KR20000023629A - 프로피오니박테리아에 기초한 면역촉진제의 제조방법 - Google Patents

프로피오니박테리아에 기초한 면역촉진제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로피오니박테리아를 액체 배지에서 혐기적으로 증식시키고, 발효가 완료되면 통상적인 방법으로 불활성화시키며, 생성된 균체를 분리하고, 세척하며, 여과하고 건조시킴을 특징으로 하는 프로피오니박테리아에 기초한 면역촉진제의 제조에 관한 것이다.

Description

프로피오니박테리아에 기초한 면역촉진제의 제조방법{Preparation of immunostimulating agents based on propionibacteria}
프로피오니박테리아 균주 DSM 1773, 1772 및 ATCC 6919에 기초한 종양의 화학 요법용 제제가 DE-A 3 011 461로 부터 알려져 있다. 박테리아 물질을 제조하기 위하여, 박테리아를 1-리터 용기중의 액체 배지에서 혐기성 조건하에서 증식시킨다. 이어서 박테리아 세포를 원심분리시키고, 분쇄하고, 비등에 의해 불활성화시키며, 트립신 처리하며, 한 번더 원심분리하여 동결-건조시킨다.
이어서, 생성된 제제를 재현탁시키고, 예를들어 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다.
상기 기술된 제조 방법은 복잡하고, 동물 건강 분야에서, 제제, 예를들어 면역촉진제의 사용에 적합하지 않다. 그러므로, 제제의 활성과 적합성을 감소시킴이 없이 제조 방법을 간단히 할 수 있는 가능성을 조사하였다.
본 발명은 프로피오니박테리아(propionibacteria)에 기초한 면역촉진제 (immunostimulating agents)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 프로피오니박테리아를 액체 배지에서 혐기적으로 증식시키고, 발효가 완료되면 통상적인 방법으로 불활성화시키며, 생성된 균체(cell mass)를 분리하고, 세척하며, 건조시킴을 특징으로 하는 프로피오니박테리아에 기초한 면역촉진제의 제조방법을 제공한다.
효과가 높으며, 동시에 내성이 양호한 제제를 상기와 같은 간단한 방법으로 수득할 수 있다는 것은 놀라운 것이다.
면역촉진제는 바람직하게는 DSM 1772의 번호로 독일 미생물 콜렉션(German collection of microorganisms)에 기탁된 프로피오니박테리움 아비둠(Propionibacterium avidum) KP 40을 사용하여 제조한다. 프로피오니박테리움 아비둠 KP40(DSM 1772)에 기초한 완전한 세포 제제는 발효기에서 액체 배양으로 단순화된 방법에 의해 수득한다. 사용된 접종 물질은 마스터 스톡(master stock)으로 부터 얻는다. 이 종자(seed) 원칙을 사용하여, 독일 미생물 콜렉션에 기탁된 균주와 성질이 동일한 한정된 수의 패시지(passage)를 갖는 초기 박테리아가 사용됨을 보장한다.
박테리아는 트립신 처리로 또한 분해될 수 있는 효모 추출물(yeast extract), 단백질 가수분해물, 글루코즈 및 유기산, 예를들어 피루베이트, 락테이트 또는 α-케토글루타레이트를 함유하는 영양-풍부 액체 배지에서 혐기성 조건에서 30-39℃, 바람직하게는 35-37℃에서 예비배양 및 주 배양을 통하여 증식한다. 또한, 뇌/심장 배지와 같은 복합 배지를 사용하는 것이 또한 가능하다. 예비배양은 0.1-50ℓ부피의 액내 정치 배양(submerged standing cultures)으로 18-30시간 동안 수행한다. 주배양물은 예비배양물로 접종한다. 발효는 10-5000ℓ 부피의 제어된 배양기에서 수행하고, 배지는 일정한 운동을 한다. 발효의 기간은 24-72 시간, 바람직하게는 40-56 시간, 특히 바람직하게는 48시간이다.
발효가 완결된후, 박테리아는 물리적 방법, 예를들어 열의 작용, UV 또는 감마 조사, 또는 화학적 방법, 예를들어 에탄올, 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤의 작용에 의해 통상적인 방법으로 불활성화시킨다.
열 불활성화는 발효기에서 60-120℃, 바람직하게는 75-85℃에서, 15-60분, 바람직하게는 30-45분동안 수행한다. 화학적 불활성화는 적절한 용기, 예를들어 발효기에서 그자체로서 알려진 방법으로 수행한다. 포름알데히드는 0.01-0.5%, 특히 바람직하게는 0.05-0.2%의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 불활성화는 물질을 일정한 운동상태에서 불활성화시키면서 30-39℃, 바람직하게는 35-37℃에서 12-48시간, 바람직하게는 18-30시간의 기간에 걸쳐 수행한다.
불활성화된 박테리아 세포는 배치식 또는 연속-흐름 방법에 의해 여과 또는 원심분리에 의해 배양 브로쓰로부터 분리한다. 여과는 바람직하게는 0.1-1㎛, 바람직하게는 0.22-0.45㎛의 구멍 크기를 갖는 막을 사용한 역류 연속-흐름 방법에 의해 수행한다. 이 방법은 박테리아 세포의 농축, 및 예를들어 0.9% 세기 염수 용액 또는 포스페이트 완충된 염수 용액과 같은 생리학적 염농도의 수성 완충된 용액으로 배양 브로쓰 및 포름알데히드 잔류물을 세정하는 것을 가능하게 한다.
박테리아 세포는 배치식 방법 또는 연속-흐름 방법에 의해 일부분씩 5000-20,000×g의 원심력으로 원심분리하여 분리한다.
침전물은 예를들어 예를들어 0.9% 세기 염수 용액 또는 포스페이트-완충된 염수 용액과 같은 생리학적 염 농도를 갖는 수성 완충된 용액에 재현탁시킨다. 배양 브로쓰 및 포름알데히드 잔류물을 세정하기 위하여, 이 작업을 수회 반복한다.
세정후, 박테리아 세포를 예를들어 분무-건조 또는 동결-건조와 같은 건조과정을 거치게 한다. 동결-건조를사용하는 것이 바람직하고, 재현탁된 박테리아 세포는 분취량들로 샘플 용기에서 직접 동결 건조시키거나, 많은 분취량으로 동결-건조시키고, 이어서 무게를 달아 샘플 용기에 넣는다. 이러한 목적으로, 박테리아 세포는 필요하다면 보호 콜로이드 및/또는 안정화제, 소포제 및 방부제와 혼합시킨다.
제제를 투여하기 전에, 건조된 생성물을 예를들어 증류수, 정제수 또는 0.9% 세기 염수 용액과 같은 용매를 사용하여 재구성시킨다.
실시예 완전-세포 박테리아 제제의 제조
재료:
- PBS(SIGMA D8537)
- NaOH 저장 용액 10%
NaOH 100.00 g
탈이온수 1000.00 ml가 되기에 적당한 양 - 배양 배지
용액 1:
카제인 가수분해물 120.00 g
효모 추출물 120.00 g
L-시스테인 HCl 10.00 g
전분 15.00 g
Na-피루베이트 15.00 g
마그네슘 설페이트 10.00 g
탈이온수 7500.00 ml가 되기에 적당한 양
용액 2:
글루코즈 40.00 g
탈이온수 250.00 ml가 되기에 적당한 양
용액 3: 칼륨 디하이드로젠 포스페이트 40.00 g
NaOH 저장 용액 10% 120.00 ml
탈이온수 2250.00 ml가 되기에 적당한 양
모든 물질을 완전히 용해시킨후, 용액 1을 발효기에 옮기고, 발효기와 함께 멸균시켰다. 용액 2와 3을 제조후 즉각적으로 +110℃에서 15분 동안 별개로 오토클레이빙하였다. 용액 2와 3을 멸균 조건하에서 발효기중의 용액 1에 첨가하였다. 혐기성 조건을 설정하고 멸균성을 점검하기 위하여 발효기를 +37℃에서, 분당 100 회전(rpm)으로, 1.5ℓ의 질소/시간(N2/h)으로 밤새 작동시켰다. 예비배양을 위하여, 100 ml의 배양 배지를 100 ml 스코트(Schott) 병에 옮겼다. 이 배지 1 ml를 취해 보존된 프로피오니박테리움 아비둠 KP40의 샘플을 재현탁시켰다. 재현탁된 보존된 샘플 모두를 스코트 병에 옮긴후 두껑을 느슨하게 돌려 잠궜다(screwed). 배양을 +37℃에서 24시간 동안 혐기성 조건(GasPak, BBL)하에서 수행하였다. 이 예비배양물 100 ml를 멸균 조건하에서 발효기에 옮긴후 +37℃, 100 rpm 및 1.5 ℓ N2/h에서 48시간 동안 배양했다. 이어서, 발효를 멈추고 발효기의 내용물을 36.5% 세기 포름알데히드 용액 27 ml(0.1%의 포름알데히드의 최종 농도에 상응)와 혼합했다. 불활성화를 +37℃에서 및 N2가스에 대한 감소된 노출로 24시간 동안 수행하였다. 이어서, 발효기의 내용물을 배출하고 후처리했다. 상기 물질의 일부를 불활성화 시험에 사용하였다(주 간격으로 3 패시지(passages)). 불활성화된 물질을 10,000×g에서 15분 동안 일부분씩 원심분리하였다. 상등액을 버리고 침전물을 혼합하여 포스페이트-완충된 염수 용액(PBS)으로 2회 세척했다. 이어서, 재현탁된 박테리아 세포 10 ml-분취량을 멸균된 25 ml 병에 채우고 동결 건조시켰다. 최종 처리된 생성물을 +4℃에서 저장하였다.

Claims (1)

  1. 프로피오니박테리아를 액체 배지에서 혐기적으로 증식시키고, 발효가 완료되면 통상적인 방법으로 불활성화시키며, 생성된 균체를 분리하고, 세척하며, 여과하고, 건조시킴을 특징으로 하는, 프로피오니박테리아에 기초한 면역촉진제의 제조방법.
KR1019997000078A 1996-07-26 1999-01-08 프로피오니박테리아에 기초한 면역촉진제의 제조방법 KR20000023629A (ko)

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