CN101565693B - 一种发酵制备除臭酶制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵制备除臭酶制剂的方法，属于生物技术与生物工程领域。本发明选用链霉菌(Streptomyces sp.)DS-021为除臭酶制剂的生产菌种，采用发酵方法生产用于去除环境恶臭物质的酶制剂。制备过程包括液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、产物提取与精制、成品加工，制备的高效除臭酶制剂可广泛地应用于安全去除环境中的恶臭物质。本发明发酵制备除臭酶制剂的方法，工艺简单，且具有能大量生产，收率高(收率≥96％)和纯度高(纯度≥90％)的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵制备除臭酶制剂的方法，具体是涉及采用系统的微生物技术通过链霉菌(Streptomyces sp.)DS-021发酵制备除臭酶制剂的方法，属于生物技术与生物工程领域。
背景技术
以硫化物为主导的恶臭污染成分，广泛地存在于污水处理厂、垃圾转运站、化工厂、养殖场、公共厕所及生活污水等中。这类物质进入大气对人类形成严重的嗅觉污染，可使人和动物损伤神经、削弱食欲、增强健忘、阻滞血液循环，而且还严重地威胁着生命；有些还会随废水、废物进入水体，使水质变成恶臭，直接影响了水生生物的生存，破坏了生态循环。硫化物产生的恶臭在城市环境中形成了典型的社会公害。我国人口密度大，工业发展速度迅速，对环境治理与保护的措施与快速的工农业化和城市化发展不相协调，环境中的恶臭污染问题愈加严重。
目前恶臭物质去除处理常用的方法可以分为三类：物理法、化学法与生物法。这些方法在不同程度上都存在着去除效率低、操作复杂、占地面积大、能耗高、使用不方便等方面的不足。
除臭酶是一类具有催化恶臭硫化物降解的生物活性大分子。发明人曾在浓香型曲酒发酵池窖泥中分离出能产生除臭酶的兼性自养型链霉菌DS-021(食品与发酵工业，2001，27(11)，17-20)。该菌株属于放线菌目链霉菌科链霉菌属，具有利用硫及硫化物自养生活和利用有机物进行异养的能力，培养产生的除臭酶液对曲酒发酵池窖泥中的致臭硫化物具有明显的去除效果。现有培养方法如2001年的文章所示，其没有做成制剂，且工艺不完善，用于大量生产也非常困难。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工艺简单，且能大量生产，可生物降解的由微生物规模化发酵制备除臭酶制剂的方法。
本发明选用链霉菌(Streptomyces sp.)DS-021为除臭酶制剂的生产菌种，采用发酵方法生产用于去除环境恶臭物质的酶制剂。制备过程包括液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、产物提取与精制和成品加工。
本发明的技术方案为：一种发酵制备除臭酶制剂的方法，包括以下步骤：
1)液体种子制备
种子培养基的水溶液组成为(g/L)：淀粉10-30；(NH4)2HPO4 3-10；K2HPO4 0.4-1.5；MgSO4 0.3-1.2；CaCl2 0.2-1.2；玉米浆0.2-2.0。
制备方法：将水和按上述浓度称取的以上各种原料加入配料容器中，搅拌加热至各成分溶解，用NaOH溶液调pH值至7.0-7.4，装入种子罐，在蒸汽压力1Kg/cm2条件下灭菌30min，降温使培养基冷却至25-33℃，得灭菌种子培养基备用；
液体种子制备：每100L灭菌种子培养基接种种龄5天的茄子瓶链霉菌DS-021孢子悬液1瓶(50ml)进行搅拌培养，培养温度为25-35℃，无菌空气通风比1∶0.15-0.55(V/V)，搅拌转速为150-350r/min，培养28-42h，得液体种子备用；
2)发酵液制备
发酵培养基的水溶液组成(g/L)：玉米粉15-40；(NH4)2HPO4 5-15；K2HPO4 0.3-1.2；MgSO4 0.2-1.0；CaCl2 0.1-1.0；玉米浆0.5-1.5。
发酵培养基的制备：方法与种子培养基的制备步骤相同，将配制的发酵培养基装入发酵罐。
发酵液制备：将重量比为5-15％的液体种子接入发酵罐进行搅拌培养，培养温度为25-35℃，无菌空气通风比1∶0.25-0.85(V/V)，搅拌转速为120-250r/min，培养32-45h，得发酵液备用；
3)发酵液预处理
将发酵液升温至65-85℃，保持10-25min后将温度降至20-45℃，加入5-15ppm的聚氨基葡萄糖进行生物絮凝，去除菌体及其它杂质，得发酵清液备用。
4)产物提取与精制
(1)产物沉淀往发酵清液中先加入0.05％-0.35％(W/V)的硅藻土搅拌5-15min，再加入0.05％-0.35％(W/V)的丹宁搅拌5-15min，静止20-60min后离心分离，得沉淀复合物；
(2)产物分离将沉淀复合物分散于5-8倍重量的水中，加入产物液量0.05％-0.35％(W/V)的PVP(聚乙烯氮戊环酮)，搅拌0.5-3h后离心分离，得酶清液备用。
5)成品制备
将酶清液用截留分子量为5000-50000的有机超滤膜进行浓缩，在浓缩液中加入稳定剂明胶，获得液态酶制剂；把酶清液用喷雾干燥器干燥获得粉末，在粉末中加入保护剂糊精，获得固态酶制剂。
本发明链霉菌DS-021孢子悬液采用现有技术的常规制备孢子悬浮液的方法制备，所制备成的孢子悬液浓度为0.8×108-1.2×108个孢子/ml，所使用的茄子瓶规格为250ml。
该除臭酶制剂的使用方法为：直接混入具有恶臭物质的污水、污物，或喷洒于产生臭味的环境中。
本发明的技术效果是：本发明发酵制备除臭酶制剂的方法，工艺简单，且具有能大量生产，收率高(收率≥96％)和纯度高(纯度≥90％)的优点。由发酵制备除臭酶制剂的方法所获得的除臭酶制剂应用于环境恶臭物质去除处理与现有的除臭方法相比具有无毒无害(山东省疾病预防控制中心检验报告，鲁疾控检字2004D060。检验结论：急性经口毒性试验证明样品实属无毒；Ames试验结果为阴性说明样品无遗传毒性；小鼠骨髓细胞微核试验证明样品无致微核作用)、可生物降解、效率高(每克固态酶制剂每小时可去除恶臭硫化物10000微克)、使用方便(直接应用于臭味物质处理，不需复杂的设施)的优点。
具体实施方式
实施例1
1)液体种子制备
种子培养基的水溶液组成为(g/L)：淀粉25；(NH4)2HPO4 8；K2HPO4 1.3；MgSO41.0；CaCl2 1.0；玉米浆1.8。
制备方法：将水和按上述溶度称取的以上各种原料加入配料容器中，搅拌加热至各成分溶解，用NaOH溶液调pH值至7.0-7.4，装入种子罐，在蒸汽压力1Kg/cm2条件下灭菌30min，降温使培养基冷却至32℃，得灭菌种子培养基备用；
液体种子制备：每100L灭菌种子培养基接种种龄5天的茄子瓶链霉菌DS-021孢子悬液1瓶(50ml)进行搅拌培养，培养温度为33℃，无菌空气通风比1∶0.5(V/V)，搅拌转速为330r/min，培养40h，得液体种子备用；
2)发酵液制备
发酵培养基的水溶液组成(g/L)：玉米粉35；(NH4)2HPO4 13；K2HPO4 1.0；MgSO41.0；CaCl2 1.0；玉米浆1.3。
发酵培养基的制备：方法与种子培养基的制备步骤相同，将配制的发酵培养基装入发酵罐。
发酵液制备：将重量比为13％的液体种子接入发酵罐进行搅拌培养，培养温度为33℃，无菌空气通风比1∶0.8(V/V)，搅拌转速为230r/min，培养42h，得发酵液备用；
3)发酵液预处理
将发酵液升温至80℃，保持25min后将温度降至42℃，加入13ppm的聚氨基葡萄糖进行生物絮凝，去除菌体及其它杂质，得发酵清液备用。
4)产物提取与精制
(1)产物沉淀 往发酵清液中先加入0.33％(W/V)的硅藻土搅拌15min，再加入0.33％(W/V)丹宁搅拌15min，静止50min后离心分离，得沉淀复合物。
(2)产物分离将沉淀复合物分散于7倍重量的水中，加入产物液量0.33％(W/V)的PVP(聚乙烯氮戊环酮)，搅拌两小时50分钟后离心分离，得酶清液备用。
5)成品制备
将酶清液用截留分子量为5000-50000的有机超滤膜进行浓缩，在浓缩液中加入稳定剂明胶，获得液态酶制剂；把酶清液用喷雾干燥器干燥获得粉末，在粉末中加入保护剂糊精，获得固态酶制剂。产品收率为96.5％，纯度为90.6％。
实施例2
1)液体种子制备
种子培养基的水溶液组成为(g/L)：淀粉20；(NH4)2HPO4 6；K2HPO4 0.9；MgSO40.8；CaCl2 0.8；玉米浆1.5。
制备方法：将水和按上述溶度称取的以上各种原料加入配料容器中，搅拌加热至各成分溶解，用NaOH溶液调pH值至7.0-7.4，装入种子罐，在蒸汽压力1Kg/cm2条件下灭菌30min，降温使培养基冷却至32℃，得灭菌种子培养基备用；
液体种子制备：每100L灭菌种子培养基接种种龄5天的茄子瓶链霉菌DS-021孢子悬液1瓶(50ml)进行搅拌培养，培养温度为32℃，无菌空气通风比1∶0.45(V/V)，搅拌转速为300r/min，培养38h，得液体种子备用；
2)发酵液制备
发酵培养基的水溶液组成(g/L)：
玉米粉30；(NH4)2HPO4 10；K2HPO4 0.7；MgSO4 0.7；CaCl2 0.7；玉米浆1.0。
发酵培养基的制备：方法与种子培养基的制备步骤相同，将配制的发酵培养基装入发酵罐。
发酵液制备：将重量比为10％的液体种子接入发酵罐进行搅拌培养，培养温度为31℃，无菌空气通风比1∶0.65(V/V)，搅拌转速为200r/min，培养40h，得发酵液备用；
3)发酵液预处理
将发酵液升温至78℃，保持23min后将温度降至40℃，加入9ppm的聚氨基葡萄糖进行生物絮凝，去除菌体及其它杂质，得发酵清液备用。
4)产物提取与精制
(1)产物沉淀往发酵清液中先加入0.30％(W/V)硅藻土搅拌13min，再加入0.28％(W/V)丹宁搅拌13min，静止45min后离心分离，得沉淀复合物。
(2)产物分离将沉淀复合物分散于6倍重量的水中，加入产物液量0.28％(W/V)的PVP(聚乙烯氮戊环酮)，搅拌2h后离心分离，得酶清液备用。
5)成品制备
将酶清液用截留分子量为5000-50000的有机超滤膜进行浓缩，在浓缩液中加入稳定剂明胶，获得液态酶制剂；把酶清液用喷雾干燥器干燥获得粉末，在粉末中加入保护剂糊精，获得固态酶制剂。产品收率为96.8％，纯度为90.7％。
实施例3
1)液体种子制备
种子培养基的水溶液组成为(g/L)：淀粉13；(NH4)2HPO4 5；K2HPO4 0.6；MgSO40.5；CaCl2 0.4；玉米浆0.8。
制备方法：将量取的水和按上述溶度称取的以上各种原料加入配料容器中，搅拌加热至各成分溶解，以NaOH溶液调pH值至7.0-7.4，装入种子罐，在蒸汽压力1Kg/cm2条件下灭菌30min，降温使培养基冷却至32℃，得灭菌种子培养基备用；
液体种子制备：每100L灭菌种子培养基接种种龄5天的茄子瓶链霉菌DS-021孢子悬液1瓶(50ml)进行搅拌培养，培养温度为30℃，无菌空气通风比1∶0.25(V/V)，搅拌转速为200r/min，培养38h，得液体种子备用；
2)发酵液制备
发酵培养基的水溶液组成(g/L)：玉米粉18；(NH4)2HPO4 8；K2HPO4 0.5；MgSO40.3；CaCl2 0.3；玉米浆0.7。
发酵培养基的制备：方法与种子培养基的制备步骤相同，将配制的发酵培养基装入发酵罐。
发酵液制备：将重量比为8％的液体种子接入发酵罐进行搅拌培养，培养温度为30℃，无菌空气通风比1∶0.35(V/V)，搅拌转速为190r/min，培养36h，得发酵液备用；
3)发酵液预处理
将发酵液升温至73℃，保持20min后将温度降至33℃，加入7ppm的聚氨基葡萄糖进行生物絮凝，去除菌体及其它杂质，得发酵清液备用。
4)产物提取与精制
(1)产物沉淀往发酵清液中先加入0.25％(W/V)硅藻土搅拌12min，再加入0.25％(W/V)丹宁搅拌12min，静止30min后离心分离，得沉淀复合物。
(2)产物分离将沉淀复合物分散于6倍重量的水中，加入产物液量0.25％(W/V)的PVP(聚乙烯氮戊环酮)，搅拌50min后离心分离，得酶清液备用。
5)成品制备
将酶清液用截留分子量为5000-50000的有机超滤膜进行浓缩，在浓缩液中加入稳定剂明胶，获得液态酶制剂；把酶清液用喷雾干燥器干燥获得粉末，在粉末中加入保护剂糊精，获得固态酶制剂。产品收率为96.5％，纯度为90.6％。
实施例4
1)液体种子制备
种子培养基的水溶液组成为(g/L)：淀粉30；(NH4)2HPO4 10；K2HPO4 1.3；MgSO41.1；CaCl2 1.2；玉米浆1.9。
制备方法：将量取的水和按上述溶度称取的以上各种原料加入配料容器中，搅拌加热至各成分溶解，用NaOH溶液调pH值至7.0-7.4，装入种子罐，在蒸汽压力1Kg/cm2条件下灭菌30min，降温使培养基冷却至32℃，得灭菌种子培养基备用；
液体种子制备：每100L灭菌种子培养基接种种龄5天的茄子瓶链霉菌DS-021孢子悬液1瓶(50ml)进行搅拌培养，培养温度为30℃，无菌空气通风比1∶0.55(V/V)，搅拌转速为340r/min，培养42h，得液体种子备用；
2)发酵液制备
发酵培养基的水溶液组成(g/L)：
玉米粉38；(NH4)2HPO4 10；K2HPO4 1.5；MgSO4 0.8；CaCl2 0.8；玉米浆0.9。
发酵培养基的制备：方法与种子培养基的制备步骤相同，将配制的发酵培养基装入发酵罐。
发酵液制备：将重量比为15％的液体种子接入发酵罐进行搅拌培养，培养温度为30℃，无菌空气通风比1∶0.85(V/V)，搅拌转速为250r/min，培养45h，得发酵液备用；
3)发酵液预处理
将发酵液升温至85℃，保持25min后将温度降至30℃，加入15ppm的聚氨基葡萄糖进行生物絮凝，去除菌体及其它杂质，得发酵清液备用。
4)产物提取与精制
(1)产物沉淀往发酵清液中先加入0.35％(W/V)硅藻土搅拌10min，再加入0.35％(W/V)丹宁搅拌10min，静止50min后离心分离，得沉淀复合物。
(2)产物分离将沉淀复合物分散于8倍重量的水中，加入产物液量0.35％(W/V)的PVP(聚乙烯氮戊环酮)，搅拌3h后离心分离，得酶清液备用。
5)成品制备
将酶清液用截留分子量为5000-50000的有机超滤膜进行浓缩，在浓缩液中加入稳定剂明胶，获得液态酶制剂；把酶清液用喷雾干燥器干燥获得粉末，在粉末中加入保护剂糊精，获得固态酶制剂。产品收率为96.5％，纯度为90.7％。
实施例5
1)液体种子制备
种子培养基的水溶液组成为(g/L)：淀粉10；(NH4)2HPO4 4；K2HPO4 0.3；MgSO40.4；CaCl2 0.2；玉米浆0.5。
制备方法：将水和按上述溶度称取的以上各种原料加入配料容器中，搅拌加热至各成分溶解，用NaOH溶液调pH值至7.0-7.4，装入种子罐，在蒸汽压力1Kg/cm2条件下灭菌30min，降温使培养基冷却至32℃，得灭菌种子培养基备用；
液体种子制备：每100L灭菌种子培养基接种种龄5天的茄子瓶链霉菌DS-021孢子悬液1瓶(50ml)进行搅拌培养，培养温度为25℃，无菌空气通风比1∶0.17(V/V)，搅拌转速为180r/min，培养30h，得液体种子备用；
2)发酵液制备
发酵培养基的水溶液组成(g/L)：
玉米粉15；(NH4)2HPO4 6；K2HPO4 0.3；MgSO4 0.4；CaCl2 0.2；玉米浆0.5。
发酵培养基的制备：方法与种子培养基的制备步骤相同，将配制的发酵培养基装入发酵罐。
发酵液制备：将重量比为5％的液体种子接入发酵罐进行搅拌培养，培养温度为25℃，无菌空气通风比1∶0.25(V/V)，搅拌150r/min，培养33h，得发酵液备用；
3)发酵液预处理
将发酵液升温至68℃，保持15min后将温度降至30℃，加入6ppm的聚氨基葡萄糖进行生物絮凝，去除菌体及其它杂质，得发酵清液备用。
4)产物提取与精制
(1)产物沉淀往发酵清液中先加入0.08％(W/V)硅藻土搅拌5min，再加入0.10％(W/V)丹宁搅拌5min，静止20min后离心分离，得沉淀复合物。
(2)产物分离将沉淀复合物分散于5倍重量的水中，加入产物液量0.10％(W/V)的PVP(聚乙烯氮戊环酮)，搅拌25min后离心分离，得酶清液备用。
5)成品制备
将酶清液用截留分子量为5000-50000的有机超滤膜进行浓缩，在浓缩液中加入稳定剂明胶，获得液态酶制剂；把酶清液用喷雾干燥器干燥获得粉末，在粉末中加入保护剂糊精，获得固态酶制剂。产品收率为96.0％，纯度为90.5％。
Claims (1)
1.一种发酵制备除臭酶制剂的方法，包括以下步骤：
1)液体种子制备
种子培养基的水溶液组成为：淀粉10-30g/L；(NH4)2HPO43-10g/L；K2HPO40.4-1.5g/L；MgSO40.3-1.2g/L；CaCl20.2-1.2g/L；玉米浆0.2-2.0g/L；
制备方法：将水和按上述浓度称取的以上各种原料加入配料容器中，搅拌加热至各成分溶解，用NaOH溶液调pH值至7.0-7.4，装入种子罐，在蒸汽压力1Kg/cm2条件下灭菌30min，降温使培养基冷却至25-33℃，得灭菌种子培养基备用；
液体种子制备：每100L灭菌种子培养基接种50ml种龄5天的茄子瓶链霉菌DS-021孢子悬液进行搅拌培养，培养温度为25-35℃，无菌空气通风体积比1∶0.15-1∶0.55，搅拌转速为150-350r/min，培养28-42h，得液体种子备用，所述的孢子悬液浓度为0.8×108-1.2×108个孢子/ml，所使用的茄子瓶规格为250ml；
2)发酵液制备
发酵培养基的水溶液组成：玉米粉15-40g/L；(NH4)2HPO4 5-15g/L；K2HPO4 0.3-1.2g/L；MgSO4 0.2-1.0g/L；CaCl2 0.1-1.0g/L；玉米浆0.5-1.5g/L；
发酵培养基的制备：方法与种子培养基的制备步骤相同，将配制的发酵培养基装入发酵罐；
发酵液制备：将重量比为5-15％的液体种子接入发酵罐进行搅拌培养，培养温度为25-35℃，无菌空气通风体积比1∶0.25-1∶0.85，搅拌转速为120-250r/min，培养32-45h，得发酵液备用；
3)发酵液预处理
将发酵液升温至65-85℃，保持10-25min后将温度降至20-45℃，加入5-15ppm的聚氨基葡萄糖进行生物絮凝，去除菌体及其它杂质，得发酵清液备用；
4)产物提取与精制
(1)产物沉淀往发酵清液中先加入重量体积比为0.05％-0.35％的硅藻土搅拌5-15min，再加入重量体积比为0.05％-0.35％的丹宁搅拌5-15min，静止20-60min后离心分离，得沉淀复合物；
(2)产物分离将沉淀复合物分散于5-8倍重量的水中，加入产物液量重量体积比为0.05％-0.35％的PVP，搅拌0.5-3h后离心分离，得酶清液备用；
5)成品制备
将酶清液用截留分子量为5000-50000的有机超滤膜进行浓缩，在浓缩液中加入稳定剂明胶，获得液态酶制剂；把酶清液用喷雾干燥器干燥获得粉末，在粉末中加入保护剂糊精，获得固态酶制剂。
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