EP0773796A1 - Eisen enthaltende nanopartikel mit doppeltem coating und anwendung in der diagnostik und therapie - Google Patents

Eisen enthaltende nanopartikel mit doppeltem coating und anwendung in der diagnostik und therapie

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EP0773796A1
EP0773796A1 EP95924859A EP95924859A EP0773796A1 EP 0773796 A1 EP0773796 A1 EP 0773796A1 EP 95924859 A EP95924859 A EP 95924859A EP 95924859 A EP95924859 A EP 95924859A EP 0773796 A1 EP0773796 A1 EP 0773796A1
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EP
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iron
nanoparticles
polymer
synthesis
metal ions
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Ceased
Application number
EP95924859A
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English (en)
French (fr)
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Mayk Kresse
Detlev Pfefferer
Rüdiger Lawaczek
Susanne Wagner
Wolfgang Ebert
Volker Elste
Wolfhard Semmler
Matthias Taupitz
Josef Gaida
Anja Herrmann
Monika Jukl
Udo Swiderski
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Bayer Pharma AG
Original Assignee
Institut fuer Diagnostikforschung GmbH
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    • G01N2446/30—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being dispersed in the polymer composition before their conversion into particulate form

Definitions

  • the present invention relates to modular iron-containing nanoparticles, their production and use in diagnostics and therapy.
  • the superparamagnetic iron oxides which are to be used as MR contrast agents show comparable properties in that they show a strong influence on the proton relaxation in their immediate vicinity (high relaxivity) and that they are particles with a "magnetite-like" crystal structure. Numerous processes for producing iron-containing crystals (iron oxides) with superparamagnetic properties have been described.
  • the different methods can be classified from different points of view.
  • the production of the crystals containing superparamagnetic iron distinguishes two basic processes, namely the sintering process at high temperature and subsequent mechanical comminution and the wet-chemical process
  • the iron-containing core (iron oxide) is first produced and then a stabilizer is added to ensure the physical-galenical quality.
  • a variant of the “two-pot synthesis” is the production of the iron core on ion exchangers.
  • the iron oxides are produced in the presence of the stabilizer, which already coats the cores during the precipitation of the iron salts and thus prevents the aggregation and sedimentation of the particles.
  • Magnetic iron oxides which are to be used as contrast agents in human diagnostics, require an aqueous dispersion medium for medical-toxicological reasons.
  • a special position in this classification is given to the particles, which were produced in a non-aqueous solvent, but which can be stably dispersed in an aqueous medium after production.
  • Such particles are currently generally used in ex vivo diagnostics, e.g. B. in magnetic separation technology [Chagnon MS, Groman EV, Josephson L, et al. ; US 4,554,088], but were also proposed for in vivo diagnostics [Pilgrimm H; US 5,160,725].
  • the pharmaceutically more stable suspensions / solutions of particles which were produced by the "one-pot process" in aqueous media, can also be further reduced. divide into different sized iron oxides.
  • Biotechnical applications have been proposed for the particles in the micrometer range [Schröder U, Mosbach K; WO 83/01738 or Schröder U; WO 83/03426] or even claims in vivo use in diagnostics or therapy [Widder KJ, Senyei AE; US 4,247,406 or Jacobsen T, Klaveness J; WO 85/04330].
  • For medical diagnostic approaches however, only the particles in the nanometer range are described today.
  • the nanometer range can also be divided into “large”(approx.> 50 nm total diameter) and “small” (approx. ⁇ 50 nm total diameter) particles.
  • the main area of application of the large nanometer particles today is the use in MR diagnostics of the liver and spleen, since particles of this size are quickly and almost completely absorbed by the macrophages of these organs [Kresse M, Pfefferer D, Lawaczeck R; EP 516,252 A2 or Groman EV, Josephson L; US 4,770,183].
  • suggestions have been made for use as enhancer substances in clinical hyperthermia [Hasegawa M, Hirose K, Hokukoku S, et al. ; WO 92/22586 AI and Gordon RT; US 4,731,239].
  • the precise synthesis conditions such as the type of iron salts, temperature, shell polymer (stabilizer), titration speed, choice of alkali, cleaning, etc. influence the chemical-physical properties and thus the pharmaceutical-pharmaceutical quality and ultimately the medical benefit.
  • MIONs in which the dextran shell of the particles (magnetic label) is oxidized with periodate and then coupled with specific molecules (antimyosin; polyclonal antibody) [Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al. ; Radiology 182; 381-385; 1992 or Weissleder R, Lee AS, Fishman A et al. ; Radiology 181; 245-249; 1991].
  • Menz et al. [Menz ET, Rothenberg JM, Groman EV, et al. ; WO 90/01295] which their large nanometer particles by polymers (arabinogalactan) envelop with physiological effector cells and, like Gordon, who oxidizes his dextran-stabilized particles with periodate and then couples transferrin by reductive amination [Gordon RT; US 4,735,796], claim a specific uptake mechanism via receptor-mediated endocytosis.
  • Stabilizer substances making whole groups more important and highly specific molecules (proteins, peptides, oligonucleotides but also most oligo- and polysaccharides) cannot be used for stabilization during production, at least not if the stabilizers after synthesis still have target properties ( biological activity).
  • a major problem in the development of specific diagnostics is the small size of the target organ. So represent z.
  • a problem with this class of substances is the crystal nucleus of the iron oxides, which determines the particulate character of the substances and the particle size has a significant influence on the biological behavior. Smaller particle sizes improve that
  • the object of the invention is to provide iron-containing nanoparticles which optimally meet the requirements of physics and biology for a specific nanoparticle.
  • the nanoparticles according to the invention are superior to the previous iron oxide particles according to the prior art with regard to the targetability.
  • contrast agents or also therapeutic agents / therapeutic carrier systems with previously unattainable "targetability” can be produced.
  • the nanoparticles are produced from individual building blocks (modular principle) and thus ensure maximum flexibility in the combination of the iron-containing cores (physical effectiveness; contrast) with the target component (biological behavior).
  • a modular structure has the advantage of combining a storable component (iron-containing core) with possibly sensitive molecules for control only "just in time” to form the finished nanoparticle.
  • This reference to the "cold kits” known from clinical radiopharmaceuticals makes it possible, for. B. also using individual serum components of individual patients as control molecules (eg autologous antibodies).
  • the nanoparticles Due to their intense coloring, it is also possible to visually detect the nanoparticles, as is the case, for example, with B. is desirable when used as an optical marker in surgical medicine.
  • the nanoparticles are also suitable for use in therapy, e.g. B. by magnetic targeting with external magnets above a target volume, combined with a magnetically coupled release of active substances, suitable.
  • the nanoparticles can in z. B. tumors are accumulated and therefore enable use as specific enhancer substances in local hyperthermia.
  • the nanoparticles according to the invention consist of an iron-containing core, a primary coat (synthesis polymer) and a secondary coat (target polymer) and optionally pharmaceutical auxiliaries, pharmaceuticals and / or adsorption mediators.
  • the iron-containing core is present as a particle, colloid or crystal.
  • the nanoparticles contain synthetic polymer, which envelops the core as a primary coat and is required during production to control the physical or pharmaceutical-pharmaceutical quality.
  • the ratio of synthetic polymer to iron is then adjusted to a desired value by means of a desorption process. For use in specific diagnostics, a
  • Adsorbed target polymer which represents the surface of the nanoparticles and envelops the basic building block of core and primary coat.
  • Adsorption mediators can be included to improve the adsorption between the primary and secondary coats.
  • the nanoparticles can contain constituents of pharmaceutical auxiliaries or pharmaceuticals.
  • FIG. 1 A schematic representation of the structure of a nanoparticle according to the invention is shown in FIG. 1.
  • the hydrodynamic diameter of the basic building block (iron-containing core and primary coat) in solution is less than 100 nm, preferably less than 50 nm, and at most five times the diameter of the core containing iron.
  • the nanoparticles according to the invention are further characterized in that they are in the form of stable colloidal sols of pharmaceutical quality, or in that they are lyophilized and easily mixed with medically used solvents (electrolyte solution, plasma expander, glucose solution, physical saline solution, etc.). can be brought back into solution or that the basic building block and target component and optionally additives are separate solutions, which can also be in the form of lyophilisates, and are only mixed together at any time to form the application solution.
  • medically used solvents electrophilyl solution, plasma expander, glucose solution, physical saline solution, etc.
  • the core containing iron has a larger magnetic moment than iron II or iron III ions. Due to its magnetic properties, the iron-containing core enables contrasting when used as a contrast agent in MR tomography. In order to achieve an optimal contrast strength, the core should be superparamagnetic or at least contain superparamagnetic components, i. H. that the nucleus must exist as a crystal or polyatomic complex ("particle"), since this type of magnetism is only possible in solids.
  • the iron-containing core can represent or contain magnetite or maghemite.
  • the non-ferrous metal ions are paramagnetic, magnetic or a mixture of both.
  • the nanoparticles according to the invention are characterized in that the iron-containing core has a diameter, determined by electron microscopy, of less than 30 nm, preferably less than 15 nm, and contains at least 50 metal atoms and a particle size distribution, at least 90% of the iron containing nuclei are in the range 0.7 mean to 1.3 mean value.
  • the nanoparticles contain a synthetic polymer in an amount between 0.01 times and 1 times the sum of the metal ions present. An amount between 0.25 times and 0.75 times is preferred.
  • Derivatives that have been additionally substituted are used with a molecular weight of less than 100,000 Da. Substances with molecular weights that are less than 10,000 or 5000 Da are preferably used.
  • a dextran derivative or a mixture of dextran and / or dextran derivatives is particularly preferably used as the synthetic polymer.
  • the synthetic polymer can contain one or more acid groups or more functional groups in the molecule, which preferably contain N, S, P or O atoms.
  • the target and the synthesis polymer can be different or the same substances or substance mixtures, but the target polymer does not meet the conditions of Synthesis is subject to and therefore not subject to the secondary reactions of the synthetic polymer during synthesis, that is to say it is still in a physiological state.
  • the basic substance made of iron-containing core and synthetic polymer determines the physical quality of the nanoparticle, while the target polymer determines the biological behavior of the nanoparticles.
  • the target polymer is in one in the nanoparticle
  • Weight amount between 0.5 times to 50 times, preferably between 1 times to 25 times the weight of the metal ions present.
  • the nanoparticles according to the invention contain adsorption mediators, the amount of which is less than or equal to the sum of the weight of the metal ions contained.
  • the adsorption mediator increases or enables the adsorption of the target polymer onto the basic building block made of iron-containing core / synthesis polymer.
  • Peptides with the structures RRTVKHHVN, RRSRHH or also RSKRGR, or partial structures thereof, are preferably used as adsorption mediators.
  • the hydrodynamic diameter including all components of the nanoparticles is at most ten times larger than the diameter of the core containing iron and at most 20% larger than the diameter of the basic building block.
  • the nanoparticles according to the invention are composed of individual modules such as basic building block, target polymer, pharmaceutical and adsorption mediator, which can be combined at any time.
  • the preparations of the nanoparticles are low-viscosity aqueous colloidal solutions or suspensions of iron-containing stabilized particles in the nanometer range.
  • the solutions of the nanoparticles contain no larger aggregates and can be administered intravenously, so that requirements of international pharmacopoeias for parenterals with regard to particle sizes are met.
  • the basic building block can be sterilized by heat processes.
  • the process for "sterilizing" the finished nanoparticles depends on the sensitivity of the secondary coat, but aseptic production is aseptic in every case. Sterile filtration can always be carried out due to the small size of the particles.
  • the option of producing a sensitive target polymer with the sterilizable basic building block shortly before use is a further possibility of ensuring a practically sterile application solution.
  • the nanoparticles are well tolerated and have e.g. B. when used as an MR contrast medium a pronounced favorable safety distance between the diagnostic dose and the lethal dose ("margin of safety").
  • the diagnostic dose is approximately between 5 and 200 ⁇ mol (iron) per kilogram of body weight
  • the lethal dose is approximately between 20 and 50 mmol / kg body weight (measured on the rat).
  • the substances are completely biodegradable. In this way the iron-containing core is dissolved and the iron is brought into the physiological iron metabolism.
  • the molecules used as synthesis polymer or target polymer can also be metabolically converted into usable ones
  • the solutions or suspensions are colored red-brown to black, which is due to the intense color of the iron-containing crystals.
  • the distinctive Eigen ⁇ color can be used for visual detection, e.g. B. can be used as a marker substance in surgical medicine.
  • the nanoparticles are superparamagnetic or contain superparamagnetic components for detection with MR technology. The particles show physically very high saturation magnetizations, which are achieved even at low applied field strengths, and after switching off an external magnet no longer show any residual magnetization, they show no remanence.
  • the nanoparticles are formulated as solutions (suspensions) and can be applied without further preparation. Since the solutions of the nanoparticles are compatible with conventional medical solvents such as physiological sodium chloride solution, electrolyte solutions or sugar solutions, the particles can be diluted as desired and e.g. B. also be infused for special applications.
  • the production of the particulate or colloidal iron-containing cores is carried out from monomolecularly dissolved iron compounds by changing the pH and thereby causing precipitation in the presence of a stabilizer substance (synthesis polymer) after a "one-pot synthesis".
  • the synthetic polymer separates the crystal nuclei during production and thus serves to control the particle size.
  • the synthetic polymer is essential for the physical and pharmaceutical-pharmaceutical properties not only of the crystal nucleus but also of the entire nanoparticle.
  • the synthetic polymer enables a stable solution (suspension) to be obtained, since the nuclei are separated from one another to such an extent that aggregation can no longer take place (steric stabilization).
  • the solution (suspension) of iron core and residual synthetic polymer, which envelops and stabilizes the iron-containing core as the primary coat, represents the basic building block of the modular system.
  • the basic building block is characterized by its high physical and galenical quality.
  • a second essential building block is the target polymer, which is adsorbed onto the basic building block post-synthetically and surrounds the core with the primary coat with a second shell (secondary coat).
  • the secondary coat provides the top area of the nanoparticles and determines the in vivo behavior.
  • the mixture between the basic building block and the target polymer can take place at any time, so that "just in time” production is also possible.
  • the adsorption between the residual synthesis polymer and the target polymer can be improved or even made possible by an intermediate step with the addition of adsorption mediators.
  • the adsorbent can also be added in one step in a mixture with the target polymer.
  • pharmaceutical adjuvants or pharmaceuticals can be added at any time.
  • the synthesis polymer which is optimal for the physical properties can be selected without being limited by the desired biological controllability of the nanoparticles; -
  • the target polymer is not subject to the destructive conditions of the synthesis, so that many substances can be used to find the target that were previously excluded from the outset.
  • post-synthetic chemistry which in turn requires adequate reaction conditions and the integrity of the
  • Ligands impaired, applied; find it z. B. no redox reactions with disulfide-containing proteins, as in periodate oxidation with subsequent reductive amination, instead - the biological activity is retained.
  • Another important advantage is that there is no need to clean the basic building block target polymer, since no reaction solutions, such as. B. periodate, must be separated - the method is fast and therefore "just in time” nanoparticles can be produced directly before application, as it is e.g. B. with "individual" contrast media (eg autologous antibodies) is necessary or can be advantageous if the target polymer is only stable for a short time in solution.
  • reaction solutions such as. B. periodate
  • the production according to the invention also has advantages for further optimization, since here the "surface" of the nanoparticles can be modified / optimized separately and an analysis can also be carried out using modern analysis methods such as NMR spectroscopy or IR spectroscopy; Methods that cannot be used in the presence of the particular core.
  • the nanoparticles are manufactured in several stages.
  • the iron-containing core is in principle synthesized by a "one-pot synthesis", that is to say in the presence of a stabilizer substance (synthesis polymer).
  • the stable lisator substance (synthesis polymer) is dissolved in water and mixed with the monomolecular iron compounds. By increasing the pH, the iron salts are converted to the preferred oxides and precipitated.
  • the stabilizer solution can also be made alkaline and then mixed with the iron salts. The mixture is heated under reflux and then neutralized, with heating and neutralization also taking place in the reverse order.
  • the raw substance is cleaned and then the excess or not firmly adsorbed / bound synthetic polymer is adjusted to an exact weight ratio of iron to stabilizer by a desorption process.
  • This cleaned and desorbed basic substance made of core and (residual) synthetic polymer represents the basic building block of the modular nanoparticles.
  • a heat sterilization can be connected here.
  • the selected target polymer is adsorbed onto the basic building block, optionally with intermediate adsorption or co-adsorption of an adsorption mediator. Additional components such as pharmaceutical auxiliaries or pharmaceuticals can optionally be added.
  • the general manufacturing process is summarized schematically in Figure 2.
  • iron-containing cores To produce the iron-containing cores, stoichiometric amounts of iron-II and iron-III salts are mixed with one another.
  • the quality of the crystals formed is also influenced by the salts used and in general the salts of hydrochloric acid, ie the iron chlorides, are used in the literature. In principle, however, here are all salts of strong acids, e.g. B. also the sulfates or nitrates can be used. It is problematic to ensure an exact stoichiometry when using these salts, since the iron-II salts are very sensitive to oxidation. Advantages result from the use of more complex salts such as. B. the Mohr 'see salt, which is not so sensitive to oxidation.
  • organic salts is superior to the inorganic salts, since the organic anions act as a stabilizer or auxiliary stabilizer.
  • organic anions act as a stabilizer or auxiliary stabilizer.
  • B. the iron-II-gluconate, or the iron-III-citrate exposed; but other organic anions, such as. B. the fumarates, tartrates, lactates or salicylates.
  • a synthesis variant that only starts with iron (III) salt enables production without using the oxidation-sensitive iron (II) salts, and the number of "foreign ions" can be reduced.
  • This synthesis variant starts only from iron (III) salt, from which iron (II) is generated in situ by a calculated amount of reducing agent only through the reaction.
  • all reducing agents can be used which exactly reduce iron III stoichiometrically, the use of hydroxylamine is preferred since the converted hydroxylamine is converted quantitatively to laughing gas and can therefore be completely removed from the reaction mixture very easily.
  • the aim of the precipitation step is to convert iron II and iron III in a stoichiometric composition into a crystal with a defined crystal structure.
  • the formation of the corresponding oxides is achieved by increasing the pH.
  • the iron III ions [pKL Fe (OH) 3 approx. 37 *] form poorly soluble hydroxides even at a pH of approx. 2, while the iron II ions only form as hydroxides at pH 8 [pKL Fe (OH) 2 approx. 13.5] fail, it can be seen that a direct
  • organic anions can also be used as complexing agents.
  • Complex salts, organic anion salts and inorganic salts of iron II and iron III ions can also be combined with one another as desired. 22
  • iron II hydroxide and iron III hydroxide are first prepared separately. Surprisingly, the iron oxide crystals can also be produced by combining the separately prepared hydroxide solutions, heating the combined solutions accelerating the crystallization.
  • An important step in the production of the iron-containing cores is the precipitation step, in which the particulate iron compounds are formed from the low-molecular iron compounds by increasing the pH, the formation of the particles possibly taking place via the formation of colloidal iron hydroxides.
  • any substance that can increase the pH of the acidic solution of the iron salts is suitable for increasing the pH.
  • the pH increase by means of ammonia, both as a gas and as a salt, or the use of basic amines and volatile buffers is preferred.
  • the base used for the precipitation influences the overall properties in such a way that "biological" effects are also visible.
  • B Differences in the organ distribution of the particles.
  • the concentration of the basic substance should be in the range 0.1 to 10 N, preference is given here to concentrated solutions of about 1-4 N, since the formation of particles with small core sizes takes place with increasing speed of the pH increase .
  • the bases are added within 30 minutes, but preferably within 30 seconds.
  • the precipitation of the iron compounds to the particles takes place in the temperature range of 0-120 ° C, the
  • Range 50-80 ° C is preferred.
  • the basic principle is that the temperature can be low if the iron oxide is formed directly and must be high if the formation takes place via the hydroxides as an intermediate step. After the precipitation, the neutralization and then, especially when the hydroxides are present, the raw substance is heated under reflux conditions, the duration of the heating being between 0 minutes and 24 hours, preferably between 30 minutes and one hour. Neutralization and heating under reflux conditions can also be carried out in the reverse order.
  • a high intrinsic coloration is desirable for use as a contrast medium (optical marker substance) in visual detection.
  • the use as a contrast medium in magnetic resonance tomography (MRT) requires a high level of effectiveness, which is determined in this tomography method by the magnetic properties of the nanoparticles. Due to the high saturation magnetization even at low applied field strengths, such as those used in clinical MRI, the iron oxides magnite and magnetite appear to be particularly suitable when using the nanoparticles as MR contrast agents.
  • the special magnetic properties are determined here by the crystal structure of the particulate iron cores. Surprisingly, however, it is possible to incorporate foreign ions into the crystal core and still achieve the magnetite-like crystal structure. This doping with non-ferrous metal ions can in principle be done in two ways. For one, can
  • Iron II and / or iron III ions are replaced on their lattice sites by other paramagnetic metal ions and on the other hand the substitution can also be carried out with diamagnetic ions.
  • the magnetization in the magnetite crystal results only from the iron II ions, since the iron III ions occupy parallel / anti-parallel grid positions and cancel each other out in their magnetic effect.
  • An increase in the net magnetizability of the crystal can take place if ions with stronger magnetic properties than iron are used, or if the para- or diamagnetic ions do exactly the same
  • Occupation ratio on the parallel / anti-parallel lattice sites for the iron III ions is changed.
  • Gadolinium can be increased by the difference of the magnetic moment compared to the replaced iron.
  • di- and paramagnetic ions can also be incorporated together in the magnetite-like crystal lattice. The doping with the non-iron ions takes place through partial substitution of the low-molecular iron-containing starting compounds in the synthesis.
  • the general production of the iron-containing cores aims to synthesize a magnetite-like crystal lattice.
  • iron II and iron III ions are used in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  • the synthesis is easiest if an exactly stoichiometric ratio of 1: 2 is used.
  • the ratios of iron-II to iron-III can also be obtained by reducing iron-III during synthesis by a reducing agent.
  • Iron II and / or Iron III ions can be replaced by up to 25% of the total iron (weight) by other metal ions.
  • diamagnetic ions such as lithium, magnesium or calcium, or a mixture of para- and diamagnetic ions, can also be used.
  • crystal Structure of magnetite is preferred.
  • the magnetite crystal can arise on the one hand, for. B. if the hydroxides are initially produced, or the magnetite crystal can also react further to other crystals, for. B. in the oxidation of magnetite to maghemite.
  • the special quality of the nanoparticles as a contrast medium for MRI requires superparamagnetic magnetic properties. Superparamagnetism can only occur in solids, so that another property is required that the
  • Crystals have solid-state properties, i.e. they are particulate crystals.
  • the minimum iron content must contain at least 50 iron atoms (or metal atoms) per crystal.
  • the size of the iron-containing cores can be controlled over wide ranges by variation in the synthesis (1- about 30 nm), but the synthesis of small cores with diameters smaller than 15 nm is preferred, the particle size distribution being such that at least 90% of the Particles in the range of 0.7 MW to 1.3 MW (MW equal mean diameter, determined by electron microscopy).
  • Polymers is not to be taken literally here, since both low molecular weight substances and mixtures of low molecular weight and higher molecular weight substances can be used to produce the iron-containing cores.
  • the use of low or higher molecular weight substances which contain negative charge carriers in the molecule is particularly preferred.
  • Carboxylates or analogs, phosphates (or other P-containing groups) and sulfates (or other S-containing groups) are preferred here. These derivatives can only carry a single functional group or several of the functional groups included.
  • the underlying theory assumes that the affinity for the surface of the iron-containing core is due to the interaction between the positive iron oxide surface and the negative charge in the synthetic polymer.
  • synthesis polymer contains several of the groups, the interaction is particularly pronounced ("multi-side attachment").
  • Some particularly suitable classes for stabilization during synthesis are: Low molecular weight substances, such as. B. carboxypolyalcohols, polycarboxypolyalcohols, polycarboxyalcohols, carboxyalcohols, alcohols, mono sugar, oligomeric sugars and synthetic polymers, such as. B. polyethylene glycol, polypropylene glycol and mixtures (block and copolymers), polyacrylic acid, polyvinyl alcohol, polylactic acid
  • Polylactide and polylactide glycid as well as natural or in particular partially synthetic or chemically and / or enzymatically modified natural polymers such as.
  • low molecular weight dextran derivatives which contain negative charge carriers is particularly preferred.
  • An example here is (mono-) carboxydextran; the
  • the polycarboxydextran can interact with the iron oxide surface due to the many negative charges via a "multi-side attachment".
  • the amount of synthesis polymer for stabilization during production is 0.5-20 times the weight of the sum of the metal ions contained in the batch, the total proportion in the reaction mixture being chosen so that the viscosity when polymeric synthesis polymers are used allows thorough mixing of the batch ( ⁇ 50% w / v). It is preferred to use an approximately 3-15 times excess (weight) of synthetic polymer compared to the sum of the metal ions contained.
  • Desorption can be used by using elevated temperature in combination with one of the desorption processes. Another way to influence the extent of desorption is the use of desorbing substances, such as. B. buffer solutions or surfactants.
  • a stable, physically optimal solution / suspension is obtained, which is the basic building block for the production of the specific nanoparticles.
  • the basic building blocks consist of the iron-containing core and the (residual) synthesis polymer.
  • the amount of remaining synthetic polymer is, depending on the ratio set by the desorption process, from 0.01 to 1. The range from 0.25 to 0.75 is preferred, since in this range the best compromise between stability and adsorption capacity of the basic building block results.
  • Diameter of the basic building block varies depending on the size of the iron-containing core and the synthetic polymer used and is of the order of less than 100 nm, preferably less than 50 nm. Particular preference is given to the production of basic building blocks in which the total diameter is at most five times the core diameter .
  • the basic building block is combined with a target polymer to produce the finished nanoparticle.
  • the adsorbed target polymer forms a secondary shell around the synthetic polymer / iron-containing core and forms the surface of the overall system and, in addition to the particulate character of the particles, determines the in vivo behavior.
  • the particular advantage of the manufacturing process is that practically any substance that can be adsorbed onto the basic building block can be used for the biological control of the nanoparticles.
  • the target polymers are not subject to any synthetic stress, so that even sensitive and previously unusable substances can be used as lead molecules for controlling the biological behavior.
  • Suitable target polymers are u. a. :
  • Galactoglucomannans phosphomannans, fucans, pectins, cyclodextrins, alginic acid, tragacanth and other types of gum, chitin, chitosan, agar, furcellaran, carrageenan, cellulose, celluronic acid, arabic acid and the chemically and / or enzymatically produced derivatives, which may still be can be substituted as desired and the low molecular weight degradation products of the high molecular weight compounds.
  • the polyamino and pseudopolyamino acids are also suitable.
  • Synthetic oligomers and polymers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylene ether, polyanetholsulfonic acid, polyethylene imine, polymaleimide, polyvinyl alcohol, polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl sulfate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polylactide, polylactide glycide.
  • Monomeric to oligomeric sugars and related substances such as aldo- and ketotrioses to aldo- and ketoheptoses, ketooctoses and ketononoses, anhydro sugar, monocarboxylic acids and derivatives with 5 or 6 carbon atoms in the main chain, cyclites, amino and diamino sugar, deoxy sugar, aminodeoxy sugar and aminosugar carboxylic acids, aminocyclites, phosphorus-containing derivatives of the mono- to oligomers.
  • Oligomers / polymers with anti-tumor properties such as lipopolysaccharides, ß-2, 6-fructan, ß-1, 3-glucan, manno- glucan, mannan, glucomannan, ß-1, 3/1, 6-glucane, ß-1,6-glucan, ß-1,3 / 1,4-glucan, arabinoxylan, hemicellulose, ß- 1,4-xylan, Arabinoglucan, arabinogalactan, arabinofucoglucan, ⁇ -1, 6/1, 3-glucan, ⁇ -1, 5-arabinan, ⁇ -1, 6-glucan, ß-2, 1/2, 6-fructan, ß- 2, 1-fructan.
  • lipopolysaccharides such as lipopolysaccharides, ß-2, 6-fructan, ß-1, 3-glucan, manno- glucan, mannan, glucomannan, ß-1, 3/1, 6-glucane
  • Polysaccharides can be improved by the introduction of hydrophilic and well hydrated groups.
  • substituents u. a. Methyl, ethyl, acetyl, carboxymethyl or sulfate groups can be used.
  • Surfactants and surface-active substances such as nonionic surfactants, alkyl glucosides, glucamides, alkyl maltosides, mono- and polydispersed polyoxyethylene, quaternary ammonium salts, bile acids, alkyl sulfates, betaines, CHAP derivatives.
  • Specificity also cell fragments, cells, bacterial fragments, substances from the large group of lectins, hormones and mediator substances, proteins and neoproteins, peptides and polypeptides, antibodies, antibody fragments or the "molecular recognition units” Integrins (ELAM, LECAM, VCAM etc.) or receptor-specific substances (e.g. Lewis-X, Sialyl-Lewis-X etc.).
  • It also includes the variety of blood / plasma / serum components and opsonins, the group of oligonucleotides and synthetic oligo- nucleotides, DNA and RNA or their derivatives or fragments or analogs and homologs, from the group of lipopolysaccharides, lipoproteins, glycerol esters, cholesterol and esters, or also metabolites and antimetabolites, drugs, drug conjugates, chemotherapeutics and cytostatics.
  • target polymers in addition or instead of the above.
  • examples of target polymers the chemical and / or enzymatically produced derivatives or degradation products can also be used.
  • the derivatives or the "native" target polymers can additionally carry functional groups. These functional groups can be at one end or at both ends or at any point in the underlying target molecule.
  • the functional groups can all be combined in the same or different groups. Both in the derivatives themselves and in the functional groups, those which contain N, S, 0 or P atoms, acid or analogs, hydroxyl, ether or ester groups are preferred.
  • composition of the nanoparticles depends on the respective requirement specified by the indication. Both individual and target polymers can be used
  • Target polymers e.g. B. synthetic and non-synthetic, lower and higher molecular weight, derivatized and non-derivatized, can be used.
  • the target polymer and the synthesis polymer can be the same.
  • the target polymer here is the declared synthetic polymer, but was not subject to the drastic conditions during manufacture and is therefore still in a "physiological" state.
  • the amounts of target polymer in the finished solution of the nanoparticles can be varied over a wide range. In principle, the range from 0.5 to 50 times the weight of the sum of the weight of the contained metal ions can be used, but preference is given to using amounts corresponding to 1 to about 25 times. All substances which improve or enable the adsorption between the target polymer or the mixture of the target polymers onto the surface of the iron-containing core or core plus primary coat are to be understood as adsorption mediators. In principle, the adsorption mediators must therefore have bifunctional properties, one part of the molecule containing the affinity for the basic building block, while another part of the molecule, which, however, may be identical to the first functional part, determines the affinity for the target molecule. Are suitable for. B.
  • Preferred adsorption mediators are peptides which have an affinity for the iron core or for the iron core plus primary coat. Such peptides can be selected using modern methods of biochemistry in peptide libraries. Preferred are peptides which contain the RRTVKHHVN or the RRSRHH or also RSKRGR sequence or parts thereof
  • Molecule contain [one-letter code of the amino acids s. z. B. Stryer, Biochemistry; Freeman and Comp. ; New York; 1988]
  • adsorption mediators do not have affinity required part of the molecule can also be covalently coupled to the target polymer or polymers using conventional biochemical methods, so that here the affinity for the target polymer only has to be present optionally.
  • the amount of adsorption mediator depends on the property or properties of the substances used (strength of the adsorption mediation) and on the properties of the target polymer (s); however, the maximum addition is less than or at most equal to the weight of the sum of the metal ions contained in the nucleus.
  • auxiliaries which can be contained in the solutions of the nanoparticles, can be assigned to the classes of preservatives, pH stabilizers, antioxidants, isotonic additives, peptizers and solubilizers according to their task.
  • Medically tolerable solvents such as sugar solutions, plasma expanders, electrolyte solutions, physiological saline or water ad injections, as well as parenterally administrable oily ones can be used as further auxiliaries
  • Exemplary examples of pharmaceuticals that can be contained in the solutions of the nanoparticles can be grouped into the groups antiallergics, antianaphylactics or prophylaxis, the vasodilators or vasoconstrictors, the substances that influence the blood circulation, the substances that influence the metabolism of the nanoparticles, assign the substances that influence the pharmacokinetics of the nanoparticles, the substances that change the iron balance, the substances from the field of enzyme inducers and inhibitors, or generally the mediators and antimediators.
  • Drugs from the groups of cytostatics, chemotherapy drugs, hormones and antidiabetics are of particular interest for use in therapy.
  • the pharmaceuticals can additionally be added to the solutions of the nanoparticles as an optional component or else they can be bound to the target polymers and the polymer-drug conjugate can then be used as the target polymer.
  • the "physiological" distribution behavior of the nanoparticles can be changed not only by influencing "physiological” factors such as blood circulation, lymph flow and lymph production or the like by pharmaceuticals, but the in vivo distribution can also be changed by simple physiotherapeutic measures. Particularly noteworthy here are the movements which, for. B. can be “applied” specifically by a walk or exercises on the ergometer and, in contrast, the immobility, such as. B. in bedridden patients and or use under anesthesia or the like, which leads to a completely different distribution behavior and pattern.
  • the supply of heat which can be made possible by simple use of red light or whole or partial body baths, should be mentioned in particular.
  • the supply of heat by means of a hyperthermia device, as used in many clinics for the targeted supply of heat in adjuvant tumor therapy, is particularly preferred here. Through targeted local heating, the "selectivity" can be improved through physiotherapy support.
  • the high flexibility of the modular production allows the free combination of target polymer (s), adsorption mediator (s), pharmaceutical auxiliaries and pharmaceuticals as well as the use of any composition of the nanoparticles in combination with physiotherapeutic measures.
  • the nanoparticles or the solutions can be composed of many different constituents, so that only general statements on the exact composition, which depends on the respective application, can be given:
  • Target polymer (s) 0.5 - 50
  • the total diameter of the nanoparticles including all additives is at most ten times higher (measured by a laser light scattering method, PCS) than the diameter of the core containing iron (measured by electron microscopy in a transmission arrangement; TEM).
  • PCS laser light scattering method
  • TEM transmission arrangement
  • targetability Because of their high physical quality and the particularly good controllability ("targetability") of the nanoparticles through flexible adaptation (modular structure) of the target polymer (secondary coat) to the respective question, there are many areas of use for special indications such as MR lymphography after intravenous or local interstitial administration, the tumor display, the display of functions or impaired functions, the plaque display (atherosclerosis imaging), the display of thrombi and vascular occlusions, MR angiography, perfusion examinations, the display of infarcts, the Representation of endothelial damage, the receptor imaging, the representation of the integrity of the blood-brain barrier, etc. and for differential diagnosis, in particular to differentiate between tumors / metastases and hyperplastic tissue.
  • MR lymphography after intravenous or local interstitial administration
  • the tumor display the display of functions or impaired functions
  • plaque display the display of thrombi and vascular occlusions
  • MR angiography perfusion examinations
  • infarcts the Represent
  • the nanoparticles according to the invention have a high degree of intrinsic color and, due to the combination with a target polymer, which leads to particularly high accumulation in the lymph nodes, the particles are outstandingly suitable as intraoperative marker substances for lymph node staging. With many surgical tumor removals, the lymph nodes are also removed and the pre-application of the nanoparticles makes it considerably easier for the surgeon to remove the z. To identify T. extremely small lymph nodes in the surrounding tissue.
  • the nanoparticles have a particularly wide usable time window for this indication and can be applied from approx. 60 min to more than 24 hours before the start of the operation.
  • intratumoral application or application into the tumor periphery gives the possibility, on the one hand, of staining the tumor periphery and thus increasing the delimitation of the tumor from the surrounding tissue and, on the other hand, the particles from the tumor area are disposed of via the same disposal Lymphatic vessels are removed, through which the tumor would also metastasize.
  • the nanoparticles thus show the lymph paths or lymph nodes that are particularly predestined for metastasis.
  • the particles can also be applied locally.
  • the local application can e.g. B. breast cancer can be advantageous because only a limited area is to be shown and the targeted application on the one hand high concentrations of contrast medium deposited in the target area and the other organism is not contaminated.
  • Indirect targeted application to the interstitial area of certain lymph nodes may also be necessary to confirm a diagnosis if there is an intravenous
  • nanoparticles Another area of application of the nanoparticles is their use as amplifying substances in in-vivo diagnostics based on highly sensitive measurement methods
  • the particles can be used as a drug carrier in therapy.
  • the specificity of the nanoparticles is used to transport drugs to the site of action.
  • the medicinal substances can be incorporated in the iron-containing core, adsorbed on the surface or chemically bound to the synthetic polymer and / or the target polymer.
  • An alternative is to bind the adsorption of drug-polymer conjugates or drugs to adsorption mediators.
  • a possible indication here is the accumulation of high concentrations of low molecular weight chemotherapy drugs in phagocytic cells, as is the case for B. is therapeutically necessary for many diseases with persistent microorganisms in RES cells.
  • the nanoparticle drug systems can also be selectively imaged by external magnetic fields Target area to be accumulated.
  • Target area to be accumulated.
  • small magnets for control in the target area, e.g. B. in a tumor area to implant.
  • nanoparticles as carriers for the targeted transport of medicinal substances into certain tissues
  • medicinal forms with modified active substance release can be produced.
  • the release of the active substance can be controlled by biologically cleavable drug conjugates or by storing the drug in different components of the nanoparticle with different biodegradation.
  • a Moegli ⁇ before indication is for.
  • chemotherapeutic agents and cytostatic agents come into consideration as drugs that can be specifically transported to the site of action with the nanoparticles.
  • Antimicrobial therapy also often requires the targeted transport of the drug to the site of action (e.g. tuberculosis, microorganisms persistent in macrophages).
  • Drugs for therapeutic systems in which the release takes place via the magnetic properties of the nanoparticles come along with others Antimicrobials, hormones, 'antidiabetic drugs, cytostatics and chemotherapeutics into consideration.
  • the nanoparticles can also be used as a "drug".
  • the nanoparticles in medical radiation therapy in the doping of the nanoparticles with radioactive elements, which are carried out in the core or by adsorption of suitable molecules with isotopes or molecules onto the basic building block.
  • a preferred application of the nanoparticles in radiation therapy is given, for example, in that the nanoparticles either contain a “self-emitter” via the radioactive isotope 55 Fe or in that the nanoparticles contain an isotope that is excited by an external “activation” into a steel isotope can.
  • the nucleus can contain 1- ⁇ Gd and the external excitation can be traced back to neutrons.
  • nanoparticles in radiation therapy results from the possibility of changing the nanoparticles in the core, in the synthesis or in the target polymer or in the adsorption mediator in such a way that self-emitters such as, for example, B. 123 oc j er 125- [are included.
  • the nanoparticles can also contain an isotope that is only converted into a radiating isotope by external excitation.
  • An example here is e.g. B. the labeling of the target polymer with iodine and the external excitation of the iodine K edge with monoenergetic X-rays.
  • the nanoparticles according to the invention can also be used to remove bacteria, viruses, endotoxins and exotoxins from the vasal space, on the one hand the interaction with the nanoparticles per se can lead to inactivation and on the other hand the interaction for recognizing the conjugates / adsorbates that RES can occur with subsequent intracellular inactivation.
  • Fig. 1 Schematic structure of the nanoparticles with an iron-containing core, primary coat (synthetic polymer) and secondary coat (target polymer)
  • Fig. 2 General synthetic scheme for the production of the nanoparticles according to the invention
  • Fig. 3 FTIR spectrum of mono-carboxydextran and the starting compound dextran 4
  • Fig. 4 FTIR spectrum of poly-carboxydextran and the
  • Fig. 5 MR images of rat lymph nodes embedded in agarose
  • Fig. 6 Quantitative evaluation (from Fig. 5) of the relative signal intensities for SE 2000/15 in various rat lymph nodes
  • Fig. 7 Quantitative Evaluation (from Fig. 5) of the relative signal intensities GE 135/15/15 ° in various rat lymph nodes
  • Fig. 8 Frontal pre- and post-contrast MR images of the pelvic region of the rabbit in the proton density weighted spin echo sequence (SE 2000/15)
  • Fig. 9 Frontal pre- and post-contrast MR Images of the pelvic region of the rabbit in the proton density weighted spin echo sequence (SE 2000/15).
  • Fig. 10 Relative signal intensities for SE 2000/15 in different rabbit lymph nodes 24 h p. i.
  • Fig. 11 Frontal pre- and post-contrast MR images of the pelvic region of the rabbit in the T2 * - weighted gradient echo sequence (GE 135/15/15 °)
  • Fig. 12 Frontal pre- and post-contrast MR images of the pelvic region of the rabbit in the T2 * - weighted gradient echo sequence (GE 135/15/15 °).
  • Fig. 13 Modified batch vs original substance:
  • Fig. 14 Ex vivo MR images (GE sequence) of agarose-embedded lymph nodes in the rabbit
  • Fig. 15 Relative signal intensities for GE 135/15/15 ° in various rabbit lymph nodes 24 h p. i.
  • Fig. 16 Relative signal intensities depending on the applied dose for SE 2000/15 in various rat lymph nodes 24 h after application of the nanoparticles.
  • Fig. 17 Relative signal intensities as a function of the applied dose for GE 135/15/15 ° in various rat lymph nodes after 24 hours
  • Fig. 18 Relative signal intensities for SE 2000/15 in various rat lymph nodes depending on the time after application (reference substance)
  • Fig. 19 Relative signal intensities for SE 2000/15 in various rat lymph nodes depending on the time after application of the specific nanoparticles .
  • Fig. 20 Relative signal intensities for GE 135/15/15 ° in various rat lymph nodes in
  • Fig. 21 Relative signal intensities for GE 135/15/15 ° in various rat lymph nodes depending on the time after application of the specific nanoparticles.
  • Fig. 22 Influencing lymph node accumulation through targeted application of heat.
  • Fig. 23 Transverse dynamic study of the rat abdomen with a Tl-weighted SE sequence (TR: 200 ms, TE: 10 ms) after bolus injection of the specific nanoparticles according to Example D2 (dose 20 ⁇ mol Fe / kg)
  • Fig. 24 Comparison of the relative signal intensities for SE TR / TE 200ms / l0ms in the venous vessel and the
  • Fig. 28 Demonstration of metastases in lymph nodes by visual detection in metastatic lymph nodes in the rabbit.
  • Fig. 29 Cell uptake of specific nanoparticles (with transferrin) compared to the non-specific control (nanoparticles without transferrin).
  • Fig. 30 Ex vivo MR tomographic representation of atherosclerotic plaques of the aorta of a rabbit with the modification to the nanoparticles according to example D7 (dose 200 ⁇ mol
  • Fig. 31 Histological iron detection in the atherosclerotic membrane of the rabbit aorta with Berlin blue staining.
  • Fig. 32 Histochemical detection (Berliner Blau
  • Fig. 33 Transverse Tl-weighted spin-echo dynamic study (TR: 300 ms, TE: 15 ms) of the tumor
  • Fig. 35 Time-dependent transverse proton density-weighted (SE 2000/15) recordings after application of the nanoparticles according to Example D2 (200 ⁇ mol Fe / kg).
  • A2 Synthesis of polycarboxydextran (P-C ⁇ x. 10 g of dextran T10 are weighed into a 250 ml 2-neck flask and mixed with 100 ml of 4 N NaOH. One neck of the flask is equipped with a reflux condenser and the solution is then poured on heated to about 80 ° C. While stirring (magnetic stirrer), 30 g of 6-bromohexanoic acid are added in portions through the second access, after which the access is closed by a stopper and the reaction mixture is stirred for a further 3 hours neutralization takes place with a deduction with 6 N HC1 and then a pre-concentration on a rotary evaporator (60 ° C., vacuum).
  • the unreacted reagent is separated off or the modified carboxydextrans is purified by precipitation with ethanol.
  • the white precipitate is washed, redissolved in double-distilled water and finally filtered through a 0.22 ⁇ m filter and lyophilized.
  • reaction solution is then heated under reflux conditions for about 1 hour.
  • the mixture is then heated for about 10 minutes on the open flask to drive off the unreacted ammonia.
  • the mixture is centrifuged at 2500 g for 30 min and the filtrate is evaporated to about 7 ml on a rotary evaporator, the pH is checked and, if necessary, neutralized and after the concentration has been determined using Aqua bidest. adjusted to an approximately 1 molar iron concentration and then filtered 0.22 ⁇ m.
  • the solution can be sterilized in an autoclave with pressurized steam (method A121).
  • Test animals (rat, approx. 200 g) a 50.5 cm long one filled with heparinized saline (0.2 ml) Implanted catheter and advanced about 1.5 cm to the heart. The freely movable end of the catheter was guided outside and fixed with histoacrylic. Approximately one hour after the end of the operation, the test substance is administered iv via the tail vein (approx. 1 ml / min). The blood samples were taken at different times according to the expected elimination rates of the test substances on the awake animal. After the end of the experiment, the animals were killed under ether anesthesia by bleeding from the vena cava.
  • the blood samples are centrifuged for 15 min at 2900 rpm (1000 g) and then 0.250 ml are removed from the supernatant and distilled off. Water made up to 2.0 ml and the mixture was then heated to 40 ° C.
  • the "concentration determination” is carried out by measuring the T ⁇ ; 2 ** Re l axat i ° nsze ten m t clem Relaxometer pcl20 (Bruker, Germany). The measurement was carried out with a 180 ° -90 ° IR (inversion recovery) sequence (Ti) or with a CPMG sequence (T 2 ).
  • the evaluation was carried out using a pharmacokinetic two-compartment model and the data were calculated using the pharmacokinetic computer program TOPFIT, by plotting the concentrations, expressed as reciprocal T ⁇ f 2 times (relaxation rates) minus blank values, over time .
  • TOPFIT calculates the slope of the straight line and the effect half-lives from the semi-logarithmic "concentration" time representation.
  • Example A2 poly-carboxydextran (Example A2) with a molecular weight of about 12,000 Da are bidistilled in 17.5 ml of aqua. solved.
  • the solution is degassed by blowing nitrogen.
  • 6.7 ml of 1 molar iron (III) citrate monohydrate solution are placed in a test tube and degassed with nitrogen.
  • 1.635 g of iron (II) gluconate trihydrate are added to the iron (III) solution and dissolved in the nitrogen stream.
  • the polymer solution is heated to approx. 75 ° C and the iron solution is added (under nitrogen gas).
  • the reaction mixture is mixed with about 12 ml of 3 N sodium hydroxide solution in the heat with thorough mixing within 30 seconds. Then the
  • reaction solution is then neutralized with about 6 N hydrochloric acid and heated under reflux conditions for about 1 hour. After cooling, the mixture is centrifuged at 2500 g for 30 min and the filtrate is concentrated to about 6 ml on a rotary evaporator, the pH is checked and, after the concentration has been determined, it is bidistilled with Aqua. adjusted to an approximately 1 molar iron concentration and then filtered 0.22 ⁇ m.
  • the solution can be sterilized in an autoclave
  • Example A2 poly-carboxydextran (Example A2) with a molecular weight of about 12,000 Da are bidistilled in 17.5 ml of aqua. solved. The solution is degassed by blowing nitrogen. 10 ml of 1 molar iron (III) chloride hexahydrate solution are added to the polymer solution and further degassed with nitrogen. The polymer solution is heated to approximately 75 ° C. and then 113.6 mg of hydroxylamine HCl are added (with nitrogen gas). The reaction mixture is under good heat
  • the polymer solution is heated to approx. 75 ° C and the iron solution is added (under nitrogen gas). About 11.5 ml of 3N sodium hydroxide solution are added to the reaction mixture in the heat with thorough mixing within 30 seconds. The reaction solution is then neutralized with about 6 N hydrochloric acid and heated under reflux conditions for about 1 hour. After cooling, the mixture is centrifuged at 2500 g for 30 min and the filtrate is concentrated to about 8 ml on a rotary evaporator, the pH is checked and after the concentration has been determined with Aqua bidest. to an approximately 1 molar
  • Example B1 5 ml of the solution according to Example B1 are poured into a Visking dialysis tube and dialyzed 5 times for 1 hour against 1 liter of fresh double-distilled water.
  • the retentate is adjusted to an iron concentration of 200 mmol / 1 by dilution with Aqua bidest and then filled into sterile 10 ml vials in sterile 0.22 ⁇ m filters (cellulose acetate) in portions of 5 ml.
  • the desorbed solution can be sterilized in an autoclave.
  • D3 Dextran FP1 as a lyophilisate 5.0 ml solution according to Example Cl with a concentration of 200 mmol Fe / 1 (corresponding to 56 mg total iron) are placed in a 10 ml vial.
  • 302.4 mg of dextran FP1 as Target polymer is dissolved in 6.0 ml of Aqua bidest and 5.0 ml are added to the iron oxide solution under aseptic conditions using a syringe with a filter attachment (0.22 ⁇ m).
  • the solution is lyophilized in the injection bottle and then closed.
  • the application solution is prepared by adding 10 ml of physiological saline; the
  • the bottle now contains 10 ml of 100 mmolar (iron) solution, which is suitable for intravenous MR lymphography.
  • dextran FPl as the target polymer are weighed into a 5 ml injection bottle and filled with 5.0 ml of solution according to Example Cl with a concentration of 200 mmol Fe / 1 (corresponding to 56 mg of total iron) and the bottle is then closed.
  • the dextran FP1 is released by rotating the injection bottle.
  • the preparation now contains 5 ml of 200 mmolar (iron) solution, which is directly suitable for intravenous MR lymphography.
  • the preparation now contains 10 ml of 100 mmol (iron) solution, which is suitable for use as a specific contrast agent for the display of proliferating cells (tumors).
  • Animals rat, SPF -Han Wistar; approx. 150 g
  • lymph nodes / lymph node groups An ex vivo agar phantom was used for lymph nodes / lymph node groups.
  • This ex vivo model has the advantage of being able to evaluate the accumulation in various central and peripheral lymph nodes (groups) even in small test animals (mouse, rat, rabbit) and thus also enables statements to be made on the homogeneity of the distribution; a quantification of the signal influence is possible.
  • the test animals (mouse, rat or rabbit) are injected with the solution of the nanoparticles via the tail vein (bolus). After 24 hours, the animals are sacrificed and various lymph nodes or lymph node groups are prepared (Lnn. Popliteales, Lnn. Mandibulares, Lnn. Iliacales, Lnn. Axillares, Lnn. Mandibulares, Lnn. Inguinales).
  • the lymph nodes are then poured into an agar phantom and kept in the refrigerator until the MR measurement
  • agar agar for microbiology 10 g agar agar for microbiology in 500 ml bidistilled water, the 0.5 ml Magnevist (0.5 mol / 1 gadolinium-DTPA-dimeglumine) are added for a signal-homogeneous background in the MR image are suspended. The suspension is boiled and then cooled to approx. 80 ° C. and kept at this temperature. About half of the agar solution is poured into a 0.5-1 cm thick layer in a plastic dish. After cooling, the organ samples are arranged on the agar layer (accordingly left-right half of the body or in "physiological order" from top to bottom) and fixed with a little agar solution (Pasteur pipette). Finally, a second layer of agar solution is poured over the tissue samples. The phantom is measured within 24 hours and stored in the refrigerator until examination.
  • Magnevist 0.5 mol / 1 gadolinium-DTPA-dimeglumine
  • the tissue samples are carefully removed from the agar phantom again after the MR measurement, decomposed in concentrated nitric acid and then the iron content is quantified using ICP-AES (Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy).
  • ICP-AES Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy
  • Fig. 5 MR images of rat lymph nodes embedded in agarose; Resection 24 h after application of the reference substance (example C2, left) or the modified substance according to example D2 (right), - dose in each case 100 ⁇ mol Fe / kg.
  • Fig. 6 Modified batch vs original substance: Quantitative evaluation (from Fig. 5) of the relative signal intensities for SE 2000/15 in various rat lymph nodes 24 h after magnetite application (100 ⁇ mol Fe / kg).
  • Fig. 7 Modified batch vs original substance: Quantitative evaluation (from Fig. 5) of the relative signal intensities GE 135/15/15 ° in various rat lymph nodes 24 h after magnetite application (100 ⁇ mol Fe / kg).
  • the lymphonodal signal reduction of mandibular, axillary, iliac, popliteal lymph nodes and the average accumulation across all lymph node groups by the batch modified with Dextran FPl as the secondary coat differs significantly (t-test, p ⁇ 0.05) from the unmodified starting compound (Fig. 6 and 7).
  • the superiority of the specific nanoparticles is already shown impressively by the optical assessment of the "blackening" of the individual lymph nodes in Figure 5. The homogeneity of the distribution across all examined lymph nodes is particularly remarkable.
  • the rabbits were pretreated about a week before the test substances were applied.
  • the test animals were given 0.5 times a sterile egg yolk suspension (oxoid) i. in the
  • Fig. 8 Frontal pre- and post-contrast MR images of the pelvic region of the rabbit in the proton density weighted spin-echo sequence (SE 2000/15). (Left: pre-contrast; right: specific substance D2 (150 ⁇ mol Fe / kg)).
  • Fig. 9 Frontal pre- and post-contrast MR images of the pelvic region of the rabbit in the proton density-weighted spin-echo sequence (SE 2000/15). (left: pre-contrast; right: starting compound C2 (150 ⁇ mol Fe / kg)).
  • Fig. 10 Specific nanoparticles vs unspecific
  • Fig. 13 Specific nanoparticles vs unspecific starting particles: Relative signal intensities for GE 135/15/15 ° in different rabbit lymph nodes
  • Fig. 14 Ex vivo MR images (GE sequence) of agarose-embedded lymph nodes in the rabbit; Dose - 150 ⁇ mol Fe / kg; left: unspecific comparison particles; right: specific nanoparticles.
  • the lymphonodal signal reduction (GE sequence) in the subiliacal, iliac and popliteal lymph nodes as well as the mean accumulation across all lymph node groups by the FPI-modified nanoparticles differs significantly (paired t-test, p ⁇ 0.05) from the unmodified ones Comparative particles (Fig. 13).
  • the more homogeneous interlymphonodal signal influence (Fig. 15) of the specific particles can also be clearly seen in the MR tomographic images of the agarose-embedded lymph nodes (Fig. 14); here, the comparison substance shows, as also observed in the rat, a strong signal reduction, but limited to the mesenteric lymph nodes.
  • Fig. 16 Specific nanoparticles according to Example D2 vs unspecific particles according to Example C2: Relative signal intensities depending on the dose applied for SE 2000/15 in various rat lymph nodes 24 h after application of the particles.
  • Fig. 17 Specific nanoparticles according to example D2 vs unspecific particles according to example C2: Relative signal intensities depending on the dose applied for GE 135/15/15 ° in various rat lymph nodes 24 h after application of the particles.
  • Tab. 11 Mean relative signal intensities and standard deviation across all lymph node stations depending on d ⁇ r. applied substance and osis.
  • Fig. 18 Comparative substance according to example C2: Relative signal intensities for SE 2000/15 in different
  • Fig. 19 Specific nanoparticles according to Example D2: Relative signal intensities for SE 2000/15 in various rat lymph nodes depending on the time after application.
  • Fig. 20 Comparative substance according to Example C2: Relative
  • Fig. 21 Specific nanoparticles according to Example D2: Relative signal intensities for GE 135/15/15 ° in different
  • rats were placed under anesthesia for 3-4 hours and then placed in a water bath for 2 hours. In this water bath, the rats lay with the left side of their body on a hot plate and with the right side of their body on an insulating plastic plate of the same height, which was not heated. This created a temperature difference between the water temperature on the left side of the body and the water temperature on the right side of the body.
  • the water temperature under the left shoulder of the rats was initially 41.0 - 41.5 ° C and after 30 minutes the temperature settled to a constant value of 41.5 - 42.0 ° C. Under the right shoulder, the water temperature was initially 37.0 - 37.5 ° C and after 30 min.
  • the constant temperature of 37.5 - 38.0 ° C was reached.
  • the nanoparticles were injected intravenously as a bolus in a dose of 100 ⁇ mol Fe / kg body weight.
  • the rats were put back in the cage and 24 h post injection the lymph nodes were prepared and examined by MRI.
  • Fig. 22 Influencing lymph node accumulation through targeted application of heat.
  • the popliteal lymph nodes can only be seen as bright spots.
  • the influence of heat treatment is impressively demonstrated in the illustration on the right.
  • the left side of the anesthetized rat lay on an insulating plastic plate and had the normal body temperature while the right side was heated in a water bath to 41.5 - 42.0 ° C.
  • the "cold" side shows practically no accumulation, while the heated side shows a high and homogeneous intralymphonodal accumulation of the nanoparticles. (Nanoparticles according to Example D 2; 100 ⁇ mol / kg body weight; 24 h pi; GE 135/15/15)
  • the rats were placed under anesthetic in the warm bath.
  • the anesthesia leads to a standstill of the peripheral muscle activity, a reduced lymph flow and a reduced vascular permeability with the result that practically no accumulation of the nanoparticles can be demonstrated without heating.
  • MR technology Device: Siemens Magnetom 1.5 T MR full body tomograph with extremity coil
  • MR parameters Siemens Magnetom 1.5 T, extremity coil, dynamic (transversal) with Tl-weighted SE sequence (TR: 200 ms, TE: 10 ms), FOV 170 mm, matrix 256x256, SD: 3 mm; - coronary MIPS of 3D flash (TR: 40 (60) ms, TE: 6 ms, FA 60 (40) °) and 3D FISP sequence (TR: 40 ms, TE: 7 ms, FA 35 °), FOV 240 mm, matrix 256x256, SD: 17 mm.
  • MR evaluation signal intensities in user-defined regions of interest of vessels (vena cava), liver, fat and muscle. The signal intensities are calculated in a standardized manner on the background.
  • Fig. 23 Transverse dynamic study of the rat abdomen with a Tl-weighted SE sequence (TR: 200 ms, TE: 10 ms) after bolus injection of the specific nanoparticles according to example D2 (dose 20 ⁇ mol Fe / kg); clear signal enhancement (1 min p.i.) in the intrahepatic vessels and the vena cava).
  • Fig. 24 Comparison of the relative signal intensities for SE TR / TE 200ms / l0ms in the venous vessel and the liver parenchyma for the specific nanoparticles according to Example D2 and the non-specific comparison substance according to Example C2; Dose 20 ⁇ mol Fe / kg, -.
  • Fig. 25 Coronary MIPS (maximum-intensity projections) from SD flash recordings (TR: 40 ms, TE: 6 ras, FA 60 °); Comparison of the specific nanoparticles according to example D2 (left) with the comparison substance C2 (right) -
  • Fig. 24 in the vena cava and liver parenchyma demonstrates the outstanding properties of the specific nanoparticles for use as contrast agents in MR angiography.
  • the enhancement is three times higher than that of the control substance and the brightening effect lasts for a long time and is very constant
  • Substance Specific Nanoparticles Animals: Rat, SPF Han-Wistar; approx. 150 g Russian rabbit (Chbb: HM, Thomae GmbH) with implanted VX2 tumor (tumor bank of the German Cancer Research Center, Heidelberg); approx.2.6 kg.
  • the tumor was implanted into the caudolateral thigh muscles by injecting 3 • 10 6 living tumor cells. The admission takes place 20 days after the implantation.
  • Rat intravenous injection of 500 ⁇ mol Fe / kg body weight
  • Rabbit Interstitial application of 20 ⁇ mol per paw Times: Rat: 1, 4 and 24 h pi Rabbit: 12 h p. i.
  • Fig. 26 Nanoparticles according to the invention as "intraoperative" marker substances for the visual detection of
  • Fig. 27 Nanoparticles according to the invention as "intraoperative" marker substances for the visual detection of lymph nodes (detailed view).
  • Fig. 28 Demonstration of metastases in lymph nodes by visual detection in metastatic lymph nodes in the rabbit. The metastases can be seen as bright recesses in the otherwise homogeneously dark colored lymph nodes.
  • the images of the rats show that a large number of different lymph node / lymph node groups can be stained by the single intravenous application of the solution of the nanoparticles.
  • the lymph nodes stand out clearly from the surrounding tissue and can be easily detected and then removed by the surgeon if necessary.
  • Transferrin as secondary coat (target polymer) substance specific nanoparticles (example D6)
  • Human myeloma cells (ATCC CRL 9068; cell line NCI H929) are at a concentration of at least 1-10 *> cells / ml in RPMI 1640 with 10% FCS and 0.05 mmol / 1
  • the cells are incubated with the nanoparticles in a concentration of 0.5 mmol / l (calculated as iron) for 18 hours.
  • the cells are pelleted, washed twice with PBS and then the cell number is determined in an aliquot (Neubauer
  • the cell pellet is concentrated in 500 ⁇ l. Nitric acid / 100 ⁇ l hydrogen peroxide dissolved by heating and made up to a volume of 5.0 ml. The iron concentration is then determined using atomic emission spectroscopy (AES, detection limit 0.1 ppm).
  • AES atomic emission spectroscopy
  • Fig. 29 Cell uptake of specific nanoparticles (with transferrin) compared to the non-specific one
  • Control nanoparticles without transferrin.
  • the NCI cells human myeloma cell line
  • the specific nanoparticles show a significantly higher uptake by the Myeloma NCI 929 cells.
  • the uptake of the nanoparticles without target polymer, which is more than 50% lower, demonstrates the advantages of the specific nanoparticles according to the invention.
  • the aorta was dissected out, carefully cut open and then rinsed with cold PBS solution in order to remove non-bound or absorbed nanoparticles. The aorta was then divided into two parts and poured into the agarose phantom and then examined by MRI.
  • Fig. 30 Ex vivo MR tomographic representation of atherosclerotic plaques of the aorta of a rabbit with the modification D7 (dose 200 ⁇ mol Fe / kg; resection of the aorta 5 h p.i.); left proton density-weighted spin-echo sequence; right T2 * weighted gradient echo sequence.
  • Fig. 31 Histological iron detection in the atherosclerotic membrane of the rabbit aorta with Berlin blue staining. The comparison with the MR tomographic image (GE 135/15/15 °) shows that the histologically proven iron adheres to the
  • Fig. 32 Histochemical detection (Berlin blue staining) of the accumulated nanoparticles according to Example D7 in the aorta of a Watanabe rabbit.
  • the upper figure shows an overview of the prepared aorta on the agar and the lower part demonstrates the good correlation of the iron staining (blue granules) with the already visually recognizable plaques in the particularly strongly modified aortic arch.
  • the MR tomographic image (“ex vivo image") of the prepared aorta shows the plaques as dark spots (signal reduction).
  • the findings from the MR scan correlate with the plaques that are already clearly visible. The largest plaques are in the area of the aortic arch and are confirmed in the MR tomographic image and the histological view; Even smaller plaques can be easily detected both in the MR image and with the histological iron staining.
  • the nanoparticles according to the invention can accumulate in tumors.
  • the studies should show that Particles represent suitable drug carriers for chemotherapeutics and, on the other hand, document that the nanoparticles can be used to check whether the therapeutics can reach their desired site of action, ie the tumor, so that here is an example of the combination of diagnosis and therapy .
  • Dosage 200 ⁇ Mol Fe / kg body weight (KGW) times: 0 - 120 minutes and 12 or 24 hours after application.
  • Fig. 33 Transversal T1-weighted spin-echo dynamic study (TR: 300 ms, TE: 15 ms) of the tumor signal behavior after bolus injection of nanoparticles according to example D2 (200 ⁇ mol Fe / kg). The images show a time-dependent slowly increasing signal enhancement in the tumor with a clearly increasing delimitation of the mass.
  • Fig. 34 Course of the relative signal intensity (accumulation) in the tumor. The temporal signal course

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft modular aufgebaute Eisen enthaltende Nanopartikel, ihre Herstellung und Anwendung in der Diagnostik und Therapie. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel zeichnen sich dadurch aus, daß sie aus einem Eisen enthaltenden Kern, einem Primärcoat (Synthesepolymer) und einem Sekundärcoat (Targetpolymer) sowie gegebenenfalls pharmazeutischen Hilfsstoffen, Pharmaka und/oder Adsorptionsvermittlern bestehen.

Description

EISEN ENTHALTENDE NANOPARTIKEL MIT DOPPELTEM COATING UND ANWENDUNG
IN DER DIAGNOSTIK UND THERAPIE
Die vorliegende Erfindung betrifft modular aufgebaute Eisen enthaltende Nanopartikel, ihre Herstellung und Anwendung in der Diagnostik und Therapie.
Substanzen, die schon bei niedriger Feldstärke maximal magnetisiert sind (hohe Sättigungsmagnetisierung) , aber nach dem Abschalten des äußeren Magnetfeldes keine Rest¬ magnetisierung (Remanenz) zeigen, da die thermische Energie einer permanenten Ausrichtung der spontan magne- tisierten Weiß' sehen Bezirke entgegenwirkt, werden als superparamagnetisch bezeichnet. Eisen enthaltende Kristalle, die als parenterale MR-Kontrast ittel entwik- kelt werden, fallen in diese Kategorie. Eine charakteri¬ stische Eigenschaft dieser Substanzen als MR-Kontrastmit- tel ist die starke Beeinflussung der Protonenrelaxations- zeiten und damit die hohe Stärke als Kontrastmittel in diesem diagnostischen Verfahren. In der medizinischen Diagnostik wurden als superparamagnetische Kontrastmit¬ tel bisher hauptsächlich Eisenoxide mit "magnetitartiger" Kristallstruktur untersucht, die z. B. im Magnetit oder Maghämit vorliegt (Spinell, inverses Spinell) .
Die superparamagnetischen Eisenoxide, die als MR-Kon¬ trastmittel verwendet werden sollen, zeigen vergleichbare Eigenschaften dahingehend, daß sie eine starke Beeinflussung der Protonen-Relaxation in ihrer Nahumgebung zeigen (hohe Relaxivität) und daß es sich um Partikel mit "magnetitartiger" Kristallstruktur handelt. Es sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung Eisen enthaltender Kristalle (Eisenoxide) mit superparamagneti- schen Eigenschaften beschrieben.
Die verschiedenen Verfahren lassen sich unter unter¬ schiedlichen Gesichtspunkten einteilen. Die Herstellung der superparamagnetischen Eisen enthaltenden Kristalle unterscheidet dabei zwei prinzipielle Verfahren, nämlich das Sinterverfahren mit hoher Temperatur und anschlie- ßender mechanischer Zerkleinerung und die naß-chemische
Synthese in Lösung. Für die medizinische Anwendung wurden bisher nur Partikel untersucht, die auf naßchemischem Wege hergestellt worden sind, während das Sinterverfahren zur Herstellung von Eisenoxiden für technische (Tonträger, Farbpigmente und Toner) und biotechnische Anwendungen wie z. B. die Magnetseparationstechnik, beschrieben wurde [Schostek S, Beer A; DE 3,729,697 AI; Borelli NF, Luderer AA, Panzarino JN; US 4,323,056; Osamu I, Takeshi H, Toshihiro M et al. ; JP 60,260,463 A2] . Die naßchemische Herstellung läßt sich weiter unter¬ teilen. Bei der "Zweitopfsynthese" erfolgt erst die Herstellung des Eisen enthaltenden Kerns (Eisenoxid) und anschließend die Zugabe eines Stabilisators, um die physikalisch-galenische Qualität zu gewährleisten. Eine Variante der "Zweitopfsynthese" ist die Herstellung des Eisenkerns an Ionenaustauschern. Bei der "Eintopf- synthese" erfolgt die Herstellung der Eisenoxide in Anwesenheit des Stabilisators, der die Kerne schon während der Präzipitation der Eisensalze umhüllt und so die Aggregation und Sedimentation der Partikel verhin¬ dert.
Neben der Unterscheidung nach dem Herstellungsgang in "Eintopf-" und "Zweitopfsynthese" kann eine Unterteilung auch nach der Art des verwendeten Lösungsmittels in wäßrige [Hasegawa M, Hokukoku S; US 4,101,435; Fuji Rebio K.K.; JP 59,195,161] und nicht-wäßrige Verfahren [Porath J, Mats L; EP 179,039 A2; Shigeo A, Mikio K, Toshikatzu M; J. Mater. Chem. 2(3) ; 277-280; 1992; Norio H, Saturo O; JP 05,026,879 A2] erfolgen.
Partikel, die nach einem "Zweitopfverfahren" in nicht¬ wäßrigen Lösungsmitteln hergestellt wurden, werden über¬ wiegend in technischen Bereichen eingesetzt. Magnetische Eisenoxide, die als Kontrastmittel in der Humandiagnostik verwendet werden sollen, erfordern aus medizinisch-toxi¬ kologischen Gründen ein wäßriges Dispersionsmedium. Eine Sonderstellung nehmen bei dieser Einteilung die Partikel ein, die zwar in einem nicht-wäßrigen Lösungsmittel hergestellt wurden, sich aber nach der Herstellung in einem wäßrigen Medium stabil dispergieren lassen. Solche Partikel werden derzeit im Allgemeinen in der ex vivo Diagnostik, z. B. in der magnetischen Separationstechnik [Chagnon MS, Groman EV, Josephson L, et al. ; US 4,554,088] , verwendet, wurden aber auch für die in vivo Diagnostik vorgeschlagen [Pilgrimm H; US 5,160,725] .
Partikel, die nach dem "Zweitopfverfahren" hergestellt wurden, fanden hauptsächlich bei den frühen experimentel¬ len Untersuchungen bis Mitte der 80er Jahre Verwendung, während z. Zt. nur noch Untersuchungen mit Eisenoxiden beschrieben werden, die nach einer "Eintopfsynthese" hergestellt sind. Das "Eintopfverfahren" zur Herstellung der superparamagnetischen Eisen-enthaltenden Oxide für Anwendungen in der Humandiagnostik hat sich durchgesetzt, da die Partikel dem "Zweitopfverfahren" hinsichtlich der physikalisch-chemischen Qualität und der pharmazeutisch- galenischen Stabilität überlegen sind.
Auch die pharmazeutisch stabileren Suspensionen/Lösungen von Partikeln, die nach dem "Eintopfverfahren" in wäßri¬ gen Medien hergestellt wurden, lassen sich weiter unter- teilen in Eisenoxide unterschiedlicher Größe. Für die Partikel im Mikrometerbereich wurden biotechnische Anwen¬ dungen vorgeschlagen [Schröder U, Mosbach K; WO 83/01738 oder Schröder U; WO 83/03426] oder auch schon die in vivo Verwendung in der Diagnostik oder Therapie beansprucht [Widder KJ, Senyei AE; US 4,247,406 oder Jacobsen T, Klaveness J; WO 85/04330] . Für medizinisch-diagnostische Ansätze werden jedoch heutzutage nur noch die Partikel im Nanometerbereich beschrieben. Auch der Nanometerbereich läßt sich je nach der bevorzugten Verwendung in "große" (ca. > 50 nm Gesamtdurchmesser) und "kleine" (ca. < 50 nm Gesamtdurchmesser) Partikel unterteilen. Hauptanwen¬ dungsgebiet der großen Nanometerpartikel ist heute die Anwendung in der MR-Diagnostik von Leber und Milz, da Partikel dieser Größenordnung schnell und nahezu voll¬ ständig von den Makrophagen dieser Organe aufgenommen werden [Kresse M, Pfefferer D, Lawaczeck R; EP 516,252 A2 oder Groman EV, Josephson L; US 4,770,183] . Darüberhinaus wurden Vorschläge für die Verwendung als Verstärkersub- stanzen in der klinischen Hyperthermie gemacht [Hasegawa M, Hirose K, Hokukoku S, et al . ; WO 92/22586 AI und Gordon RT; US 4,731,239] .
Bei nahezu allen derzeit für medizinische Anwendungen vorgeschlagenen Partikeln handelt es sich um Eisenoxide, die in Anwesenheit von Dextran als Stabilisatorsubstanz hergestellt wurden [Bacic G, Niesmann MR, Magin RL et al.,* SMRM - Book of abstracts 328; 1987; Ohgushi M, Nagayama K, Wada A et al.; J. Magnetic Resonance 29; 599- 601; 1978; Pouliquen D, Le Jeune JJ, Perdrisot R et al . ; Magnetic Resonance Imaging 9; 275-283; 1991 oder Ferrucci JT und Stark DD; AJR 155; 311-325; 1990] , beschrieben wurde aber auch die Verwendung anderer Polysaccharide wie Arabinogalactan [Josephson L, Groman EV, Menz E et al; Magnetic Resonance Imaging 8; 616-637; 1990] , Stärke
[Fahlvik AK, Holtz E, Schröder U et al; Invest. Radiol . 25; 793-797; 1990] , Glycosaminoglycanen [Pfefferer D, Schimpfky C, Lawaczeck R; SMRM - Book of abstracts 773; 1993] , oder auch von Proteinen [Widder DJ, Grief WL, Widder KJ et al . ; AJR 148; 399-404; 1987] .
Die genauen Synthesebedingungen wie Art der Eisensalze, Temperatur, Hüllpolymer (Stabilisator) , Titrationsge¬ schwindigkeit, Alkaliwahl, Reinigung usw. beeinflussen die chemisch-physikalischen Eigenschaften und damit die pharmazeutisch-galenische Qualität und letztendlich den medizinischen Nutzen.
Ein wichtiger Schritt in der weiteren Entwicklung zu einer zielgerichteteren Anwendung geht auf Weissleder und Papisov [Weissleder R; Papisov MI; Reviews of Magnetic Resonance in Medicine 4; 1-20; 1992] zurück, die zeigen konnten, daß die "targetability" der magnetischen Eisen¬ oxide sich umgekehrt zur Partikelgröße verhält. Problema¬ tisch ist in diesem Zusammenhang, daß zu kleinen Parti- kelgrößen die Wirksamkeit (MR-Effekt) der Partikel ab¬ nimmt. Die Herstellung besonders kleiner magnetischer Eisenoxide ohne Fraktionierungsschritte wurde kürzlich beschrieben [Hasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al . ; JP 4,227,792] . Für besonders kleine Partikel, MION's, wurden auch schon Experimente zum "functional imaging" publi¬ ziert, bei denen die Dextran-Hülle der Partikel (magnetische Label) mit Periodat oxidiert und anschlie¬ ßend mit spezifischen Molekülen gekoppelt wurden (Antimyosin; polyklonaler Antikörper) [Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al. ; Radiology 182; 381-385; 1992 oder Weissleder R, Lee AS, Fishman A et al . ; Radiology 181; 245-249; 1991] .
Einen spezifischen Weg gehen Menz et al. [Menz ET, Rothenberg JM, Groman EV, et al . ; WO 90/01295] , die ihre großen Nanometerpartikel durch Polymere (Arabinogalactan) mit physiologischen Effektorzellen umhüllen und, ebenso wie Gordon, der seine Dextran-stabilisierten Partikel mit Periodat oxidiert und dann Transferrin durch reduk- tive Aminierung koppelt [Gordon RT; US 4,735,796] , einen spezifischen Aufnahmemechanismus über Rezeptor-vermit- telte Endozytose, beanspruchen.
Die Herstellung "großer" superparamagnetischer Eisenoxide für die Anwendung als Kontrastmittel in der MR-Diagnostik von Leber und Milz ist heute "Stand der Technik" und der diagnostische Nutzen für diese Indikationen ist nachge¬ wiesen. Vertreter dieser Eisenoxide befinden sich in der klinischen Entwicklung (SHU 555A; Schering AG Berlin; Deutschland; Phase II und AMI-25; Advanced Magnetics Inc.; Cambridge; Mass. ; USA; Phase 111/IV) .
Die Bedeutung der hydrodynamischen Durchmesser der Eisen¬ oxide für spezifischere (extrahepatische) Ansätze wie die MR-Lymphographie oder die MR-Angiographie sind bekannt und werden bearbeitet. Bei sonst identischen Partikeln sollte die Bluthalbwertszeit mit kleinerem Durchmesser zunehmen. Aus der Literatur sind Synthesevarianten zur Herstellung kleiner Eisenoxide bekannt.
Ein wesentliches Problem für die Weiterentwicklung spezi- fischer Kontrastmittel auf der Basis der superparamagne¬ tischen Eisenoxide ist bisher, daß es nicht möglich ist, die Targeteigenschaften, also Anreicherung und Verteilung im Zielgewebe, zu verbessern ohne gleichzeitig Kompro¬ misse bei den physikalisch-chemischen Parametern einzuge- hen, da die Stabilisatoren, die besonders gut zur Her¬ stellung der Eisen-enthaltenden Kerne geeignet sind, nur sehr eingeschränkt zum Targeting der Substanzen verwend¬ bar sind. Darüberhinaus limitieren die Reaktionsbedingun¬ gen bei der Synthese (pH-Extrema, Temperatur, Redoxreak- tionen mit den Eisensalzen) die Auswahl der möglichen
Stabilisatorsubstanzen, so daß ganze Gruppen wichtiger und hochspezifischer Moleküle (Proteine, Peptide, Oligo- nukleotide aber auch die meisten Oligo- und Polysacchari- de) nicht zur Stabilisierung bei der Herstellung verwen¬ det werden können, zumindest dann nicht, wenn die Stabi- lisatoren nach der Synthese noch über Targeteigenschaften (biologische Aktivität) verfügen sollen.
Auch bei den bisher verwendeten (chemisch) "unempfind¬ lichen" Polymeren - in der Hauptsache Dextran - ist bekannt, daß es unter den Bedingungen der Synthese zu vielfältigen und nicht kontrollierbaren Reaktionen kommt, so z. B. zur Depolymerisation im sauren pH-Bereich (niedermolekulares Dextran wird technisch z. B. durch Säurehydrolyse gewonnen) und verschiedenen Reaktionen bis zur völligen Zerstörung des Polymers im alkalischen
Bereich (Präzipitationschritt) . Unter Berücksichtigung der Zuckerchemie und der notwendigen Reaktionsbedingungen ist also davon auszugehen, daß die "Dextran-Magnetite" nach dem "Stand der Technik" gar keine Dextran-Magnetite sind, da zwar Dextran zur Stabilisierung eingesetzt wurde, es sich aber nach der Synthese nicht mehr um Dextran handelt .
Unter pharmazeutischen und zulassungsrelevanten Gesichts¬ punkten heißt das, daß ein wesentlicher Bestandteil - der Stabilisator ist ja die Hülle und bestimmt damit überwie¬ gend das biologische Verhalten - nicht bekannt oder deklariert ist .
Aus praktischen Gründen ergibt sich zusätzlich das Pro- ble , daß eine Optimierung der Oberflächeneigenschaften für die weitere Entwicklung unmöglich erscheint, wenn die Oberfläche gar nicht bekannt ist.
Am Beispiel einer spezifischen Anwendung wie der am besten untersuchten MR-Lymphographie, läßt sich zeigen, daß mit den Partikeln nach dem "Stand der Technik" unter Verwendung von Dextran als Stabilisator - andere Polymere zur Herstellung der besonders kleinen Eisenoxide wurden bisher nicht publiziert -, die Optimierung der Größe zwar die Anwendbarkeit verbessert und eine sehr hohe Akkumula- tion der Partikel im Lymphgewebe erzielt werden kann, aber für eine klinische Anwendung ist die Homogenität der inter-lymphonodalen Verteilung bisher unzureichend [Taupitz, M et al . ; SMRM - Book of abstracts 500; New York; USA; 1993] . Die zwar insgesamt sehr hohe aber inhomogene Anreicherung läßt bei dieser Anwendung auch nicht erwarten, daß eine weitere Verbesserung durch nochmalige Optimierung der hydrodynamischen Durchmesser erreicht werden kann.
Ein wesentliches Problem bei der Entwicklung spezifischer Diagnostika ist die geringe Größe des Zielorgans. So repräsentieren z. B. die gesamten Lymphknoten weniger als ein Prozent des Körpergewichtes. Potentielle Diagnostika müssen also eine hohe Anreicherung im Zielgewebe (Spezifität) zeigen und schon in geringer Konzentration eine starke Kontrastbeeinflussung ermöglichen.
Da die superparamagnetischen Eisenoxide, z. Zt. die Sub¬ stanzklasse mit der stärksten MR-Kontrastbeein-flussung darstellen, erscheinen die Partikel für spezifische
Anwendungen besonders geeignet. Ein Problem bei dieser Substanzklasse ist der Kristallkern der Eisenoxide, der den partikulären Charakter der Substanzen bedingt und die Partikelgröße wesentlichen Einfluß auf das biologische Verhalten hat. Kleinere Partikelgrößen verbessern die
Steuerbarkeit, aber die Effektivität -der Kontrastmittel nimmt wegen des Zusammenhangs zwischen der Kerngröße und dem magnetischen Moment zu den kleineren Größen ab, so daß hier ein Kompromiß zwischen kontrastbeeinflussender Wirkung (Physik) und Steuerbarkeit (Biologie) gewählt werden muß. Prinzipiell ist zu fordern, daß der Eisen- enthaltende Kern so groß wie möglich sein sollte, um eine hohe Wirksamkeit zu erreichen, wobei allerdings der Gesamtdurchmesser klein bleiben muß.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eisenhaltige Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, welche die Forderungen der Physik und der Biologie an ein spezifisches Nanopartikel optimal erfüllen.
Überraschenderweise stellte sich heraus, daß die erfin¬ dungsgemäßen Nanopartikel den bisherigen Eisenoxid-Parti¬ keln nach dem Stand der Technik hinsichtlich der Tar¬ getfähigkeit überlegen sind. Durch die Kombination der physikalischen Qualität mit der verbesserten Targetfähig- keit der Nanopartikel lassen sich Kontrastmittel oder auch Therapeutika/therapeutische Trägersysteme mit bisher unerreichter "targetability" herstellen.
Die Herstellung der Nanopartikel erfolgt aus einzelnen Bausteinen (modulares Prinzip) und gewährleistet dadurch höchste Flexibilität bei der Kombination der Eisen ent¬ haltenden Kerne (physikalische Wirksamkeit; Kontrast) mit der Targetkomponente (biologisches Verhalten) . Ein modu- larer Aufbau hat den Vorteil eine lagerfähige Komponente (Eisen-enthaltender Kern) mit möglicherweise empfindli¬ chen Molekülen zur Steuerung erst "just in time" zum fertigen Nanopartikel zu kombinieren. Diese Anlehnung an die aus der klinischen Radiopharmazie bekannten "Cold- Kits" ermöglicht es z. B. auch individuelle Serumkompo- nenten einzelner Patienten als Steuerungsmolekül zu nutzen (z. B. autologe Antikörper) .
Aufgrund ihrer intensiven Färbung gelingt es, die Nanopartikel auch visuell zu detektieren, wie es z. B. bei der Verwendung als optische Markersubstanz in der chirurgischen Medizin wünschenswert ist. Darüber hinaus sind die Nanopartikel auch für den Einsatz in der Therapie, z. B. durch ein magnetisches Targeting mit externen Magneten über einem Zielvolumen, verbunden mit einer magnetisch gekoppelten Freisetzung von Wirksub¬ stanzen, geeignet. Die Nanopartikel können in z. B. Tumoren akkumuliert werden und ermöglichen daher die Verwendung als spezifische Verstärkersubstanzen in der lokalen Hyperthermie.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel bestehen aus einem Eisen enthaltenden Kern, einem Primärcoat (Synthese¬ polymer) und einem Sekundärcoat (Targetpolymer) sowie gegebenenfalls pharmazeutischen Hilfsstoffen, Pharmaka und/oder Adsorptionsvermittler.
Der Eisen enthaltende Kern liegt als Partikel, Kolloid oder Kristall vor. Aus der Herstellung des Kerns enthal¬ ten die Nanopartikel Synthesepolymer, das den Kern als Primärcoat umhüllt und während der Herstellung zur Steue¬ rung der physikalischen oder pharmazeutisch-galenischen Qualität benötigt wird. Anschließend wird das Verhältnis von Synthesepolymer zu Eisen durch ein Desorptionsver- fahren auf einen gewünschten Wert eingestellt . Für die Anwendung in der spezifischen Diagnostik wird ein
Targetpolymer adsorbiert, das die Oberfläche der Nano¬ partikel darstellt und den Grundbaustein aus Kern und Primärcoat umhüllt. Zur Verbesserung der Adsorption zwischen dem Primär- und dem Sekundärcoat können Adsorptionsvermittler enthalten sein. Als weitere
Bestandteile können die Nanopartikel pharmazeutische Hilfsstoffe oder Pharmaka enthalten.
Eine schematische Darstellung des Aufbaus eines erfin- dungsgemäßen Nanopartikels ist in Abbildung 1 darge¬ stellt. Der hydrodynamische Durchmesser des Grundbausteins (Eisen enthaltender Kern und Primärcoat) in Lösung ist kleiner als 100 nm, bevorzugt kleiner als 50 nm, und höchstens fünfmal so groß wie der Durchmesser des Eisen enthal¬ tenden Kerns.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel zeichnen sich weiter¬ hin dadurch aus, daß sie als stabile kolloidale Sole in pharmazeutischer Qualität vorliegen, oder daß sie lyophi- lisiert vorliegen und leicht mit medizinisch verwendeten Lösungsmitteln (Elektrolytlösung, Plasmaexpander, Gluco- selösung, phys . Kochsalzlösung etc.) wieder in Lösung gebracht werden können oder daß Grundbaustein und Tar- getkomponente und gegebenenfalls Zusätze getrennte Lösun¬ gen sind, die auch als Lyophilisate vorliegen können, und erst zu einem beliebigen Zeitpunkt zur Applikationslösung zusammengemischt werden.
Der Eisen enthaltende Kern hat ein größeres magnetisches Moment als Eisen-II-oder Eisen-III-Ionen. Der Eisen enthaltende Kern ermöglicht durch seine magnetischen Eigenschaften die Kontrastierung bei der Verwendung als Kontrastmittel in der MR-Tomographie. Um eine optimale Kontraststärke zu erreichen, sollte der Kern superpara- magnetisch sein oder zumindest superparamagnetische Anteile enthalten, d. h. , daß der Kern als Kristall oder polyatomarer Komplex ("Partikel") vorliegen muß, da diese Art des Magnetismus nur in Festkörpern möglich ist.
Erfindungsgemäß kann der Eisen enthaltende Kern Magnetit oder Maghämit darstellen oder enthalten.
Bis zu 25 Gew.-% des im Kern enthaltenden Eisens können durch andere Metallionen ersetzt sein. Die Nicht-Eisen-Metallionen sind paramagnetisch, diama¬ gnetisch oder eine Mischung von beiden.
Ferner zeichnen sich die erfindungsgemäßen Nanopartikel dadurch aus, daß der Eisen enthaltende Kern einen durch Elektronenmikroskopie bestimmten Durchmesser kleiner als 30 nm, bevorzugt kleiner als 15 nm, aufweist und minde¬ stens 50 Metallatome enthält sowie eine Partikelgrößen¬ verteilung, wobei mindestens 90 % der Eisen enthaltenden Kerne im Bereich 0, 7-Mittelwert bis 1, 3 -Mittelwert liegen, aufweist.
Die Nanopartikel enthalten ein Synthesepolymer in einer Menge zwischen dem 0,01fachen und dem lfachen der Summe der vorhandenen Metallionen. Bevorzugt ist eine Menge zwischen dem 0,25fachen und dem 0,75fachen.
Als Synthesepolymer wird eine monomere oder polymere Substanz oder ein Gemisch dieser Substanzen oder Deri- vate, oder Derivate mit funktionellen Gruppen oder
Derivate, die zusätzlich substituiert worden sind, mit einem Molekulargewicht kleiner 100.000 Da eingesetzt. Bevorzugt werden Substanzen mit Molekulargewichten, die kleiner 10000 oder 5000 Da sind, verwendet.
Besonders bevorzugt wird als Synthesepolymer ein Dextran- derivat oder eine Mischung von Dextran und/oder Dextran- derivaten eingesetzt.
Das Synthesepolymer kann eine oder mehrere Säuregruppen oder mehrere funktioneile Gruppen im Molekül enthalten, die bevorzugt N, S, P oder O-Atome enthalten.
Das Target- und das Synthesepolymer können unterschied- liehe oder gleiche Substanzen oder Substanzgemische sein, wobei das Targetpolymer aber nicht den Bedingungen der Synthese unterliegt und damit auch nicht den Nebenreak¬ tionen des Synthesepolymers bei der Synthese unterlag, also noch in physiologischem Zustand ist.
Die Grundsubstanz aus Eisen enthaltendem Kern und Synthe¬ sepolymer bestimmt die physikalische Qualität des Nano- partikels, während das Targetpolymer das biologische Verhalten der Nanopartikel bestimmt.
Das Targetpolymer ist in dem Nanopartikel in einer
Gewichtsmenge zwischen dem 0,5-fachen bis 50-fachen, bevorzugt zwischen dem 1-fachen bis 25-fachen des Gewichts der vorhandenen Metallionen enthalten.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel enthalten Adsorptions¬ vermittler, deren Menge kleiner oder gleich der Summe des Gewichts der enthaltenen Metallionen ist. Durch die Adsorptionsvermittler wird die Adsorption des Targetpoly¬ mers an den Grundbaustein aus Eisen enthaltenden Kern/Synthesepolymer verstärkt oder erst ermöglicht.
Bevorzugt werden als Adsorptionsvermittler Peptide mit den Strukturen RRTVKHHVN, RRSRHH oder auch RSKRGR, oder Teilstrukturen davon, eingesetzt.
Der hydrodynamische Durchmesser inclusive aller Bestand¬ teile der Nanopartikel ist höchstens zehnmal größer als der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns und höchstens 20 % größer als der Durchmesser des Grund- bausteins.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel setzen sich aus einzelnen Modulen wie Grundbaustein, Targetpolymer, Pharmakon und Adsorptionsvermittler zusammen, die jederzeit kombinierbar sind. Bei den Präparationen der Nanopartikel handelt es sich um niedrigviskose wäßrige kolloidale Lösungen oder Suspen¬ sionen von Eisen enthaltenden stabilisierten Partikeln im Nanometerbereich. Die Lösungen der Nanopartikel enthalten keine größeren Aggregate und sind intravenös applizier- bar, so daß Forderungen internationaler Arzneibücher an Parenteralia hinsichtlich der Partikelgrößen erfüllt sind.
Im allgemeinen kann der Grundbaustein durch Hitzeverfah¬ ren sterilisiert werden. Das Verfahren zur "Sterilisation" der fertigen Nanopartikel richtet sich nach der Empfindlichkeit des Sekundärcoats, aber eine keimfreie aseptische Herstellung ist in jedem Fall gewährleistet. Eine "Sterilfiltration" kann wegen der geringen Größe der Partikel immer durchgeführt werden. Die Option, ein empfindliches Targetpolymer mit dem sterilisierbaren Grundbaustein erst kurz vor der Verwen¬ dung herzustellen, ist eine weitere Möglichkeit eine praktisch sterile Applikationslösung zu gewährleisten.
Die Nanopartikel sind gut verträglich und weisen z. B. bei der Verwendung als MR-Kontrastmittel einen ausgespro¬ chen günstigen Sicherheitsabstand zwischen diagnostischer Dosis und der letalen Dosis auf ("margin of safety") . Die diagnostische Dosis liegt, je nach spezieller Anwendung, etwa zwischen 5 und 200 μmol (Eisen) pro Kilogramm Kör¬ pergewicht, während die letale Dosis etwa zwischen 20 und 50 mMol/kg Körpergewicht einzuordnen ist (gemessen an der Ratte) .
Die Substanzen sind vollständig bioabbaubar. So wird der Eisen enthaltende Kern aufgelöst und das Eisen in den physiologischen Eisenstoffwechsel eingebracht. Im Allge¬ meinen können auch die als Synthesepolymer oder Targetpo- lymer benutzten Moleküle metabolisch in verwertbare
Grundbausteine (Zucker, Aminosäuren) abgebaut werden. Die Lösungen der Nanopartikel sind sehr stabil und es findet nach der Fertigstellung keine feststellbare Ände¬ rung physikalischer Parameter statt (Partikelgrδße, magnetische Eigenschaften) . Bei keimfreier Herstellung weisen die Lösungen eine lange Lagerfähigkeit auf; es wurden z. B. innerhalb von 12 Monaten keine Instabilitä¬ ten wie Aggregation oder Sedimentation festgestellt.
Die Lösungen oder Suspensionen sind rotbraun bis schwarz gefärbt, was auf die intensive Farbe der Eisen enthalten¬ den Kristalle zurückzuführen ist . Die ausgeprägte Eigen¬ farbe kann zur visuellen Detektion, z. B. als Markersub¬ stanz in der chirurgischen Medizin, genutzt werden. Für die Detektion mit der MR-Technik sind die Nanopartikel superparamagnetisch oder enthalten superparamagnetische Anteile. Die Partikel zeigen physikalisch sehr hohe Sättigungsmagnetisierungen, die schon bei niedrigen ange¬ legten Feldstärken erreicht werden und weisen nach dem Abschalten eines externen Magneten keine Restmagnetisie¬ rung mehr auf, sie zeigen keine Remanenz.
Die Nanopartikel sind als Lösungen (Suspensionen) formu¬ liert und können ohne weitere Vorbereitung appliziert werden. Da die Lösungen der Nanopartikel kompatibel mit üblichen medizinischen Lösungsmitteln wie physiologischer Natriumchloridlösung, Elektrolytlösungen oder Zuckerlö¬ sungen sind, können die Partikel beliebig verdünnt und z. B. für spezielle Anwendungen auch infundiert werden.
Eine Alternative zur Formulierung der "Lagerform" Lösung stellt die Herstellung von Lyophilisaten dar. Möglich ist hier die Lyophilisation des Grundbausteins, der dann im gelösten Targetpolymer resuspendiert wird, oder Grundbau- stein und Nanopartikel werden nach der Adsorption lyophi- lisiert und dann vor der Anwendung in phys. NaCl oder Aqua ad injectabilia wieder gelöst. Die Vorratshaltung kann auch so erfolgen, daß Grundbaustein und Targetpoly¬ mer in getrennten Lösungen aufbewahrt werden und erst vor der Applikation gemischt werden.
Die Herstellung der partikulären oder kolloidalen Eisen¬ enthaltenden Kerne erfolgt aus monomolekular gelösten Eisenverbindungen durch Änderung des pH-Wertes und dadurch bewirkte Ausfällung in Anwesenheit einer Stabilisatorsubstanz (Synthesepolymer) nach einer "Eintopfsynthese" . Das Synthesepolymer separiert die Kristallkerne während der Herstellung und dient so zur Steuerung der Partikelgröße. Das Synthesepolymer ist wesentlich für die physikalischen und pharmazeutisch- galenischen Eigenschaften nicht nur des Kristallkerns sondern auch des gesamten Nanopartikels. Das Synthesepolymer ermöglicht es, eine stabile Lösung (Suspension) zu erhalten, da die Kerne soweit voneinander getrennt sind, daß keine Aggregation mehr stattfinden kann (sterische Stabilisierung) .
Nachdem die Eisen enthaltenden Kernpartikel fertigge¬ stellt sind, wird das Synthesepolymer durch ein Desorptionsverfahren auf ein vorgegebenes Synthesepolymer zu Eisen-Verhältnis eingestellt. Die Lösung (Suspension) aus Eisen-Kern und Rest-Synthesepolymer, das den Eisen enthaltenden Kern als Primärcoat umhüllt und stabilisiert, stellt den Grundbaustein des modularen Systems dar. Der Grundbaustein zeichnet sich hierbei durch hohe physikalisch-galenische Qualität aus.
Ein zweiter wesentlicher Baustein ist das Targetpolymer, daß postsynthetisch an den Grundbaustein adsorbiert wird und den Kern mit dem Primärcoat mit einer zweiten Hülle umgibt (Sekundärcoat) . Der Sekundärcoat stellt die Ober- fläche der Nanopartikel dar und bestimmt das In-vivo- Verhalten. Die Mischung zwischen dem Grundbaustein und dem Targetpolymer kann zu beliebiger Zeit erfolgen, so daß auch eine "just in time" Herstellung möglich ist.
Die Adsorption zwischen Rest-Synthesepolymer und Target- polymer kann durch einen zwischengeschalteten Schritt mit Zugabe von Adsorptionsvermittlern verbessert oder auch erst ermöglicht werden. Die Zugabe des Adsorptionsver- mittlers kann auch in einem Schritt in einer Mischung mit dem Targetpolymer erfolgen. In analoger Weise können zu einem beliebigen Zeitpunkt pharmazeutische Hilfsstoffe oder auch Pharmaka zugesetzt werden.
Die besonderen Vorteile der Erfindung sind offensicht¬ lich, da es mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfah¬ ren erstmals gelingt, Forderungen der Physik und der Biologie an ein spezifisches Nanopartikel optimal zu erfüllen.
Aufgrund des modularen Aufbaus, d. h. getrennte Herstel¬ lung von Grundbaustein (Eisen enthaltender Kern + Pri¬ märcoat) und Targetprinzip (Sekundärcoat) , kann für die Synthese das für die physikalischen Eigenschaften opti- malste Synthesepolymer gewählt werden ohne durch die erwünschte biologische Steuerbarkeit der Nanopartikel limitiert zu sein; - erstmals müssen also keine Kompro¬ misse bzgl . der physikalisch-pharmazeutischen Qualität der Nanopartikel und der gewünschten biologischen Wirkung gemacht werden. Das Targetpolymer unterliegt nicht den zerstörenden Bedingungen der Synthese, so daß viele Substanzen zur Zielfindung eingesetzt werden können, die bisher von vornherein ausgeschlossen waren. Ebenso muß keine postsynthetische Chemie, die ihrerseits adäquate Reaktionsbedingungen erfordert und die Integrität des
Liganden beeinträchtigt, angewandt werden; es finden z. B. keine Redoxreaktionen mit Disulfidbrücken-enthaltenden Proteinen wie bei der Periodat-Oxidation mit anschließen¬ der reduktiver Aminierung, statt - die biologische Akti¬ vität bleibt erhalten.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist, daß keine Reini¬ gung von Grundbaustein-Targetpolymer erfolgen muß, da keine Reaktionslösungen, wie z. B. Periodat, abgetrennt werden müssen - die Methode ist also schnell und es können daher auch "just in time" Nanopartikel direkt vor der Applikation hergestellt werden, wie es z. B. bei "individuellen" Kontrastmitteln (z. B. autologe Antikör¬ per) nötig ist oder vorteilhaft sein kann, wenn das Targetpolymer in Lösung nur kurzzeitig stabil ist.
Auch für eine weitere Optimierung zeigt die erfindungs¬ gemäße Herstellung Vorteile, da hier die "Oberfläche" der Nanopartikel separat modifiziert/optimiert werden kann und sich eine Analyse auch mit modernen Analysemethoden wie der NMR-Spektroskopie oder der IR-Spektroskopie durchführen läßt; Methoden die in Anwesenheit des parti¬ kulären Kerns nicht anwendbar sind.
Da die Oberfläche definiert hergestellt ist und auch adäquat analysiert werden kann, ist eine systematische
Optimierung der Oberflächeneigenschaften möglich, während bei der Herstellung nach dem "Stand der Technik", welcher die Partikel als eine einheitliche Substanz ansieht, die Oberfläche gar nicht bekannt ist und eine Optimierung daher auch nur über "try and error" möglich ist.
Die Nanopartikel werden in mehreren Stufen hergestellt. Der Eisen enthaltende Kern wird prinzipiell nach einer "Eintopfsynthese" , also in Anwesenheit einer Stabilisa¬ torsubstanz (Synthesepolymer), synthetisiert. Die Stabi- lisatorsubstanz (Synthesepolymer) wird in Wasser gelöst und mit den monomolekularen Eisenverbindungen versetzt . Durch pH-Erhöhung werden die Eisensalze zu den vorzugs¬ weise Oxiden umgesetzt und ausgefällt. Als Variante kann auch die Stabilisatorlösung alkalisch gestellt und dann mit den Eisensalzen versetzt werden. Das Gemisch wird unter Rückfluß erhitzt und dann neutralisiert, wobei Erhitzen und Neutralisieren auch in umgekehrter Reihen¬ folge stattfinden kann. Die Rohsubstanz wird gereinigt und dann wird das überschüssige oder nicht fest adsor¬ bierte/gebundene Synthesepolymer durch ein Desorptions- verfahren auf ein exaktes Gewichtsverhältnis von Eisen zu Stabilisator eingestellt. Diese gereinigte und desorbier- te Grundsubstanz aus Kern und (Rest-) Synthesepolymer stellt den Grundbaustein der modular aufgebauten Nano¬ partikel dar. Optional kann hier eine Hitzesterilisation angeschlossen werden. Bei Bedarf oder "auf Vorrat" wird das gewählte Targetpolymer, gegebenfalls unter Zwischen¬ adsorption oder Ko-Adsorption eines Adsorptionsver- mittlers, an den Grundbaustein adsorbiert. Optional können weitere Bestandteile wie pharmazeutische Hilfsstoffe oder Pharmaka zugegeben werden. Das allgemeine Herstellungsverfahren ist in der Abbildung 2 schematisch zusammengefaßt.
Bei der folgenden Beschreibung des Eisen enthaltenden Kerns muß berücksichtigt werden, daß die Synthese immer in Anwesenheit des Stabilisators nach einer "Eintopf¬ synthese" durchgeführt wird.
Zur Herstellung der Eisen enthaltenden Kerne werden stöchiometrische Mengen von Eisen-II und Eisen-III-Salzen miteinander gemischt. Die Qualität der entstehenden Kristalle wird dabei auch von den eingesetzten Salzen beeinflußt und im Allgemeinen werden in der Literatur die Salze der Salzsäure, also die Eisenchloride, eingesetzt. Prinzipiell sind hier aber alle Salze starker Säuren, also z. B. auch die Sulfate oder Nitrate verwendbar. Problematisch ist es, bei der Verwendung dieser Salze eine exakte Stöchiometrie zu gewährleisten, da die Eisen- II-Salze sehr oxidationsempfindlich sind. Vorteile ergeben sich hier durch die Verwendung komplexerer Salze wie z. B. dem Mohr' sehen Salz, das nicht so oxidations¬ empfindlich ist.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die Verwendung organischer Salze den anorganischen Salzen überlegen ist, da die organischen Anionen als Stabilisator oder Hilfs¬ stabilisator wirken. Als besonders geeignet hat sich hier z. B. das Eisen-II-gluconat, oder das Eisen-III-citrat herausgestellt; verwendet werden können aber auch andere organische Anionen, wie z. B. die Fumarate, Tartrate, Lactate oder Salicylate.
Durch eine Synthesevariante, die nur von Eisen-III-Salz ausgeht, gelingt zum einen die Herstellung ohne die oxidationsempfindlichen Eisen-II-salze zu verwenden und zum anderen kann die Anzahl an "Fremdionen" reduziert werden. Diese Synthesevariante geht nur von Eisen-III- Salz aus, aus dem in situ durch eine berechnete Menge Reduktionsmittel Eisen-II erst durch die Reaktion gene¬ riert wird. Obwohl prinzipiell alle Reduktionsmittel eingesetzt werden können, die Eisen-III stδchiometrisch exakt reduzieren, wird die Verwendung von Hydroxylamin bevorzugt, da das umgesetzte Hydroxylamin quantitativ zu Lachgas umsetzt und dadurch sehr einfach komplett aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden kann.
4 Fe3+ + 2 NH2OH > 4 Fe2+ + N2θt + 4 H+ + H2O
Ein Nachteil aller bisher beschriebenen Verfahren wird ersichtlich, wenn man sich die Chemie der Eisensalze näher betrachtet. Ziel des Präzipitationsschrittes ist es, Eisen-II und Eisen-III in stöchiometrischer Zusammensetzung zu einem Kristall mit definierter Kristallstruktur umzusetzen. Die Bildung der ent- sprechenden Oxide wird durch die pH-Wert Erhöhung erreicht. Berücksichtigt man jedoch, daß schon bei einem pH-Wert von ca. 2 die Eisen-III-Ionen [pKL Fe (OH) 3 ca. 37*] schwerlösliche Hydroxide bilden, während die Eisen- II-Ionen erst bei pH 8 als Hydroxide [pKL Fe (OH) 2 ca. 13,5] ausfallen, so wird ersichtlich, daß eine direkte
Bildung der gewünschten Kristalle kaum möglich erscheint und der Weg nur über eine Folgereaktion der Hydroxide stattfindet . Durch Verwendung geeigneter Komplexbildner ist es jedoch möglich die Fällungspunkte der Eisen- Verbindungen gegeneinander zu verschieben, so daß eine gleichzeitige Fällung und der Einbau auf die unter¬ schiedlichen Gitterplätze im Eisenoxid-Kristall erfolgen kann. Durch die Wahl des Komplexbildners können die Fällungspunkte der eingesetzten Eisenverbindungen über weite Bereiche gesteuert werden.
*Die pKL-Werte sind von der Konzentration abhängig und die Angaben beziehen sich auf eine 10"2 Mol/1-Lösung.
Als Komplexbildner können neben den "klassischen" Sub¬ stanzen nach Tabelle 1 auch die o. g. organischen Anio¬ nen eingesetzt werden. Komplexe Salze, organische Anio- nensalze und anorganische Salze der Eisen-II und Eisen- III-Ionen können auch beliebig miteinander kombiniert werden. 22
Tab. 1: Auswahl an Komplexbildnern und Chelatoren für die
Verschiebung der Fällungspunkte bei der pH-
Erhöhung während der Magnetitsynthese
Eisen- Eisen-
Komplexbildner (Chelat) II III logKl* logKl*
CDTA 16,27 28,05 trans-1, 2-Diamino-cyclohexan-N,N,N' ,N' - tetraessigsäure
EDTA 14,33 25,10 Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA 11,92 20,50
Ethylenglycol-O,0' -bis- (2-aminoethyl) -N,N,N' ,N' - tetraessigsäure
DTPA 16,50 28,60 Diethylentriamin-pentaessigsäure
HEDTA 12,20 19,80
N- (2-Hydroxyethyl) -ethylendiamin-N,N' ,N'- triessigsäure
NTA 8,84 15,87 Nitrilotriessigsäure
TTHA 17,10 26,80
Triethylentetramin-N,N,N' ,N' ' ,N' ' ' ,N' ' •- hexaessigsäure
-Ki ist die absolute Stabilitätskonstante und ist unabhängig vom pH. Sie bezieht sich auf die deprotonierte Form des Chelators: Ki = [ML] / [M] • [L] , wobei [ML] , [M] und [L] die Konzentrationen von Chelat, Metallion und Chelator (Ligand) sind. In einer Variante der Synthese erfolgt zunächst eine getrennte Herstellung von Eisen-II-hydroxid und Eisen- III-hydroxid. Die Herstellung der Eisenoxid-Kristalle gelingt überraschenderweise auch durch die Kombination der separat hergestellten Hydroxid-Lösungen, wobei ein Erhitzen der kombinierten Lösungen die Kristallisation beschleunigt.
Ein wichtiger Schritt bei der Herstellung der Eisen- enthaltenden Kerne ist der Präzipitationschritt, bei dem durch pH-Wert Erhöhung aus den niedermolekularen Eisen¬ verbindungen die partikulären Eisenverbindungen gebildet werden, wobei die Bildung der Partikel ggf. über die Bildung kolloidaler Eisenhydroxide erfolgen kann. Für die pH-Wert Erhöhung ist prinzipiell jede Substanz geeignet, die den pH-Wert der sauren Lösung der Eisensalze erhöhen kann. Neben der Verwendung von Natronlauge ist die pH- Wert Erhöhung durch Ammoniak, sowohl als Gas als auch als Salz, oder die Anwendung basischer Amine und flüchtiger Puffer, bevorzugt. Überraschenderweise hat sich heraus¬ gestellt, daß die zur Präzipitation verwendete Base die Gesamteigenschaften so beeinflußt, daß auch "biologische" Auswirkungen sichtbar werden, so z. B. Unterschiede in der Organverteilung der Partikel.
Die Konzentration der basischen Substanz soll dabei im Bereich 0,1 bis 10 N liegen, bevorzugt sind hier konzen¬ trierte Lösungen von etwa 1-4 N, da mit zunehmender Geschwindigkeit der pH-Wert-Erhöhung die Bildung von Partikeln mit kleinen Kerngrößen bevorzugt stattfindet. Die Zugabe der Basen erfolgt innerhalb von 30 Minuten, vorzugsweise aber innerhalb von 30 Sekunden.
Die Präzipitation der Eisenverbindungen zu den Partikeln erfolgt im Temperaturbereich von 0-120 °C, wobei der
Bereich 50 - 80 °C bevorzugt ist. Prinzipiell gilt, daß die Temperatur niedrig sein kann, wenn direkt das Eisenoxid gebildet wird, und hoch sein muß, wenn die Bildung über die Hydroxide als Zwischenschritt erfolgt. Nach der Präzipitation erfolgt die Neutralisation und dann, insbesondere wenn zunächst die Hydroxide vorliegen, ein Erhitzen der Rohsubstanz unter Rückflußbedingungen, wobei die Dauer des Erhitzens zwischen 0 Minuten und 24 Stunden, vorzugsweise zwischen 30 Minuten und einer Stunde liegt. Neutralisation und Erhitzen unter Rückfluß- bedingungen können dabei auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden.
Für die Anwendung als Kontrastmittel (optische Markersub¬ stanz) bei visueller Detektion ist eine hohe Eigenfärbung wünschenswert. Die Anwendung als Kontrastmittel in der Magnetresonanz-Tomographie (MRT) erfordert eine hohe Wirksamkeit, die bei diesem Tomographieverfahren durch die magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel bestimmt wird. Aufgrund der hohen Sättigungsmagnetisierung schon bei niedrigen angelegten Feldstärken, wie sie in der klinischen MRT verwendet werden, erscheinen die Eisenoxide Maghätnit und Magnetit bei der Verwendung der Nanopartikel als MR-Kontrastmittel besonders geeignet. Die besonderen magnetischen Eigenschaften werden hier durch die Kristallstruktur der partikulären Eisenkerne festgelegt. Überraschenderweise ist es jedoch möglich, Fremdionen in den Kristallkern einzubauen und trotzdem zu der magnetitartigen Kristallstruktur zu gelangen. Diese Dotierung mit Nicht-Eisenhaltigen Metallionen kann prinzipiell über zwei Wege erfolgen. Zum einen können
Eisen-II und/oder Eisen-III-Ionen auf ihren Gitterplätzen durch andere paramagnetische Metallionen ersetzt werden und zum anderen kann die Substitution auch mit diamagnetischen Ionen erfolgen. Zum Verständnis sei daran erinnert, daß die Magnetisierung im Magnetitkristall nur von den Eisen-II-Ionen herrührt, da die Eisen-III-Ionen parallele/antiparallele Gitterplätze besetzen und sich in ihrer magnetischen Wirkung genau aufheben. Eine Erhöhung der Netto-Magnetisierbarkeit des Kristalls kann erfolgen, wenn Ionen mit stärkeren magnetischen Eigenschaften als Eisen verwendet werden, oder wenn durch para- oder diamagnetische Ionen das genau gleiche
Besetzungsverhältnis auf den parallelen /antiparallelen Gitterplätzen für die Eisen-III-Ionen verändert wird. Für die Substitution mit paramagnetischen Metallen durch stärkere magnetische Ionen, wie z. B. Gadolinium kann dabei eine Erhöhung um die Differenz des magnetischen Momentes im Vergleich zum ersetzten Eisen erfolgen. Bei der Substitution von Eisen-III mit diamagnetischen Metallen kann das jetzt nicht mehr kompensierte Moment eines Eisen-III-Ions zum Gesamtmoment beitragen. In einer Variante können auch dia- und paramagnetische Ionen zusammen in das magnetitartige Kristallgitter eingebaut werden. Die Dotierung mit den Nicht-Eisen-Ionen erfolgt durch teilweise Substitution der niedermolekularen Eisen-haltigen Ausgangsverbindungen in der Synthese.
Die allgemeine Herstellung der Eisen enthaltenden Kerne hat zum Ziel, ein magnetitartiges Kristallgitter zu synthetisieren. Für diesen Zweck werden Eisen-II und Eisen-III-Ionen in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20 eingesetzt. Am einfachsten gelingt die Synthese, wenn ein genau stöchiometrisches Verhältnis von 1:2 verwendet wird. Die Verhältnisse von Eisen-II zu Eisen-III können auch durch die Reduktion von Eisen-III während der Synthese durch ein Reduktionsmittel erhalten werden.
Eisen-II und/oder Eisen-III-Ionen können bis zu 25 % des Gesamteisens (Gewicht) durch andere Metallionen ersetzt sein. Neben paramagnetischen Ionen wie Gadolinium oder Mangan können auch diamagnetische Ionen wie Lithium, Magnesium oder Calcium, oder eine Mischung para- und diamagnetischer Ionen, verwendet werden. Als Kristall- Struktur wird die Bildung von Magnetit bevorzugt . Der Magnetitkristall kann dabei zum einen sekundär entstehen, z. B. wenn bei der Herstellung zunächst die Hydroxide entstehen, oder der Magnetitkristall kann auch zu anderen Kristallen weiterreagieren, so z. B. bei der Oxidation von Magnetit zum Maghämit. Die besondere Qualität der Nanopartikel als Kontrastmittel für die MRT, erfordert superparamagne tische magnetische Eigenschaften. Superparamagnetismus kann nur in Festkörpern vorkommen, so daß als weitere Eigenschaft gefordert wird, daß die
Kristalle Festkörpereigenschaften haben, also partikuläre Kristalle sind. Als Minimal-Eisenanteil müssen mindestens 50 Eisenatome (bzw. Metallatome) pro Kristall enthalten sein. Die Größe der Eisen enthaltenden Kerne kann durch Variation bei der Synthese über weite Bereiche gesteuert werden (1- ca. 30 nm) , bevorzugt ist aber die Synthese kleiner Kerne mit Durchmessern kleiner 15 nm, wobei die Partikelgrößenverteilung so liegt, daß mindestens 90 % der Partikel im Bereich 0,7 - MW bis 1,3 - MW (MW gleich mittlerer Durchmesser, bestimmt durch Elektronen¬ mikroskopie) sind.
Einer der besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens ist die große Flexibilität bei der Wahl des Synthesepolymers, wobei der Begriff des
"Polymers" hier nicht wörtlich zu nehmen ist, da sowohl niedermolekulare Substanzen als auch Mischungen nieder- mit höhermolekularen Substanzen zur Herstellung der Eisen enthaltenden Kerne verwendet werden können. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von nieder- oder höhermolekularen Substanzen, die negative Ladungsträger im Molekül enthalten. Bevorzugt sind hier Carboxylate oder Analoga, Phosphate (oder andere P enthaltende Gruppen) und Sulfate (oder andere S enthaltende Gruppen) . Diese Derivate können dabei lediglich eine einzige funktioneile Gruppe tragen oder auch mehrere der funktioneilen Gruppen enthalten. Die zugrundeliegende Theorie geht davon aus, daß die Affinität zur Oberfläche des Eisen enthaltenden Kerns durch Wechselwirkung zwischen positiver Eisenoxidoberfläche und negativer Ladung im Synthesepolymer erfolgt. Enthält das Synthese¬ polymer mehrere der Gruppen, so ist die Wechselwirkung besonders ausgeprägt ("Multi-Side-Attachement" ) . Einige besonders geeignete Klassen für die Stabilisierung während der Synthese sind: Niedermolekulare Substanzen, wie z. B. Carboxypolyalkoho- le, Polycarboxypolyalkohole, Polycarboxyalkohole, Carboxyalkohole, Alkohole, Monozucker, Oligomere Zucker und synthetische Polymere, wie z. B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und Mischungen (Block und Copolymere) , Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol, Polymilchsäure
(Polylactide und Polylactid-Glycid) , sowie natürliche oder insbesondere partialsynthetische oder chemisch und/oder enzymatisch modifizierte natürliche Polymere wie z. B. Dextrane und Derivate, Arabinsäure, Glycosamino- glycane und synthetische Analoga, Stärke und Derivate sowie Gelatinederivate.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung niedermolekularer Dextranderivate, die negative Ladungsträger enthalten. Ein Beispiel ist hier (Mono-) Carboxydextran; die
Herstellung ist z. B. bei Bremner et al. [Bremner, I . ; Cox, JSG; Moss, GF; Carbohydrate Research 11; 77-84; 1969] beschrieben und ein anderes bevorzugtes Beipiel ist die Verwendung von Polycarboxydextran, daß durch Ether- bindung zwischen 6-Bromhexansäure und den Hydroxylgruppen des Dextrans hergestellt werden kann. [Noguchi, A. ,* Takahashi, T; Yamaguchi, T.,* Kitamura, Y. ,* Takakura, T. ,* Hashida, M. ; Sezaki, H. ; Bioconjugate chemistry 3; 132- 137; 1992] . Das Polycarboxydextran kann durch die vielen negativen Ladungen über ein "Multi-Side-Attachement" mit der Eisenoxidoberfläche wechselwirken. Die Menge an Synthesepolymer zur Stabilisierung während der Herstellung beträgt das 0,5-20 fache des Gewichtes der Summe der im Ansatz enthaltenden Metallionen, wobei der Gesamtanteil im Reaktionsgemisch so gewählt wird, daß die Viskosität bei Verwendung polymerer Synthesepolymere noch eine gute Durchmischung des Ansatzes erlaubt (< 50 % g/V) . Bevorzugt ist die Verwendung eines etwa 3-15fachen Überschusses (Gewicht) an Synthesepolymer gegenüber der Summe der enthaltenen Metallionen.
Nach der Herstellung der Rohsubstanz erfolgt die Reduk¬ tion des Anteils an Synthesepolymer im Ansatz durch ein Desorptionsverfahren. Zur Desorption können chromatogra- phische Verfahren, ein Verfahren aus dem Bereich der
Magnetseparationstechnik, eine Dialyse, eine Zentrifuga- tion oder Ultrazentrifugation, eine Ultrafiltration oder andere geeignete Verfahren verwendet werden. Die Desorption kann durch die Anwendung erhöhter Temperatur in Kombination mit einem der Desorptionsverfahren angewandt werden. Eine weitere Möglichkeit Einfluß auf das Ausmaß der Desorption zu nehmen ist die Verwendung desorbierender Substanzen, wie z. B. von Pufferlösungen oder Tensiden. Nach der Desorption der Rohsubstanz erhält man eine stabile, physikalisch optimale Lösung/Suspension, die den Grundbaustein für die Herstellung der spezifischen Nanopartikel darstellt. Die Grundbausteine bestehen aus dem Eisen enthaltenden Kern und dem (Rest-) Synthesepoly- mer. Die Menge an verbliebenem Synthesepolymer beträgt, je nach dem durch as Desorptionsverfahren eingestellte Verhältnis, 0,01 bis 1. Bevorzugt ist der Bereich von 0,25 bis 0,75, da in diesem Bereich der beste Kompromiß aus Stabilität und Adsorptionsfähigkeit des Grundbau- steins resultiert. Die Gesamtgröße (hydrodynamischer
Durchmesser) des Grundbausteins variiert in Abhängigkeit von der Größe des Eisen-enthaltenden Kerns und dem verwendeten Synthesepolymer und liegt in der Größenord¬ nung kleiner 100 nm, vorzugsweise kleiner 50 nm. Beson¬ ders bevorzugt ist die Herstellung von Grundbausteinen, bei denen der Gesamtdurchmesser höchstens fünfmal so groß ist wie der Kerndurchmesser.
Der Grundbaustein wird mit einem Targetpolymer zum ferti¬ gen Nanopartikel kombiniert. Das adsorbierte Targetpoly- mer bildet um das Synthesepolymer/Eisen-enthaltender Kern eine Sekundärhülle und bildet die Oberfläche des Gesamt¬ systems und bestimmt, neben dem partikulären Charakter der Partikel, das In-vivo-Verhalten. Der besondere Vorteil des Herstellungsverfahrens liegt darin, daß praktisch jede Substanz, die an den Grundbaustein adsorbiert werden kann, zur biologischen Steuerung der Nanopartikel verwendbar ist. Die Targetpolymere unterlie¬ gen keinem Synthesestreß, so daß auch empfindliche und bisher nicht verwendbare Substanzen als Leitmoleküle zur Steuerung des biologischen Verhaltens verwendet werden können.
Beispiele für geeignete Targetpolymere sind u. a. :
Natürliche Oligo- und Polysaccharide wie Dextran mit Molekulargewichten kleiner als 100.000, Mischungen verschiedener Dextrane, Dextrane unterschiedlicher Herkunft, besonders gereinigtes Dextran (FP = free pyrogen Qualität) , Fucoidan, Arabinogalactan, Chondroitin und -sulfate, Dermatan, Heparin, Heparitin, Hyaluron- säure, Keratan, Polygalacturonsäure, Polyglucuronsäure, Polymannuronsäure, Inulin, Polylactose, Polylactosamin, Polyinosinsäure, Polysucrose, Amylose, Amylopektin, Glycogen, Glucan, Nigeran, Pullulan, Irisin, Asparagosin, Sinistrin, Tricitin, Kritesin, Graminin, Sitosin, Lichenin, Isolichenan, Galactan, Galactocaolose, Luteose, Mannane, Mannocarolose, Pustulan, Laminarin, Xanthan, Xylan und Copolymere, Araboxylan, Arabogalaktan, Araban, Lävane (Fructosane) , Teichinsäure, Blutgruppenpoly- saccharide, Guaran, Carubin, Alfalfa, Glucomannane,
Galactoglucomannane, Phosphomannane, Fucane, Pektine, Cyclo-Dextrine, Alginsäure, Traganth und andere Gummi- Sorten, Chitin, Chitosan, Agar, Furcellaran, Carrageen, Cellulose, Celluronsäure, Arabinsäure und die chemisch und/oder enzymatisch hergestellten Derivate, die ggf. noch beliebig substituiert sein können und die niedermo¬ lekularen Abbauprodukte der hochmolekularen Verbindungen. Ebenso geeignet sind die Polyamino- und Pseudopolyami- nosäuren.
Synthetische Oligomere und Polymere wie Polyethylen- glycol Polypropylenglycol, Polyoxyethylenether, Polyanetholsulfonsäure, Polyethylenimin, Polymaleimid, Polyvinylalkohol, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylsulfat, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polylactid, Polylactid-glycid.
Monomere bis oligomere Zucker und verwandte Substanzen wie Aldo- und Ketotriosen bis Aldo- und Ketoheptosen, Ketooktosen und Ketononosen, Anhydrozucker, Monocarbon- säuren und Derivate mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen in der Hauptkette, Cyclite, Amino- und Diaminozucker, Desoxy- zucker, Aminodesoxyzucker und Aminozucker-carbonsäuren, Aminocyclite, Phosphor enthaltende Derivate der Mono- bis Oligomere.
Oligomere/Polymere mit antitumoralen Eigenschaften (höhere Pflanzen, Pilze, Flechten und Bakterien) wie Lipopolysaccharide, ß-2, 6-Fructan, ß-1, 3-Glucan, Manno- glucan, Mannan, Glucomannan, ß-1, 3/1, 6-Glucane, ß-1,6- Glucan, ß-1,3/1,4-Glucan, Arabinoxylan, Hemicellulose, ß- 1,4-Xylan, Arabinoglucan, Arabinogalactan, Arabinofuco- glucan, α-1, 6/1, 3-Glucan, α-1, 5-Arabinan, α-1, 6-Glucan, ß-2, 1/2, 6-Fructan, ß-2, 1-Fructan .
Eine wesentliche Vorraussetzung für die Wirkung der Antitumorpolysaccharide ist die Wasserlöslichkeit, die bei den ß-1, 3/1, 6-Glucanen durch Verzweigungen in Position 6 gewährleistet ist. Bei wasserunlöslichen
Polysacchariden läßt sich durch die Einführung hydrophi¬ ler und gut hydratisierter Gruppen die Löslichkeit verbessern. Als Substituenten können u. a. Methyl-, Ethyl-, Acetyl-, Carboxymethyl- oder Sulfatgruppen verwendet werden.
Tenside und oberflächenaktive Substanzen wie Niotenside, Alkylglucoside, Glucamide, Alkylmaltoside, mono- und polydisperses Polyoxyethylen, Quartäre Ammoniumsalze, Gallensäuren, Alkylsulfate, Betaine, CHAP-Derivate.
Beispielhaft und um die Vielzahl der verwendbaren Steuerungsmöglichkeiten aufzuzeigen und damit auch die Vorzüge des modularen Systems zu demonstrieren, können die Moleküle zur Steuerung des In-vivo-Verhaltens
(Spezifität) auch Zellfragmente, Zellen, Bakterienfrag¬ mente, Substanzen aus der großen Gruppe der Lectine, der Hormone und Mediatorsubstanzen, der Proteine und Neopro- teine, der Peptide und Polypeptide, der Antikörper, Antikörperfragmenten oder den "molecular recognition units", der Integrine (ELAM, LECAM, VCAM usw.) oder Rezeptor-spezifischen Substanzen (z. B. Lewis-X, Sialyl- Lewis-X usw.) sein. Ferner gehören dazu die Vielzahl der Blut-/ Plasma-/Serumbestandteile und der Opsonine, der Gruppe der Oligonukleotide und synthetischen Oligo- nukleotide, DNA und RNA oder deren Derivate oder Fragmente oder Analoga und Homologe, aus der Gruppe der Lipopolysaccharide, Lipoproteine, Glycerinester, Cholesterine- und Ester, stammen, oder auch Metabolite und Antimetabolite, Arzneistoffe, Arzneistoffkonjugate, Chemotherapeutika und Zytostatika.
Als Targetpolymere können zusätzlich oder statt der o. g. Beispiele für Targetpolymere auch die chemischen und/oder enzymatisch hergestellten Derivate oder Abbauprodukte verwendet werden.
Die Derivate oder die "nativen" Targetpolymere können zusätzlich funktioneile Gruppen tragen. Diese funktionel- len Gruppen können an einem Ende oder an beiden Enden oder an beliebiger Stelle im zugrundeliegenden Targetmo¬ lekül sein. Dabei können die funktionellen Gruppen alle gleich oder aber auch unterschiedliche Gruppen miteinan¬ der kombiniert sein. Sowohl bei den Derivaten selber als auch bei den funktionellen Gruppen sind diejenigen, die N- , S-, 0- oder P-Atome, Säure- oder Analoga, Hydroxy-, Ether- oder Estergruppen enthalten, bevorzugt.
Die genaue Zusammensetzung der Nanopartikel richtet sich nach der jeweiligen, durch die Indikation festgelegten, Anforderung. Als Targetpolymere können sowohl einzelne
Substanzen als auch beliebige Kombinationen der Targetpo¬ lymere, z. B. synthetisch und nichtsynthetisch, nieder und höhermolekular, derivatisiert und nicht-derivati- siert, verwendet werden.
Eine besondere Variante der Herstellung besteht darin, daß das Targetpolymer und das Synthesepolymer gleich sein können. In diesem Zusammenhang heißt das, daß das Target- polymer mit dem zur Synthese eingesetzten Polymer gleich ist, da wie schon o. g. beschrieben, daß Synthesepolymer nach der Synthese ja nicht mehr mit dem zur Synthese eingesetzten Polymer identisch ist. Das Targetpolymer ist hier also das deklarierte Synthesepolymer, unterlag aber nicht wie dieses den drastischen Bedingungen während der Herstellung und befindet sich daher noch in "physiolo- gischem" Zustand.
Die Mengen an Targetpolymer in der fertigen Lösung der Nanopartikel können über weite Bereiche variiert werden. Prinzipiell ist der Bereich vom 0,5- bis zum 50-fachen Gewicht der Summe des Gewichtes der enthaltenen Metallio¬ nen, verwendbar, aber bevorzugt ist die Verwendung von Mengen entsprechend dem 1 bis ca. 25-fachen. Als Adsorptionsvermittler sind alle Stoffe aufzufassen, die die Adsorption zwischen dem Targetpolymer oder dem Gemisch der Targetpolymere an die Oberfläche des Eisen¬ enthaltenden Kerns oder Kern plus Primärcoat, verbessern oder erst ermöglichen. Prinzipiell müssen die Adsorpti¬ onsvermittler also bifunktionelle Eigenschaften aufwei¬ sen, wobei ein Molekülteil die Affinität zum Grundbau- stein beinhaltet, während ein anderer Molekülteil, der allerdings mit dem ersten funktionellen Teil identisch sein kann, die Affinität zum Targetmolekül bedingt. Geeignet sind z. B. Stoffe mit 2 funktionellen Gruppen oder einem hydrophoben und einem hydrophilen Molekülteil . Bevorzugte Adsorptionsvermittler sind Peptide, die eine Affinität zum Eisenkern oder zum Eisenkern plus Pri¬ märcoat aufweisen. Solche Peptide lassen sich mit moder¬ nen Methoden der Biochemie in Peptid-Librarys selektie¬ ren. Bevorzugt sind Peptide, die die RRTVKHHVN oder die RRSRHH oder auch RSKRGR Sequenz oder Teile davon im
Molekül enthalten [Ein-Buchstaben-Code der Aminosäuren s. z. B. Stryer, Biochemistry; Freeman and Comp. ; New York; 1988]
Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung der Peptide als Adsorptionsvermittler ist, daß der nicht zur Affinität benötigte Molekülteil auch mit üblichen Methoden der Biochemie kovalent an das oder die Targetpolymere gekop¬ pelt werden kann, so daß hier die Affinität zum Targetpo¬ lymer nur optional vorhanden sein muß. Die Menge an Adsorptionsvermittler hängt von der oder den Eigenschaf¬ ten der verwendeten Substanzen (Stärke der Adsorptions- vermittlung) und von den Eigenschaften des oder der Targetpolymere ab; der maximale Zusatz ist allerdings kleiner oder höchstens gleich dem Gewicht der Summe der im Kern enthaltenen Metallionen.
Pharmazeutische Hilfsstoffe, die in den Lösungen der Nanopartikel enthalten sein können, lassen sich nach ihrer Aufgabe den Klassen Konservierungsmittel, pH-Stabi- lisatoren, Antioxidantien, Isotonisierungszusätze, Pep- tisatoren und Lösungsvermittler zuordnen. Als weitere Hilfsstoffe können medizinisch tolerable Lösungsmittel wie Zuckerlösungen, Plasmaexpander, Elektrolytlösungen, physiologische Kochsalzlösung oder auch Wasser ad injek- tionem, sowie parenteral applizierbare ölige
"Lösungsmittel" verwendet werden.
Exemplarische Beispiele für Pharmaka, die in den Lösungen der Nanopartikel enthalten sein können, lassen sich den Gruppen Antiallergika, Antianaphylaktika oder Prophylak- tika, den Vasodilatatoren oder Vasokonstriktoren, den Stoffen mit Einfluß auf die Durchblutung, den Stoffen, die den Metabolismus der Nanopartikel beeinflussen, den Stoffen, die die Pharmakokinetik der Nanopartikel beein- flussen, den Stoffen, die die Eisenbilanz verändern, den Stoffen aus dem Bereich der Enzyminduktoren und Inhibito¬ ren, oder allgemein den Mediatoren und Antimediatoren, zuordnen. Für die Verwendung in der Therapie sind haupt¬ sächlich Arzneistoffe aus den Gruppen Zytostatika, Che- moptherapeutika, der Hormone und Antidiabetika von besonderem Interesse. Die Pharmaka können den Lösungen der Nanopartikel dabei als optionale Komponente zusätzlich zugesetzt sein oder aber auch an die Targetpolymere gebunden und dann das Polymer-Arzneistoff-Konjugat als Targetpolymer verwendet werden.
Das "physiologische" Verteilungsverhalten der Nanoparti¬ kel läßt sich nicht nur über die Beeinflussung "physiologischer" Faktoren, wie Durchblutung, Lymphfluß und Lymphproduktion o. ä. durch Pharmaka verändern, sondern die in vivo Verteilung kann auch durch einfache physiotherapeutische Maßnahmen verändert werden. Beson¬ ders hervorzuheben sind hier die Bewegung, die z. B. durch einen Spaziergang oder Übungen auf dem Ergometer gezielt "appliziert" werden kann und entgegengesetzt dazu die Bewegungslosigkeit, wie z. B. bei bettlägerigen Patienten und oder die Anwendung in Narkose o. ä. die zu einem völlig anderen Verteilungsverhalten und -muster führt. Zum anderen ist insbesondere die Zufuhr von Wärme, die sich durch einfache Anwendung von Rotlicht oder Ganz- bzw. Teilkörperbädern, ermöglichen läßt, zu erwähnen. Besonders bevorzugt ist hier die Wärmezufuhr durch eine Hyperthermie-Vorrichtung, wie sie in vielen Kliniken zur gezielten Wärmezufuhr in der adjuvanten Tumortherapie verwendet wird. Durch gezielte lokale Erwärmung läßt sich die "Selektivität" durch physiotherapeutische Begleitung verbessern.
Die hohe Flexibilität der odularen Herstellung erlaubt die freie Kombination von Targetpolymer (en) , Adsorptions¬ vermittler(n) , pharmazeutischen Hilfsstoffen und Pharma¬ ka sowie die Anwendung beliebiger Zusammensetzungen der Nanopartikel in Kombination mit physiotherapeutischen Maßnahmen. Die Nanopartikel bzw. die Lösungen können aus vielen unterschiedlichen Bestandteilen zusammengesetzt sein, so daß nur allgemeine Aussagen zur exakten Zusammensetzung, die sich nach der jeweiligen Anwendung richtet, gegeben werden können:
Tab. Prozentuale bzw. Mengenzusammensetzung der erfindungsgemäßen Nanopartikel
relativer Anteil (Gewicht)
Grundbau¬ Eisen = 1 Summe = 1 stein
Dotierung mit anderen < 0,25 Metallen
Synthesepolymer (e) 0,01-1
Adsorptionsvermittler < 1
Targetpolymer (e) 0,5 - 50
Pharmaka wie erforder¬ lich pharmazeutische wie Hilfsstoffe erforder¬ lich
Der Gesamtdurchmesser der Nanopartikel inklusive aller Zusatzstoffe ist höchstens zehnmal höher (gemessen durch ein Laserlichtstreuverfahren, PCS) als der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns (gemessen durch Elektronen¬ mikroskopie in Transmissionsanordnung; TEM) . Bevorzugt sind die Kombinationen, bei denen der Durchmesser des Grundbausteins (Kern + Primärhülle) durch das Target- polymer oder die Kombination Targetpolymer und optionale Zusätze nur unwesentlich erhöht wird, der mit PCS gemessene Durchmesser soll maximal 20 % über dem Durchmesser des Grundbausteins liegen.
Durch die Kombination optimaler physikalischer Eigen¬ schaften der Grundbausteine mit einer Vielzahl möglicher Targetpolymere lassen sich Nanopartikel mit bisher uner¬ reichter Flexibilität und Qualität für Anwendungen, die hohe biologische Spezifität und hohe physikalische Quali¬ tät (z. B. Partikelgröße, magnetische Eigenschaften) erfordern, herstellen. Durch die modulare Bauweise und die damit verbundenen vielen Kombinationsmöglichkeiten ergibt sich ein breites Spektrum möglicher Anwendungen:
Aufgrund ihrer hohen physikalischen Qualität und der besonders guten Steuerungsfähigkeit ("targetability") der Nanopartikel durch flexible Anpassung (modularer Aufbau) des Targetpolymers (Sekundärcoat) an die jeweilige Frage- Stellung, ergeben sich viele Einsatzbereiche für spezi¬ elle Indikationen wie die MR-Lymphographie nach intravenöser oder lokaler interstitieller Gabe, die Tumordarstellung, die Darstellung von Funktionen oder gestörten Funktionen, die Plaque-Darstellung (Atherosklerose-Imaging) , die Darstellung von Thromben und Gefäßverschlüssen, die MR-Angiographie, Perfusions- untersuchungen, die Darstellung von Infarkten, die Darstellung von Endothelschädigungen, das Rezeptor- Imaging, die Dar Stellung der Integrität der Blut-Hirn- Schranke usw. und für die Differentialdiagnose, insbesondere zur Unterscheidung von Tumoren/Metastasen und hyperplastischem Gewebe.
Die Partikel eignen sich durch die außerordentliche Flexibilität bei der Herstellung auch für die unter¬ schiedlichsten Einsatzgebiete in der In-vitro-Diagnostik, so z . B. als spezifische Träger bei der Magnetseparation¬ stechnik in EIA's (Enzym-Immuno-Assays) . Eine Kombination von In-vitro-Verfahren mit einem thera¬ peutischen Ansatz ist die selektive Depletierung spezif- scher Faktoren aus dem Blut ("Ex-vivo-Blutwäsche") .
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen eine hohe Eigenfärbung auf und durch die Kombination mit einem Targetpolymer, das zu besonders hoher Akkumulation in den Lymphknoten führt, eignen sich die Partikel hervorragend als intraoperative Markersubstanzen zum Lymphknotenstai- ning. Bei vielen chirurgischen Tumorentfernungen werden die Lymphknoten mit entfernt und die Vorabapplikation der Nanopartikel erleichtert es dem Operateur erheblich, die z. T. äußerst kleinen Lymphknoten im umgebenden Gewebe zu identifizieren. Die Nanopartikel weisen für diese Indikation ein besonders breites nutzbares Zeitfenster auf und können von ca. 60 min bis mehr als 24 Stunden vor Operationsbeginn appliziert werden.
Neben der visuellen Darstellung von Lymphknoten ergibt sich bei intratumoraler Applikation oder Applikation in die Tumorperipherie die Möglichkeit, zum einen die Tumor¬ peripherie anzufärben und damit die Abgrenzbarkeit des Tumors zum umgebenden Gewebe zu erhöhen und zum anderen werden die Partikel aus dem Tumorarreal über die gleichen entsorgenden Lymphgefäße abtransportiert, über die auch der Tumor metastasieren würde. Die Nanopartikel zeigen also die für eine Metastasierung besonders prädesti- nierten Lymphwege bzw. Lymphknoten auf.
Neben der Verwendung als intravenöses Kontrastmittel können die Partikel auch lokal appliziert werden. Die lokale Anwendung kann z. B. bei einem Mammakarzinom vorteilhaft sein, da nur ein begrenzetes Gebiet darge- stellt werden soll und durch die zielgerichtete Anwendung werden einerseits hohe Konzentrationen des Kontrastmit- tels im Zielgebiet deponiert und zum anderen wird der restliche Organismus nicht belastet. Die indirekte gezielte Applikation ins Interstitium der Umgebung bestimmter Lymphknoten kann auch erforderlich sein, um eine Diagnose zu erhärten, falls sich nach intravenöser
Gabe ein verdächtiger aber unsicherer Befund ergeben hat.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der Nanopartikel ist die Verwendung als Verstärkersubstanz in der In-vivo- Diagnostik auf der Basis hochempfindlicher Meßmethoden
(SQUID) zur Messung der Magnetisierung oder magnetischer Felder/Flußdichten. Die Entwicklung hoch empfindlicher Meßmethoden auf diesem Gebiet hat die Verfolgung magneti¬ scher Partikel in vivo möglich gemacht, so daß, ähnlich wie in der Szintigraphie mit radioaktiven Substanzen, magnetische Partikel zur Diagnostik von Funktionsstörun¬ gen und Läsionen herangezogen werden können.
In der Therapie lassen sich die Partikel als Arzneistoff- träger verwenden. Die Spezifität der Nanopartikel wird zum Transport von Arzneistoffen an den Wirkort ausge¬ nutzt. Die Arzneistoffe können dabei in den Eisen¬ enthaltenden Kern inkorporiert sein, auf der Oberfläche adsorbiert werden oder aber auch chemisch an das Synthe- sepolymer und /oder das Targetpolymer gebunden sein. Eine Alternative ist die Adsorption von Arzneistoff-Polymer- Konjugaten oder Arzneistoffe an Adsorptionsvermittler zu binden, so sind z. B. bestimmte Peptidsequenzen mit hoher Adsorption an Eisenoxidoberflächen herstellbar. Eine mögliche Indikation ist hier auch die Anreicherung hoher Konzentrationen von niedermolekularen Chemothera- peutika in phagozytierenden Zellen, wie es z. B. bei vielen Krankheiten mit in RES Zellen persistierenden Mikroorganismen therapeutisch erforderlich ist. Bei allen therapeutischen Ansätzen können die Nanopartikel-Arznei- stoff-Systeme auch durch externe Magnetfelder selektiv im Zielgebiet akkumuliert werden. Bei speziellen Fragestel¬ lungen besteht auch die Möglichkeit, kleine Magnete zur Steuerung im Zielgebiet, z. B. in einem Tumorarreal, zu implantieren.
Neben einer Verwendung der Nanopartikel als Träger für den gezielten Transport von Arzneistoffen in bestimmte Gewebe, lassen sich Arzneiformen mit modifizierter Wirk¬ stofffreisetzung herstellen. Die Freisetzung des Wirk- Stoffs kann dabei durch biologisch spaltbare Arzneistoff- Konjugate gesteuert werden oder durch die Einlagerung des Arzneistoffs in verschiedene Komponenten des Nanoparti- kels mit unterschiedlichem Bioabbau erfolgen. Eine mögli^ ehe Indikation ist z. B. die Verwendung der Nanopartikel als Depotarzneiform für die Verabreichung von Hormonen.
Auch der Einsatz in neuen therapeutischen Systemen, bei denen die Freisetzung des Arzneistoffs über die magneti¬ schen Eigenschaften der Nanopartikel über einen "magnetischen Schalter" der z. B. auch extern geregelt werden kann, induziert und gesteuert wird, ist denkbar. Eine wichtige Indikation ist hier die Entwicklung thera¬ peutischer Systeme mit der regulierbaren Freisetzung von Antidiabetika für die Behandlung des Diabetes mellitus.
Als Arzneistoffe, die sich mit den Nanopartikeln gezielt zum Wirkort transportieren lassen , kommen insbesondere Chemotherapeutika und Zytostatika in Betracht. Auch die antimikrobielle Therapie erfordert oft den gezielten Transport des Arzneistoffs zum Wirkort (z. B. Tuberku¬ lose, in Makrophagen persistierende Mikroorganismen) . Als Arzneistoffe für therapeutische Systeme, bei denen die Freisetzung über die magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel erfolgt, kommen neben anderen insbesondere Antimikrobiotika, Hormone,' Antidiabetika, Zytostatika und Chemotherapeutika in Betracht.
Über die indirekte therapeutische Verwendung hinaus lassen sich die Nanopartikel aber auch selber als "Arzneistoff" nutzen, so z. B. als Absorber in der Hyperthermie oder in der Mößbauer-Kernabsorptionsthera- pie, oder bei entsprechender Dotierung mit Bor oder Gadolinium in der Neutroneneinfang Therapie. Auch in der Dotierung der Nanopartikel mit radioaktiven Elementen, die im Kern oder auch durch Adsorption geeigneter Moleküle mit Isotopen oder Molekülen an den Grundbaustein erfolgen, besteht eine Möglichkeit zur Verwendung der Nanopartikel in der medizinischen Strahlentherapie.
Eine bevorzugte Anwendung der Nanopartikel in der Strahlentherapie ist beispielsweise gegeben, indem die Nanopartikel entweder über das radioaktive Isotop 55Fe einen "Selbststrahler" enthalten oder indem die Nano- partikel ein Isotop enthalten, das durch eine externe "Aktivierung" in ein stählendes Isotop angeregt werden kann. Beispielsweise kann der Kern l-^Gd enthalten und die externe Anregung auf Neutronen zurückgehen.
Eine weitere Anwendung der Nanopartikel in der Strahlen¬ therapie ergibt sich durch die Möglichkeit, die Nanopartikel im Kern, im Synthese- oder im Targetpolymer oder auch im Adsorptionsvermittler so zu verändern, daß Selbststrahler wie z. B. 123 ocjer 125-[ enthalten sind. Alternativ können die Nanopartikel auch ein Isotop enthalten, das erst durch externe Anregung in ein strahlendes Isotop überführt wird. Ein Beispiel ist hier z. B. die Markierung des Targetpolymers mit Iod und die externe Anregung der Iod-K-Kante mit monoenergetischer Röntgenstrahlung. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch zur Entfernung von Bakterien, Viren, Endo- und Exotoxinen aus dem Vasalraum eingesetzt werden, wobei zum einen die Wechselwirkung mit den Nanopartikeln an sich zur Inaktivierung führen kann und zum anderen die Wechselwir¬ kung zur Erkennung der Konjugate/Adsorbate durch das RES mit nachfolgender intrazellulärer Inaktivierung, erfolgen kann.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele unter Verwendung der Abbildungen 1 bis 35 näher erläu¬ tert.
Im einzelnen zeigen:
Abb. 1: Schematischer Aufbau der Nanopartikel mit Eisen-enthaltendem Kern, Primärcoat (Synthesepolymer) und Sekundärcoat (Targetpolymer)
Abb. 2: Allgemeines Syntheseschema zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel Abb. 3: FTIR-Spektrum von Mono-Carboxydextran und der Ausgangsverbindung Dextran 4 Abb. 4: FTIR-Spektrum von Poly-Carboxydextran und der
Ausgangsverbindungen Dextran T10 und 6- Bromhexansäure Abb. 5: MR-Aufnahmen von in Agarose-eingebetteten Rattenlymphknoten Abb. 6: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte Abb. 7: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen Signalintensitäten GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte Abb. 8: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Pro¬ tonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15) Abb. 9: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Pro¬ tonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15) .
Abb. 10: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschieden Lymphknoten des Kaninchens 24 h p. i .
Abb. 11: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*- gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/15°)
Abb. 12: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*- gewichteten Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/15°) . Abb. 13: Modifizierte Charge vs Originalsubstanz:
Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten des Kaninchens 24 h p. i .
Abb. 14: Ex vivo MR-Aufnahmen (GE-Sequenz) von Agarose- eingebetteten Lymphknoten des Kaninchens
Abb. 15: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten des Kaninchens 24 h p. i .
Abb. 16: Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Applikation der Nanopartikel.
Abb. 17: Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach
Applikation der Nanopartikel. Abb. 18: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation (Vergleichssubstanz) Abb. 19: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation der spezifischen Nanopartikel. Abb. 20: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in
Abhängigkeit der Zeit nach Applikation (Vergleichssubstanz) . Abb. 21: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation der spezifischen Nanopartikel. Abb. 22: Beeinflussung der Lymphknotenanreicherung durch gezielte Applikation von Wärme. Abb. 23 : Transversale Dynamik-Studie des Rattenabdomens mit einer Tl-gewichteten SE Sequenz (TR: 200 ms, TE: 10 ms) nach Bolus-Injektion der spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 (Dosis 20 μmol Fe/kg) Abb. 24: Vergleich der relativen Signalintensitäten für SE TR/TE 200ms/l0ms im venösen Gefäß und dem
Leberparenchym für die spezifischen Nanopar¬ tikel nach Beispiel D2 und die unspezifische Vergleichssubstanz nach Beispiel C2 Abb. 25: Koronare MIPS (maximum-intensity projections) von 3D-Flash-Aufnahmen (TR: 40 ms, TE: 6 ms,
FA 60 °) für die spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 und die Vergleichssubstanz C2 Abb. 26: Erfindungsgemäße Nanopartikel als
"intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von Lymphknoten
(Übersichtsaufnähme) Abb. 27: Erfindungsgemäße Nanopartikel als
"intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von Lymphknoten (Detailansicht) . Abb. 28: Demonstration von Metastasen in Lymphknoten durch visuelle Detektion in metastatischen Lymphknoten am Kaninchen. Abb. 29: Zellaufnahme von spezifischen Nanopartikeln (mit Transferrin) im Vergleich zur unspezi- fischen Kontrolle (Nanopartikel ohne Trans¬ ferrin) . Abb. 30: Ex vivo MR-tomographische Darstellung atherosklerotischer Plaques der Aorta eines Kaninchens mit der Modifikation zu den Nanopartikeln nach Beispiel D7 (Dosis 200 μmol
Fe/kg; Resektion der Aorta 5 h p.i.) Abb. 31: Histologischer Eisen-Nachweis in der atherosklerotischen Membran der Kaninchen- Aorta mit Berliner-Blau-Färbung. Abb. 32: Histochemische Detektion (Berliner Blau
Färbung) der akkumulierten Nanopartikel nach Beispiel D7 in der Aorta eines Watanabe Kaninchens . Abb. 33: Transversale Tl-gewichtete Spin-Echo Dynamik- Studie (TR: 300 ms, TE: 15 ms) des tumoralen
Signalverhaltens nach Bolusinjektion von Nanopartikeln nach Beispiel D2 (200 μmol Fe/kg) Abb. 34: Verlauf der relativen Signalintensität (Anreicherung) im Tumor.
Abb. 35: Zeitabhängige transversale Protonen-Dichte- gewichtete (SE 2000/15) Aufnahmen nach Appli¬ kation der Nanopartikel nach Beispiel D2 (200 μmol Fe/kg) . Beispiele
zur Herstellung und zur Anwendung
A: Herstellung von Synthesepolymeren
AI Synthese von (Mono- . Carboxydextran (CDx)
100 g Dextran 4 werden in 500 ml Wasser gelöst und auf 60 °C erhitzt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe von ungefähr 55 ml ca. 10 N Natronlauge. Nach 5 Stunden Reaktionszeit erfolgt die (teilweise) Neutralisation der Lösung auf pH 8. Die braune Lösung wird anschließend über einen Misch¬ bett-Ionenaustauscher gereinigt. Die Fraktionen mit sauren Eigenschaften werden gepoolt und am Rotationsver¬ dampfer bei 40 °C im Vakuum auf onzentriert. Anschließend erfolgt die Gefriertrocknung.
Tab. 3: analytische Daten:
Dimension Ergebnis Methode
Molekularge¬ g/Mol ca. AusSchluß-Chromatographie wicht 2.000
Säuregehalt (%) % 7,3 ± 0,4 Potentiometrische Titration pKs-Carbonsäure 3,6 - 3,8 Potentiometrische Titration optische + 156,9 ° Kreispolarimeter (Zeiss) Drehung(Wasser) (Grad) ± 9,9 °
Ausbeute % 59 Anthron-Methode
Elementar- %' analyse
Wasser 0,70
Kohlenstoff 41,25
Wasserstoff 6,30 Das FTIR-Spektrum (Kaliumbromid) des modifizierten Dextrans (=Carboxydextran) ist in Abbildung 3 dargestellt.
A2 Synthese von Polycarboxydextran (P-CΩx. 10 g Dextran T10 werden in einen 250 ml 2-Hals-Kolben eingewogen und mit 100 ml 4 N NaOH versetzt. Der eine Hals des Kolbens wird mit einem Rückflußkühler ausge¬ stattet und die Lösung dann auf ca. 80 °C erhitzt. Unter Rühren (Magnetrührer) erfolgt durch den zweiten Zugang die portionsweise Zugabe von 30 g 6-Bromhexansäure. Nach der Zugabe wird der Zugang durch einen Stopfen verschlos¬ sen und das Reaktionsgemisch für 3 Stunden weitergerührt. Nach der Reaktion erfolgt unter einem Abzug die Neutrali¬ sation mit 6 N HC1 und dann eine Vorkonzentration am Rotationsverdampfer (60 °C, Vakuum) . Die Abtrennung des nicht umgesetzten Reagenzes bzw. die Reinigung des modi¬ fizierten Carboxydextrans erfolgt durch Fällung mit Ethanol . Der weiße Niederschlag wird gewaschen, in Aqua bidest . wieder aufgelöst und abschließend durch 0,22 μm Filter filtriert und lyophilisiert.
Tab. 4: analytische Daten
Dimension Ergebnis Methode
Molekularge¬ g/Mol ca. 12.000 Ausschluß- wicht Chromatographie
Säuregehalt (%) % 19,86 ± 1,2 Potentiometrische Titration pKs-Carbonsäure 4,4 - 4,8 Poten iometrische Titration optische + 109,3 ° Kreispolarimeter Drehung(Wasser) (Grad) ± 6,9 ° (Zeiss)
Ausbeute % 95 Anthron-Methode
Elementar¬ % analyse Wasser 2,3
Kohlenstoff 49,7
Wasserstoff 5,4
Das FTIR-Spektrum des Poly-Carboxydextrans ist in Abbildung 4 abgebildet.
E: Herstellung der Rohsubstanzen
Bl Herstellung aus CDx mit Ammoniak-Gas
5,0 g Mono-Carboxydextran (CDx, Beispiel AI) mit einem Molekulargewicht von ca. 2000 Da werden in 17,5 ml Aqua bidest. gelöst. Die Lösung wird durch einblasen von Stickstoff entgast. In einem Reagenzglas werden 6,7 ml 1 molare Eisen-III-chlorid-hexahydrat-Lösung vorgelegt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen-III-Lösung werden 648 mg Eisen-II-chlorid-tetrahydrat gegeben und im Stick¬ stoffström gelöst. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75 °C erwärmt und die Eisenlösung zugegeben (unter Stickstoff- begasung) . Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter Durchmischung durch schnelles Einleiten von Ammoniak aus einer Gasflasche alkalisch gestellt. Anschließend wird die Reaktionslösung etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Anschließend wird noch für ca. 10 Minuten am offenen Kolben erhitzt, um den nicht umgesetzten Ammoniak auszutreiben. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 7 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und ggf. neutralisiert und nach der Konzentrationsbestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 μm filtriert. Die Lösung kann in einem Autoklaven mit gespanntem Wasserdampf (Verfahren A121) sterilisiert werden. Tab. 5: analytische Daten:
Dimension Ergebnis Bemerkung
Gehaltsangaben
Ausbeute (Eisen) % 87
Gehalt (Eisen) Mol/1 1 ICP- Atomemissionsspektroskopie
Eisen- % 9,8 Phenanthrolin-Methode II/Gesamteisen
Polymer (C- mg/ml 500 Anthron-Methode Dextran)
Polymer/Eisen: (g/g) 9:1
Größenangaben
Kerndurchmesser nm ± SD 3,8 ± Elektronenmikroskop (TEM) 0,8
Gesamtdurchmesser nm ± SD 9,9 ± Laserlichtstreuung (PCS) 6,1 nm 11,1 Ausschluß-Chromatographie
Relaxivität und Suszeptibilität
Suszeptibilität EMU/g 64 Magnetische Waage
Tl-Relaxivität 1 mmol"-1- 54 ICP- s-1 Atomemissionsspektroskopie
T2-Relaxivität 1 mmol-1 24 ICP- s-1 Atomemissionsspektroskopie
Bluthalbwertszeit 88 (Tl)1
(200 μmol/kg KGW, min 94 ' (T2)2 Ratte, n=5) 101 (Fe)3
Anmerkung 1-3: Bestimmung der Bluthalbwertszeit
•Bluteliminationshalbwertszeit
In Ethernarkose wird in die arteria carotis communis der
Versuchstiere (Ratte, ca. 200 g) ein 50,5 cm langer mit heparinisierter Kochsalzlösung (0,2 ml) gefüllter Katheter implantiert und etwa 1,5 cm zum Herzen vorgeschoben. Das frei bewegliche Ende des Katheters wurde nach außen geführt und mit Histoacryl fixiert. Etwa eine Stunde nach Operationsende wird die Prüfsub- stanz i. v. über die Schwanzvene (ca. 1 ml/min) appliziert. Die Blutentnahmen erfolgten zu verschiedenen Zeitpunkten entsprechend den erwarteten Eliminations- geschwindigkeiten der Probesubstanzen am wachen Tier. Nach Ende des Versuchs wurden die Tiere unter Ether- narkose durch Entbluten aus der vena cava getötet.
•Halbwertszeit des Tχ~ und T2-Effektes
Die Blutproben werden für 15 min bei 2900 rpm (1000 g) zentrifugiert und dann werden aus dem überstand 0,250 ml abgenommen und mit bidest. Wasser auf 2,0 ml aufgefüllt und das Gemisch dann auf 40 °C temperiert. Die "Konzentrationsbestimmung" erfolgt über die Messung der Tι;2**Relaxati°nsze ten m t clem Relaxometer pcl20 (Bruker, Deutschland) . Die Messung wurde mit einer 180°- 90°-IR- (Inversion Recovery) -Sequenz (Ti) bzw. mit einer CPMG-Sequenz (T2) durchgeführt.
Die Auswertung wurde mit einem pharmakokinetischen Zwei- Kompartiment-Modell vorgenommen und die Berechnung der Daten erfolgte mit Hilfe des Pharmakokinetik Computer¬ programms TOPFIT, indem die Konzentrationen, ausgedrückt als reziproke Tιf2-Zeiten (Relaxationsraten) abzüglich Leerwert, über der Zeit aufgetragen wurden. TOPFIT errechnet durch lineare Regression aus der halblogarith- mischen "Konzentrations"-Zeit-Darstellung die Steigung der Geraden und daraus die Effekt-Halbwertszeiten.
•Halbwertszeit über den Eisengehalt
Von den Lösungen zur Relaxationszeitbestimmung wurden 800 μl abpipettiert, mit konzentrierter Salpetersäure aufgelöst, ad 10,0 ml mit bidest. Wasser aufgefüllt und anschließend der Eisengehalt mit Atomemissionsspektro¬ skopie (AES) quantifiziert. Unter Berücksichtigung der Verdünnungsfaktoren erfolgt dann die Umrechnung in Blutkonzentrationen und die Auswertung über ein Konzentrations-Zeit-Diagramm mit TOPFIT.
B2 Herstellung aus P-CDX mit NaOH und Fe-TIT-citrat und Fe-II-g uconat
5,0 g Poly-Carboxydextran (Beispiel A2) mit einem Molekulargewicht von ca. 12000 Da werden in 17,5 ml Aqua bidest . gelöst. Die Lösung wird durch einblasen von Stickstoff entgast. In einem Reagenzglas werden 6,7 ml 1 molare Eisen-III-citrat-monohydrat-Lösung vorgelegt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen-III-Lösung werden 1,635 g Eisen-II-gluconat-trihydrat gegeben und im Stick¬ stoffström gelöst. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75 °C erwärmt und die Eisenlösung zugegeben (unter Stickstoff- begasung) . Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter Durchmischung innerhalb von 30 Sekunden mit ca. 12 ml 3 N Natronlauge versetzt. Anschließend wird die
Reaktionslösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugi-ert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 7 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrations- bestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 μm filtriert. Die Lösung kann in einem Autoklaven (Verfahren A121) sterilisiert werden. Tab. 6: analytische Daten:
Dimension Ergebnis Bemerkung
Gehaltsangaben
Ausbeute (Eisen) % 84 Gehalt (Eisen) Mol/1 1 ICP- Atomemissionsspektroskopie
Eisen-II/ % 11,4 Phenanthrolin-Methode Gesamteisen
Polymer (P- mg/ml 505* Anthron-Methode Dextran)
Polymer/Eisen: (g/g) 9:1
Größenangaben
Kerndurchmesser nm ± SD 4,1 ± 1,3 Elektronenmikroskop (TEM)
Gesamtdurch- nm ± SD 20,4 + Laserlichtstreuung (PCS) messer nm 8,4 Ausschluß-Chromatographie ca. 27
Relaxivität und Suszeptibilität
Suszeptibilität EMU/g 77 Magnetische Waage
Tl-Relaxivität 1 mrnol"1 24 ICP- s-1 Atomemissionsspektroskopie
T2-Relaxivität 1 mmol-1 64 ICP- s-1 Atomemissionsspektroskopie
Bluthalbwerts¬ 68 (Tl) s. Beispiel Bl zeit min 64 (T2) s. Beispiel Bl
(200 mmol/kg 59 (Fe) s. Beispiel Bl KGW, Ratte, n=5)
* Der Gehalt an P-CDx errechnet sich aus den bestimmten Glucoseäquivalenten multipliziert mit dem Faktor 1,64 (100 mg P-CDx = 61 mg Glucoseäquivalente)
P.3 Herstellung ans CDx mit Fe-III-NTA und
Ammoniumhydroxid
5,0 g (Mono-) Carboxydextran (CDx, Beispiel AI) mit einem Molekulargewicht von ca. 2000 Da werden in 35 ml Aqua bidest . gelöst . Die Lösung wird durch einblasen von Stickstoff entgast. Das Reaktionsgemisch wird erwärmt und unter guter Durchmischung mit konzentrierter Ammonium¬ hydroxid-Lösung (32 %) versetzt, bis ein pH-Wert von 10 erreicht ist. In einem Reagenzglas werden 6,85 ml 1 molare Eisen-III-Lösung vorgelegt, mit der äquimolaren Menge NTA versetzt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen- III-Lösung werden 667 mg Eisen-II-chlorid-tetrahydrat gegeben und im Stickstoffström gelöst. Die Eisenlösung wird innerhalb von 20 Sekunden zur alkalischen Polymer- Lösung gegeben. Anschließend wird die Reaktionslösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 6 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrationsbestimmung mit Aqua bidest . auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 μm filtriert. Die Lösung kann im Autoklaven sterilisiert werden
Tab .7 : analytische Daten:
Dimension Ergebnis Bemerkung
Gehaltsangaben
Ausbeute (Eisen) % 69
Gehalt (Eisen) Mol/1 1 ICP-
Atomemissionsspektro- skopie
Eisen-II/ % 7,1 Phenanthrolin-Methode Gesamteisen
Polymer (P- mg/ml 421 Anthron-Methode Dextran)
Polymer/Eise : (g/g) 8:1
Größenangaben
Kerndurchmesser nm ± SD 5,5 ± 2,3 Elektronenmikroskop (TEM) Gesamtdurchmesser nm ± SD 24,4 ± 8,4 Laserlichtstreuung (PCS) nm ca. 31 Ausschluß- Chromatographie
Relaxivität und
Suszeptibilität
Suszeptibilität EMU/g 96 Magnetische Waage
Tl-Relaxivität 1 mmol-1 33 ICP- s-1 Atomemissionsspektro- skopie
T2-Relaxivität 1 mmol"1 148 ICP- s-1 AtomemissionsSpektro¬ skopie
Bluthalbwertszeit 59 (Tl) s. Beispiel Bl
(200 mmol/kg KGW, min 54 (T2) s. Beispiel Bl
Ratte, n=5) 58 (Fe) s. Beispiel Bl
B4 Herstellung aus P-CDx mit Eisen-III und Reduktionsmittel . Natronlauge
5,0 g Poly-Carboxydextran (Beispiel A2) mit einem Molekulargewicht von ca. 12000 Da werden in 17,5 ml Aqua bidest. gelöst. Die Lösung wird durch einblasen von Stickstoff entgast. Zur Polymer-Lösung werden 10 ml 1 molare Eisen-III-chlorid-hexahydrat-Lösung gegeben und weiter mit Stickstoff entgast. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75 °C erwärmt und ddann werden 113,6 mg Hydroxylamin-HCl zugegeben (unter Stickstoffbegasung) . Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter
Durchmischung innerhalb von 30 Sekunden mit ca. 12 ml 3 N Natronlauge versetzt. Anschließend wird die Reaktions¬ lösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 7 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrations- bestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 μm filtriert. Die Lösung kann im Autoklaven sterilisiert werden (Verfahren A121) .
Tab. 8: analytische Daten:
Dimension Ergebnis Bemerkung
Geha11sangaben
Ausbeute (Eisen) % 84
Gehalt (Eisen) Mol/1 1 ICP-
AtomemissionsSpektro¬ skopie
Eisen-II/ % 5,4 Phenanthro1in-Methode Gesamteisen
Polymer (P- mg/ml 515 Anthron-Methode Dextran)
Polymer/Eisen: (g/g) 9:1
Größenangaben
Kerndurchmesser n ± SD 4,5 ± 1,4 Elektronenmikroskop (TEM)
Gesamtdurchmesser nm ± SD 21,4 ± 5,4 Laserlichtstreuung (PCS) nm ca. 24 Ausschluß- Chromatographie
Relaxivität und Suszeptibilität
Suszeptibilität EMU/g 88 Magnetische Waage
Tl-Relaxivität 1 mmol"1 28 ICP- s-i Ato emissionsspektro- skopie T2-Relaxivität 1 mmol"1 138 ICP- s-1 Atomemissionsspektro- skopie
Bluthalbwertszeit 57 (Tl) s. Beispiel Bl
(200 mmol/kg KGW, min 55 (T2) s. Beispiel Bl
Ratte, n=5) 51 (Fe) s. Beispiel Bl
B5 Herstellung mit einer Mischung aus Dextran 4 und Dextran 15
5,0 g einer 1:1 Mischung von Dextran 4 und Dextran 15 mit einem Molekulargewicht von ca. 4000 - 6000 Da bzw. 15000 - 20000 werden in 20 ml Aqua bidest. gelöst. Die farblose Polymerlösung wird mit 3 N Natronlauge auf einen pH-Wert von ca. 12 eingestellt und für 1 Stunde am Rückfluß gekocht und dann mit ca. 6 N HC1 neutralisiert. Die dunkelrot-braune Lösung wird durch einblasen von Stick¬ stoff entgast. In einem Reagenzglas werden 6,7 ml 1 molare Eisen-III-chlorid-hexahydrat-Lösung vorgelegt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen-III-Lösung werden 648 mg Eisen-II-Chlorid-tetrahydrat gegeben und im Stick- stoffström gelöst. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75 °C erwärmt und die Eisenlösung zugegeben (unter Stickstoff- begasung) . Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter Durchmischung innerhalb von 30 Sekunden mit ca. 11,5 ml 3 N Natronlauge versetzt. Anschließend wird die Reaktionslösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 8 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrations- bestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare
Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 μm filtriert. Die Lösung kann im Autoklaven nach dem Verfahren A121 sterilisiert werden. Tab . 9 : analytische Daten :
Dimension Ergebnis Bemerkung
Gehaltsangaben
Ausbeute (Eisen) % 91
Gehalt (Eisen) Mol/1 1 ICP-
Atomemissionsspektro- skopie
Eisen- % 12,8 Phenanthrolin-Methode II/Gesamteisen
Polymer (P- mg/ml 570 Anthron-Methode Dextran)
Polymer/Eisen: (g/g) 10:1
Größenangaben
Kerndurchmesser nm ± SD 4,0 ± 1,1 Elektronenmikroskop (TEM)
Gesamtdurchmesser nm ± SD 18,1 ± 3,4 Laserlichtstreuung (PCS) nm ca. 21 Ausschluß- Chromatographie
Relaxivität und Suszeptibilität
Suszeptibilität EMU/g 68 Magnetische Waage
Tl-Relaxivität 1 mmol"-1- 21 ICP- s-1 AtomemissionsSpektro¬ skopie
T2-Relaxivität 1 mmol"1 78 ICP- s-1 Atomemissionsspektro- skopie
Bluthalbwertszeit 61 (Tl) s. Beispiel Bl
(200 mmol/kg KGW, min 59 (T2) s. Beispiel Bl Ratte, n=5) 67 (Fe) s. Beispiel Bl C: Herstellung der Grundsubstanzen
G1 Dialyse gegen Wasser
5 ml der Lösung nach Beispiel Bl werden in einen Visking Dialyseschlauch gefüllt und unter Rühren 5 mal für jeweils 6 h gegen 1 1 frisches Aqua bidest dialysiert. Das Retentat wird durch Verdünnen mit Aqua bidest auf eine Eisenkonzentration von 200 mMol/1 eingestellt und anschließend durch sterile 0,22 μm Filter (Cellulose- acetat) in Portionen ä 5 ml in sterile 10 ml Vials abgefüllt. Die desorbierte Lösung kann im Autoklaven sterilisert werden.
C2 Dialyse gegen 20 mMol Na rin lactat
5 ml der Lösung nach Beispiel Bl werden in einen Visking Dialyseschlauch gefüllt und unter Rühren 5 mal für jeweils 6 h gegen 1 1 frische Natriumlactat-Lösung (20 mMol/1, pH 7) dialysiert. Anschließend wird noch 2 mal für 5 h gegen jeweils 1 1 frisches Aqua bidest. dialy¬ siert . Das Retentat wird durch Verdünnen mit Aqua bidest auf eine Eisenkonzentration von 200 mMol/1 eingestellt und anschließend durch sterile 0,22 μm Filter (Cellulose- acetat) in Portionen a 5 ml in sterile 10 ml Vials abgefüllt.
C3 Ultrafiltration mit Amicon
Jeweils 5 ml der Lösung nach Beispiel Bl werden in präparative Ultrafiltrationseinheiten pipettiert und mit Aqua bidest auf 15 ml aufgefüllt (Centriprep 100, Cut off 100 kDa) und für l h bei 1000 g ultrafiltriert. Anschließend wird das Filtrat verworfen und der Retentatbehälter wieder bis zur 15 ml Marke mit frischem Aqua bidest. aufgefüllt und erneut ultrafiltriert. Das Retentat wird durch Verdünnen mit Aqua bidest auf eine Eisenkonzentration von 200 mMol/1 eingestellt und anschließend durch sterile 0,22 μm Filter (Cellulose- acetat) in Portionen a 5 ml in sterile 10 ml Vials abgefüllt.
C4 Chromatographische Trennung
5 ml der Lösung nach Beispiel Bl werden mit einem 10 ml Superloop auf eine S400HR Sephacryl-Säule (100 x 5 cm) gegeben und mit 50 mM Zitronensäure/250 mM Mannit mit einem Flow von 300 ml/Stunde eluiert . Die Fraktion von 450 ml bis 840 ml wird gesammelt und im Rotations¬ verdampfer bei 60 °C im Vakuum auf ca. 50 ml aufkon¬ zentriert . Das Konzentrat wird 3 mal für 6 Stunden gegen bidest. Wasser dialysiert, erneut am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und nach der Eisenbestimmung auf eine Konzentration von 200 mMol Eisen/1 eingestellt. Die Lösung wird durch 0,22 μm Celluloseacetat Filter filtriert und in Portionen a 5 ml in sterilisierte 10 ml Vials abgefüllt. Die Lösungen können im Autoklaven sterilisiert werden.
Tab. 10: analytische Daten zu den Grundbausteinen nach
Beispiel C1-C4
Beispiel Ausbeute (Fe) Polymer : Eisen [ = 200 mMol/1] (g/g)
Cl 96 % 0,501 ± 0,025
C2 94 % 0,300 ± 0,020
C3 89 % 0,610 ± 0,041
C4 67 % 0,143 ± 0,030 Die physiko-chemischen Daten zu den magnetischen Eigenschaften und zu den Größenparametern entsprechen den Werten der Ausgangsverbindung (Beispiel Bl) . D: Applikationslösungen
Dl Dextran Tl 0
5,0 ml Lösung nach Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/1 (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 33,6 mg Dextran T10 als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 μm) unter aseptischen Bedingungen 5,0 ml zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 1
(Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg) . Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.
D2 Dextran FP1 Herstellung aus 2 Lösungen
5, 0 ml Lösung nach Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/1 (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 302,4 mg Dextran FP1 als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 μm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 5 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 252 mg) . Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.
D3 Dextran FP1 als Lyophilisat 5,0 ml Lösung nach Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/1 (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 302,4 mg Dextran FP1 als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 μm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 5 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 252 mg) . Die Lösung wird in der Injektionsflasche lyophilisiert und dann verschlossen.
Die Zubereitung der Applikationslösung erfolgt durch Zugabe von 10 ml physiologischer Kochsalzlösung; die
Flasche enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die zur Anwendung für die intravenöse MR-Lymphographie geeignet ist.
D4 Dextran FPl
252 mg Dextran FPl als Targetpolymer werden in eine 5 ml Injektionsflasche eingewogen und mit 5,0 ml Lösung nach Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/1 (entsprechend 56 mg Gesamteisen) aufgefüllt und die Flasche dann verschlossen. Durch Drehen der Injektions¬ flasche wird das Dextran FPl gelöst. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 5 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 252 mg) . Die Zubereitung enthält jetzt 5 ml 200 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.
D_5 Laminarin
5,0 ml Lösung nach' Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/1 (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 33,6 mg Laminarin als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 μm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 1 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg) . Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.
D6 mit Transferrin
5,0 ml Lösung nach Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/1 (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 33,6 mg humanes Fe2~ Transferrin als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 μm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient
Polymer zu Eisen ist 1 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg) .
Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die zur Anwendung als spezifisches Kontrastmittel für die Darstellung proliferierender Zellen (Tumore) geeignet ist.
D7Mit Endothelin-Agonist
5,0 ml Lösung nach Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/1 (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 33,6 mg eines Endothelin- Rezeptor spezifischen Heptapeptids [Cys-His-Leu-Asp-Ile- Ile-Trp]als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 μm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid- Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 1 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg) . Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die zur Anwendung für das intravenöse MR-Plaque- Imaging (Atherosklerose-Imaging) geeignet ist.
E: Anwendungen
Anwendungsbeispiel El
• MR-Lymphographie an der Ratte
Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der Ausgangsverbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Target¬ polymer) am Tiermodell Ratte.
Substanz Spezifische Nanopartikel (Beispiel D5) ; Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel Cl
(= D5 ohne Targetpolymer)
Tiere: Ratte, SPF -Han Wistar; ca. 150 g
Dosierung: 100 μMol Fe/kg Körpergewicht (KGW)
Zeiten: 24 h p. i. (post injectionem)
MR-Methode:
Gerät : Siemens Magnetom 1,5 T
MR Ganzkörpertomograph mit
Extremitätenspule
MR-Parameter: Field of View (FOV) = 150 mm, Matrix =
256x256; Slice = 3 mm
Schichtorientierung = frontal
Sequenz 1 Protonendichte-betonte Spin-Echo Sequenz
(SE) mit TR = 2000 ms und TE = 15 ms
Sequenz 2 : T2-gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz (GE) mit TR = 135 ms und TE = 15 ms; FA = 15° Ex-vivo-Modell :
• Lymphknotenanreichenang an Ratten und Kaninchen Zur Untersuchung der Anreicherung und Verteilung der Substanzen in verschiedenen
Lymphknoten/Lymphknotengruppen wurde ein Ex-vivo-Agar- Phantom verwendet. Dieses Ex-vivo-Modell hat den Vorteil auch bei kleinen Versuchstieren (Maus, Ratte, Kaninchen) die Akkumulation in verschiedenen zentralen und peripheren Lymphknoten(gruppen) bewerten zu können und ermöglicht damit auch Aussagen zur Homogenität der Verteilung; eine Quantifizierung der Signalbeeinflussung ist möglich. Den Versuchstieren (Maus, Ratte oder Kaninchen) wird die Lösung der Nanopartikel über die Schwanzvene injiziert (Bolus) . Nach 24 Stunden werden die Tiere getötet und verschiedene Lymphknoten bzw. Lymphknotengruppen präpariert (Lnn. popliteales, Lnn. mandibulares, Lnn. iliacales, Lnn. axillares, Lnn. mandibulares, Lnn. inguinales) . Die Lymphknoten werden anschließend in ein Agar-Phantom eingegossen und bis zur MR-Messung im Kühlschrank verwahrt (max. 24 Stunden) :
• Herstellung des Ex-vivo Agarose-Phantoms
Zur Herstellung des Phantoms werden 10 g Agar-Agar für die Mikrobiologie in 500 ml bidestilliertem Wasser, dem 0,5 ml Magnevist (0,5 Mol/1 Gadolinium-DTPA-dimeglumin) für einen Signal-homogenen Hintergrund in der MR-Aufnähme zugesetzt sind, suspendiert. Die Suspension wird aufgekocht und dann auf ca. 80 °C abgekühlt und bei dieser Temperatur gehalten. Etwa die Hälfte der Agar- Lösung wird zu einer 0,5 - 1 cm dicken Schicht in eine Plastikschale gegossen. Nach dem Erkalten werden die Organproben auf der Agarschicht angeordnet (entsprechend linker-rechter Körperhälfte bzw. in "physiologischer Reihenfolge" von oben nach unten) und mit wenig Agar- Lösung fixiert (Pasteurpipette) . Abschließend wird eine zweite Schicht Agar-Lösung über die Gewebeproben gegossen. Das Phantom wird innerhalb von 24 Stunden gemessen und bis zur Untersuchung im Kühlschrank gelagert.
Zur Kontrolle (Organleerwerte) werden Tiere ohne Injektion von Nanopartikeln mitgeführt und die Gewebe identisch präpariert bzw. ein entsprechendes Phantom angefertigt.
Neben der visuellen Auswertung erfolgt zum einen eine Quantifizierung der relativen Signalreduktion in den einzelnen Geweben über
und zum anderen werden die Gewebeproben nach der MR- Messung wieder vorsichtig aus dem Agar-Phantom herausgelöst, in konzentrierter Salpetersäure zersetzt und dann mit ICP-AES (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy) der Eisengehalt quantifiziert. An adäquat behandelten Kontrolltieren ohne Applikation von Nanopartikeln wurden die Leerwerte ermittelt und bei der Eisen-Bestimmung der Proben berücksichtigt.
Ergebnis; Abb. 5: MR-Aufnahmen von in Agarose eingebetteten Ratten¬ lymphknoten; Resektion 24 h nach Applikation von der Vergleichssubstanz (Beispiel C2, links) bzw. der modifizierten Substanz nach Beispiel D2 (rechts) ,- Dosis jeweils 100 μmol Fe/kg.
Abb. 6: Modifizierte Charge vs Originalsubstanz: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen Signalinten¬ sitäten für SE 2000/15 in verschieden Lymphknoten der Ratte 24 h nach Magnetit-Applikation (100 μmol Fe/kg) .
Abb. 7: Modifizierte Charge vs Originalsubstanz: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen SignalInten¬ sitäten GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Magnetit-Applikation (100 μmol Fe/kg) .
Die Auswertung über die Beeinflussung der relativen lymphonodalen Signalintensität (Abb. 6 = SE; Abb. 7 = GE) der spezifischen Nanopartikel bzw. der Ausgangssubstanz demonstriert eindrucksvoll die homogenere Anreicherung der modifizierten Substanz in den Lymphknoten. Die lymphonodale Signalreduktion von mandibularen, axillaren, iliakalen, poplitealen Lymphknoten sowie der mittleren Anreicherung über alle Lymphknoten-Gruppen durch die mit Dextran FPl als Sekundärcoat modifizierte Charge unter¬ scheidet sich signifikant (t-Test, p < 0,05) von der unmodifizierten Ausgangsverbindung (Abb. 6 und 7) . Die Überlegenheit der spezifischen Nanopartikel wird schon durch die optische Beurteilung der "Schwärzung" der einzelnen Lymphknoten in der Abbildung 5 eindrucksvoll gezeigt. Besonders bemerkenswert ist die Homogenität der Verteilung über alle untersuchten Lymphknoten.
Anwend ngsbeisoiel E2 • MR-Lymphographie am Kaninchen
Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der AusgangsVerbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Target- polymer) am Tiermodell Kaninchen.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2) ,* Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel
C2
( = D2 ohne Targetpolymer) Tiere : Neuseeländer, ca . 3 kg
Dosierung : 150 μMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) Zeiten : 24 h p . i . (post inj ectionem)
MR-Methode : MR- Tomographie in SE und GE-Technik
( s . Anwendungsbeispiel El ) In-vivo-Modell : Kaninchen mit stimulierten
Lymphknoten • Lymphknotenstimulation mit Eigelb
Die Kaninchen wurden etwa eine Woche vor der Applikation der Prüf Substanzen vorbehandelt . Zur Induktion einer reaktiven Hyperplasie (Lymphknotenvergrößerung) wurde den Versuchstieren 3 x im Abstand von 2 Tagen je 0 , 5 ml einer sterilen Eigelbsuspension (Oxoid) i .m. in den
Oberschenkel und s . c . in die Flanke inj iziert .
Ex-vivo-Modell : Agarose- Phantom
( s . Anwendungsbeispiel El )
Ergebnis :
Abb. 8: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Protonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15). (links: prae-Kontrast; rechts: spezifische Substanz D2 (150 μmol Fe/kg) ) . Abb. 9: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Protonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15) . (links: prae-Kontrast; rechts: Ausgangsverbindung C2 (150 μmol Fe/kg) ) . Abb. 10: Spezifische Nanopartikel vs unspezifische
Ausgangspartikel: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschieden Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i. (150 μmol Fe/kg, n=3). (Quantitative Auswertung nach Abb. 8 und 9) . Abb. 11: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*-gewichteten Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/15°) . (links: prae-Kontrast; rechts: spezifische Substanz D2 (150 . μmol Fe/kg) ) . Abb. 12: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*-gewichteten Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/15°) . (links: prae-Kontrast; rechts: Ausgangsverbindung C2 (150 μmol Fe/kg) ) . Abb. 13: Spezifische Nanopartikel vs unspezifische Ausgangs¬ partikel: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschieden Lymphknoten des Kaninchens
24 h p.i. (150 μmol Fe/kg, n=3) . (Quantitative Auswertung der Abb. 11 und 12) Abb. 14: Ex vivo MR-Aufnahmen (GE-Sequenz) von Agarose- eingebetteten Lymphknoten des Kaninchens; Dosis - 150 μmol Fe/kg; links: unspezifsche Vergleichspartikel; rechts: spezifische Nanopartikel. Abb. 15: Spezifische Nanopartikel vs unspezifische Ausgangs¬ partikel: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschieden Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i. (150 μmol Fe/kg, n=3). Die Auswertung der Beeinflussung der relativen lymphonodalen Signalintensität (Abb. 8, 9 = SE; Abb. 11, 12 = GE) durch die spezifischen Nanopartikel bzw. die Ausgangspartikel demonstriert die homogenere Signal- reduktion der Lymphknoten durch die modifizierte
Substanz. Die lymphonodale Signalreduktion (GE-Sequenz) in den von subiliacalen, iliakalen und poplitealen Lymphknoten sowie die mittlere Anreicherung über alle Lymphknoten-Gruppen durch die FPl-modifizierten Nanopartikel unterscheidet sich signifikant (gepaarter t- Test, p < 0,05) von den unmodifizierten Vergleichs¬ partikeln (Abb. 13) . Die homogenere interlymphonodale Signalbeeinflussung (Abb. 15) der spezifischen Partikel ist auch deutlich in den MR-tomographischen Aufnahmen der Agarose-eingebetteten Lymphknoten zu erkennen (Abb. 14) ; hier zeigt die Vergleichssubstanz, wie auch bei der Ratte beobachtet, eine starke, aber auf die mesenterialen Lymphknoten beschränkte Signalreduktion.
Anwendungsbeispiel E3
• Dosisabhängigkeit der Lymphknotenanreicherung an der Ratte
Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der Ausgangs- Verbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Targetpolymer) in Abhängigkeit der applizierten Dosis.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2) ; Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel C2 (= D2 ohne Targetpolymer)
Tiere: s. Anwendungsbeispiel El Dosierung : 50 -200 μMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) (n=3 /Dosis)
Zeiten: 24 h p. i. (p_ost injectionem) Methode : MR-Tomographie in SE und GE-Technik (s. Anwendungsbeispiel El)
Ex-vivo-Modell Agarose-Phantom
(s. Anwendungsbeispiel El)
Ergebnis: Abb. 16: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2 vs unspezifische Partikel nach Beispiel C2 : Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Applikation der Partikel. Abb. 17: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2 vs unspezifische Partikel nach Beispiel C2: Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Applikation der Partikel.
In allen Lymphknotengruppen mit Ausnahme der mesen¬ terialen und inguinalen Lympknoten zeigt sich eine signifikant (p< 0,05) bessere Signalreduktion durch die nach Beispiel D2 modifizierte Ausgangsverbindung schon bei halb so hoher Dosierung (200 μmol Fe/kg (C2) vs 100 μmol Fe/kg (D2) ) . Diese deutlichen Unterschiede zeigen sich auch, wenn man die mittlere Signalbeeinflussung über alle Lymphknotenstationen betrachtet (s. Tab 11) .
Tab. 11: Mittlere relative Signalintensitäten und Standardabweichung über alle Lymphknotenstationen in Abhängigkeit d≤r. applizierten Substanz und osis.
Probe Dosis mittlere rel. Signalintensität C2 100 μmol Fe/kg 0,85 ± 0,13
D2 100 μmol Fe/kg 0,45 ± 0,23
C2 200 μmol Fe/kg 0,49 ± 0,17
D2 200 μmol Fe/kg 0,35 ± 0,15
Anwendungsbeispiel E4
• Zeitabhängigkeit der Lymphknotenanreicherung Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der Ausgangsverbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Target- polymer) in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2) ; Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel C2 (= D2 ohne Targetpolymer)
Tiere: Ratte; (s. Anwendungsbeispiel El) Dosierung: 200 μMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) (n=3 /Zeitpunkt)
Zeiten: 4 - 168 h p. i. (yost injectionem) Methode : MR-Tomographie in SE und GE-Technik (s. Anwendungsbeispiel El) Ex-vivo-Modell: Agarose-Phantom
(s. Anwendungsbeispiel El)
Ergebnis:
Abb. 18: Vergleichssubstanz nach Beispiel C2: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen
Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation. Abb. 19: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2 : Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation. Abb. 20: Vergleichssubstanz nach Beispiel C2: Relative
Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.
Abb. 21: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2 : Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen
Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.
Die zeitabhängigen MR-tomographischen Untersuchungen zur lymphonodalen Signalreduktion nach intravenöser
Applikation der Substanzen zeigen deutlich, daß auch zeitabhängig die nicht-spezifische AusgangsSubstanz eine schlechtere Signalreduktion in den Lympknoten verursacht als die spezifische Modifikation nach Beispiel D2.
Anwendungsbeispiel E5
• Kombination mit physiotherapeutischen Maßnahmen am Beispiel Temperatur Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen in Abhängigkeit von der durch ein Wärmebad regulierten peripheren Körpertemperatur.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2) ; Dosierung: 100 μMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) (n=7
/Gruppe) Zeiten: 24 h p. i. (post injectionem) Methode: MR-Tomographie in GE-Technik (s. Anwendungsbeispiel El) Hyperthermie-Modell :
• Applikation von Wärme
Um den Einfluß von Wärme auf die Anreicherung des Kontrastmittels in verschiedenen Lymphknotengruppen zu untersuchen, wurden Ratten für 3 - 4 h in Narkose gelegt, um sie dann für 2 h in ein Wasserbad zu legen. In diesem Wasserbad lagen die Ratten mit der linken Körperseite auf einer Wärmeplatte und mit der rechten Körperseite auf einer gleich hohen isolierenden Kunststoffplatte, die nicht erwärmt wurde. Dadurch entstand eine Temperatur¬ differenz zwischen der Wassertemperatur auf der linken Körperseite und der Wassertemperatur auf der rechten Körperseite. Die Wassertemperatur unter der linken Schulter der Ratten betrug anfangs 41,0 - 41,5°C und nach 30 min pendelte sich die Temperatur auf den konstanten Wert von 41,5 - 42,0 °C ein. Unter der rechten Schulter betrug die Wassertemperatur anfangs 37,0 - 37,5 °C und nach 30 min. wurde die dann konstant bleibende Temperatur von 37,5 - 38,0 °C erreicht. Nachdem die Ratten 30 min. im Wasserbad lagen, bekamen sie die Nanopartikel in einer Dosis von 100 μmol Fe/kg KGW intravenös als Bolus injiziert. Nach weiteren 1,5 h im Wasserbad bei konstanten Temperaturen wurden die Ratten wieder in den Käfig zurückgelegt und 24 h post injektionem die Lymphknoten präpariert und MR-tomographisch untersucht.
Ergebnis:
Abb. 22: Beeinflussung der Lymphknotenanreicherung durch gezielte Applikation von Wärme. In der linken prä- Kontrast Aufnahme sind die poplitealen Lymphknoten nur als helle Flecken zu erahnen. In der rechten Abbildung ist der Einfluß der Wärmebehandlung eindrucksvoll demonstriert. Die linke Seite der narkotiserten Ratte lag auf einer isolierenden Kunststoffplatte und hatte die normale Körper- temperatur während die rechte Seite in einem Wasserbad auf 41,5 - 42,0 °C erwärmt wurde. Die "kalte" Seite zeigt praktisch keine Anreicherung während die erwärmte Seite eine hohe und homogene intralymphonodale Akkumulation der Nanopartikel aufweist. (Nanopartikel nach Beispiel D 2; 100 μMol/kg KGW; 24 h p. i. ; GE 135/15/15)
Die In-vivo-Aufnähme (Abb. 22) demonstriert eindrucksvoll die Effekte der Wärmebehandlung. Während die kalte, nicht erwärmte, linke Seite der Ratte keine erkennbare Anreicherung in den poplitealen Lymphknoten zeigt, hat die erwärmte rechte Seite eine hohe und homogene Signalauslöschung (Anreicherung) in den beobachteten Lnn. popliteales.
Um die Effekte der Erwärmung besonders deutlich zeigen zu können, wurden die Ratten narkotisiert in das Wärmebad gelegt. Die Narkose führt zu einem Stillstand der peripheren Muskelaktivität, einem verminderten Lymphfluß und herabgesetzter Gefäßpermeabilität mit der Folge, daß sich ohne Erwärmung praktisch keine Anreicherung der Nanopartikel nachweisen läßt.
Anwendungsbeispiel E6
• MR-Angiographie
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2)
Tiere: Ratte (s. Anwendungsbeispiel El)
Dosis: 20 μmol Fe / kg i. v.
Zeitpunkt: 0-2 h p. i..
MR-Technik: Gerät: Siemens Magnetom 1,5 T MR Ganzkörpertomograph mit Extremitätenspule
MR-Parameter: Siemens Magnetom 1.5 T, Extremitäten¬ spule, Dynamik (transversal) mit Tl- gewichteter SE Sequenz (TR: 200 ms, TE: 10 ms) , FOV 170 mm, Matrix 256x256, SD: 3 mm; - koronare MIPS von 3D-Flash (TR: 40 (60) ms, TE: 6 ms, FA 60 (40) °) und 3D-FISP-Sequenz (TR: 40 ms, TE: 7 ms, FA 35 °) , FOV 240 mm, Matrix 256x256, SD: 17 mm.
MR-Auswertung: Signalintensitäten in benutzerdefi¬ nierten Regions of Interest von Gefäßen (V. cava) , Leber, Fett und Muskel. Die Signalintensitäten werden standardisiert auf den Hintergrund kalkuliert .
Ergebnisse:
Abb. 23 : Transversale Dynamik-Studie des Rattenabdomens mit einer Tl-gewichteten SE Sequenz (TR: 200 ms, TE: 10 ms) nach Bolus-Injektion der spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 (Dosis 20 μmol Fe/kg) ; deutliches Signal-Enhancement (1 min p.i.) in den intrahepatischen Gefäßen und der V. cava) .
Abb. 24 : Vergleich der relativen Signalintensitäten für SE TR/TE 200ms/l0ms im venösen Gefäß und dem Leber- parenchym für die spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 und die unspezifische Vergleichssubstanz nach Beispiel C2; Dosis 20 μmol Fe/kg,-. Abb. 25: Koronare MIPS (maximum-intensity projections) von SD- Flash-Aufnahmen (TR: 40 ms, TE: 6 ras, FA 60 °) ; Vergleich der spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 (links) mit der Vergleichssubstanz C2 (rechts) -
Dosis jeweils 20 μmol Fe/kg. Die Abbildungen 23 und 25 zeigen deutlich die Vorteile der spezifischeren Nanopartikel (nach Beispiel D2) gegenüber der Ausgangssubstanz nach Beispiel C2. Die graphische Zusammenfassung des zeitlichen Signalverlaufs
(Abb. 24) in der Vena cava bzw. im Leberparenchym demonstriert die überragenden Eigenschaften der spezifischen Nanopartikel für die Anwendung als Kontrastmittel in der MR-Angiographie. Das Enhancement ist dreifach höher als bei der Kontrollsubstanz und der hellmachende Effekt hält lange an und ist sehr konstant
(diagnostisches Fenster > 60 min) .
Anwendungsbeispiel E7
• Visuelle Darstellung von Lymphknoten an der gesunden Ratte und am tumortragenden Kaninchen
Ziel: Nachweis der Eignung der erfindungsgemäßen Nanopartikel für die Verwendung als visuelle Marker¬ substanz in der chirurgischen Medizin.
Substanz Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2) Tiere: Ratte, SPF Han-Wistar; ca. 150 g Russenkaninchen (Chbb: HM, Thomae GmbH) mit implantiertem VX2-Tumor (Tumorbank des Deutschen Krebsforschungszentrums, Heidelberg) ; ca. 2,6 kg. Der Tumor wurde durch Injektion von 3 • 106 lebenden Tumorzellen in die kaudolaterale Oberschenkelmuskulatur implantiert. Die Aufnahme erfolgt 20 Tage nach der Implantation.
Dosierung: Ratte: intravenöse Injektion von 500 μMol Fe/kg Körpergewicht Kaninchen: Interstitielle Applikation von 20 μMol pro Pfote Zeiten: Ratte: 1, 4 und 24 h p. i. Kaninchen: 12 h p. i .
Ergebnisse
Abb. 26: Erfindungsgemäße Nanopartikel als "intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von
Lymphknoten (Übersichtsaufnahme)
Abb. 27: Erfindungsgemäße Nanopartikel als "intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von Lymphknoten (Detailansicht) . Abb. 28: Demonstration von Metastasen in Lymphknoten durch visuelle Detektion in metastatischen Lymphknoten am Kaninchen. Die Metastasen sind als helle Aussparungen im ansonsten homogen dunkel gefärbten Lymphknoten erkennbar. Die Aufnahmen der Ratten (Abb. 26 und 27) zeigen, daß eine Vielzahl unterschiedlichster Lymphknoten- /Lymphknotengruppen durch die einmalige intravenöse Applikation der Lösung der Nanopartikel angefärbt werden kann. Die Lymphknoten heben sich deutlich vom umgebenden Gewebe ab und können so einfach detektiert werden um dann ggf. vom Operateur entfernt zu werden.
Die Untersuchungen am VX2-tumortragenden Kaninchen demonstrieren, daß durch die Anwendung der spezifischen Nanopartikel auch nach interstitieller Applikation die Lymphknoten im Einzugsgebiet homogen angefärbt sind und daß auch kleine Metastasen schon rein visuell als helle Aussparungen im dunkel angefärbten gesunden Lymphknoten¬ gewebe abgrenzbar sind (Abb. 28) .
Anwendungsbeispiel E8 • Zellexperiment zum Nachweis der Spezifität der Nanopartikel
Ziel: Nachweis der spezifischen zellulären Aufnahme
(Rezeptor-vermittelte Endozytose) bei Nanopartikeln mit
Transferrin als Sekundärcoat (Targetpolymer) Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D6)
Vergleich: Grundsubstanz nach Beispiel Cl (D6 ohne Transferrin)
Konzentration: 0,5 mMol Fe/1 Medium
Zeiten: 18 h Inkubation bei 37 °C; 5 % CO2 - 95 % Luft
Zellkultur:
• Zellaufnahme in humane Myeloma-Zellen
Humane Myeloma-Zellen (ATCC CRL 9068; Zellinie NCI H929) werden in einer Konzentration von mindestens 1- 10*> Zellen/ml in RPMI 1640 mit 10 % FCS und 0,05 mMol/1
2-Mercaptoethanol in Kultur genommen (37 °C, 5 % Kohlendioxid; Kulturflaschen 225 cm2. Wenn die Zellen eine Konzentration von ca. 1,5 ■ 106 Zellen/ml erreicht haben, werden die Zellen zentrifugiert und in frischem Medium resuspendiert.
Die Zellen werden mit den Nanopartikeln in einer Konzentration von 0,5 mMol/1 (berechnet als Eisen) für 18 Stunden inkubiert. Die Zellen werden pelletiert, 2 mal mit PBS gewaschen und dann in einem Aliquot die Zellzahl bestimmt (Neubauer-
Zählkammer) . Das Zellpellet wird in 500 μl konz. Salpetersäure/ 100 μl Wasserstoffperoxid durch Erhitzen aufgelöst und auf ein Volumen von 5,0 ml aufgefüllt. Anschließend wird mit Atomemissionsspektroskopie (AES, Nachweisgrenze 0,1 ppm) die Eisenkonzentration bestimmt.
Ergebnisse
Abb. 29: Zellaufnahme von spezifischen Nanopartikeln (mit Transferrin) im Vergleich zur unspezifischen
Kontrolle (Nanopartikel ohne Transferrin) . Die NCI- Zellen (humane Myeloma Zellinie) akkumulieren die spezifischen Partikel mehr als doppelt so stark wie die Kontroll-Partikel.
Die spezifischen Nanopartikel zeigen eine deutlich höhere Aufnahme durch die Myeloma NCI 929 Zellen. Die um über 50 % geringere Aufnahme der Nanopartikel ohne Targetpolymer demonstriert die Vorteile der erfindungsgemäßen Ausgestaltung der spezifischen Nanopartikel.
Anwendungsbeispiel E9 • Atherosklerose- Imaging am Watanabe-Kaninchen (Plaque-
Darstellung)
Ziel: Darstellung von atherosklerotischen Plaques am
Kaninchen mit Nanopartikeln, auf die nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren ein Plaque-af f ines Peptid (Sekundärcoat, Targetpolymer) aufgebracht wurde.
Substanz : Spezifische Nanopartikel (Beispiel D7) Tiere : Watanabe-Kaninchen Dosierung: 200 μMol Fe/kg Körpergewicht (KGW)
Zeiten: 5 h p. i. (p_ost injectionem) MR-Technik Gerät : Siemens Magnetom 1,5 T MR Ganzkörpertomograph mit
Extremitätenspule
MR-Parameter: Field of View (FOV) = 150 mm, Matrix =
256x256; Slice = 3 mm
Schichtorientierung = frontal
Sequenz 1: Protonendichte-betonte Spin-Echo Sequenz (SE) mit TR = 2000 ms und TE = 15 ms
Sequenz 2: T2-gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz
(GE) mit TR = 135 ms und TE = 15 ms; FA = 15°
Ex-vivo-Modell: Agarose-Phantom (s. Anwendungsbei¬ spiel El)
Die Aorta wurde herauspräpariert, vorsichtig aufge¬ schnitten und dann mit kalter PBS-Lösung gespült, um nich -gebundene oder aufgenommene Nanopartikel zu entfernen. Anschließend wurde die Aorta in zwei Teile geteilt und im Agarose-Phantom eingegossen und dann MR- tomographisch untersucht.
Histologie: Berliner-Blau Färbung
Ergebnisse: Abb. 30: Ex vivo MR-tomographische Darstellung atherosklerotischer Plaques der Aorta eines Kaninchens mit der Modifikation D7 (Dosis 200 μmol Fe/kg; Resektion der Aorta 5 h p.i.) ; links Protonendichte-gewichtete Spin-Echo-Sequenz; rechts T2*-gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz .
Abb. 31: Histologischer Eisen-Nachweis in der atherosklero- tischen Membran der Kaninchen-Aorta mit Berliner- Blau-Färbung. Die Gegenüberstellung mit der MR- tomographischen Aufnahme (GE 135/15/15°) zeigt, daß sich das histologiεch nachgewiesene Eisen an den
Stellen befindet, an denen im Image das Signal infolge der Anreicherung der spezifischen Nano¬ partikel deutlich reduziert ist. Resektion der Aorta 5 h nach intravenöser Applikation von 200 μmol Fe/kg der spezifischen Partikel nach Beispiel D7. Abb. 32: Histochemische Detektion (Berliner Blau Färbung) der akkumulierten Nanopartikel nach Beispiel D7 in der Aorta eines Watanabe Kaninchens. Die obere Abbildung zeigt eine Übersicht der präparierten Aorta auf dem Agar und der untere Teil demonstriert die gute Korrelation der Eisenfärbung (blaue Granula) mit den schon visuell erkennbaren Plaques im besonders stark veränderten Aortenbogen.
Die MR-tomographische Aufnahme ("Ex-vivo-Aufnähme" ) der präparierten Aorta zeigt die Plaques als dunkle Flecken (Signalreduktion) . Der histologische Nachweis über die Berliner Blau Färbung (Eisen) zeigt in der Gegenüber¬ stellung mit der MR-tomographischen Aufnahme (GE 135/15/15°) , daß sich das histologisch nachgewiesene Eisen an den Stellen befindet, an denen im Image das Signal infolge der Nanopartikel-Anreicherung deutlich reduziert ist. Die Befundung aus der MR-Aufnähme korreliert mit den schon visuell deutlich erkennbaren Plaques. Die größten Plaques befinden sich im Bereich des Aortenbogens und bestätigt sich in der MR-tomographischen Aufnahme und der histologischen Ansicht; auch kleinere Plaques sind sowohl im MR-Bild als auch mit der histologischen Eisenfärbung gut detektierbar.
Anwendungsbeispiel E10
• Tumoranreicherung an der tumortragenden Maus
Ziel: Es sollte gezeigt werden, daß die erfindungs¬ gemäßen Nanopartikel sich in Tumoren anreichern können. Die Untersuchungen sollen zum einen zeigen, daß die Partikel geeignete Arzneistoffträger für Chemothera- peutika darstellen und zum anderen dokumentieren, daß mit Hilfe der Nanopartikel kontrolliert werden kann, ob die Therapeutika ihren gewünschten Wirkort, also den Tumor, überhaupt erreichen können, so daß hier ein Beispiel für die Kombination von Diagnose und Therapie vorliegt.
Substanz Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2) ; Tiere: Nacktmaus (Swiss nude) mit implantiertem Tumor (n = 5/Dosis)
(LS 174T, s. c. - Applikation 10 Tage vor Versuchsbeginn)
Narkose: Rompun/Ketavet (1:1) , ca. 0.5 ml pro kg Körpergewicht i.m.
Dosierung: 200 μMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) Zeiten: 0 - 120 Minuten und 12 bzw. 24 Stunden nach Applikation.
MR-Methode : Gerät -. Siemens Magnetom 1,5 T MR Ganzkörpertomograph mit Extremitätenspule
MR-Parameter: Field of View (FOV) = 150 mm, Matrix = 256x256; Slice = 3 mm Schichtorientierung = frontal
Sequenz 1: Protonendichte-betonte Spin-Echo-Sequenz (SE) mit TR = 2000 ms und TE = 15 ms Sequenz 2 : Dynamische Aufnahmen: SE-Sequenz mit TR/TE = 300 ms/15 ms MR-Auswertung Signalintensitäten in benutzerdefinierten Regions of Interest von Tumor, Muskel, Fett und Background. Die relativen Signalintensitäten in den verschiedenen Geweben werden standardisiert auf die Signalintensität im Fett kalkuliert. Ergebnisse
Abb. 33 : Transversale Tl-gewichtete Spin-Echo Dynamik-Studie (TR: 300 ms, TE: 15 ms) des tumoralen Signalver¬ haltens nach Bolusinjektion von Nanopartikeln nach Beispiel D2 (200 μmol Fe/kg) . Die Aufnahmen zeigen ein zeitabhängig langsam ansteigendes Signal- Enhancement (Anreicherung) im Tumor mit deutlich zunehmender Abgrenzung der Raumforderung. Abb. 34: Verlauf der relativen Signalintensität (Anreiche- rung) im Tumor. Der zeitliche Signalverlauf
(Enhancement) für eine Dosis von 200 μMol/kg Kgw verdeutlicht das starke und mit der Zeit zunehmende Enhancement (zunehmende Anreicherung) im Tumor (SE 2000/15) . Abb. 35: Zeitabhängige transversale Protonen-Dichte-gewichtete (SE 2000/15) Aufnahmen nach Applikation der . Nanopartikel nach Beispiel D2 (200 μmol Fe/kg) .
In der Tl-gewichteten und in der Protonen-Dichte- gewichteten Spin-Echo-Sequenz ist eine zunehmende
Akkumulation der Nanopartikel im Tumor mit zeitabhängig linear ansteigendem Signalenhancement festzustellen (Abb. 33; 35) . Bis 135 min nach Injektion wird ein 35 - 40 %iges Enhancement beobachtet, was eine deutliche Abgren- zung des Tumors vom gesunden Gewebe erlaubt und die
Anreicherung der Nanopartikel bestätigt. Im Gegensatz zu den hier gemachten Beoabachtungen wurde bei angio- graphischen Untersuchungen festgestellt, daß ein durch die Perfusion verursachtes Enhancement im Tumor schon nach spätestens 30 min (p.i.) wieder vollständig abgeklungen ist .

Claims

Patentansprüche
1. Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Eisen enthaltenden Kern, einem Primärcoat
(Synthesepolymer) und einem Sekundärcoat (Target- polymer) sowie gegebenenfalls pharmazeutischen Hilfsstoffen, Pharmaka und/oder Adsorptionsvermitt¬ lern bestehen.
2. Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der hydrodynamische Durchmesser des Grundbau¬ steins aus Eisen enthaltendem Kern und Primärcoat in Lösung kleiner als 100 nm und höchstens fünfmal so groß wie der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns ist.
3. Nanopartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Eisen enthaltende Kern Magnetit oder Maghämit ist oder mindestens eine dieser Verbindungen enthält.
4. Nanopartikel nach mindestens einem .der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu 25 Gew.-% des im Kern enthaltenen Eisens durch andere Metallionen ersetzt sind.
5. Nanopartikel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Eisen-Metallionen paramagnetisch, diamagnetisch oder eine Mischung para- und diamag¬ netischer Metallionen sind.
6. Nanopatikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Eisen enthaltende Kern einen durch Elektronenmikroskopie bestimmten Durchmesser von kleiner als 30 nm aufweist und mindestens 50 Metallatome enthält sowie eine Partikelgrößenverteilung, wobei mindestens 90 % der Eisen enthaltenden Kerne im Bereich 0, 7-Mittelwert bis 1, 3 -Mittelwert liegen, aufweist.
7. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Synthesepolymer in einer Menge zwischen dem 0,01- fachen und dem 1-fachen der Summe der vorhandenen Metallionen enthalten.
8. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Synthesepolymer eine monomere oder polymere Substanz oder ein Gemisch dieser Substanzen oder Derivate, oder Derivate mit funktionellen Gruppen, oder Derivate, die zusätzlich substituiert worden sind, mit einem Molekulargewicht kleiner 100.000 Da, darstellt .
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Synthese¬ polymer ein Dextranderivat oder eine Mischung von Dextran und/oder Dextranderivaten darstellt .
10. Nanopartikel nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Synthesepolymer eine oder mehrere Säuregruppen im Molekül, oder mehrere funktioneile Gruppen, die N, S, P oder O-Atome enthalten, im Molekül aufweist.
11. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Targetpolymer und das Synthesepolymer gleiche oder unterschiedliche Substanzen oder Substanzgemische darstellen.
12. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Targetpolymer in einer Gewichtsmenge zwischen dem 0,5-fachen bis 50-fachen des Gewichts der vorhandenen Metallionen enthalten.
13. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie Adsorptions- vermittler enthalten, deren Menge kleiner oder gleich der Summe des Gewichtes der enthaltenen Metallionen ist.
14. Nanopartikel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeich¬ net, daß sie als Adsorptionsvermittler Peptide enthalten.
15. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der hydrodyna¬ mische Durchmesser aller Bestandteile höchstens zehnmal größer als der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns und höchstens 20 % größer als der Durchmesser des Grundbausteins ist .
16. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einzelnen Modulen wie Grundbaustein, Targetpolymer, Pharmakon und Adsorptionsvermittler bestehen, die jederzeit kombinierbar sind.
17. Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt ein Eisen enthaltender Kern in Anwesenheit eines Synthesepolymers durch Basen¬ behandlung hergestellt wird, in einem zweiten Schritt das Verhältnis von Eisen zu Synthesepolymer durch ein Desorptionsverfahren verändert wird und in einem dritten Schritt ein Targetpolymer adsorbiert wird und gegebenenfalls Adsorptionsvermittler, pharmazeutische Hilfsstoffe und/oder Pharmaka zugesetzt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Eisen enthaltenden Kerns ein Eisen-II-, Eisen-III-Salz-Gemisch verwendet wird, wobei das Verhältnis von divalentem zu trivalentem Eisen 1:1 bis 1:20 beträgt.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Eisen enthaltenden Kerns ein Eisen-III-Salz-Gemisch in Kombination mit einem Reduktionsmittel verwendet wird, wobei die Menge an Reduktionsmittel so gewählt ist, daß das generierte Eisen-II zu Eisen-III- Verhältnis 1:1 bis 1:20 beträgt.
20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten
Eisenverbindungen beliebige Mischungen aus anorga¬ nischen und organischen Salzen sowie Komplexen davon darstellen.
21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Eisen enthalten¬ den Kristalle durch Mischung der zuvor getrennt hergestellten Eisen-II-hydroxid- und Eisen-III- hydroxid-Lösungen hergestellt werden.
22. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu 25 Gew.-% der eingesetzten Metallionen Nicht-Eisen-Ionen sind.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Eisen-Metallionen paramagnetisch, diamagnetisch oder eine Mischung para- und diamagne¬ tischer Metallionen sind.
24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß als Synthesepolymer Substanzen oder Kombinationen verschiedener Substanzen verwendet werden, welche die während der Ausfällung entstehenden Kristalle voneinander separieren, wobei die Menge an Synthesepolymer im
Reaktionsgemisch, relativ zum Gewicht der enthaltenen Metallionen, 0,5 bis 20-fach höher liegt, aber insgesamt weniger als 50 % (g/v) im Reaktionsgemisch beträgt.
25. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfällung der Eisenverbindungen eine 0,1 bis 10 N Base eingesetzt wird, deren Zugabe schnell erfolgt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfällung der Eisenverbindungen Ammoniak als Gas oder Salz, ein Amin oder ein Aminderivat eingesetzt wird.
27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese des Grundbausteins in einem Temperaturbereich zwischen 0° - 120°C erfolgt.
28. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis
27, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Eisen zu Synthesepolymer auf ein Gewichtsverhältnis von 1:0,01 bis 1:1 eingestellt wird.
29. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis
28, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an zugesetztem Targetpolymer so gewählt ist, daß das Verhältnis der enthaltenen Metallionen zu dem Targetpolymer 1:0,5 bis 1:50 beträgt.
30. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis
29, dadurch gekennzeichnet, daß die Nanopartikel als stabile kolloidale Sole oder lyophilisiert vorliegen und mit medizinisch verwendeten Lösungsmitteln wieder in Lösung gebracht werden können oder daß der Grundbaustein, Targetkomponente und gegebenenfalls Zusätze getrennte Lösungen oder Lyophilisate sind, die erst zu einem bestimmten Zeitpunkt zur Appli- kationslösung zusammengemischt werden.
31. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis
30, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Module der Nanopartikel jederzeit kombinierbar sind.
32. Verwendung der Nanopartikel als Kontrastmittel in der Diagnostik als visuelle Markersubstanz in der chirurgischen Medizin und/oder als. Arzneistoffträger oder Wirkstoff in der Therapie.
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