KR20020089314A - 폐수 중의 폴리포스페이트-축적 유기체를 검출하기 위한프로브 및 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐수로부터 인을 생물학적으로 제거할 수 있는 폴리포스페이트-축적 유기체의 확인법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체를 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 제공한다. 본 올리고뉴클레오타이드는 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA에 특유한 12 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 가진다. 본 발명은 또한 폴리포스페이트-축적 유기체의 검출 방법을 제공한다.

Description

폐수 중의 폴리포스페이트-축적 유기체를 검출하기 위한 프로브 및 프라이머 {PROBES AND PRIMERS FOR THE DETECTION OF POLYPHOSPHATE ACCUMULATING ORGANISMS IN WASTEWATER}

가정 폐수는 일반적으로 지구 부영양화를 방지하기 위해서 폐수로부터 탄소(C), 질소(N) 및 인(P)과 같은 영양소를 제거하도록 디자인된 활성 슬러지 공정으로 처리된다(Metcalf and Eddy, 1991). 상기 공정은 생물학적으로 매개되고, 폐수로부터 상기 영양소를 섭취하여 성장 및 분열 세포에 도입하거나 영양소를 분해하는 미생물에 의존한다. 예를 들어, 니트레이트는 이질소(dinitriogen)로 환원되어 대기로 방산될 수 있다(Seviour and Blackall, 1999).

활성 슬러지 공정의 미생물은 직경이 약 100 ㎛인 3차원 응집체인플록(floc)으로서 성장한다. 이들 플록은 중력 침강에 의해 처리 폐수로부터 분리될 수 있으나, 상기 분리 공정은 실패하기 쉬워 이를 처리하는데 호주에서만 매년 수십만 달러의 비용이 허비된다. 상기 실패 원인으로는 2가지 주요 원인이 존재한다:

1. 처리수로부터 바이오매스가 분리되지 않는 고체 분리 문제.

섬유상 박테리아가 그 침강 및 조밀화를 방해하는 플록 사이의 브리지를 형성할 때 벌킹이 발생한다. 또한, 액체 표면 상에서 선택적으로 부유하는 소수성 섬유상 박테리아에 의한 바이오매스의 과성장은 바이오매스의 단일 분획으로의 완전한 분리 및 액체의 다른 분획으로의 완전한 분리를 곤란하게 만든다. 이러한 문제는 포말 형성(foaming)으로 언급된다.

2. 적절한 활성 미생물 집단의 상실.

폐수 미생물 집단 중의 특정 미생물 군락은 P 또는 N의 섭취 및 제거 기능을 담당한다. 상기 군락이 특정 수 미만으로 감소하면 이에 따라 P 및 N의 제거가 감소할 것이다.

폐수로부터 P의 제거는 화학적 침전 또는 증강된 생물학적 인 제거(enhanced biological phosphorus removal, EBPR)로 언급되는 공정에서 생물학적 메카니즘에 의해 달성할 수 있다. EBPR 활성 슬러지 플랜트의 기본적인 구조는 유입 폐수를 혐기 대역으로 보내어 2차 정화기로부터 재공급된 미생물 바이오매스와 혼합시켜 소위 혼합된 용액을 형성한다. 상기 혼합된 용액은 이어서 호기 대역으로 유동된 후, 2차 정화기에서 처리 폐수로부터 바이오매스가 분리된다. 폴리포스페이트-축적 유기체(PAO)(van Loosdrecht 등, 1997)는 상기 시스템에서 선택적으로 농축되고 과량의 포스페이트-축적이 호기 대역에서 발생한다. 성장하는 바이오매스(활성화된 폐슬러지)의 일부를 제거하면 폐수로부터 P가 순수하게 제거된다.

30 내지 40년에 걸친 EBPR 작동 경험에 의해 플랜드 작동자는 EBPR 공정을 보다 성공적으로 실시하였다(Hartley & Sickerdick, 1994). 그러나, 이러한 경험에도 불구하고, EBPR 미생물학의 연구는 EBPR 공정이 간헐적으로 실패하면서 중요해졌다. 폐수 처리 플랜트 작동자가 P 수준 모니터링에 의해 EBPR 공정 실패를 인지할 때까지, 상기 실패를 야기하는 미생물 집단의 변화는 이미 오랜 시간 동안 진행되어 왔고, 사실상 PAO는 미생물 집단에서 경쟁력을 상실할 정도의 낮은 수준에 도달할 수 있다. 또한, PAO는 분명하게 확인되지 않았고, P 제거를 위한 생화학적 경로는 규명되지 않은 상태이다. 연구자들은 EBPR 공정에서 관찰되는 총 화학적 전환을 수용하는 생화학 모델을 만들었다(Comeau 등, 1986; Wentzel 등, 1991).

박테리아 단리물의 대사 성능을 EBPR에 대해 제안된 생화학 모델에 적용하기 위해 많은 연구가 시도되어 왔다. 이들은 대부분 아시네토박터(Acinetobacter) 속의 단리물에 대해 연구를 집중하였는데, 이것은 상기 속의 구성원을 EBPR 슬러지로부터 쉽게 단리할 수 있고(Fuhs & Chen, 1975; Kerdachi & Healey, 1987; Wentzel 등, 1988), 일부 단리물이 EBPR에 대해 중요할 수 있는 일부 특성을 보이기 때문이다(Deinema 등, 1985; Streichan 등, 1990). 그러나, 아시네토박터가 EBPR에서 기능을 수행하지 않을 수 있다는 증거는 생물학적 모델과 관계없는 순수 배양물 성능(Bond, 1997; Tandoi 등, 1998) 및 EBPR을 수행하기에 충분히 높은 수로 아시네토박터가 존재하지 않는다는 것을 보여주는 EBPR 박테리아 집단의 분석(Bond, 1997; Cloete & Steyn, 1987; Kaempfer 등, 1996; Melasniemi 등, 1999; Wagner 등, 1994)을 포함한다. 그램 양성 박테리아, 예를 들어 미크로루나투스 포스포보루스(Microlunatus phosphovorus(Nakamura 등, 1995; Ubukata, 1994)), 그램 음성 람프로페디아(Lampropedia(Stante 등, 1997)) 및 악티노박테리아(Actinobacteria) 및 α-프로테오박테리아(α-Proteobacteria(Kawaharasaki 등, 1999))에 대해 일부 관심이 있었지만 다른 EBPR 관련 미생물의 연구는 제한된다. 그러나, 상기 박테리아가 PAO의 예라는 일반적인 의견의 일치는 존재하지 않았고, 실제로 문헌 [Mino 등 (1998)]은 하나의 우세한 PAO보다는 몇개의 상이한 박테리아 그룹이 중요할 수 있다고 결론지었다. 추정 PAO의 단리는 단리 전략에서 P 제거 표현형을 사용하는 쉬운 방법의 결여에 의해 제한된다.

폐수로부터의 인의 생물학적 제거를 증강시키는 기능을 수행하는 미생물의 확인이 처리 시스템의 효율적인 관리를 위해 요구된다. 또한, 초기 경보 시스템처럼 EBPR 공정이 실패하기 시작하면, 미생물 집단의 인 제거 능력을 평가하기 위해 상기 유기체의 수를 신속하게 측정할 수 있는 것이 바람직하다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체를 검출하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 샘플 중의 상기 유기체의 수준의 검출 또는 정량 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 1 실시태양에 따르면, 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체를 검출하기 위한, 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA에 특유한 12개 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브가 제공된다.

본 발명의 제 2 실시태양에 따르면, 폴리포스페이트-축적 유기체의 DNA의 PCR 증폭을 위한, 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA에 특유한 12개 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 제공된다.

본 발명의 제 3 실시태양에 따르면, (a) 16S rDNA의 한 가닥으로부터 선택되는 서열을 갖는 12 이상의 뉴클레오타이드의 제 1 올리고뉴클레오타이드; 및 (b) 상기 제 1 올리고뉴클레오타이드 서열의 하류의 상기 16S rDNA의 다른 가닥으로부터 선택되는 서열을 갖는 12 이상의 뉴클레오타이드의 제 2 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 여기서 상기 제 1 올리고뉴클레오타이드 및 제 2 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상은 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA에 특유한 서열을 갖는 것인, 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍이 제공된다.

본 발명의 제 4 실시태양에 따르면, (a) 샘플 중의 세포를 처리하여 세포 내용물을 고정시키는 단계; (b) 표지한 제 1 실시태양에 따른 올리고뉴클레오타이드 프로브가 16S rRNA와 상기 고정 세포 내에서 혼성화되게 하는 조건 하에서, 단계 (a)로부터의 상기 고정 세포를 상기 프로브와 접촉시키는 단계; (c) 상기 고정 세포로부터 혼성화되지 않은 프로브를 제거하는 단계; 및 (d) 상기 표지된 프로브-RNA 혼성체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의세포를 검출하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제 5 실시태양에 따르면, (a) 폴리포스페이트-축적 유기체의 세포로부터 핵산을 수득하는 단계; (b) 표지하거나 고정화한 제 1 실시태양에 따른 올리고뉴클레오타이드 프로브가 16S 핵산 분자와 혼성화되게 하는 조건 하에서, 단계 (a)로부터의 핵산을 상기 프로브와 접촉시키는 단계; (c) 필요한 경우, 혼성화되지 않은 프로브 및 표지된 프로브-핵산 혼성체를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 표지된 프로브-핵산 혼성체를 검출하는 단계를 포함하는 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의 검출 방법이 제공된다.

본 발명의 제 6 실시태양에 따르면, (a) 유기체의 세포를 용해시켜 게놈 DNA를 방출시키는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 변성 게놈 DNA를 제 3 실시태양에 따른 프라이머쌍과 접촉시키는 단계; (c) 상기 프라이머쌍을 상기 rDNA와 주기적으로 반응시켜 상기 유기체의 16S rDNA를 증폭하여 증폭 산물을 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의 검출 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의 수를 정량하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 폴리포스페이트-축적 유기체의 검출 또는 정량에 적합한 올리고뉴클레오타이드 프로브 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 폐수로부터 인을 생물학적으로 제거할 수 있는 폴리포스페이트-축적 유기체의 확인 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폐수 샘플 중의 상기 유기체의 존재 또는 폐수 미생물 집단의 인 제거 능력의 지표인 유기체의 수를 신속하게 평가하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 다양한 슬러지로부터 유래한 거의 완전한 16S rDNA 서열 및 공지의데이타베이스로부터의 서열로부터 제작한 계통발생도이다.

도 2는 서열분석 배치 반응기로부터의 혼합액의 형광 원위치(in situ) 혼성화 현미경 사진을 도시한다.

도 3은 16S rDNA 서열의 정렬이다.

도 4는 슬러지 P 함량(건조 중량 %)와 EUB338-프로브 양성 세포의 퍼센트로서 표 4의 모든 3종의 PAO 프로브에 결합하는 세포 % 사이의 상관관계를 도시한다.

하기 약어를 본원에서 사용하였다.

bp	염기쌍
C	탄소
CH	탄수화물
EBPR	증강된 생물학적 인 제거
FID GC	화염 이온화 검출기 기체 크로마토그래피
FISH	형광 원위치 혼성화
HRT	유체 체류 시간
N	질소
P	인
PAO	폴리포스페이트-축적 유기체
PCR	폴리머라제 연쇄 반응
PHA	폴리하이드록시알카노에이트
Pns	불용성 포스페이트
Psol	가용성 오르토포스페이트
Pt	총 오르토포스페이트
rDNA	리보좀 DNA
RFLP	제한효소 절편 길이 다형성
rRNA	리보좀 RNA
SBR	서열분석 배치 반응기
SEP	샌스판시스코 사우쓰이스트 수질오염 통제 플랜트(San Francisco Southeast Water Pollution Control Plant)
SRT	고체 체류 시간
Tm	용융 온도
Td	해리 온도
TSS	총 현탁 고형물
VSS	휘발성 현탁 고형물

DNA의 뉴클레오타이드의 1문자 코드는 문헌 [Biochemical Journal219, 345-373 (1984)]에 기재된 IUPAC-IUB 표준에 따른 것이다.

본원에서 사용된 용어 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 상기 용어의 변형은 언급된 대상(들)을 포함하고, 문장 내용 또는 어법상 그 용어의 배제적인 해석이 요구되지 않는 한 임의의 다른 대상(들)을 배제하지 않음을 의미한다.

본원에서 인용되는 각각의 문헌의 전체 내용은 본원에 상호 참고로 포함된다. 그러나, 문헌의 상호 인용은 그 문헌이 통상의 일반적인 지식을 구성함을 의미하지는 않는다.

본 발명자들은 폴리포스페이트-축적 유기체(PAO)에 농축된 슬러지를 생성시키기 위해서 실험실 규모의 서열분석 배치 반응기(SBR)을 이용하여 상기 슬러지 및 다른 슬러지로부터 16S rDNA 클론 라이브러리를 제조하였다. 특성이 결정된 16S rDNA 서열이 박테리아 아류 β-2 프로테오박테리아(β-2Proteobacteria)에 속하는 PAO에서 유리하고, 16S rRNA 서열이 로도사이클루스(Rhodocyclus) 종 및 프로피오니박터 펠로필루스(Propionibacter pelophilus)에 가장 밀접한 관련이 있음을 입증하는 증거가 제공된다. 본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머용 서열로서 사용될 수 있는, PAO의 16S rDNA에 특유한 서열이 있음을 놀랍게도 발견하였다. 상기 프로브는 PAO 검출을 위한 상이한 혼성화 기술에 사용될 수 있고, 상기 프라이머는 상기 유기체의 DNA 증폭용 PCR을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 제 1 실시태양의 16S rRNA- 또는 rDNA-지향 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머는 일반적으로 약 12 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 바람직한 길이는 15 내지 25 뉴클레오타이드이다. 특히 바람직한 제 1 실시태양의 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:

5'-CCGTCATCTACWCAGGGTATTAAC-3'

5'-CCCTCTGCCAAACTCCAG-3'

5'-GTTAGCTACGGCACTAAAAGG-3'

또한, 본 발명은 PAO와 밀접한 관련이 있는 유기체 검출용 프로브 또는 프라이머를 제공한다. 프라이머의 5' 말단에서 미스매치(mismatch)를 갖는 상기 프라이머도 허용된다. PAO와 밀접하게 관련된 유기체 검출을 위한 바람직한 프라이머는 하기 서열을 갖는다:

5'-AGGATTCCTGACATGTCAAGGG-3'.

다른 적합한 서열은 도 3에 제시된 서열 배열로부터 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 디자인시에 많은 고려 요인이 존재한다. 이들 요인에 대해 간단하게 설명한다.

특이성: 특이성은 프로브 및 프라이머 디자인의 제 1의 가장 중요한 고려사항이다. 이것은 미스매치(규정되지 않은 염기쌍)가 존재하지 않는 표적 유기체의 16S rRNA 및(또는) 16S rDNA에 상보적인 서열을 선택함으로써 달성된다. 비표적 유기체는 혼성화가 발생하지 않도록 프로브 또는 프라이머 서열에 대해 하나 이상의 미스매치를 가져야 한다. 혼성화 프로브 중의 최적 미스매치 위치는 올리고뉴클레오타이드의 중앙부에 존재하고, PCR 프라이머 중의 최적 미스매치 위치는 3'(신장부) 말단에 존재한다. 본 발명의 모든 프로브는 ARB 소프트웨어패키지(Strunk 등, 미공개)를 사용하여 특이성을 갖도록 디자인되었다. ARB에서 초기 디자인 후에 하기 파라미터를 평가하였다.

열역학적 고려 사항: 프로브 또는 프라이머의 혼성화는 물리적 파라미터에 의존적이며, 그 중에서 온도가 가장 중요하다. 따라서, 용용 온도(Tm) 또는 해리 온도(Td)(Keller, 1993)와 같은 프로브 또는 프라이머의 열역학 파라미터는 올리고뉴클레오타이드의 특이적 혼성화가 발생하는 조건을 결정한다.

접근가능성: FISH의 경우, 본 발명의 제 2 실시태양에 따르면, 리보좀의 접근가능성은 중요한 고려사항이다(Fuchs 등, 1998). 리보좀 중의 16S rRNA의 일부 영역은 다른 영역보다 접근하기기 어렵고, 가장 심한 경우 이들 부위에 대한 올리고뉴클레오타이드의 접근을 방해하여 검출을 불가능하게 만든다.

2차 구조 고려 사항: 올리고뉴클레오타이드는 자기 상보성을 가져 이량체 또는 헤어핀(hairpin) 구조를 생성시킬 수 있다. 프로브의 2차 구조는 이온 채널 막 바이오센서와 함께 사용될 때 중요한 디자인 파라미터이다.

본 발명의 제 2 실시태양에 따른 프라이머는 제 1 실시태양에서 마찬가지로 일반적으로 12 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 바람직한 길이는 12 내지 22 뉴클레오타이드이다.

본 발명의 제 3 실시태양에 따른 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍은 표적 서열의 한가닥에 어닐링하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 표적 서열의 다른 상보성 가닥에 어닐링하는 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함한다. PCR에서, 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 상보성 가닥으로 발생하는 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열의 하류에 위치하는 상보성 가닥에 어닐링하여 이중 가닥 증폭 산물을 생성시켜야 함을 이해할 것이다. 증폭 산물은 검출을 용이하게 하는 크기이다. 일반적으로, 표적 DNA의 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 부위는 50 내지 1,400 bp 떨어져 있다. 바람직한 분리 거리는 400 내지 1,000 bp이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 제 1 실시태양에 따른 프로브는 PAO를 검출하기 위한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 바람직한 혼성화 기술은 상기한 특이적 올리고뉴클레오타이드가 특히 적합한 FISH이다. 그러나, 상기 프로브는 이하에서 설명하는 다른 임의의 혼성화 기술에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 프로브를 이용하는 방법은 제 4 실시태양에서 정의된다. 프로브 표지는 프로브-RNA 혼성체의 원위치 검출에 적합한 임의의 표지일 수 있다. 바람직한 표지는 플루오로세인(fluorescein)과 같은 형광 표지이다. FISH 기술의 상세한 설명은 본원의 참고문헌 목록에 상세하게 언급된 문헌 [De Long 등 (1989)]에 기재되어 있다.

본 발명의 제 5 실시태양에 따르면, 제 1 실시태양의 프로브는 보다 일반적인 혼성화 기술 또는 특정 기술, 예를 들어 이온 채널 바이오센서에 사용될 수 있다. 구체적으로, PAO-유래 핵산은 막과 같은 불활성 지지체에 고정될 수 있다. 고정된 핵산에 대한 프로브의 혼성화 후에, 혼성체는 표지에 의해 검출된다. 특히 편리한 혼성화 기술은 슬롯 블롯 매니폴드(slot blot manifold), 예를 들어 문헌 [Stahl 등 (1988)]에 기재된 정량적 방법을 사용한다.

일반적인 혼성화 기술에 사용되는 프로브는 50 뉴클레오타이드 이하의 일반적인 길이보다 길 수 있다.

이온 채널 바이오센서에서, 프로브는 이온 채널 막 바이오센서에 부착된다. 표적 16S rDNA 또는 rRNA가 프로브에 결합할 때, 이온 채널 스위치가 작동된다. 스위치 작동은 전기 전도도를 저하시키고, 이것은 표적 핵산이 존재함을 의미한다. 바이오센서의 메카니즘은 문헌 [Cornell 등 (1997)]에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명에 따른 프로브의 표지는 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 표지일 수 있다. 예를 들어, 표지는 방사성 표지, 리포터 그룹(reporter group) 또는 합텐일 수 있다.

제 5 실시태양의 방법은 샘플 중의 PAO 세포의 수를 정량하기 위해 사용될 수 있다. 보다 일반적인 혼성화 기술과 함께, 상기 방법은 프로브-핵산 혼성체로부터 얻은 시그널과 표준치(들)을 비교함으로써 수행된다. 즉, 공지값의 세포 또는 공지량의 PAO DNA 및 샘플 중의 세포 또는 DNA의 정량적 기준을 제공하기 위해 사용되는 표준값으로부터의 시그널을 포함하는 표준치를 준비한다. 이온 채널 바이오센서는 스위치를 작동시킬 때 전기 전도도의 저하가 정량적 기준을 제공하기 때문에 세포 수의 정량적 결정에 특히 적합하다.

본 발명의 제 6 실시태양에서, PCR은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 16S rDNA 서열을 지수적으로 증폭하기 위해 사용된다. 미생물 검출에 사용하는 예는 문헌 [Burrell 등 (1998)]에 기재되어 있다. 증폭된 DNA의 검출은 당업자의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 증폭된 DNA는 아가로스 겔 전기영동 후에 염색하여 예상 크기의 DNA 밴드를 확인함으로써 분석할 수 있다. 다른 증폭 산물 검출 방법은 증폭된 DNA의 말단 사이에 위치한 DNA 영영에 상보성인 표지된 내부 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용한 혼성화, 특히 용액 혼성화를 포함한다. 내부 올리고뉴클레오타이드는 당업계의 숙련자에게 공지된 표지를 사용하여 표지할 수 있다. 예를 들어, 표지는 방사성 표지 또는 비방사성 표지, 예를 들어 비오틴일 수 있다. 닉 번역(nick-translation)을 사용하여 내부 프로브를 표지시킬 수 있다.

본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 표지는 적절한 경우 프로브 또는 프라이머를 구성하는 올리고뉴클레오타이드의 합성 동안 실시하거나 또는 합성 후에 실시할 수 있다. 프라이머 표지 방법은 문헌 [예를 들어 Sambrook 등 (1989)]에 기재되어 있다.

프로브 및 프라이머를 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트로서 제공할 수 있다. 키트는 하나의 프로브 또는 프라이머 및 방법 수행에 적합한 시약을 포함할 수 있다. 유리하게는, 표적 DNA의 PCR 증폭용 키트는 제 3 실시태양에 따른 하나 이상의 프라이머쌍을 포함한다. 정량 방법의 경우에, 키트는 하나 이상의 표준물질을 포함하는 것이 유리하다.

본 발명의 방법에 따르면, 슬러지 또는 폐수 샘플이 PAO를 포함하는지를 신속하고 편리하게 평가할 수 있고 샘플 중의 PAO 세포의 수준을 정량적으로 분석할 수 있다. 따라서, 폐수 시스템 관리자는 PAO 수준에 의한 시스템 내의 임의의 문제를 신속하게 진단할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 특히 이러한 측면에서 유용하다.

PAO 특이적 프로브 및 프라이머를 개발하기 위해서, 서열 정보가 필요하다. 다른 유기체의 PAO 16S rDNA 서열 및 16S rDNA 서열의 패널을 제작하여야 한다. 패널로부터, PAO 16S rDNA에 특유한 서열을 선택할 수 있다. 도 3의 서열 배열은 PAO에 특유한 서열의 확인을 위해 특히 적합한 패널을 구성한다.

본 발명의 다양한 실시태양에 사용되는 일반적인 기술은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 상기 기술은 문헌 [예를 들어 Sambrook 등 (1989)]에 기재되어 있다.

본 발명의 비제한적 실시예를 이하에서 설명한다.

실시예 1

폴리포스페이트-축적 유기체 검출용 프로브의 개발

본 실시예에서, 상이한 슬러지를 폴리포스페이트-축적 유기체에서 농축시키는 방법, 상기 슬러지로부터의 16S rDNA 클론 라이브러리의 제조 및 특성 분석과 FISH 프로브의 개발을 설명한다.

1.1 방법

폴리포스페이트-축적 유기체가 풍부한 슬러지의 생성

호주 퀸즈랜드 브리스반에서 2개의 슬러지(A 및 GRC 슬러지)를 생성시키고, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코에서 1개의 슬러지(B 슬러지)를 생성시켰다. A 및GRC 슬러지에 사용하기 위한 반응기 및 매질과 이들의 평가 방법은 문헌 [Bond 등 (1999a)]에 보고된 바와 같았다. 합성 폐수 혼합물(Bond 등, 1999a)을 사용한 증강된 생물학적 인 제거(EBPR)를 위한 혐기/호기 순환 조건에서 1.8 내지 2 ℓ의 서열분석 배치 반응기(SBR)를 작동하였다. SBR에는 pH 전극 및 휴대용 용존산소 전극을 설치하고, 2시간의 혐기 조건, 3.5시간의 호기 조건 및 0.5시간의 침강 조건으로 이루어지는 6시간의 작동 사이클을 유지하였다. 12시간의 유체 체류 시간(HRT)은 900 ㎖ 또는 1 ℓ의 매질을 혐기 기간의 처음 10분에 공급하고 900 ㎖ 또는 1 ℓ의 처리 상청액을 침강 단계의 마지막 5분 동안 제거하면서 유지시켰다. 혼합액은 호기 기간 동안 소모되어 고체 체류 시간(SRT)는 8 내지 10 d이었다.

A 슬러지로 유입되는 용액의 PO₄-P 농도는 57 ㎎ PO₄-P/ℓ로 증가하였고, GRC 슬러지에서는 28 ㎎/ℓ이었다. A 슬러지 중 유출액 PO₄-P 농도는 항상 검출 한계(0.05 ㎎ PO₄-P/ℓ) 이하였다. 이 시점에서, 혼합 A 배양물의 P%는 15.1%이었다. GRC 반응기의 성능은 12개월에 걸쳐 변동하였고, 규칙적인 안정한 작동 회수로 슬러지를 FISH에 의해 분석하여 P%를 측정하였다. 도 1에 제시한 GRC 슬러지로부터의 영상은 반응기 유출액이 6.7 ㎎ PO₄-P/ℓ이고 슬러지가 6.7% P를 포함할 때의 결과이다.

SBR로서 반응기 B도 또한 1 ℓ의 작업 부피, 23.5℃±2^o의 온도로 작동시키고, pH는 1% HCl 또는 40 g/ℓ의 Na₂CO₃용액의 첨가에 의해 7.15 내지 7.25의 범위로 조절하였다. 6시간 사이클은 1.83시간 혐기, 3시간 호기, 0.5시간 침강, 및 질소 기체를 이용한 흡입, 충진, 및 스트립을 포함하는 0.67시간으로 이루어진다. 12시간의 HRT는, 각각의 침강기 동안 반응기 내용물 500 ㎖을 회수하여 이를 신선한 영양 공급물 500 ㎖로 대체함으로써 유지하였다. 공급 및 유출 펌프의 일정 시각에서의 작동, 공기 및 질소 유동과, 혼합은 프로그램가능한 제어기로 조절하였다(모델 CD-4, Chrontrol Corp.제, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재). 동일 사이클 동안 침강기 직전에 혼합 반응기 내용물의 일부를 일일 1회 수동식으로 회수함으로써 SRT를 4 d(25% 의 폐기되는 바이오매스/d)로 유지하였다. 반응기 중 슬러지의 P%는 17.2%이었다.

혐기 조건은 다공성 확산기를 통하여 N₂기체로 연속적으로 버블링함으로써 유지하였다. 산소의 N₂-스트리핑은 대략 공급물 첨가 30분 전에 시작하였다. 호기 조건은 다공성 확산기를 통하여 주위 공기를 버블링함으로써 유지하였다. 공기 및 N₂의 유속은 대략 500 ㎖/분 이었다. 혐기성 및 호기 조건은, 반응기-중 산소 전극(M1016-0770, New Brunswick Scientific제, 미국 뉴저지주 에디슨 소재), 용존 산소 미터(모델 DO-40, New Brunswick Scientific제) 및 스트립 차트 기록기(모델 288, Rustrak Corporation제, 미국 뉴햄프셔주 맨체스터 소재)를 사용한 연속 측정에 의해 검증하였다.

영양 및 탄소 공급물을 개별적으로 첨가하였다. 영양 공급물은(ℓ 당) 259 ㎎의 NaH₂PO₄·2H₂O(50 ㎎ P/ℓ), 117 ㎎의 KCl, 119 ㎎의 NH₄Cl, 219 ㎎의MgCl₂·6H₂O, 14.4 ㎎의 MgSO₄·7H₂O, 45.9 ㎎의 CaCl₂, 8.3 ㎎의 효모 추출물, 0.24 ㎖의 10% HCl, 0.20 ㎖의 미량 원소 용액, 및 0.15 ㎖의 FeSO₄용액으로 이루어진다. 미량 원소 용액은 (ℓ 당) 300 ㎎의 H₃BO₃, 1 500 ㎎의 ZnSO₄·7H₂O, 75 ㎎의 KI, 300 ㎎의 CuSO₄·5H₂O, 367 ㎎의 Co(NO₃)₂·6H₂O, 150 ㎎의 Na₂MoO₄·2H₂O, 및 1,679 ㎎의 MnSO₄·H₂O로 이루어진다. FeSO₄용액은 2,054 ㎎/ℓ 의 FeSO₄·7H₂O이었다. 탄소 공급물은 농축 원액으로 첨가하였다(1 사이클 당 10 ㎖). 탄소 공급물은 영양 공급물 1 ℓ 당 425 ㎎의 CH₃COONa·3H₂O 및 30 ㎎의 카사미노산으로 이루어져 있다.

첫번째의 것이 혐기성 선별기(selector)로서 기능하는 6개의 바신(basin)을 연속하여 가지며 순수한 산소로 활성화된 슬러지 플랜트인 시티 오브 샌프란시스코 사우쓰이스트 수질 오염 통제 플랜트(City of San Francisco Southeast Water Pollution Control Plant, SEP)로부터의 혼합액을 반응기에 접종하였다. 혐기성 선별기 중의 높은 가용성 P 농도는 SEP 중 EBPR 유기체의 존재의 지표이다.

반응기 분석.혐기 및 호기 기간의 마지막에서의 상청 P 및 아세테이트 농도, 유출 P 농도, 및 슬러지 P%의 측정에 의해 3개의 모든 반응기(A, GRC, 및 B)의 성능을 피상적으로 평가하였다. P 및 아세테이트 농도는 제조한 각각의 공급물 배치에서도 측정하였다. 반응기 작동 동안 1주 또는 2주 간격으로 사이클 연구를 수행하였다. 상청 아세테이트 및 P 농도와, 세포 탄수화물 및 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 함량의 측정을 위해서는, 1회의 불연속적 사이클 동안 0.5시간 간격으로 반응기로부터 샘플을 수집하였다. A 및 GRC 반응기에 있어서는 분석 방법이 Bond 등 (1999a)에 의해 보고된 바와 같으나, B 반응기에서 이용한 과정은 이하에 보고한다.

화학 분석

포스페이트.가용성 오르토포스페이트(Psol)는, 바나도-몰리브데이트 비색정량법(Method 4500-P C; APHA 등, 1992)에 의해 GF/B-여과(P/N 1821025, Whatman International, Ltd.제, 영국 메이드스톤 소재) 또는 0.45 ㎛ 막 여과(P/N 60172, Gelman Sciences제, 미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재) 샘플에 대한 것이었다. 총 오르토포스페이트(Pt)는 퍼술페이트 소화법에 의한 것이었다(Method 4500-P B.5; APHA 등, 1992). 불용성 포스페이트(Pns)는 호기 기간의 마지막에 취한 샘플에 있어서의 (Pt - Psol)로 계산하였다.

아세테이트.아세테이트는, J&W Scientific DB-FFAP 0.53 mm 모세관 컬럼을 사용하여 화염 이온화 검출기 기체 크로마토그래피(FID GC)에 의해 여과(GF/B 또는 0.45 ㎛ 막 필터) 산성화 샘플에 대하여 분석하였다. 2 μL의 샘플을 주입하는 경우 분석 전에 샘플을 진한 H₃PO₄로 산성화하여 4℃에서 보관하였다. FID로의 담체 기체는 15 ㎖/분 의 유속의 N₂이며; H₂의 유속은 20 ㎖/분 이고 공기 유속은 250 ㎖/분이었다. 오븐 온도는 90℃에서 시작하여 50℃/분 으로 110℃로 구배되게 하고, 110℃에서 30 s 동안 유지시키고, 이어서 50℃/분 으로 130℃로 구배되게 하였다. 주입기 온도는 250℃였으며; FID는 가열하지 않았다.

폴리하이드록시알카노에이트.PHA는 하기와 같이 Riis 및 Mai(1988)의 GC 방법의 변형에 의해 측정하였다: 10 ㎖의 샘플을 25 mm 와트만(Whatman) GF/B 필터 상에서 수집하여 100℃에서 1시간 동안 즉시 건조시키고, 이어서 분석 전에 4℃에서 건조기에서 보관하고; 1 ㎖의 4:1의 1-프로판올:HCl 및 1 ㎖의 트리클로로에탄을 10 ㎖의 샘플 바이알 중의 각각의 샘플에 첨가하고, 이어서 뚜껑을 닫아 95 내지 100℃로 3 내지 4시간 동안 가열하였다. 샘플을 냉각시키고, 이어서 2 ㎖의 탈이온수로 추출하였다. 하부상 중 PHA를, 2 μL를 FID GC(유리 패킹 컬럼, 크로모소르브(Chromosorb) W-AW 80-100 메쉬 상의 10% AT-1000 수지, 바리안(Varian) 모델 3700 GC) 내로 주입함으로써 측정하였다. 2 μL 부피의 샘플을 하기 온도를 사용하여 분석하였다: 오븐, 250℃; 주입구, 250℃; FID, 220℃. 벤조산을 내부 표준물로서 사용하였다.

탄수화물(CH).총 CH는 하기와 같이 변형시킨 Jenkins 등 (1993)의 문헌에 기술되어 있는 안트론(anthrone) 방법에 의한 것이었다. 15 ㎖ 시험관에서 샘플을 1 ㎖로 희석시키고, 분석시까지 동결시켰다. 희석수를 시험관에서 예비동결시켜 대사 활성을 신속하게 중지시켰다. 가용성 CH를 와트만 GF/B-여과 샘플에 대하여 측정하였다. 이중 글루코스 표준 샘플을 각각의 샘플 배치와 함께 분석하였다.

총 현탁 고형물(total suspended solids, TSS) 및 휘발성 현탁 고형물(volatile suspended solids, VSS).TSS 및 VSS는 각각 표준 방법 2540B 및 2540E에 의한 것이었다(APHA 등, 1992).

미생물학적 분석

혼합 배양물의 현미경에 의한 검사.Bond 등 (1999a)에 의해 보고된 바와 같이, A, GRC 및 B 반응기와, 기타 반응기로부터의 혼합 배양물(슬러지)를 수집하고, 고정시키고, 프로빙하였다. 프로빙한 A 슬러지의 카운팅은 수동식으로 때때로 행하였는데, 상기 혼합 미생물 배양물은 상기 공정을 돕기 위하여 경미한 초음파 처리를 필요로 하였다(Bond 등, 1999). A 슬러지에 있어서, α, β(β-1 및 β-2 포함), 및 γ-프로테오박테리아, 악티노박테리아, 및 사이토파가-플라보박테리움 (Cytophaga-Flavobacterium)의 카운트를, (프로브 EUB338에 따라; Bond 등, 1999a-프로브에 대한 상세한 설명은 하기를 참조) 모든 박테리아의 비율로 측정하였다. 메틸렌 블루 및 그램 염색(Bond 등, 1999a)도 A 및 GRC 슬러지와, 기타 선별 슬러지 상에서 행하였다. B 슬러지에 있어서, 니세르(Neisser) 염색은 Eikelboom 및 van Buijsen (1981)의 문헌에 기술된 바와 같았으며, 그램 염색은 변형된 후커법(Modified Hucker Method)에 의한 것이었고, 인디아 잉크(India Ink) 염색은 Jenkins 등 (1993)의 문헌으로부터의 것이었으며, PHB 염색은 Murray (1981)의 문헌에 기술된 바와 같았다. 그램 및 메틸렌 블루 염색의 광학 현미경 사진은, PC에 연결된 하전 커플 장치를 통하여 Nikon Microphot FXA 현미경 상에서 획득하였다. 영상은 Adobe Photoshop에서 작성하였다. FISH 프로빙 샘플은 Zeiss LSM510 및 Zeiss Axiophot 상에서 관찰하였다. Zeiss LSM 510 공초점 레이저 주사 현미경은 Axiovert 100M SP 역위 광학 연구 현미경, 및 Plan-Neofluar 63x/ 1.25 갯수의 구경의 대물 렌즈를 이용하였다. 주사 시간은, 프레임 당 31.8 s, 및 4.48 μs의 화소 정지 시간이었다. 아르곤 레이저 488 nm 라인 및 HeNe 543 nm 라인을 영상화에 사용하였다. 프레임 크기는 512 × 512 화소였다. 도 1에 나타낸 영상은 LSM510로 취하였으며 Adobe Photoshop에서 작성하였다.

클론 라이브러리.박테리아 16S rDNA 클론 라이브러리를 동결 A, P (Bond 등, 1999) 및 B 슬러지로부터 추출한 게놈 DNA로부터 제조하고, 개개의 클론으로부터의 인서트를 증폭하여 이전에 기술된 방법을 사용하여 제한효소 절편 길이 다형성(RFLP) 분석법(Burrell 등, 1998)에 따라 분류하였다. 프라이머 530f를 사용하여 대표적인 RFLP-그룹의 클론을 서열분석하고, 계통적으로 분석하였다(Bond 등, 1995; Burrell 등, 1998). 선별한 클론 인서트를 일련의 프라이머를 이용하여 완전히 서열분석하였다(Blackall, 1994). 16S rDNA 서열의 계통 분석을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Dojka 등, 1998). 간략하게는, 서열은 소프트웨어 패키지 SeqEd(Applied Biosystems, 오스트레일리아)를 사용하여 편집하였다. 기본 국부 정렬 검색 도구(basic local alignment search tool, BLAST; Altschul 등, 1990)을 사용하여 각각의 편집된 서열을 입수가능한 데이터베이스와 비교하여 근사한 계통적 관계를 결정하였다. 모든 클론 서열을 CHECK_CHIMERA 프로그램(Maidak 등, 1999)으로 조사하여 임의의 키메라 서열을 확인하였다. 편집된 서열은 ARB 소프트웨어 패키지를 사용하여 정렬하고(Strunk 등, 미공개), 정렬체를 수동으로 다듬었다(refine). ARB 데이터베이스 중 적절한 도구를 사용하여, 16S rDNA 정렬체에 대한 전개 거리 분석을 실시함으로써 계통발생도를 제작하였다. 계통발생도 토폴로지의 견고성(robustness)은, 기무라(Kimura) 2-파라미터를 이용한 네이버-조이닝(neighbour-joining)을 사용한 부트스트랩(bootstrap) 분석법, 및 파시모니 (parsimony) 분석법(버전 4.0b2a of PAUP^*; Swofford, 1999)에 의해 시험하였다.

프로브 디자인, 합성 및 사용

ARB 소프트웨어 패키지 중 프로브 디자인 도구를 사용하여 PAO-특이적 프로브를 디자인하였다(Strunk 등, 미공개). 데이터베이스의 모든 서열의 비교 분석에 기초하여, 모든 다른 참조 서열과의 구별을 가능하게 하는 추정-PAO 서열 내의 특정 영역을 상기 프로그램에 의해 선별하였다. 그 후, BLAST를 사용하여 특이성에 대하여 서열을 확인하였다(Altschul 등, 1990). 디자인한 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, Genset(프랑스)에 의해 인도카르보시아닌 염료 CY3으로 5'-말단을 표지하였다. 상기 형광-표지 프로브를 파라포름알데히드 고정 A 슬러지를 이용하여 평가하였다. 최적의 프로브 엄격성을 위한 포름아미드 농도는, 0% 포름아미드에서 시작하여 5% 포름아미드 증분값에서 일련의 FISH 실험을 수행함으로써 결정하였다. 거의 최저의 엄격성 조건 하에서는, 형태학적으로 독특한 메틸렌 블루 양성 구균(coccobacillus) 클러스터가 PAO-프로브에 결합하는 유일한 세포였다. 따라서, 최적 포름아미드 농도는 상기 구균 클러스터를 참조하여 결정하였다. 이는, 16S rRNA가 PAO-프로브에 결합하는 순수한 배양물이 전혀 존재하지 않기 때문에 필요하였다. 유사한 접근법이 Erhart 등 (1997)에 의해 이용되었다. 일반적으로 슬라이드 상에 스폿팅한 임의의 하나의 개개의 샘플에 모든 3종의 디자인 PAO-프로브인 PAO462, PAO651 및 PAO846(하기 참조)를 적용하였다.

기타 슬러지에의 디자인 프로브의 사용. 최적 프로브 엄격성을 위한 포름아미드 농도를 결정한 후, 실험실 규모의 공정 및 최대 규모의 EBPR 플랜트로부터의 일련의 슬러지를 수집하고, 고정시키고, 새롭게 디자인한 프로브 PAO462, PAO651 및 PAO846로 프로빙하였다.

슬롯 블롯 혼성화

프로브의 표지. 제조업자의 지시에 따라, 디그옥시제닌(DIG) 올리고뉴클레오타이드 3'-말단 표지 키트(Boehringer Mannheim제, 독일 만하임 소재)를 사용하여 디그옥시제닌-ddUTP로 올리고뉴클레오타이드 프로브를 표지하였다. 표준 20 ㎕ 표지 반응물은 4 ㎕의 25 mM CoCl₂에 첨가된 100 pmole의 미표지 올리고뉴클레오타이드, 50 U의 말단 트랜스퍼라제, 1 ㎕의 1 mM 디그옥시제닌-11-ddUTP, 및 살균 증류수(최종 부피가 20 ㎕가 되게 함)을 포함한다. 표지 반응물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 1 ㎕의 20 ㎎/㎖의 글라이코겐 용액 및 1 ㎕의 200 mM EDTA의 첨가에 의해 표지 반응을 종결하였다. 0.1 부피의 3 M 아세트산나트륨 및 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하고, 이어서 -70℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 표지 올리고뉴클레오타이드를 침전시켰다. 12,000 g에서 5분 동안 원심분리한 후, 에탄올을 제거하고, 펠렛을 50 ㎕의 70% 냉 에탄올로 세정하였다. 단시간의 원심분리 후, 70% 에탄올을 제거하고, 펠렛을 진공 하에 건조시켰다. 마지막으로, 표지된 프로브를 20 ㎕의 밀리Q(milliQ) 살균수에 재현탁시켰다. 이어서, 표지된 대조군 DNA(제조업자에 의해 공급됨) 및 새롭게 표지된 프로브의 희석물을 나일론 막 상에 스폿팅함으로써 각각의 표지 반응의 수율을 평가하였다. 표지 프로브의 수율은, 화학발광 검출 후, 대조와의 비교에 의해 평가할 수 있다.

막으로의 RNA의 적용. 96℃에서 10분 동안 가열함으로써 모든 RNA 샘플을 변성시켰다. 약간의 진공 하에, PR648 슬롯 블롯 장치(Hoefer Scientific Instruments제, 미국 샌 프란시스코 소재)를 사용하여 양으로 하전된 습윤 나일론 막(Boehringer Mannheim제, 독일 만하임 소재) 상에 변성 RNA 샘플을 50 ㎕의 부피로 슬로팅하였다. 이어서, 5분 동안 자외선으로 조사하거나 80℃에서 1시간 동안 베이킹함으로써 RNA 샘플을 나일론 막 상에 고정화하였다. 정량적 혼성화에 있어서는, 각각의 변성 RNA 표적(표준 RNA 포함)의 10 ng 내지 40 ng의 순차적 희석물을 고정화하였다.

혼성화 및 세정. 5 ㎖의 혼성화 완충제(DIG Easy Hyb; 5x SSC, 0.1% N-라우릴사르코신, 0.02% SDS 및 1% 블로킹 용액) 중에서, 40℃에서 2시간 동안 막을 예비혼성화하였다. 5 ㎖의 혼성화 완충제 중 2 내지 5 ㎕의 프로브(슬롯 당 0.1 ㎕의 프로브; 10배 과량)를 사용하여 40℃에서 12 내지 16시간 동안 혼성화를 수행하였다. 모든 혼성화 단계는 Hybaid Mini 10 혼성화 오븐(Hybaid제, 영국 소재)에서 실시하였다. 이어서, 1 × SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, pH는 7로 조정함) 및 1% SDS를 포함하는 세정 완충제 중에서 동일 온도(40℃)에서 15분 동안 2회, 이어서 각각의 프로브에 대하여 결정된 T_d값에서 10분 동안 막을 세정하였다.

화학발광성 검출. 혼성화 및 엄격한 세정에 이어, 0.1 M 말레산, 0.15 MNaCl 및 0.3% 트윈(Tween) 20을 포함하며 NaOH로 pH를 7.5로 조정한 세정 완충제 중에서 5분 동안 막을 헹구었다. 높은 배경(background)을 배제하기 위하여, 1% Diploma 탈지유 분말을 포함하는 말레산 완충제(0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl, pH를 7.5로 조정)로 이루어지는 25 ㎖의 블로킹 용액에서 30분 동안 막을 블로킹하였다. 블로킹 후, 20 ㎖의 블로킹 용액 중 2 ㎕의 항-DIG-알칼리 포스파타제 용액(Boehringer Mannheim제, 독일 만하임 소재)으로 30 내지 60분 동안 실온에서 막을 인큐베이션하였다. 상기한 바와 같이 막을 25 ㎖의 세정 완충제 중에서 실온에서 15분 동안 2회 세정하고, 이어서 25 ㎖의 검출 완충제(0.1 M 트리스(Tris)-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5) 중에서 5분 동안 평형화하였다. 화학발광성 기질인 CSPD(디소듐 3-(4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리사이클로 [3.3.1.1^3,7]데칸]-4-일) 페닐포스페이트)(Boehringer Mannheim제, 독일 만하임 소재)를 검출 완충제 중에서 1/100으로 희석시키고, 각각의 막을, 1 내지 2 ㎖의 CSPD 용액을 포함하는 혼성화 백 중에 밀봉하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 막을 혼성화 백으로부터 잠시 꺼내어 와트만 3MM 페이퍼 상에 블로팅하여 과량의 CSPD 용액을 제거하고, (혼성화 백 내로 재밀봉한 후) 추가로 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 발광 반응을 증강시켰다. 이어서, LumiImager(Boehringer Mannheim, 독일 만하임 소재)를 사용하여 막을 가시화하고, 각각의 슬롯으로부터의 화학발광성 시그널의 수준을 LumiAnalyst 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.

정량적 혼성화 분석.화학발광성 시그널(BLU=Beohringer 광 유닛) 대 ng의RNA 를 플로팅함으로써 각각의 순차적 RNA 희석물에 있어서의 기울기를 생성하였다. 기울기 데이터를 사용하여 PAO의 퍼센트(%PAO)를 계산하는데, 단, 기울기는 0.85 초과의 회귀 계수를 가진다. 각각의 슬러지 RNA 샘플에 있어서 %PAO를 계산하는 데에 사용되는 식은 하기 수학식 1과 같았다:

상기 식에서,

θ_x는 특이적 혼성화 퍼센트(프로브 x에 혼성화하는 RNA 샘플의 퍼센트)이고,

P는 샘플 RNA에 대한 프로브 혼성화의 기울기이고,

P'은 공지된 순수 대조군 RNA(PAO 클론 유래의 RNA 전사체)에 대한 프로브 혼성화의 기울기이고,

x는 특이적 프로브이고,

c는 보편적인 박테리아 프로브인 EUB338이다.

1.2 결과

A, GRC 및 B 슬러지 작동

반응기 작동 데이터를 표 1에 나타내었다. A 및 B 슬러지에 있어서는, 몇몇 비교 데이타를 표 2에 또한 나타내었다. 비교 데이터는, 표 2의 첫번째 컬럼에 나타낸 바와 같이 다수의 문헌 자료원으로부터의 것이다.

실험실 규모의 시스템은 우수한 EBPR 공정 모델이었다. 표 1에 의하면, 모든 3개의 SBR이 EBPR를 수행하고 있는데, 이는 초기 혐기 단계 동안 바이오매스에 의해 P 방출 및 아세테이트 흡수가 존재하기 때문임이 나타났다. 이는, 공급 중및 혐기 단계의 마지막의 PO₄-P 및 아세테이트 데이터를 비교함으로써 알 수 있다(표 1). 혐기 단계 마지막에서의 PO₄-P 값을 유출물로부터의 값과 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이, 후속 호기 기간 동안 모든 슬러지는 과량의 P를 흡수하였다. A 및 B 슬러지는 과-P 제거 슬러지였는데, 상기 슬러지는 약 50%의 무기 폴리포스페이트와 같은 >15%의 PO₄-P를 포함하였다. GRC 슬러지는, 폐수로부터 >20 ㎎/ℓ의 PO₄-P를 제거할 수 있는 우수한 P 제거 슬러지이며(유입물 중 28 ㎎의 PO₄-P/ℓ와, 유출물 중 6.7 ㎎/ℓ을 비교), 6.7%P를 포함하였다(표 1).

본원에 나타낸 결과에 의하면, A 및 B 슬러지는 가장 최근에 보고된 슬러지보다 더 많은 P를 제거할 수 있으며, 종래 기술의 슬러지의 P% 중에서도 가장 큰 P%를 포함하였다(표 2 참조). 단지 Wentzel 등 (1988)의 문헌의 슬러지만이 이러한 2개의 슬러지와 비견할 만하였으며, 화학량론적 비교가 상기 모든 슬러지에 있어서 입수가능할 경우, 상기 데이터는 매우 유사하였다(표 2)

클론 라이브러리

A 슬러지 유래의 총 281개의 박테리아 16S rDNA 클론, P 슬러지 유래의 총 89개의 상기 클론, 및 B 슬러지 유래의 총 250개의 상기 클론을 RFLP로 평가하였다. 상기 슬러지를 16S rDNA 서열 생성을 위해 선택하였는데, 이는 상기 슬러지가 고성능 EBPR 시스템이어서(표 1), 특이적 FISH 프로브가 디자인될 수 있는 우수한 PAO 서열원이기 때문이다. 대표적인 그룹을 부분적으로 서열분석하여 전체 결과를 표 3에 나타내었다.

프로브 개발

다수의 공지된 FISH를 사용하여 그룹 프로빙 실험을 수행하였다. 상기 프로브의 상세한 사항은 표 4에 포함되어 있다. 표 5는, A 슬러지 및 다양한 P-제거 능력을 가지는 다수의 기타 슬러지로부터의 그룹 프로빙 결과를 포함한다. β-프로테오박테리아, 구체적으로는 β-2 프로테아박테리아가 A 슬러지 집단에서 우위를 점하였는데, 이는 PAO가 상기 박테리아 아류의 구성원이라는 것을 강력하게 암시하는 것이다. 모든 경우에 있어서, GRC 슬러지의 그룹 프로빙의 정량화를 수행하지는 않았으나, 도 2C(하기 참조)는 그의 메틸렌 블루 염색 결과를 예시한다. 현미경으로 조사한 EBPR 슬러지는 로간홀름 하수 처리 플랜트(Loganholme Sewage Treatment Plant) (최대 규모), 및 향상된 폐수 처리 센터(Advanced Wastewater Management Centre)의 연구원에 의해 작동되는 많은 실험실 규모의 반응기로부터의 슬러지(A, P, GRC, 염수 EBPR 및 탈질화 EBPR 슬러지; 상기 슬러지원에 대해서는 표 2 참조)를 포함하였다. 상기 모든 EBPR 슬러지에 있어서, PAO-프로브 결합 세포의 클러스터는 독특하면서도 균일하였으며, 도 2A 및 2C와 관련하여 하기에 논의한 세포와 닮았다.

상기에서 알 수 있듯이, 그룹 프로빙은 β-2 프로테오박테리아로서 PAO를 광범위하게 강조하였다(표 5 참조). 그러나, β-2 프로테오박테리아 프로브(BTWO23a)는 원래 단지 β-1 프로테오박테리아 프로브에 대한 경쟁체로서만 디자인되었다(BONE23a; Amann 등, 1996). 그의 특이성은, 상기 프로브가 β-3 프로테오박테리아, 몇몇 γ-프로테오박테리아 및 그린-비-황 분할 클론인 OPB9와, β-2 프로테오박테리아의 구성원을 (미스매치 없이) 표적화하기 때문에 광범위하다. 따라서, 추가의 더욱 특이적인 프로브가 β-2 프로테오박테리아 그룹을 표적화하는 데에 필요하였다. 이 때문에, β-2 프로테오박테리아에 속하는 A, P 및 B 슬러지로부터의 모든 클론을 프로브 디자인을 위한 제제에 있어서 완전히 서열분석하였다. 또한, 이전에 보고된 2개의 EBPR 및 비-EBPR 클론 라이브러리로부터의 β-2 프로테오박테리아에 속하는 부분적으로 서열분석된 클론(Bond 등, 1995), 및 비공개 라이브러리로부터의 슬러지 클론 SBRH147을 완전히 서열분석하였다.

A 슬러지 클론 중 계통적 그룹의 상대적인 비율(표 3 참조)는 FISH 프로빙에 의해 결정한 것(표 5 참조)과 매칭되지 않는다는 것을 알아야 한다. 본 발명자들은, 클론 라이브러리가 분석한 샘플의 미생물 집단 구조에 대한 정량적 데이터를 제공할 수 없다는 것을 인식하였다. 실제, 이는 PAO에 특이적인 프로브에 대한 필요성을 강조한다.

도 1은, PAO 프로브가 디자인된, 거의 완전하게 서열분석된 β-2 프로테오박테리아 클론의 계통발생도, 및 상기 프로브의 특이성을 예시한다. 슬러지 A, B, P, SBRH, SBR1, SBR2 및 GC(스트레일리아 퀸즈랜드 골드 코스트)로부터 16S rDNA 서열을 결정하였다. 기타 서열은 대중적으로 접근가능한 데이터베이스로부터 입수하였다. 분석에 있어서 루브리비박스 겔라티노수스(Rubrivivax gelatinosus)(D16213)를 아웃그룹으로 사용하였으나 계통발생도에서는 예시하지 않았다. 진화 거리 및 파시모니 분석을, 2000 부트스트랩 재샘플링법을 이용하여 PAUP^*에서 실시하였다. 노드에서의 폐쇄 환은 둘 모두의 분석으로부터의 >75% 부트스트랩 지지를 나타내며; 개봉 환은 둘 모두의 분석으로부터의 50 내지 75% 부트스트랩 지지를 나타내고; 절반 쉐이딩 환은, 하나의 알고리듬은 >75% 부트스트랩 지지를 제공하고 다른 하나는 50 내지 75% 부트스트랩 지지를 제공하는 분석에 대한 것이다. 코딩 P+++는 클론이 과-P 제거 슬러지(슬러지 중 대략 15%P)로부터 유래한 것임을 나타내고; P++는 우수한 P 제거 슬러지로부터 유래한 것임을 나타내며; P+는 상당한 P 제거능의 슬러지로부터 유래한 것임을 나타내고; P-는 비-P 제거 슬러지로부터 유래한 것임을 나타낸다. 공표된 β-2 프로테오박테리아 프로브(BTWO23a) 및 본 발명에서 디자인한 프로브(PAO-프로브 및 Rc988)의 특이성을 실선으로 나타내었다. 서열에 대한 실선은, 프로브가 그 서열과 100% 동일성을 가지지 않음을 나타낸다. 예를 들어 Rc988은 (1009 위치)에서 SBRP112 서열과 하나의 미스매치를 가진다. 프로브 BTWO23a는, 계통발생도에서 나타낸 서열을 특이적으로 표적화할 뿐만 아니라, (미스매치 없이) β-3 프로테오박테리아, γ 프로테오박테리아; 요오도박터 에스피피.(Iodobacter spp.), 크로모박테리움 에스피피.(Chromobacterium spp.), 크로마티움 에스피피(Chromatium spp.) 및 그린-비-황 분할 클론인 OPB9의 구성원들도 표적화한다. 스케일은 뉴클레오타이드 위치 당 0.02 뉴클레오타이드 변화를 나타낸다.

EBPR 슬러지 클론의 2개의 주요 클러스터가 관찰되었다(SBRA220 클러스터 및 GC4 클러스터, 도 1). 그러나, 단지 SBRA220 클러스터만은 오로지 고성능 EBPR 슬러지만으로 이루어져 있었다. 상기는 프로브 디자인에 있어서의 중심 그룹이 되었다. 3개의 PAO-프로브를 디자인하여 SBRA220 클러스트를 특이적으로 표적화하였으며, Rc988(표 5)로 불리우는 더 광범위한 특이성의 추가의 프로브를 디자인하였다. 모든 PAO-프로브를, 그의 경험적으로 결정된 최적 엄격성과 함께 표 4에 열거하였다.

과-P 제거 슬러지 클론인 P+++ SBRA220, P+++ SBRA245A, P+++ SBRB34 및 P+++ SBRP112에 있어서의 거의 완전한 16S rDNA 서열 및 기타 서열을 도 3에 정렬하여 나타내었다. 상기 서열로부터 유래한 PAO 프로브 및 Rc988 프로브의 역 상보체를 상기 도면에서 강조하여 나타내었다.

디자인한 프로브의 사용

상이한 작동 기간에서의 A 슬러지, GRC 슬러지, 및 로간홀름 슬러지를 포함하여 일련의 고정 슬러지를 표 4의 디자인 PAO-프로브로 평가하였다. 도 2A 및 2B는 EUB338(25 ng, 플루오레세인-표지) 및 모든 3종의 프로브의 혼합물(표 4, 각각 25 ng, CY3 표지)로 이중 프로빙한 슬러지의 공초점 레이저 주사 현미경 사진을 예시한다. 영상을 플루오레세인 및 CY3 채널에 대하여 수집하고, 인공적으로 착색시키고 이중으로 인화하였다. 화살표 표시가 된 세포는 PAO인데, 이는이들이 EUB338(회색-착색 세포) 및 PAO 프로브(영상에서 백색으로 나타나는 밝게 착색된 세포)로 이중 표지되기 때문이다. 도 2A는 표 1에 주어져 있는 바와 같은 작동 데이터를 가지는 SBR A로부터의 혼합액을 예시한다. 도 2B는 해산식품 가공 폐수 연구에 있어서, 3.5% NaCl에서 작동하는 EBPR SBR(슬러지 중 대략 10%P)로부터의, 경미하게 초음파 처리한 혼합액을 예시한다.

도 2C는 표 1의 데이터에 따라 작동시킨 GRC 슬러지의 명계 현미경 사진이다. 도 2C에 있어서, 세포는 폴리포스페이트를 염색하는 메틸렌 블루로 염색시켰다. 도 2C 중 화살표로 표시한 세포는 폴리포스페이트를 포함하는 것이며, 그의 세포 크기, 형태 및 배열은 도 2A 중의 밝은 세포와 매치한다. 도 2C에서 다이아몬드 형상의 테일을 가지는 화살표로 나타낸 세포는 폴리포스페이트를 포함하지 않는다. 도 2C 중 막대의 길이는 6 μm이다.

도 2D 및 2E에 예시한 현미경 사진은, 표지 PAO 프로브로 먼저 프로빙하고(도 2D), 이어서 메틸렌 블루로 염색한(도 2E) SBR A 슬러지로부터의 세포의 단일 클러스터의 것이다. 도 2D 중 화살표로 표시한 세포는 "밝은 세포"이며, 도 2E에서 다시 화살표로 표시한 메틸렌 블루로 염색된 세포에 해당하는 것으로 밝혀졌다. 현미경 사진의 몬톤(montone) 재생으로부터는 결정하기가 어렵기는 하지만, PAO 프로브에 결합하지 않는 세포는 상당히 더 어두웠으며 메틸렌 블루로 염색되지 않았다. 상기 세포는 다시 다이아몬드 형상 테일을 가지는 화살표로 표시하였다. 도 2D 중 막대는 4 μm를 나타낸다.

도 2D 및 2E의 결과에 의하면, PAO 프로브가 폴리포스페이트-축적 유기체에 특이적이라는 것이 명확하게 나타났다.

도 2는, 상기 모든 슬러지에 있어서, 특징적인 구균 클러스터가 PAO 프로브에 결합하며, EBPR 성능에 따라 다소간의 클러스터가 존재한다는 것을 예시한다. 예를 들어, 로간홀름 슬러지인 대략 10 ㎎ PO₄-P/ℓ를 포함하는 유입물을 포함하는 가정 폐수를 처리하는 최대 규모의 활성 슬러지 플랜트에 있어서, 중간 정도의 수의 클러스터가 관찰되었다. 다수의 클러스트는 A 슬러지와 같은 과-P-제거 시스템에서 관찰되었다(도 2A). 세포 카운팅에는 실험실 규모의 염수 EBPR 슬러지의 경미한 초음파 처리가 필요하였는데, 이는 도 2B에 있어서 PAO-프로브 결합 세포가 전형적인 클러스터로 배열하지 않는 이유를 설명한다. 그럼에도 불구하고, 모든 슬러지에서와 마찬가지로 염수 슬러지에서도, 3종의 PAO-프로브가 β-2 프로테오박테리아 프로브가 결합한 것과 동일한 세포에 결합하였다.

슬러지 샘플 중 PAO-프로브 결합 세포의 비율과 슬러지 P% 사이의 상관관계가 존재하는지를 평가하기 위한 실험도 수행하였다. 실험은, 상기에서 주로 수행한 FISH 분석 및 슬롯 블롯 분석을 포함하였다. 모든 3종의 PAO 프로브를 FISH 분석에서 사용하였으며, 반면, 슬롯 블롯 혼성화에는 PAO-651을 사용하였다(표 4 참조). 특정 샘플 중 총 박테리아 세포 수의 척도로서 EUB338 프로브를 사용하였다.

슬롯 블롯 분석에 있어서, 여러 16S rDNA 클론으로부터 RNA 전사체를 생성하였는데, 상기 중 하나는, 표준물로서 사용하기 위한 SBRA220(상기 참조)이었다. M13 벡터 중 16S rDNA 인서트는, 인서트 측면의 벡터 프라이머 또는 보편적 박테리아 프라이머인 1492R을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 적절한 T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사를 위한 주형으로는 정제 PCR 산물을 사용하였다. 정제 RNA 전사체는 대략 1,500 bp의 크기를 가지는 것으로 추정되었는데, 이는 이. 콜라이(E. coli)로부터 추출한 16S rRNA와 동일하였다. 전사체 제제 중 RNA의 농도는 320 내지 660 ng/㎕이었다.

시험 샘플로서, 세포의 용해, 고도의 변성 구아니디늄 이소티오시아네이트-포함 완충제의 존재 하에서의 균질화, 및 RNeasy 미니 스핀 컬럼으로의 에탄올성 균질물의 적용에 의해 활성 슬러지 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. 각각의 샘플로부터 추출한 RNA의 농도는, GeneQuant RNA/DNA 계산기를 사용하여 측정하였는데, 50 ng/㎕ 내지 400 ng/㎕ 범위인 것으로 밝혀졌다.

슬롯 블롯 혼성화는 상기 섹션 1.1에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 오스트레일리아 남동쪽 퀸즈랜드 내에서 7개의 폐수 처리 설비로부터 수집한 최대-규모활성 슬러지 샘플 및 실험 반응기 슬러지(상기 참조)로부터 RNA 추출물을 수득하였다.

다양하지만 안정한 P-제거 효율에서 GRC 슬러지, A 슬러지(상기 참조), 및 Bond 등(Bond 등, 1999a; Bond 등, 1999b; Bond 등, 1998)의 Q, P 및 S 슬러지에 대하여 FISH 분석을 수행하였다. FISH 및 슬롯 블롯 분석의 결과를 도 4A 및 도 4B에 각각 나타내었다. 큰 흑색 삼각형은 두 방법 모두를 사용하여 수득한 결과를 나타내며, 반면, 회색 삼각형은 최대-규모 슬러지에 있어서의 슬롯 블롯 혼성화 결과를 나타낸다. 도 4A 중 작은 삼각형은 해당하는 슬롯 블롯 데이터가 존재하지 않는 경우의 결과이다.

도 4는, PAO 프로브 결합 세포의 비율과 슬러지 P% 사이의 명확하고도 양성적인 상관관계가 존재한다는 것을 예시한다. FISH 분석에 의하면 회귀값이 0.937인 반면, 슬롯 블롯 혼성화에서는 심지어 큰 0.979의 값이 수득되었다. 그럼에도 불구하고 FISH 및 슬롯 블롯 평가는 비견할만하였다. 슬롯 블롯 분석에 의하면, 이러한 혼성화 기술을 사용하여 환경 RNA 샘플 중 PAO의 비율을 정확하게 측정할 수 있음도 입증되었다.

1.3 PAO-특이적 프로브의 이용

고도로 연관된 클론 서열 그룹(98% 이상 동일함)으로부터 디자인한 PAO-프로브는 β-2 프로테오박테리아와 관계가 있으며, β-2 프로테오박테리아를 위한 프로브가 결합하는 것과 동일한 A 슬러지 중 세포 클러스터에 결합하였다. β-2 프로테오박테리아 클론 서열(도 1 참조)에 가장 근접한 순수 배양 박테리아 친족체는로도사이클루스(알. 테누이스(R. tenuis) 및 알. 푸르푸레우스(R. purpureus))와, 프로피오니박터 펠로필루스로부터 유래한 것이었다. 아직 공표되지 않은 스위스 EBPR 슬러지 유래의 클론 서열(R6; Hesselmann 등, 1998)은 A, P 및 B 슬러지로부터의 완전한 클론 인서트를 포함하는 그룹 중에 존재하였다(도 1). 과-P-제거 A 슬러지중의 미생물 바이오매스의 거의 80%가 β 프로테오박테리아 프로브(BET42a)에 결합하였으며, 이들 모두는 β 프로테오박테리아(표 5)로서 PAO-프로브 양성이었다. 따라서, 상기 협력 프로빙 접근법의 사용에 의해(도 1 참조), 디자인 프로브가 A 슬러지 중의 우세한 β-2 프로테오박테리아에 고도로 특이적이라는 것이 입증되었다. 또한, PAO-프로브 양성 세포는 메틸렌 블루 염색에 의해 폴리포스페이트 양성으로 염색되는 세포의 형태, 크기 및 배열과 매치되었다(도 2). 다른 슬러지와 함께 사용할 경우, PAO-프로브 및 β-2 프로테오박테리아 프로브는 항상 동일한 세포에 결합하였다. 3종의 PAO-프로브를 다른 슬러지와 함께 동시 사용할 경우의 하나의 시범이 도 2에 주어져 있다.

P 슬러지(8.8%P; 45% β 프로테오박테리아), S 슬러지(12.3%P, 56% β 프로테오박테리아), 및 A 슬러지(15.1%P, 80% β 프로테오박테리아)에 대한 데이터를 비교할 경우, 슬러지 중 P%에 의해 판단되는 P 제거 성능의 증가와, β 프로테오박테리아의 수준 사이의 지시적 상관관계가 관찰되었다(표 5 참조). Q, P, 및 A 슬러지에 있어서의 데이터는 β 프로테오박테리아를 β-2 프로테오박테리아로 구체적으로 협소화하였다(표 5). GRC, Q, P, S 및 A 슬러지에 대하여 특이적 PAO-프로브로 상기 상관관계를 더욱 심도있게 조사할 경우, 슬러지 중 P%와, PAO-프로브 결합세포의 수 사이의 링크가 명료하게 입증되었다(도 4). 명확하게도, 특정 β-2 프로테오박테리아를 위한 디자인 PAO-프로브를 사용하여 슬러지 샘플 중의 실제 PAO를 검출할 수 있다.

당 업계의 숙련자라면, 본 발명의 광범위한 범위 및 범주로부터 벗어남이 없이 상기에 예시된 것 외의 다수의 상이한 프로브를 제조할 수 있다는 것을 알 것이다.

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Claims (19)

1. 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체를 검출하기 위한, 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA에 특유하며 12 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머.
2. 제 1 항에 있어서,

   12 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드.
3. 제 1 항에 있어서,

   15 내지 25 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드.
4. 제 1 항에 있어서,

   올리고뉴클레오타이드의 서열이 도 3의 서열 (서열 번호 1 내지 서열 번호 10) 중 하나로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
5. 제 1 항에 있어서,

   하기 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드:

   5'-CCGTCATCTACWCAGGGTATTAAC-3'(서열 번호 11)

   5'-CCCTCTGCCAAACTCCAG-3'(서열 번호 12)

   5'-GTTAGCTACGGCACTAAAAGG-3'(서열 번호 13).
6. 폴리포스페이트-축적 유기체와 관련된 샘플 중의 유기체를 검출하기 위한, 하기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머:

   5'-AGGATTCCTGACATGTCAAGGG-3'(서열 번호 14)
7. (a) 16S rDNA의 한 가닥으로부터 선택되는 서열을 갖는 12 이상의 뉴클레오타이드의 제 1 올리고뉴클레오타이드; 및 (b) 상기 제 1 올리고뉴클레오타이드 서열의 하류의 상기 16S rDNA의 다른 가닥으로부터 선택되는 서열을 갖는 12 이상의 뉴클레오타이드의 제 2 올리고뉴클레오타이드를 포함하되,

   여기서 상기 제 1 올리고뉴클레오타이드 및 제 2 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상이 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA에 특유한 서열을 갖는 것인, 폴리포스페이트-축적 유기체의 16S rDNA의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 프라이머쌍의 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 제 1항에 따른 올리고뉴클레오타이드인 프라이머쌍.
9. 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의 세포를 검출하는 방법으로서,

   (a) 샘플 중의 세포를 처리하여 세포 내용물을 고정시키는 단계;

   (b) 표지한 제 1항에 따른 올리고뉴클레오타이드 프로브가 16S rRNA와 상기 고정 세포 내에서 혼성화되게 하는 조건 하에서, 단계 (a)로부터의 상기 고정 세포를 상기 프로브와 접촉시키는 단계;

   (c) 상기 고정 세포로부터 혼성화되지 않은 프로브를 제거하는 단계; 및

   (d) 상기 표지된 프로브-RNA 혼성체를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서,

    상기 표지가 방사성 표지, 리포터 그룹(reporter group) 또는 합텐인 방법.
11. 제 9 항에 있어서,

    상기 검출이 형광성의 원위치(in situ) 혼성화에 의한 것인 방법.
12. 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의 검출 방법으로서,

    (a) 폴리포스페이트-축적 유기체의 세포로부터 핵산을 수득하는 단계;

    (b) 표지하거나 고정화한 제 1항에 따른 올리고뉴클레오타이드 프로브가 16S 핵산 분자와 혼성화되게 하는 조건 하에서 단계 (a)로부터의 핵산을 상기 프로브와 접촉시키는 단계;

    (c) 필요한 경우, 혼성화되지 않은 프로브 및 표지된 프로브-핵산 혼성체를 분리하는 단계; 및

    (d) 상기 표지된 프로브-핵산 혼성체를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서,

    상기 고정화가 불활성 지지체에 대한 것인 방법.
14. 제 12 항에 있어서,

    상기 검출이 이온 채널 바이오센서에 의한 것인 방법.
15. 제 12 항에 있어서,

    상기 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의 세포의 수를 정량화하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
16. 샘플 중의 폴리포스페이트-축적 유기체의 검출 방법으로서,

    (a) 유기체의 세포를 용해시켜 게놈 DNA를 방출시키는 단계;

    (b) 단계 (a)로부터의 변성 게놈 DNA를 제 7항에 따른 프라이머쌍과 접촉시키는 단계;

    (c) 상기 프라이머쌍을 상기 rDNA와 주기적으로 반응시켜 상기 유기체의 16S rDNA를 증폭하여 증폭 산물을 생성시키는 단계; 및

    (d) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서,

    상기 증폭 산물의 크기가 50 내지 1,400 bp인 방법.
18. 제 16 항에 있어서,

    상기 증폭 산물의 크기가 400 내지 1,000 bp인 방법.
19. 제 16 항에 있어서,

    상기 증폭 산물을 겔 전기영동 후에, 또는 혼성화에 의해 검출하는 방법.