SK5599A3 - Preparation of immunostimulating agents based on propionibacteria - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby imunostimulujúceho prostriedku na báze propionibaktérii.

Doterajší stav techniky

Z DE-A 3 011 461 sú známe preparáty na chemoterapiu nádorov na základe kmeňov propionibaktérii DSM 1773 a 1772 a ATCC 6919. Na výrobu bakteriálneho materiálu sa baktérie množia za anaeróbnych podmienok v kvapalnej kultúre v jednolitrových nádobách. Bakteriálne bunky sa odstredia, rozomelú, inaktivujú sa varom, podrobia sa spracovaniu trypsínom, znova sa odstredia a zlyofilizujú.

Takto vyrobený preparát sa môže potom resuspendovať a aplikovať napríklad intravenóznou injekciou.

Popísaný spôsob výroby je nákladný, čo je na prekážku použitia prostriedku napríklad ako imunostimulujúceho prostriedku v oblasti zdravia zvierat. Hľadajú sa preto možnosti zjednodušenia spôsobu výroby bez toho, aby sa znížila účinnosť a prijateľnosť preparátu.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu je spôsob výroby imunostimulujúceho prostriedku na báze propionibaktérii, ktorého podstata spočíva v tom, že sa baktérie anaeróbne namnožia v kvapalnej kultúre, po skončení fermentácie sa baktérie zvyčajným spôsobom inaktivujú a takto získaná bunečná hmota sa oddelí, premyje a usuší.

Je prekvapujúce, že týmto jednoduchým spôsobom sa môže získať dobre účinný a súčasne dobre prijateľný preparát.

31149/H

Na výrobu imunostimulujúceho prostriedku sa výhodne používa kmeň Propionibacterium avidum KP 40, uložený v Nemeckej zbierke mikroorganizmov pod číslom DSM 1772. Získajú sa takto celobunečné preparáty na báze Propionibacterium avidum KP 40 (DSM 1772) zjednodušeným spôsobom v kvapalnej kultúre vo fermentoroch. Použitý očkovací materiál pochádza ztzv. Master Stock. Použitím princípu vysiatia je zaručené použitie východiskového zárodku s definovaným počtom pasáží, ktorý je vo svojich vlastnostiach identický s kmeňom uloženým v Nemeckej zbierke mikroorganizmov.

Množenie baktérií sa vykonáva cez predkultúru a hlavnú kultúru za anaeróbnych podmienok pri teplote v rozmedzí 35 až 37 °C v kvapalnom médiu bohatom na živiny, obsahujúcom kvasničný extrakt, ktorý môže byt' trypticky natrávený, bielkovinový hydrolyzát, glukózu a organické kyseliny, ako je pyruvát, laktát alebo alfa-ketoglutarát. Tiež sa môžu použiť komplexné médiá ako je mozgovo

- srdcový bujón. Predkultúra sa pestuje ako submerzná stacionárna kultúra s objemom 0,1 až 50 I po dobu 18 až 30 hodín. Predkultúrou sa zaočkuje hlavná kultúra. Fermentácia sa vykonáva v regulovanom fermentore s objemom 10 až 5 000 I za stáleho pohybu média. Doba fermentácie je 24 až 72 hodín, výhodne 40 až 56 hodín a obzvlášť výhodne 48 hodín.

Po skončení fermentácie sa baktérie bežným spôsobom inaktivujú fyzikálnym postupom, napríklad pôsobením tepla, UV - žiarením alebo gama - žiarením alebo chemickou cestou, napríklad pôsobením etylalkoholu, formaldehydu alebo tiež beta

- propiolaktónu.

Inaktivácia teplom sa vykonáva vo fermentore pri teplote v rozmedzí 60 °C až 120 °C, výhodne 75 °C až 85 °C, po dobu 15 až 60 minút, výhodne 30 až 45 minút. Chemická inaktivácia sa vykonáva známym spôsobom vo vhodnej nádobe, napríklad vo fermentore. Výhodne sa používa formaldehyd v koncentrácii 0,01 až 0,5 %, obzvlášť výhodne 0,05 až 0,2 %. Inaktivácia sa vykonáva za stáleho pohybu inaktivovaného materiálu pri teplote rozmedzí 30 °C až 39 °C, výhodne 35 °C až 37 °C, po dobu 12 až 48 hodín, výhodne 18 až 30 hodín.

Inaktivované bakteriálne bunky sa oddelia od kultivačnej kvapaliny filtráciou alebo odstredením vsádzkovým alebo prietokovým postupom. Na filtráciu sa výhodne používa protiprúdová prietoková metóda za použitia membrán s veľkosťou

31149/H pórov v rozmedzí 0,1 až 1 pm, výhodne 0,22 až 0,45 μίτι. Tento spôsob dovoľuje tiež koncentrovanie bakteriálnych buniek a vymývanie kultivačnej kvapaliny, ako i zvyškov formaldehydu s vodnými pufrovanými roztokmi s fyziologickými koncentráciami solí, ako je napríklad 0,9 % roztok chloridu sodného alebo fosfátom pufrovaný roztok chloridu sodného.

Oddeľovanie bakteriálnych buniek odstreďovaním sa vykonáva pri 5 000 až 20 000 x g po častiach pri vsádzkovom postupe alebo prietokovým postupom.

Sediment sa resuspenduje vo vodnom pufrovanom roztoku s fyziologickou koncentráciou soli, ako je napríklad 0,9 % roztok chloridu sodného alebo fosfátom pufrovaného chloridu sodného. Kvôli vymytiu kultivačnej kvapaliny a zvyškov formaldehydu sa tento postup niekoľkokrát opakuje.

Po procese premývania sa bakteriálne bunky podrobia procesu sušenia, ako je napríklad sprejové sušenie alebo mrazové sušenie. Výhodne sa používa mrazové sušenie, pri ktorom sa bakteriálne bunky sušia buď priamo v odoberacích nádobách alebo sa lyofilizujú vo väčších častiach a potom sa navážia do odoberacích nádob. Bakteriálne bunky sa prípadne zmiešajú s ochrannými koloidmi, prípadne so stabilizátormi, odpeňovadlami a konzervačnými činidlami.

Pred použitím preparátov sa vysušený produkt rekonštituuje rozpúšťadlom, ako je napríklad destilovaná voda, purifikovaná voda alebo 0,9 % roztok chloridu sodného.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Výroba celobunečného bakteriálneho preparátu

Materiál:

- PBS (SIGMA D8537)

- NaOH - základný roztok 10 %

NaOH 100,00 g

VE-voda do 1 000,00 mi

31149/H

Kultivačné médium:

Roztok 1:

kazeínový hydrolyzát kvasničný extrakt L-cysteín-HCI škrob pyruvát sodný síran horečnatý

VE-voda do

Roztok 2:

glukóza

VE-voda do

Roztok 3:

dihydrogénfosforečnan draselný NaOH-základný roztok 10 %

VE-voda do

120,00 g 120,00 g 10,00 g 15,00 g 15,00 g 10,00 g 7 500,00 ml

40,00 g 250,00 ml

40,00 g 120,00 ml

250,00 ml

Roztok 1 sa po úplnom rozpustení všetkých látok prevedie do fermentora a sterilizuje sa spoločne s fermentorom. Roztoky 2 a 3 sa bezprostredne po pripravení oddelene autoklávujú pri teplote 110 °C po dobu 15 minút. Roztoky 2 a 3 sa za sterilných podmienok pridajú do fermentora k roztoku 1. Kvôli nastaveniu anaeróbnych podmienok a preskúšaniu sterility sa nechá fermentor bežať cez noc pri teplote 37 °C, 100 otáčkach za minútu a za prívodu 1,5 I dusíka za hodinu (N2/h). Po predkultivácii sa prevedie 100 ml kultivačného média do kultivačnej banky s objemom 100 ml. 1 ml tohto média sa odoberie kvôli resuspendovaniu konzervy Propionibacterium avidum KP 40. Resuspendovaná konzerva sa úplne prevedie do kultivačnej banky a iba ľahko sa prikryje krytom. Inkubácia sa vykonáva za anaeróbnych podmienok (GasPak, BBL) pri teplote 37 °C po dobu 24 hodín. Z tejto predkultúry sa prevedie za sterilných podmienok 100 ml do fermentora a obsah sa inkubuje po dobu 48 hodín pri teplote 37 °C, 100 otáčkach za minútu a za prívodu

31149/H

1,5 I N2/h. Potom sa fermentácia skončí a obsah fermentora sa zmieša s 27 ml 36,5 %-ného roztoku formaldehydu (to znamená konečná koncentrácia formaldehydu 0,1 %). Inaktivácia sa vykonáva po dobu 24 hodín pri teplote 37 °C a za redukovaného prívodu dusíka. Potom sa obsah fermentora vypustí a spracováva. Z tohto materiálu sa odoberie vzorka na kontrolu inaktivácie (trojnásobné pasážovanie v týždennom rytme). Inaktivovaný materiál sa po častiach odstred’uje po dobu 15 minút pri 10 000 x g. Kvapalina sa vypustí, sedimenty sa spoja a dvakrát sa premyjú fosfátom pufrovaným roztokom chloridu sodného (PBS). Resuspendované bakteriálne bunky sa potom v 10 ml porciách naplnia do sterilných fľaštičiek s objemom 25 ml a vysušia sa mrazom. Skladovanie hotových preparátov sa vykonáva pri teplote 4 °C.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÄROKY

   1. Spôsob výroby imunostimulujúceho prostriedku na báze propionibaktérii, vyznačujúci sa tým, že sa baktérie anaeróbne namnožia v kvapalnej kultúre, po skončení fermentácie sa baktérie zvyčajným spôsobom inaktivujú a takto získaná bunečná hmota sa oddelí, premyje, odfiltruje a usuší.