EP0918530A1 - Herstellung immunstimulierender mittel auf basis von propionibakterien - Google Patents

Herstellung immunstimulierender mittel auf basis von propionibakterien

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EP0918530A1
EP0918530A1 EP97933674A EP97933674A EP0918530A1 EP 0918530 A1 EP0918530 A1 EP 0918530A1 EP 97933674 A EP97933674 A EP 97933674A EP 97933674 A EP97933674 A EP 97933674A EP 0918530 A1 EP0918530 A1 EP 0918530A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
preparation
propionibacteria
bacteria
agents based
immunostimulating agents
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97933674A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Block
Ernst Heinen
Norbert Schmeer
Gerhard Pulverer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/03—Bacteria

Definitions

  • the present invention relates to the production of immunostimulating agents based on propionibacteria.
  • Preparations for chemotherapy of tumors are known from DE-A 3 011 461 on the basis of the propionibacterial strains DSM 1773, 1772 and ATCC 6919.
  • the bacteria are propagated under anaerobic conditions in liquid culture in 1 liter vessels.
  • the bacterial cells are then centrifuged, ground, inactivated by boiling, subjected to trypsin treatment, centrifuged again and freeze-dried.
  • the preparation so produced can then be resuspended and e.g. administered by intravenous injection.
  • the manufacturing process described is complex and is an application of the means e.g. as an immunostimulating agent in the field of animal health in
  • the present invention relates to the preparation of an immunostimulating agent based on propionibacteria, which is characterized in that the bacteria are multiplied anaerobically in a liquid culture, that after the fermentation has ended, the bacteria are inactivated in a conventional manner so that the bacteria obtained in this way Cell mass is separated, washed and dried.
  • Propionibacterium avidum KP 40 deposited with the German Collection of Microorganisms under the number DSM 1772, is preferably used to produce the immunostimulating agents.
  • the whole-line preparations based on Propionibacterium avidum KP 40 (DSM1772) are obtained in a simplified process in liquid culture in fermenters.
  • the inoculation material used comes from a master stock. By using this seed principle, the use of a seed with a defined number of passages is guaranteed is identical in its properties to the strain deposited with the German Collection of Microorganisms
  • the bacteria are propagated via a pre-culture and a main culture under anaerobic conditions at 30-39 ° C, preferably at 35-37 ° C, in nutrient-rich liquid media, the yeast extracts, which can also be tryptically digested, protein hydrolysates, glucose and contain organic acids such as pyruvate, lacatate or ⁇ -ketoglutarate. Complex media such as brain-heart broth can also be used.
  • the preculture takes place in submerged stand cultures of 0.1-150 l volume for 18-30 hours.
  • the main culture is inoculated with the preculture.
  • the fermentation is carried out in controlled fermenters with a volume of 10-5000 1 with constant movement of the medium.
  • the fermentation time is 24-72 hours, preferably 40-56 hours, particularly preferably 48 hours
  • the bacteria are inactivated in the usual way by physical processes, for example the action of heat, UV or gamma radiation or chemical processes, for example the action of
  • the inactivation by heat takes place in fermenters at 60-120 ° C, preferably at 75-85 ° C for 15-60 minutes, preferably 30-45 minutes.
  • Chemical inactivation takes place in a known manner in suitable vessels, for example in fermenters.
  • Formaldehyde is preferably used in concentrations of 0.01-0.5%, particularly preferably 0.05-0.2%.
  • the inactivation takes place with constant movement of the inactivated material at 30-39 ° C., preferably at 35-37 ° C. over a period of 12-48 hours, preferably 18-30 hours
  • the inactivated bacterial cells are separated from the culture broth by filtration or by centrifugation in a batch or flow process
  • Filtration is preferably used using the countercurrent flow method using membranes with a pore size of 0.1-1 ⁇ m, preferably 0.22-0.45 ⁇ m.
  • This method also allows the bacterial cells to be concentrated and the culture broth and the formaldehyde pressure levels to be washed out aqueous, buffered solutions with physiological salt concentrations, such as 0.9% saline solution or phosphate-buffered saline solution.
  • physiological salt concentrations such as 0.9% saline solution or phosphate-buffered saline solution
  • the bacterial cells are separated off by centrifugation at a centrifugal acceleration of 5,000-20,000 xg in portions in a batch process or in a flow-through process
  • the sediments are resuspended in aqueous, buffered solutions with physiological salt concentrations, such as 0.9% saline solution or phosphate-buffered saline solution. This process is repeated several times to wash out the culture broth and the formaldehyde pressure levels
  • the bacterial cells are subjected to a drying process, such as spray drying or freeze-drying. Freeze-drying is preferably used, the resuspended bacterial cells being freeze-dried either in aliquots directly in the removal container or in larger portions and then weighed into removal containers Protective colloids or stabilizers, defoamers and preservatives added
  • the dried product is washed with a
  • Reconstituted solvents such as aqua dest, aqua purificata or 0.9% saline
  • Solution 1 is transferred to the fermenter after complete dissolution of all substances and sterilized together with the fermenter.
  • Solutions 2 and 3 are autoclaved separately for 15 minutes immediately after preparation at + 110 ° C.
  • Solutions 2 and 3 are added to solution 1 in the fermenter under sterile conditions Setting anaerobic conditions and checking the sterility, the fermenter is operated overnight at + 37 ° C, 100 revolutions per minute (rpm) and 1.5 l nitrogen / hour (N 2 / h). For preculturing, 100 ml culture medium are placed in a 100 ml Schott bottle transfers 1 ml of this medium to
  • Fermenter content mixed with 27 ml formaldehyde solution 36.5% (corresponds to 0.1% formaldehyde as the final concentration).
  • the inactivation takes place for 24 hours at + 37 ° C and reduced N 2 fumigation.
  • the fermenter contents are then drained off and worked up.
  • An inactivation control is created from this material (3 passages per week).
  • the inactivated material is centrifuged in portions at 10,000 xg for 15 minutes. The supernatant is discarded, the sediments are combined and washed twice in phosphate-buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the resuspended bacterial cells are then filled into 10 ml aliquots in sterile 25 ml bottles and freeze-dried.
  • the finished preparations are stored at + 4 ° C

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung immunstimulierender Mittel auf Basis von Propionibakterien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bakterien anaerob in einer Flüssigkultur vermehrt werden, daß nach Abschluß der Fermentation die Bakterien in üblicher Weise inaktiviert werden, daß die so erhaltene Zellmasse abgetrennt, gewaschen, filtriert und getrocknet wird.

Description

Herstellung immunstii-iuiierender Mittel auf Basis von Propionibakterien
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung immunstimulierender Mittel auf Basis von Propionibakterien.
Aus DE-A 3 011 461 sind Präparate zur Chemotherapie von Tumoren bekannt auf Grundlage der Propionibakterienstämme DSM 1773, 1772 und ATCC 6919. Zur Herstellung des Bakterienmaterials werden die Bakterien unter anaeroben Bedingungen in Flüssigkultur in 1 -Liter-Gefäßen vermehrt. Die Bakterienzellen werden dann abzentrifugiert, zermahlen, durch Kochen inaktiviert, einer Trypsinbe- handlung unterworfen, erneut abzentrifugiert und gefriergetrocknet.
Das so hergestellte Präparat kann dann resuspendiert und z.B. durch intravenöse Injektion verabreicht werden.
Das beschriebene Herstellverfahren ist aufwendig und steht einer Anwendung der Mittel z.B. als immunstimulierendes Mittel auf dem Gebiet der Tiergesundheit im
Wege. Es wurde daher nach Möglickeiten gesucht, das Herstellverfahren zu vereinfachen, ohne daß Wirksamkeit und Verträglichkeit der Präparation vermindert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines immunstimulie- renden Mittels auf der Basis von Propionibakterien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bakterien anaerob in einer Flüssigkultur vermehrt werden, daß nach Abschluß der Fermentation die Bakterien in üblicher Weise inaktiviert werden, daß die so erhaltene Zellmasse abgetrennt, gewaschen und getrocknet wird.
Es ist überraschend, daß auf diese einfache Weise ein gut wirksames und gleichzeitig gut verträgliches Präparat erhalten werden kann.
Zur Herstellung der immunstimulierenden Mittel wird bevorzugt eingesetzt Pro- pionibacterium avidum KP 40, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 1772. Man erhält die Ganzzeilpräparationen auf Basis von Propionibacterium avidum KP 40 (DSM1772) in einem verein- fachten Verfahren in Flüssigkultur in Fermentern. Das verwendete Animpfmaterial entstammt einem Master Stock. Durch Verwendung dieses Saatprinzipes ist die Verwendung eines Ausgangskeimes mit definierter Passagenzahl gewährleistet, der in seinen Eigenschaften identisch ist mit dem bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegten Stamm
Die Vermehrung der Bakterien erfolgt über eine Vor- und eine Hauptkultur unter anaeroben Bedingungen bei 30-39°C, bevorzugt bei 35-37°C, in nährstoffreichen Flussigmedien, die Hefeextrakte, die auch tryptisch verdaut sein können, Eiweiß- hydrolysate, Glucose und organische Sauren wie Pyruvat, Lakatat oder α- Ketoglutarat enthalten. Auch komplexe Medien wie Hirn-Herz-Bouillon können verwendet werden. Die Vorkultur erfolgt in Submersstandkulturen von 0, 1-50 1 Volumen für 18-30 Stunden Mit der Vorkultur wird die Hauptkultur beimpft Die Fermentation wird in geregelten Fermentern mit einem Volumen von 10-5000 1 unter standiger Bewegung des Mediums durchgeführt. Die Fermentationsdauer betragt 24-72 Stunden, bevorzugt 40-56 Stunden, besonders bevorzugt 48 Stunden
Nach Abschluß der Fermentation werden die Bakterien in üblicher Weise inaktiviert durch physikalische Verfahren, z B Einwirkung von Hitze, UV- oder Gamma-Bestrahlung oder chemische Verfahren, z B durch Einwirkung von
Ethanol, Formaldehyd oder ß-Propiolakton
Die Inaktivierung durch Hitze erfolgt in Fermentern bei 60-120°C, bevorzugt bei 75-85°C für 15-60 Minuten, bevorzugt 30-45 Minuten Die chemische Inaktivierung erfolgt in an sich bekannter Weise m geeigneten Gefäßen, z B in Fermen- tern Bevorzugt eingesetzt wird Formaldehyd in Konzentrationen von 0,01-0,5%, besonders bevorzugt 0,05-0,2% Die Inaktivierung erfolgt unter standiger Bewegung des Inaktivierungsgutes bei 30-39°C, bevorzugt bei 35-37°C, über einen Zeitraum von 12-48 Stunden, bevorzugt 18-30 Stunden
Die inaktivierten Bakterienzellen werden von der Kulturbrühe abgetrennt durch Filtration oder durch Zentrifugation im Batch- oder Durchflußverfahren Zur
Filtration wird bevorzugt eingesetzt die Gegenstrom-Durchflußmethode unter der Verwendung von Membranen mit einer Porengroße von 0,1-1 μm, bevorzugt 0,22- 0,45 μm Dieses Verfahren erlaubt auch eine Konzentrierung der Bakterienzellen und eine Auswaschung der Kulturbruhe sowie der Formaldehydruckstande mit wassrigen, gepufferten Losungen mit physiologischen Salzkonzentrationen, wie z B 0,9%ιge Kochsalzlosung oder phosphatgepufferte Kochsalzlosung Die Abtrennung der Bakterienzellen durch Zentrifugati on erfolgt bei einer Zentrifugalbeschleunigung von 5 000-20 000 x g portionsweise im Batch- Verfahren oder im Durchflußverfahren
Die Sedimente werden resuspendiert in wassrigen, gepufferten Losungen mit phy- siologischen Salzkonzentrationen, wie z B 0,9%ige Kochsalzlosung oder phosphatgepufferte Kochsalzlosung Zum Auswaschen der Kulturbruhe und der Formaldehydruckstande wird dieser Vorgang mehrfach wiederholt
Nach dem Auswaschvorgang werden die Bakterienzellen einem Trockenverfahren wie z B einer Sprühtrocknung oder einer Gefriertrocknung unterzogen Bevorzugt eingesetzt wird die Gefriertrocknung, wobei die resuspendierten Bakterienzellen entweder in Aliquots direkt im Entnahmebehältnis oder in größeren Portionen gefriergetrocknet und anschließend in Entnahmebehaltnisse eingewogen werden Die Bakteπenzellen werden hierzu gegebenenfalls mit Schutzkolloiden bzw Stabilisatoren, Entschäumern und Konservierungsmitteln versetzt
Vor der Verwendung der Praparationen wird das getrocknete Produkt mit einem
Losungsmittel, wie z B Aqua dest , Aqua purificata oder 0,9%ιge Kochsalzlosung rekonstituiert
Beispiel Herstellung einer Ganzzell-Bakteπen-Praparation
Material
PBS (SIGMA D8537)
NaOH-Stammlosung 10%
NaOH 100,00 g
VE-Wasser ad 1000,00 ml
Kulturmedium
Losung 1
Caseinhydrolysat 120,00 g
Hefeextrakt 120,00 g
L-Cystein-HCl 10,00 g
Starke 15,00 g
Na-Pyruvat 15,00 g
Magnesiumsulfat 10,00 g
VE-Wasser ad 7500,00 ml
Losung 2
Glucose 40,00 g
VE- Wasser ad 250,00 ml
Losung 3 Kaliumdihydrogenphosphat 40,00 g
NaOH-Stammlosung 10% 120,00 m
VE-Wasser ad 2250,00 ml
Losung 1 wird nach vollständiger Losung aller Substanzen in den Fermenter überfuhrt und zusammen mit dem Fermenter sterilisiert Losungen 2 und 3 werden unmittelbar nach Ansatz separat bei +110°C für 15 Min autoklaviert Losungen 2 und 3 werden unter Sterilbedingungen der Losung 1 im Fermenter zugesetzt Zur Einstellung anaerober Bedingungen und Überprüfung der Sterilität wird der Fermenter über Nacht bei +37°C, 100 Umdrehungen pro Minute (UpM) und 1 ,5 1 Stickstoff/Stunde (N2/h) betrieben Zur Vorkultivierung werden 100 ml Kultur- medium in eine 100 ml Schott-Flasche überfuhrt 1 ml dieses Mediums wird zum
Resuspendieren einer Konserve P avidum KP40 entnommen Die resuspendierte Konserve wird vollständig in die Schottflasche überfuhrt und der Deckel nur leicht angeschraubt Die Inkubation erfolgt unter anaeroben Bedingungen (GasPak, BBL) bei +37°C für 24 Stunden. Von dieser Vorkultur werden 100 ml unter Sterilbedingungen in den Fermenter überführt und für 48 Stunden bei +37°C, 100 UpM und 1,5 1 N2/h inkubiert. Danach wird die Fermentation gestoppt und der
Fermenterinhalt mit 27 ml Formaldehydlösung 36,5% versetzt (entspricht 0,1% Formaldehyd als Endkonzentration). Die Inaktivierung erfolgt für 24h bei +37°C und reduzierter N2-Begasung. Darauf wird der Fermenterinhalt abgelassen und aufgearbeitet Von diesem Material wird eine Inaktivierungskontrolle angelegt (3maliges Passagieren im Wochenrhythmus). Das inaktivierte Material wird portionsweise 15 Minuten bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, die Sedimente werden vereinigt und zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlosung (PBS) gewaschen. Die resuspendierten Bakterienzellen werden anschließend in 10-ml-Aliquots in sterile 25-ml-Flaschen abgefüllt und gefrier- getrocknet. Die Lagerung der fertigen Präparate erfolgt bei +4°C

Claims

Patentanspruch
Verfahren zur Herstellung eines immunstimulierenden Mittels auf der Basis von Propionibakterien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bakterien anaerob in einer Flüssigkultur vermehrt werden, daß nach Abschluß der Fermentation die Bakterien in üblicher Weise inaktiviert werden, daß die so erhaltene Zellmasse abgetrennt, gewaschen, filtriert und getrocknet wird
EP97933674A 1996-07-26 1997-07-14 Herstellung immunstimulierender mittel auf basis von propionibakterien Withdrawn EP0918530A1 (de)

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