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
8. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 7, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
9. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 7, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
10. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 7, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E coli JM 109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
11. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet ist/sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 und 99 aufgeführt sind.
12. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , zusätzlich dotiert mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen(en) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
13. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein handelt, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase, eine Hemicellulase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
14. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt wird/werden.
15. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden in Form einer DNA oder eines Nukleinsäureanalogs, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt wird/werden.
16. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden Genbereiche umfaßt/umfassen, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
17. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren anspricht/ansprechen, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
18. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden eine Länge von weniger als 200 Nukleotiden, vorzugsweise von weniger als 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 20 bis 60 Nukleotiden, ganz besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden aufweist/aufweisen.
19. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei durch die Bindung der mRNA an die betreffende genannte Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst wird.
20. Gleichzeitige Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 50 Gene: kdgR, citA, für ein putatives Protein (putativer ABC-T ransporter / Aminosäure-Permease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 91), htrA, ycnl, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 41), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 53), yppF, yqjN, ggt, alsR, glnA, nrgA, yciC, yvtA, nrgB, für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 19), für ein putatives Protein (ATP- Bindungsprotein eines putativen ABC-T ransporters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81), tnrA, gebunden an einen Nukleinsäure-bindenden Chip, vorzugsweise an denselben, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Gesamtzahl aller für den Stickstoff-Stoffwechsel spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 80 liegt.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21 , wobei die in Anspruch 20 angegebenen Sonden in der dort angegebenen Reihenfolge zunehmend bevorzugt eingesetzt werden.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für Gene aus den folgenden 34 Genen spezifisch ist/sind: für ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 19), für ein putatives Protein (ATP-Bindungsprotein eines putativen ABC- Transporters) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvIA, yncE, yvlB, für ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine- Glycinpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd- Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81), tnrA; vorzugsweise für Gene aus den folgenden 20 Genen: trpC, für ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase / Lysozym) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 45), für ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95), nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium- Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff- Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81), tnrA; besonders bevorzugt für Gene aus den folgenden 12 Genen: nasD, für ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd- Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81); ganz besonders bevorzugt für Gene aus den folgenden 4 Genen: für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-Il) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81).
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 von gleichzeitig mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 50 der genannten Sonden.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10 liegt.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 25 zur Bestimmung einer Änderung im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus, vorzugsweise zur Detektion eines Stickstoffmangelzustands.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 26, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 und 99 aufgeführt sind.
28. Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines Nukleinsäure-bindenden Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei eine Änderung im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Stickstoffmangelzustand.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder S. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
33. Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
34. Verfahren nach Anspruch 33 oder vorzugsweise 32, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97 oder 99 abgeleitet sind.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 34, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 35, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
38. Verfahren nach Anspruch 36, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
39. Verwendung eines Nukleinsäure-bindenden Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Bestimmung des physiologischen Zustande eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
40. Verwendung nach Anspruch 39, wobei eine Änderung im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Stickstoffmangelzustand.
41. Verwendung nach Anspruch 39 oder 40, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
42. Verwendung nach Anspruch 41 , wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
43. Verwendung nach Anspruch 41 , wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B agaradherens, B stearothermophilus, B globigu oder B lentus, und ganz besonders um ß licheniformis
Verwendung nach Anspruch 41, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E coli RV308, E coli DH5α, E coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf)
Verwendung nach Anspruch 44 oder vorzugsweise 43, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 oder 99 abgeleitet sind
Verwendung nach einem der Ansprüche 39 bis 45, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips
Verwendung nach einem der Ansprüche 39 bis 46, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt
Verwendung nach Anspruch 47, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt
Verwendung nach Anspruch 47, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen
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