DE102010023850B4

DE102010023850B4 - Funktionalisierte Nanopartikel mit verbesserter Bioverfügbarkeit

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Publication number: DE102010023850B4
Application number: DE102010023850A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Langguth Peter; Dr. Jahn Markus; Prof. Dr. Tremel Wolfgang; Dr. Shukoor Mohammed Ibrahim
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2010-05-15
Filing date: 2010-05-15
Publication date: 2013-12-19
Anticipated expiration: 2030-05-16
Also published as: DE102010023850A1

Abstract

Nanopartikel, umfassend einen Kern, eine Schutzhülle, die den Kern ummantelt, und mindestens ein Häm- oder Häminmolekül, das kovalent an die Schutzhülle oder den Kern gebunden ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft funktionalisierte Nanopartikel mit verbesserter Bioverfügbarkeit, sowie deren Verwendung als Arzneimittel und als Nahrungsergänzungsmittel.
Eisenmangel ist die häufigste Mangelerkrankung beim Menschen überhaupt, etwa zwei Milliarden Menschen sollen weltweit darunter leiden [1], die meisten davon in Entwicklungsländern.
Obwohl die Therapie des Eisenmangels mit oralen Fe(II)-Salzen weit verbreitet ist, ist die Bioverfügbarkeit von Eisen aus solchen Salzen nachweislich schlecht [2]. Unter Bioverfügbarkeit versteht man dabei die Menge des Eisens, die tatsächlich aus den Fe(II)-Salzen in den Körper aufgenommen und für diesen verfügbar gemacht wird. Nahrungs- und Genussmittelbestandteile, z. B. Phytat in Vollkornprodukten und Getreidekleie, Oxalsäure im Spinat, Phosphat in praktisch allen Lebensmitteln oder Tannine aus Schwarztee und Kaffee können die Bioverfügbarkeit der Fe(II)-Salze weiter erniedrigen, indem sie mit Eisen unlösliche Komplexe bilden [3, 4]. Aber auch Arzneistoffe, wie Tetracycline, Gyrasehemmer, Levodopa, Methyldopa und Antacida vermindern die Bioverfügbarkeit von Eisen aus Fe(II)-Salzen [5]. Die Nebenwirkungen der Fe(II)-Salze als Folge von oxidativem Stress, insbesondere Magen-Darm-Beschwerden, sind hinlänglich bekannt [5, 6].
Um die geringe Verträglichkeit und schlechte Bioverfügbarkeit von Fe(II)-Salzen zu verbessern, wurden verschiedene Ansätze verfolgt. So wurde z. B. mit ferro sanol^® duodenal Kapseln eine Arzneiform mit magensaftresistentem Überzug entwickelt, die Eisen erst im Duodenum freisetzt, wodurch die Magenverträglichkeit verbessert werden soll [7]. Eine vergleichsweise hohe Bioverfügbarkeit zeigte Eisen, das in Form von Häm-Eisen Polypeptid oral gegeben wurde [8] („Häm-Eisen” ist ein Protoporphyrin mit zweiwertigem Eisen und ist dafür verantwortlich, dass Fleisch-Eisen sehr gut aus dem Darm aufgenommen wird).
Eisen(III)-oxid/Eisen(III)-hydroxid-Nanopartikel (FeONP) mit einem Kern aus Eisen(III)-oxid/Eisen(III)-hydroxid und einer Hülle aus Polymer, wie z. B. Eisen(III)-hydroxid Polymaltose Komplex (FeONP_PM) [9, 10], sind eine interessante nebenwirkungsarme Alternative zu Fe(II)-Salzen, da Eisen in einem Eisenhydroxid-Kern relativ sicher verpackt ist, was gewährleistet, dass weniger oxidativer Stress verursacht wird [6]. Im Gegensatz zu gewöhnlichen Fe(H)-Salzen werden FeONP_PM bei gleichzeitiger Einnahme von Nahrung sogar besser absorbiert [11, 12] und Wechselwirkungen von FeONP_PM mit einer großen Bandbreite von Arzneistoffen bleiben aus [13, 14, 15]. In einer erst kürzlich veröffentlichten Meta-Analyse von Studien bei Erwachsenen mit Eisenmangelanämie wurde gezeigt, dass FeONP_PM ähnliche Hämoglobinwerte erzielen wie FeSO₄, aber besser verträglich sind [16].
Trotzdem bleiben Zweifel bezüglich der Bioverfügbarkeit von FeONP_PM. So wurden z. B. gerade einmal 0,81% Eisen der verabreichten ⁵⁹Fe-markierten Dosis Eisen(III)-hydroxid Polymaltose Komplex vom Körper zurückgehalten, verglichen mit 8% Gesamtkörperretention nach Verabreichung einer ⁵⁹Fe-markierten Lösung von Fe(II)-Ascorbat [2] (1).
Es war somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein kostengünstiges, oral zu verabreichendes, effektiv wirksames und sicheres Eisenpräparat oder Nahrungssupplement zur Verfügung zu stellen.
Eisen(III)-oxid/Eisen(III)-hydroxid-Nanopartikel (FeONP) werden neben der Therapie des Eisenmangels auch für andere biomedizinische Anwendungen eingesetzt. So können nach der Aufnahme ins Tumorgewebe Krebszellen durch Hitze zerstört werden (Magnetische Hyperthermie) [17] oder FeONP mit einem Magneten gezielt zum Tumor geführt werden („Tumor Targeting”) [18]. Auch hier besteht hinsichtlich der effektiven Aufnahme der Nanopartikel in die Krebszellen bzw. in das Tumorgewebe noch Verbesserungsbedarf.
Es war somit auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die sich nach parenteraler Verabreichung durch eine verstärkte Aufnahme in Zellen auszeichnen.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden gelöst durch einen Nanopartikel, umfassend
einen Kern,
eine Schutzhülle, die den Kern ummantelt, und
mindestens ein Häm- oder Häminmolekül, das kovalent an die Schutzhülle oder den Kern gebunden ist.
Der erfindungsgemäße Nanopartikel kann dabei einen einzelnen Kern umfassen, der von der Schutzhülle ummantelt ist. Er kann aber auch mehr als einen Kern umfassen, wobei jeder einzelne Kern von einer Schutzhülle ummantelt ist oder alle Kerne von einer gemeinsamen Schutzhülle ummantelt sind.
Umfasst der Nanopartikel mehr als ein Häm- oder Häminmolekül, können diese entweder an den Kern oder die Schutzhülle, oder sowohl an die Schutzhülle als auch an den Kern gebunden sein.
Bei dem Hämmolekül kann es sich dabei um jedes Häm handeln. Häme sind Komplexverbindungen mit einem Eisen(II)-Ion (Fe²⁺) als Zentralatom und einem Prophyrin-Molekül als Ligand. Dazu zählen Häm a, Häm b, Häm c, Häm o, Häm s, Häm d, Häm d₁, Häm-P460, Sirohäm. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Hämmolekül um Häm b.
Bei dem Häminmolekül oder Hämin handelt es sich um ein oxidiertes Häm, also um ein Häm mit einem Eisen(III)-Ion (Fe³⁺) als Zentralatom. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Häminmolekül um Hämin b.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kern Eisen(III)-oxid oder Eisen(III)-hydroxid, oder Gemische davon. In einer Ausführungsform besteht der Kern aus Eisen(III)-oxid oder Eisen(III)-hydroxid, oder Gemischen davon. Eisen(III)-hydroxid wird auch als Eisen(III)-oxidhydrat bezeichnet.
Vorzugsweise wird die Schutzhülle (engl. „shell” oder „coating”) von einer Vielzahl von Molekülen gebildet. Die Anzahl dieser die Schutzhülle bildenden Moleküle hängt dabei u. a. von der Größe des Kerns und der Größe der Moleküle selbst ab. Die Schutzhülle kann vollständig geschlossen sein oder Lücken aufweisen.
Die die Schutzhülle bildenden Moleküle weisen vorzugsweise eine oder mehrere funktionelle Gruppen auf, die die kovalente Bindung an den Kern ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte funktionelle Gruppen sind Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Carbonylgruppen und Carboxylgruppen.
Bevorzugte Moleküle für die Schutzhülle sind Polysaccharide, Oligosaccharide und Monosaccharide, vorzugsweise Polysaccharide. Ein besonders bevorzugtes Molekül für den Aufbau der Schutzhülle ist das Polysaccharid Dextran.
In einer Ausführungsform ist das mindestens eine Häm- oder Häminmolekül direkt (d. h. ohne Verwendung eines Linker-Moleküls) kovalent an die Schutzhülle oder den Kern gebunden.
In einer Ausführungsform weisen die die Schutzhülle bildenden Moleküle vorzugsweise eine oder mehrere der oben genannten funktionellen Gruppen auf, die die kovalente Bindung des mindestens einen Häm- oder Häminmoleküls an die Schutzhülle ermöglichen. Aminogruppen sind dabei besonders bevorzugt.
In einer Ausführungsform weist der Kern eine oder mehrere der oben genannten funktionellen Gruppen auf, die die kovalente Bindung des mindestens einen Häm- oder Häminmoleküls an den Kern ermöglichen. Aminogruppen sind dabei besonders bevorzugt.
In einer Ausführungsform weisen alle oder ein Teil der die Schutzhülle bildenden Moleküle eine Modifikation auf, mit der eine oder mehrere der oben genannten funktionellen Gruppen, bevorzugt Aminogruppen, in das die Schutzhülle bildende Molekül eingeführt wurden.
In einer Ausführungsform erfolgt die kovalente Bindung des mindestens einen Häm- oder Häminmoleküls an die Schutzhülle oder den Kern über ein Linker-Molekül.
Die Linker-Moleküle binden zum einen an die Schutzhülle oder den Kern, zum anderen stellen sie eine oder mehrere der oben genannten funktionellen Gruppen, bevorzugt Aminogruppen, zur Verfügung, die die kovalente Bindung des mindestens einen Häm- oder Häminmoleküls an die Linker-Moleküle, und somit an die Schutzhülle oder den Kern ermöglichen.
Die Bindung der Linker-Moleküle an die Schutzhülle oder den Kern kann dabei über eine oder mehrere der oben genannten funktionellen Gruppen erfolgen, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Die Bindung des Linker-Moleküls an das die Schutzhülle bildende Molekül kann dabei die oben genannte Modifikation darstellen.
Bevorzugte Linker-Moleküle sind Diaminoalkane H₂N[(CH₂)_z]NH₂ und (Di-) Aminohydroxyalkane H₂N[(H)_p(CH)_z(OH)_q]NH₂/HO[(H)_p(CH)_z(OH)_q]NH₂,
mit z = 1–50, bevorzugt 1–40, besonders bevorzugt 1–30, ganz besonders bevorzugt 1–20, q ≥ 1 und
p = z – q.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 4, bevorzugt mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 20 und ganz besonders bevorzugt mindestens 40 Häm- oder Häminmoleküle kovalent an die Schutzhülle oder den Kern gebunden.
In einer Ausführungsform weist der Nanopartikel einen Durchmesser von 1 bis 1000 nm, bevorzugt 10 bis 1000 nm, auf.
In einer Ausführungsform weist der Kern einen Durchmesser von 1 bis 20 nm, bevorzugt 1 bis 15 nm, besonders bevorzugt 1 bis 10 nm, auf.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Nanopartikel mit wenigstens einem Wirkstoff beladen. Der Wirkstoff kann z. B. über die Schutzhülle an den Nanopartikel gekoppelt oder adsorbiert werden. Außerdem kann der Wirkstoff im Kern enthalten sein.
Der Begriff „Wirkstoff”, wie hierin verwendet, bezieht sich vorzugsweise auf eine therapeutisch wirksame Substanz, wie etwa Zytostatika. Insbesondere erstreckt sich der Begriff auch auf alle schlecht bioverfügbaren therapeutisch wirksamen Substanzen, da deren Aufnahme im Darm mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nanopartikel gesteigert werden kann. Der Begriff kann sich aber auch auf Substanzen oder Agenzien beziehen, die die selektive Ansteuerung („Targeting”) bestimmter Zellkompartimente, Zellen, Zellgewebe oder Organe ermöglichen (z. B. Signalpeptide etc.). Es ist auch eine Kombination der oben genannten Substanzen möglich.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden auch gelöst durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Nanopartikels als Arzneimittel.
Die Nanopartikel können dabei sowohl oral als auch parenteral verabreicht werden.
Ferner werden die Aufgaben der vorliegenden Erfindung gelöst durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Nanopartikels als Nahrungsergänzungsmittel.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden auch gelöst durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Nanopartikels für die Behandlung von Eisenmangel in einem Patienten. Vorzugsweise werden die Nanopartikel hierbei oral verabreicht (= orale Eisensubstitution).
Es wird vermutet, dass Eisen aus Eisen(III)-Oxid/Eisen(III)-hydroxid-Nanopartikeln (FeONP) mit einem Kerndurchmesser kleiner 10 nm besser bioverfügbar ist als Eisen aus FeONP mit größerem Kerndurchmesser, da die Kerne nach Aufnahme in die Enterozyten in diesen lysosomatisch abgebaut werden. Wenn die Enterozyten nach 3–5 Tagen erneuert werden (Enterozyten-Turnover) könnte bei zu großen Kernen der Abbau unvollständig sein und die FeONP werden in den Enterozyten über den Darm ausgeschieden.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden auch gelöst durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Nanopartikels für die Behandlung von Krebs in einem Patienten.
Dabei können die Nanopartikel mit einem Magneten gezielt zum Tumor geführt werden („Tumor Targeting” oder „Magnetotargeting”). Die Krebszellen können dann nach Aufnahme der Nanopartikel in die Krebszellen durch Hitze („Hyperthermie”) oder durch einen an die Nanopartikel gekoppelten Wirkstoff (z. B. Zytostatika) zerstört oder in ihrem Wachstum gehemmt werden. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel, die zusätzlich mit einem Wirkstoff beladen sein können, zeichnen sich dabei durch ihre verstärkte Aufnahme in die Zellen aus. Vorzugsweise werden die Nanopartikel parenteral verabreicht.
Vorzugsweise hat der Kern des Nanopartikels, bevorzugt ein FeONP, für die Hyperthermie und das Magnetotargeting in der Krebstherapie einen Durchmesser von 2 bis 20 nm und ist vorzugsweise superparamagnetisch. Beim Magnetotargeting ist der Durchmesser des Nanopartikels vorzugsweise mindestens 100 nm. Dabei ist eine Zusammenlagerung mehrerer kleinerer Kerne möglich und bevorzugt. Da die Kraft, die auf die magnetischen Partikel im Feldgradienten einwirkt, proportional zum Partikelvolumen ist, lassen sich größere Partikel leichter „lenken” als kleinere. Beim passiven Targeting von Tumorgewebe mit Zytostatika beladenen Nanopartikeln, vorzugsweise FeONP, ist ein Durchmesser des Nanopartikels von 10 bis 1000 nm bevorzugt.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls gelöst durch die Verwendung von Häm- oder Häminmolekülen zur Funktionalisierung von Nanopartikeln, vorzugsweise Eisen(III)-Oxid/Eisen(III)-hydroxid-Nanopartikeln (FeONP).
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden zudem gelöst durch einen Nanopartikel, umfassend
einen Kern, der Eisen(III)-oxid oder Eisen(III)-hydroxid oder Gemische davon umfasst, und
eine negative geladene Schutzhülle, die den Kern ummantelt,
zur Verwendung bei der oralen Eisensubstitution oder zur Verwendung für die Behandlung von Krebs in einem Patienten, wie oben beschrieben.
In einer Ausführungsform besteht der Kern aus Eisen(III)-oxid oder Eisen(III)-hydroxid oder Gemischen davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die negative geladene Schutzhülle Polyacrylsäure. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die negative geladene Schutzhülle aus Polyacrylsäure.
Der Begriff „negativ geladene Schutzhülle”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Schutzhülle, die unter physiologischen Bedingungen (~pH 7) eine oder mehrere negative Ladungen trägt. Zum Beispiel liegt Polyacrylsäure im sauren pH-Bereich (Magen) in ungeladener, im alkalischen und neutralen pH-Bereich (Darm) in negativ geladener Form vor.
In einer Ausführungsform weist der Nanopartikel einen Durchmesser von 10 bis 1000 nm, bevorzugt 10 bis 500 nm, besonders bevorzugt 10 bis 250 nm, ganz besonders bevorzugt 10 bis 150 nm, auf. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Nanopartikel einen Durchmesser von 40 bis 140 nm, bevorzugt 40 bis 120 nm, besonders bevorzugt 50 bis 120 nm, ganz besonders bevorzugt 60 bis 120 nm.
In einer Ausführungsform weist der Kern einen Durchmesser von 1 bis 20 nm, bevorzugt 1 bis 15 nm, besonders bevorzugt 1 bis 10 nm, ganz besonders bevorzugt 1 bis 8.5 nm, auf.
In einer Ausführungsform hat der Nanopartikel einen Durchmesser von 60 bis 90 nm und der Kern einen Durchmesser von 1 bis 8.5 nm.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem im Zusammenhang mit den oben beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung definierte Durchmesser des Nanopartikels um dessen hydrodynamischen Durchmesser, der bevorzugt mittels dynamischer Lichtstreuung ermittelt wird. Vorzugsweise wird der oben definierte Durchmesser des Kerns mittels TEM bestimmt.
Der Begriff „funktionalisierter Nanopartikel”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Nanopartikel, welcher einen Kern und eine Schutzhülle, die den Kern ummantelt, umfasst, wobei die Schutzhülle durch kovalente Bindung von Molekülen, vorzugsweise Häm- oder Häminmolekülen, funktionalisiert wurde oder negativ geladen ist.
Der Begriff „Bioverfügbarkeit”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Anteil des Stoffes (also z. B. des Eisens aus den FeONP oder des Wirkstoffs, vorzugsweise der therapeutischen Substanz, mit dem/der die Nanopartikel beladen sein können), der unverändert im systemischen Kreislauf zur Verfügung steht. Er gibt an, in welchem Umfang der Stoff resorbiert/absorbiert oder durch ein aktives Transportsystem aufgenommen wird (d. h. in den Körper aufgenommen wird) und am Wirkungsort zur Verfügung steht (d. h. dem Körper verfügbar gemacht wird).
Die Erfinder haben im Rahmen von Toxizitätsuntersuchungen von FeONP beobachtet, dass unterschiedliche Funktionalitäten der Hülle einen Einfluss auf die Aufnahme der Nanopartikel in Zellen haben. Insbesondere konnte beobachtet werden, dass Eisen nach Inkubation mit FeONP mit kovalent gebundenem Hämin (oxidiertes Häm mit dreiwertigem Eisen) bis zu 10 mal mehr in Enterozyten in Kultur aufgenommen wird als nach Inkubation mit vergleichbaren FeONP ohne kovalent gebundenem Hämin. Dabei steigt die Aufnahme mit zunehmendem Hämin-Besetzungsgrad und sinkt bei zunehmender freier Hämin-Konzentration. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel ermöglichen somit eine verbesserte intestinale Eisenaufnahme in der Therapie des Eisenmangels und bei der Nahrungssupplementierung.
Außerdem ermöglichen sie eine effektive Aufnahme in Tumorgewebe nach parenteraler Verabreichung. Vorteilhaft ist zudem das Phänomen der passiven Anreicherung von Nanopartikeln in Tumorgeweben, welches als EPR-Effekt (engl. „enhanced permeability and retention” = „erhöhte Permeabilität und Retention”) bezeichnet wird: Das Eindringen der Partikel in das Tumorgewebe ist wegen der Gefäßneubildung und der Fenestrierung der Kapillargefäße im Tumor erhöht („enhanced permeation”) und der Abtransport der eindiffundierten Partikel ist wegen der mangelhaften Funktion des Lymphatischen Systems erschwert („retention”).
Bei Anwendung an Patienten mit Eisenmangel liegt der Vorteil von Häm-/Hämingekoppelten FeONP in einer höheren Wirksamkeit, d. h. Bioverfügbarkeit, bei gleichzeitig geringerer Nebenwirkung. Nanopartikel, deren Hülle mit Häm/Hämin funktionalisiert ist, können nicht nur als Träger für Eisen dienen, sondern auch als Träger für an der Hülle adsorbierte Arzneistoffe oder im Kern befindliche Arzneistoffe (z. B. Proteine).
Außerdem haben die Erfinder herausgefunden, dass Nanopartikel, mit einem Kern, der Eisen(III)-oxid oder Eisen(III)-hydroxid oder Gemische davon enthält und von einer negativen Schutzhülle, vorzugsweise aus Polyacrylsäure, ummantelt ist, ebenfalls hervorragend für die Verwendung bei der oralen Eisensubstitution geeignet sind. Die Aufnahmeeffizienz dieser Nanopartikel hängt dabei stark von ihrer Größe bzw. ihrem (hydrodynamischen) Durchmesser ab.
FIGUREN
1 zeigt die Eisenabsorption aus Fe(II)-Handelspräparaten und aus Fe(III)-hydroxid Polymaltose (FeONP_PM) bei gesunden Personen mit normalen Eisenreserven. Gemessen wurde die Gesamtkörperretention des absorbierten ⁵⁹Fe 14–21 Tage nach Nüchternverabfolgung einer Menge von 80–105 mg Fe (Werte aus Heinrich [2]).
2 zeigt einen Vergleich der Aufnahme von FeONP und FeSO₄ in Caco-2 Zellen. Eisenkonzentration: 200 μg Fe ml^–1, 12 h Inkubationszeit. Daten repräsentieren den MW ± STABW, n = 3. Die Aufnahme von FeSO₄ ist Folge einer erhöhten Toxizität, die Säule ist daher grau dargestellt. * Eisen fällt als Niederschlag aus. Abkürzungen: siehe Tabelle 1.
3 zeigt TEM-Aufnahmen von Caco-2 Zellen nach Inkubation mit FeONP_PM (A, FeONP mit hydrophiler neutraler Hülle), FeONP_PAA 100 nm (B, FeONP mit negativ geladener Hülle) und FeONP_Hämin2 (C). Inkubationsbedingungen: 100 μg Fe/ml, 12 h Inkubationszeit, pH 6,5. Abkürzungen: siehe Tabelle 1.
4 zeigt die Aufnahme (Uptake) von FeONP_DEX_Hämin in Caco-2 Zellen. A: Aufnahme in Abhängigkeit des Substitutionsgrades von FeONP_DEX_Hämin. FeONP: 200 μg Fe ml^–1, 12 h, pH 6,5. B: Kompetitive Hemmung der Eisenaufnahme über FeONP_DEX_Hämin2 durch eine steigende Konzentrationen an Hämin. FeONP: 200 μg Fe ml^–1, 12 h Inkubationszeit, pH 6,5. Daten repräsentieren den MW ± STABW, n = 3. Abkürzungen: siehe Tabelle 1.
5 zeigt den Reaktionsweg für die Synthese von FeONP_DEX_Hämin. Der schwarze Kreis stellt den Eisenhydroxid-Kern der FeONP dar. NBS: N-Bromsuccinimid; DCC: Dicyclohexylcarbodiimid.
Die Erfindung soll im Folgenden anhand von Beispielen beschrieben werden, ohne sie jedoch auf diese Beispiele zu begrenzen.
BEISPIELE 1. Materialien
Siehe Tabelle 1.
Tabelle 1
2. Methoden
2.1 Synthese von FeONP_DEX_Hämin
Die Synthese wurde in Anlehnung an Choi et al. [19] durchgeführt und ist in 5 dargestellt. Bei der Umsetzung von FeONP_DEX mit Hämin wurde FeONP_DEX_Hämin1 bzw. FeONP_DEX_Hämin2 erhalten, wobei letzteres höher substituiert ist. Zur Synthese wurde das Chloridsalz von Hämin verwendet. Alle Reaktionsschritte erfolgten bei Raumtemperatur.
Synthese Amin-terminierter FeONP_DEX
Mit Natriumperjodat (15 mM, 5 ml) wurden Hydroxylgruppen in FeONP_DEX (50 mg Fe ml^–1, 1 ml) nach einer Stunde Rühren zu Aldehydgruppen oxidiert. Anschließend wurde die Lösung gegen Natriumhydrogencarbonat-Puffer dialysiert (mw-cutoff 3000, 12 h). Die Aldehyde wurden mit 1,6-Diamindecahexan (0.2 mol/L, 5 ml) bei 12-ständigem Rühren zur Schiffschen Base umgesetzt, und mit Natriumborhydrid (0,07 g/10 ml Wasser-Methanol-Mischung) unter weiterem 12 h-ständigen Rühren zum Amin reduziert. Abschließend wurde erneut gegen Natriumhydrogencarbonat-Puffer dialysiert (mw-cutoff 3000, 2 × 12 h).
Reaktion vom Hämin mit Amin-terminiertem FeONP_DEX
Die Carboxylgruppen von Hämin wurden mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviert. Hierzu wurden N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und NHS zur Lösung von Hämin in DMSO/Triethylamin (TEA) gegeben und für 24 h unter Ausschluss von Licht umgesetzt (Mengen sind in Tabelle 2 angegeben). Nach Entfernung des Nebenproduktes N,N'-Dicyclohexylharnstoff durch Filtration oder Zentrifugation wurde gebildetes NHS-Hämin mit den Amin-terminierten FeONP_DEX in DMSO (1 ml, 3 h) umgesetzt, um eine kovalente Amidbindung zwischen Nanopartikel und aktiviertem Liganden zu knüpfen. Abschließend wurde die Reaktionsmischung gegen PBS dialysiert (mw-cutoff 3000, 2 × 12 h) und mehrmals ultrazentrifugiert (mw-cutoff 3000, 11000 g, 30 min, Aufnahme des Filterkuchens in PBS) bis im Filtrat kein Hämin mehr nachweisbar war (UV/VIS-Spektroskopie, siehe unten).

Produkt Ligand [mg] DCC [mg] NHS [mg] TEA [μl] DMSO [ml]

FeONP_DEX_Hämin1 FeONP_DEX_Hämin2 Hämin 20 100 10 50 5 25 80 400 5 8

Tabelle 2: Mengen der beteiligten Reaktionspartner von 1 ml FeONP_DEX (50 mg Fe ml^–1) bei der Synthese von FeONP_DEX_Hämin.
2.2 Strukturuntersuchungen
Die Bindungsbildung einer Amidbindung (Hämin-Carboxylgruppe + Dextran/Linker-Amingruppe). Die Aldehydgruppe wurde FTIR-spektroskopisch nachgewiesen und die Anzahl substituierter Häminmoleküle pro Kern wurde UV-spektroskopisch untersucht. Der hydrodynamische Durchmesser wurde mit dynamischer Lichtstreuung bestimmt (0,4 mg Fe ml^–1 in Wasser) und ist in Tabelle 1 als Gesamt-∅ bezeichnet. Die Größe des Eisen(III)-oxid/Eisen(III)-hydroxid-Kerns wurde mit TEM bestimmt (1 mg Fe ml^–1, Wasser) und ist in Tabelle 1 als Kern-∅ bezeichnet.
2.2.1 Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie-(FTIR-)Spektroskopie: Kontrolle der Knüpfung der Amidbindung nach Kopplung von FeONP_DEX an Hämin
2,5 mg der gefriergetrockneten Lösungen von FeONP_DEX und FeONP_DEX_Hämin2 (–56°C, 600 mbar, 36 h; Alpha 1–4, Christ, Osterode) wurden mit 250 mg getrocknetem KBr verpresst und FTIR-spektroskopisch untersucht (Impact 400/Omnic 1.2 Software, Nicolet, Großbritannien).
2.2.2 UV/VIS-Spektroskopie: Substitutionsgrades von Hämin in FeONP_DEX_Hämin
Es wurden UV-VIS-Spektren von Hämin (0,01 M in NaOH 0,1 M) [20] sowie von FeONP_DEX, dem niedrig substituierten FeONP_DEX_Hämin1 und dem höher substituierten FeONP_DEX_Hämin2 (10 μg Fe ml^–1 in NaOH 0,1 M) aufgenommen (Lambda 20, Perkin Elmer, Überlingen). Um den Substitutionsgrad zu bestimmen, wurde mit Hämin (0–0,2 mM in NaOH 0,1 M) eine Kalibrierkurve bei 383 nm erstellt und die Stoffmengenkonzentration von Hämin im Produkt bestimmt. Unter der Annahme, dass eine kolloidale Lösung FeONP_DEX mit der Eisenkonzentration von 10 μg Fe ml^–1 einer Nanopartikel-Stoffmengenkonzentration von 0,379 μM entspricht, wurde die Ligandenanzahl/Nanopartikel abgeschätzt. Für FeONP_DEX_Hämin1 betrug diese 4 Häminmoleküle pro Eisenoxidkern, für FeONP_DEX_Hämin2 betrug sie 48 Häminmoleküle pro Eisenoxidkern (Tabelle 1).
Dabei wurde die Nanopartikel-Stoffmengenkonzentration wie folgt berechnet:
Laut deutscher Fachinformation [21] sind in 1 ml unverdünnter Lösung CosmoFer^® 312,5 mg FeONP_DEX-Komplex enthalten, laut US-amerikanischer Fachinformation [22] hat der FeONP_DEX-Komplex ein Molekulargewicht von 165000 g mol^–1. Hieraus ergibt sich ein Stoffmengenanteil FeONP_DEX-Komplex von 312 mg ml^–1/165000 g mol^–1 = 1,89 mmol l^–1. Bei Verdünnung von ComoFer^® von 50 mg _Fe ml^–1 auf 10 μg _Fe ml^–1 nimmt die Stoffmengenkonzentration des FeONP_DEX-Komplexes auf 1,89 mmol l^–1 _{FeONP_DEX-Komplex} x 10 μg _Fe ml^–1/50 mg _Fe ml^–1 = 0,379 μmol l^–1 ab.
2.2.3 Dynamische Lichtstreuung (DLS): Hydrodynamischer Durchmesser des Gesamtpartikels
Die DLS-Proben wurden in einer Konzentration von 0,4 mg Fe ml^–1 in Rückstreuung bei 170° über einen Zeitraum von 5 Minuten gemessen (Nanovel ProspecD Prototyp, Helium-Neon-Laser, 632,8 nm, 5 mW). Die Korrelation erfolgte multiexponentiell.
2.2.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM): Durchmesser des FeONP-Kerns
Zur Herstellung der TEM-Proben wurde die wässrige Lösung der FeONP (1 mg Fe ml^–1, sterilfiltriertes Aqua demineralisata) auf ein hydrophilisiertes Kupfernetzchen getropft oder aufgesprüht. Anschließend trockneten die Kupfernetzchen für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur. Es wurden jeweils 50 Kerne ausgemessen, wobei der geometrische Durchmesser d gemäß
bestimmt wurde (d_s = kürzeste Dimension, d_l = längste Dimension). Im Folgenden wird der „geometrische Durchmesser” kurz Durchmesser genannt.
2.3 Zellversuche
Sämtliche Zellversuche wurden mit einem Caco-2 Zellmonolayer durchgeführt, der in DMEM Komplettmedium 20 bis 21 Tage gewachsen war.
2.3.1 Colorimetrischer Eisennachweis: Quantitative Aufnahme von FeONP in Caco-2 Zellen
Nach Inkubation bei 4°C und bei 37°C (200 μg Fe ml^–1, HBSS + MES[10 mM] pH 6,5, 12 h) wurden FeONP-Kerne, die sich nach Waschen an oder in den Zellen befinden, durch KMnO₄ in verdünnter Salzsäure und Hitze aufgelöst und colorimetrisch [23, 24] erfasst. Mit Subtraktion des adsorbierten Eisens bei 4°C von der Summe aus adsorbiertem und in die Zelle aufgenommenem Eisen bei 37°C wurde der Uptake in die Caco-2 Zellen bestimmt.
2.3.2 TEM: Qualitative Aufnahme von FeONP
Der Versuch wurde mit einem Caco-2 Zellmonolayer durchgeführt, die auf Polycarbonat Membranen (Poren-∅ 0,4 μm, Membran-∅ 12 mm) 21 Tage gewachsen waren. Die Fixierung der Zellen wurde in Anlehnung an Glube et al. [25] durchgeführt.
Inkubation: 100 μg Fe ml^–1, HBSS + MES[10 mM] pH 6,5, 12 h bei 37°C, Shaker (90 U/min).
2.3.3 MTT-Test: Toxizität
Als Vorlage diente ein Protokoll des National Cancer Instituts, USA [26].
Inkubation: 200 μg Fe ml^–1, HBSS + MES[10 mM] pH 6,5, 12 h bei 37°C.
3. Ergebnisse
Es konnte beobachtet werden, dass Eisen nach Inkubation FeONP mit negativ geladener Hülle bis zu 44 mal besser (FeONP_PAA 100 nm, FeONP_Polyacrylsäure_100 nm) in Enterozyten in Kultur aufgenommen wird als nach Inkubation mit Nanopartikeln mit neutraler, hydrophiler Hülle, wie etwa FeONP_PM (2). Es konnte außerdem gezeigt werden, dass neben der Ladung der Hülle die Größe derselben eine wichtige Rolle bei der Eisenaufnahme spielt (Aufnahme von FeONP_PAA 100 nm größer als die von FeONP_PAA 200 nm bzw. FeONP_PAA 50 nm, 2). Die vergleichsweise hohe Aufnahme von FeONP mit negativ geladener Hülle konnte durch TEM-Aufnahmen bestätigt werden (3). Bei FeONP_PM (3A) ist hier weder eine Adsorption noch eine Aufnahme zu erkennen. Bei FeONP_PAA 100 nm (3B) sind viele Eisenhydroxid-Kerne in Lysosomen zu sehen und es findet eine massive Aufnahme in die Zellen statt (Pfeile). FeONP_Hämin2 werden durch endozytotische Einstülpungen der Zellmembran in die Zelle aufgenommen (3C, Pfeile).
Es konnte ferner beobachtet werden, dass Eisen nach Inkubation mit FeONP mit kovalent gebundenem/konjugiertem Hämin (oxidiertes Häm mit dreiwertigem Eisen) bis zu 10 mal mehr in Enterozyten in Kultur aufgenommen wird als nach Inkubation mit vergleichbaren FeONP ohne kovalent gebundenem/konjugiertem Hämin. Dabei steigt die Aufnahme mit zunehmendem Hämin-Besetzungsgrad (4A) und sinkt bei zunehmender freier Hämin-Konzentration (4B), was auf eine aktive und kompetitive Aufnahme über ein (Rezeptor-vermitteltes) Häm-Transportsystem hinweist.

Die erhöhte Aufnahme von FeONP mit negativ geladener Hülle und Hämin-gekoppeltem FeONP war nicht Folge einer erhöhten Toxizität, wie es z. B. für FeSO₄ im MTT-Test gezeigt wurde (Tabelle 3). Hierbei wies FeSO₄ eine Toxizität von 45,2%, alle getesteten FeONP eine Toxizität < 20% auf.

FeONP bzw. FeSO₄	Toxizität [%]
FeONP_PM FeONP_DEX FeONP_GLU FeONP_SAC FeONP_DEX_COOH FeONP_PAA 50 nm FeONP_PAA 50 nm FeONP_PAA 100 nm FeONP_PAA 200 nm FeSO₄	–34,0 ± 7,2 –15,0 ± 10,4 –8,9 ± 4,9 –37,0 ± 12,2 2,1 ± 4,3 19,5 ± 12,2 8,1 ± 6,0 8,2 ± 6,9 –43,2 ± 4,1 45,2 ± 2,7

Tabelle 3: Zelltoxizität von FeONP und Salzen im MTT-Test, Caco-2 Zellen. Eisenkonzentration: 200 μg Fe ml^–1, 12 h Inkubationszeit, pH 6,5. Daten repräsentieren den MW ± STABW, n = 3. Abkürzungen: siehe Tabelle 1.

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Claims

Nanopartikel, umfassend einen Kern, eine Schutzhülle, die den Kern ummantelt, und mindestens ein Häm- oder Häminmolekül, das kovalent an die Schutzhülle oder den Kern gebunden ist.
Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei der Kern Eisen(III)-oxid oder Eisen(III)-hydroxid oder Gemische davon umfasst.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die kovalente Bindung des mindestens einen Häm- oder Häminmoleküls an die Schutzhülle oder den Kern über ein Linker-Molekül erfolgt.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens 4, bevorzugt mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 20 und ganz besonders bevorzugt mindestens 40 Häm- oder Häminmoleküle kovalent an die Schutzhülle oder den Kern gebunden sind.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Nanopartikel einen Durchmesser von 1 bis 1000 nm aufweist.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Nanopartikel mit wenigstens einem Wirkstoff beladen ist.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Arzneimittel.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zur Verwendung für die Behandlung von Eisenmangel in einem Patienten.
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung für die Behandlung von Krebs in einem Patienten.
Verwendung von Häm- oder Häminmolekülen zur Funktionalisierung von Nanopartikeln.
Nanopartikel, umfassend einen Kern, der Eisen(III)-oxid oder Eisen(III)-hydroxid oder Gemische davon umfasst, und eine negativ geladene Schutzhülle, die den Kern ummantelt, zur Verwendung bei der oralen Eisensubstitution oder zur Verwendung für die Behandlung von Krebs in einem Patienten.
Nanopartikel nach Anspruch 12, wobei die Schutzhülle Polyacrylsäure umfasst.