KR0135456B1 - 결핵 진단용 탐침 - Google Patents

결핵 진단용 탐침

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KR0135456B1 KR1019950007771A KR19950007771A KR0135456B1 KR 0135456 B1 KR0135456 B1 KR 0135456B1 KR 1019950007771 A KR1019950007771 A KR 1019950007771A KR 19950007771 A KR19950007771 A KR 19950007771A KR 0135456 B1 KR0135456 B1 KR 0135456B1
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Abstract

본 발명은 하기의 염기 서열을 지닌 올리고뉴클레오타이드로 구성된 결핵균 진단용 탐침에 관한 것이다.
DTBF(센스프라이머) : 5'-GCCTACGAATACATCGCCACC-3'
DTBB(안티센스프라이머) : 5'-GGAGACGAAGCTGATCACTTC-3'

Description

결핵 진단용 탐침
제1도는 IS6110 결합 프라이머와 본 발명의 프라이머간의 PCR 반응을 비교한 전기영동 사진이다.
제2도는 본 발명의 프라이머의 결핵균 특이성 시험시 나타난 전기영동 사진이다.
본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 진단을 위한 탐침(probe)에 관한 것이다. 더욱 상세히는 단시간에 결핵 감염 여부를 진단하는데 사용하는 유전자의 중합효소연쇄반응(PCR)에 의한 결핵균에 특이적인 진단용 탐침에 관한 것이다.
종래에 결핵에 관한 PCR 진단용 탐침으로서 IS6110에 특이한 결합을 할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 많이 사용해 왔으나 IS6110은 이전가능한 유전요소(transposable genetic element)로서 결핵균간에 그 카피수가 일정치 않고 또 어떤 경우에는 이를 유전자내에 가지고 있지 않은 경우도 있음으로 진단의 신뢰도가 낮은 단점이 있었다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 모든 결핵균의 유전자에 공통적으로 일정하게 존재하는 유전자인 메티오닐-tRNA 신쎄타제(methionyl-tRNA synthetase)의 유전자 염기 서열로부터 이 유전자에 특이하게 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 결핵 진단에 사용함으로써 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 진단 대상물질인 메티오닐-tRNA 신쎄타제(methionyl-tRNA synthetase)는 생체내 20개의 아미노산이 단백질 합성에 참가할 수 있도록 tRNA에 해당 아미노산을 전달해 주는 아미노아실-tRNA 신쎄타제류 중의 하나이며, 생체내에서 메티오닌과 개시제(initiator) 및 엘롱게이터 메티오닌 tRNA(elongator methionine tRNA)를 결합시켜 주는 효소이다.
이들 효소는 생명체의 성장에 필수적이므로 모든 세포에 공통적으로 존재한다. 그러나 이를 발현하는 유전자는 각 종마다 특이적 염기 서열을 가지며 이러한 종 특이 염기 서열을 이용하면 각 개체의 메티오닐-tRNA 신쎄타제의 발현 유전자에 특이 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 고안할 수 있다. 본 발명 물질은 최근 클로닝(cloning)을 통하여 밝혀진 결핵균의 메티오닐-tRNA 신쎄타제 발현 유전자 염기 서열로부터 이 유전자의 코우딩과 논코우딩 스트랜드에 각각 결합할 수 있는 23개의 뉴클레오타이드로 구성된 올리고튜클레오타이드(oligonucleotide)를 합성하였다.
본 발명의 목적은 본 발명 물질을 이용하여 결핵에 관한 감염 여부를 단 시간내에 진단하는 탐침을 제공하는데 있다. 즉 본 발명 물질을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통합함으로써 좀 더 정확하고 능률적인 결핵 진단용 탐침을 제공하는 것이다.
본 물질은 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드로서 최근 유전자의 염기 서열이 알려진 결핵균의 메티오닐-tRNA 신쎄타제 발현 유전자를 주형(template)으로 하여 코우딩(coding)과 논코우딩 스트랜드(noncoding strand)에 각각 특이 결합할 수 있도록 고안되었으며 일반적인 유전자 합성 방법을 이용하여 화학적으로 합성하였다.
본 발명의 결핵 진단에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머(primer)의 염기 서열은 다음과 같다.
DTBF(센스프라이머) : 5'-GCCTACGAATACATCGCCACC-3'
DTBB(안티센스프라이머) : 5'-GGAGACGAAGCTGATCACTTC-3'
따라서 이 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 결핵균과 혼합하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실행할 경우, 결핵균의 메티오닐-tRNA 신쎄타제의 발현 유전자와 결합하여 유전자 일부를 증폭하게 되며, 이는 전기영동등의 방법을 통해서 확인할 수 있다.
더욱 상세히는, 상기 염기 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드는 결핵균의 유전자중에서 메티오닐-tRNA 신쎄타제 발현 유전자의 해당 부위에 결합한다. 이러한 성질을 이용하여 PCR을 수행할 경우 두 개의 올리고뉴클레오타이드는 폴리머라제의 프라이머로 작용하여 결핵균의 메티오닐-tRNA 신쎄타제 발현 유전자 일부를(약 500 염기짝) 증폭하게 된다. 이렇게 증폭된 PCR 물질은 전기영동에 의해 분리되어 확인되게 된다.
또한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법에 의한 결핵 진단용 키트로 개발할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 함유한 키트내에 발색단을 지닌 지시제를 첨가하여, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 결핵균의 메티오닐-tRNA 신쎄타제와 중합효소연쇄반응(PCR)이 실행됨을 비색판독(color detection)할 수도 있다.
이하 본 발명의 실시예를 통하여 결핵 진단방법을 더욱 상세히 설명한다.
[실시예 1]
본 발명의 실시예를 통하여 결핵 진단방법을 더욱 상세히 설명한다.
결핵균의 메티오닐-tRNA 신쎄타제의 발현 유전자에 특이하게 결합하는 프라이머의 제조를 위해, DNA 합성기로 올리고뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하였다. 합성된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 증류수에 용해하여 UV 스펙트로 포토메터를 사용하여 정량하였으며, 합성된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 MetRS 프라이머라 명명하였다.
[실시예 2]
PCR 반응을 위한 검체의 제조
실험에 사용한 Mycobacterium 균주들은 Lowenstein-Jensen 배지에 배양한 뒤 4000g에서 10분간 원심분리하여 균을 수획하고, 이를 10mM Tris HCl(pH 8.3), 1mM EDTA, 100mM NaCl 혼합용액에 현탁하고 100℃에서 10분간 처리한 후 PCR에 사용되는 균주검체로 이용하였다.
[실시예 3]
IS6110 결합 프라이머와 MetRS 프라이머 간의 PCR 반응 비교 시험
100pmole의 ISO6110 결합 프라이머와 MetRS 프라이머를 5μl의 균체용액이 함유된 10mM 트리스-HCl(pH 8.4), 50mM KCl, 0.1mg/ml 젤라틴, 1.5mM MgCl2 혼합용액에 첨가한 후, 여기에 20nmole의 dNTP와 5unit의 Taq 폴리머라제를 첨가하여 반응을 수행하였다. 유전자의 증폭을 위해 터모사이클러(thermocycler)를 사용하여 95℃에서 1분, 72℃에서 1분간을 35회 반복하였다.
이때 사용되는 균체용액은 Mycobacterium tuberculosis(ATCC 27294)를 함유하는 균액을 2×10-2, 4×10-4, 8×10-6으로 희석하여 사용하였고, 본 실험에서 합성한 프라이머(MetRS primers)와 기존에 사용되고 있는 프라이머인 IS6110의 프라이머 세트(IS I1/I3와 I2/I4)를 사용하였다.
PCR 반응으로부터 얻어진 유전자의 단편은 1.0% 아가로즈를 사용하여 전기영동후 확인하였다. 전기영동후에 나타난 PCR 반응 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 탐침의 진단 감도(sensitivity)는 IS6110 탐침에 비해 동등하거나 우수한 것으로 판명되었다.
실시예 4
MetRS 프라이머의 결핵균 특이성 시험
본 발명의 프라이머의 결핵균에 대한 특이성을 알아보기 위하여 결핵균이 속한 Mycobacterium 속 내에서 열가지 유사 균주를 선발하여 실시예 3과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다.
제2도는 MetRS 프라이머에 대한 결핵균의 특이성을 나타낸 것으로 결핵균인 마이코박테리움 튜버클로시스(Mycobacterium tuberclosis)와 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)를 제외하고는 다른 Mycobacterium 종에서는 양성반응이 일어나지 않았다. 제2도는 그 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
이때 사용되는 균주는 제2도의 좌에서 우로 순서대로 Mycobacterium tuberculosis(ATCC 27294), Mycobacterium bovis ATCC(19210), Mycobacterium avium(ATCC 25291), Mycobacterium fortuitum(ATCC 6841), Mycobacterium chelonei(ATCC 19977), Mycobacterium gordonae(ATCC 14470), Mycobacterium kansasii(ATCC 12478), Mycobacterium scroflaceum(ATCC 19981), Mycobacterium smegmatis(ATCC 19420), Mycobacterium terrae(ATCC 15755)이다.
M. tuberculosis와 M. bovis는 분류학상 상호 유사성이 매우 높으며 공히 결핵균의 집단으로서 분류된다. 기존의 IS6110에 대한 플라이머 역시 이들 두 균종에 대하여 반응하는 것으로 알려져 있다. 본 실시예의 결과는 본 발명의 프라이머가 결핵균에 대하여 특이성이 매우 높은 것을 시사하고 있다.
위의 결과를 종합할 때 본 발명의 프라이머는 결핵균에 대해 진단 감수성(sensitivity)와 특이성(specificity)이 매우 높으며, 기존의 IS6110에 대한 탐침에 비해 대상 유전자가 결핵균의 생존에 필수적이고 개체당 카피수가 일정해 결핵의 진단에 있어 더욱 신뢰성 있는 결과를 나타낼 것으로 판단된다.

Claims (3)

  1. 하기의 염기 서열을 지닌 올리고뉴클레오타이드로 구성된 결핵균 진단용 탐침
    DTBF(센스프라이머) : 5'-GCCTACGAATACATCGCCACC-3'
    DTBB(안티센스프라이머) : 5'-GGAGACGAAGCTGATCACTTC-3'
  2. 제1항의 올리고뉴클레오타이드가 결핵균내의 메티오닐-tRNA 신쎄타제와 중합효소연쇄반응(PCR)의 수행 여부를 전기영동등의 방법으로 측정하여 결핵감염 여부를 진단하는 방법.
  3. 제1항의 올리고뉴클레오타이드와 메티오닐-tRNA 신쎄타제와 효소중합연쇄반응을 측정할 수 있는 지시제등을 첨가하여 제조된 결핵 진단용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20020063122A (ko) * 2001-01-26 2002-08-01 (주)네오딘 결핵균 검출용 키트 및 그 검출방법

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