NO314785B1 - Jernholdige nanopartikler med dobbelt belegning og deres anvendelse i diagnostikk og terapi - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører modulært oppbygde, jernholdige nanopartikler, deres fremstilling og anvendelse i diagnostikken og terapien.

Substanser som allerede ved lavere feltstyrke er maksimalt magnetisert (høy metningsmagnetisering), men etter utkoblingen av det ytre magnetfelt ikke viser noen restmagneti-sering (remanens), da den termiske energi av en permanent oppretting motvirker de spontant magnetiserte Weisske områder, kalles superparamagnetiske. Jernholdige krystaller som utvikles som parenterale MR-kontrastmidler, faller inn i denne kategori. En karakteristisk egenskap hos disse substanser som MR-kontrastmidler er den sterke innflytelse av protonrelaksasjonstidene og dermed den høye styrke som kontrastmidler i denne diagnostiske metode. I den medisinske diagnostikk ble hittil hovedsakelig jernoksider med "magnetittaktig" krystallstruktur undersøkt som superparamagnetiske kontrastmidler, hvilke jernoksider foreligger f.eks. i magnetitt eller maghemitt (spinell, invers spinell).

De superparamagnetiske jernoksider som skal anvendes som MR-kontrastmidler, oppviser sammenlignbare egenskaper således at de viser en sterk innflytelse på protonrelaksa-sjonen i sine nærmeste omgivelser (høy relaksivitet), og at det dreier seg om partikler med "magnetittaktig" krystallstruktur .

Det er beskrevet tallrike fremgangsmåter for å fremstille jernholdige krystaller (jernoksider) med superparamagnetiske egenskaper.

De forskjellige fremgangsmåter kan inndeles i forskjellige synspunkter. Fremstillingen av de superparamagnetiske, jernholdige krystaller atskiller seg ved to prinsipielle fremgangsmåter, nemlig sintermetoden med høy temperatur og påfølgende mekanisk finfordeling og våtkjemisk syntese i løsning. For medisinsk anvendelse ble det hittil bare undersøkt partikler som var fremstilt på våtkjemisk måte, mens sintermetoden for fremstilling av jernoksider for tekniske (tonebærere, fargepigmenter og tonere) og biotek-niske anvendelser, så som f.eks. magnetseparasjonsteknikk, ble beskrevet [Schostek, S., Beer, A., DE 3 729 697 Al; Borelli, N.F., Luderer A.A., Panzarino, J.N., US 4 323 056; Osamu, I., Takeshi, H., Toshihkiro, M. et al., JP 60 260 463 A2]. Den våtkjemiske fremstilling kan inndeles ytterligere. Ved "tokarsyntesen" skjer først fremstillingen av de jernholdige kjerner (jernoksid) og deretter tilsetning av en stabilisator for å sikre fysikalsk-galenisk kvalitet. En variant av "tokarsyntesen" er fremstillingen av jernkjernen i ioneutbyttere. Ved "ettkarsynte-sen" skjer fremstillingen av jernoksidene i nærvær av stabilisatoren som omhyller kjernene allerede under fellingen av jernsaltene og således forhindrer aggregasjon og sedimentasjon av partiklene.

I tillegg til å inndele etter framstillingsprosessen i "ettkar"- og "tokarsyntese" kan man også inndele etter det anvendte løsningsmiddels art i vandige [Hasegawa, M., Hokukoku, S., US 4 101 435; Fuji Rebio, K.K., JP 59 195 161] og ikke-vandige metoder [Porath, J., Mats, L., EP 179 039 A2; Shigeo, A., Mikio, K., Toshikatzu M., J. Mater. Chem. 2(3), 277-280, 1992; Norio, H., Saturo, O., JP 05 026 879 A2].

Partikler som ble fremstilt ifølge en "tokarmetode" i ikke-vandige løsningsmidler, anvendes overveiende på tekniske områder. Magnetiske jernoksider som skal anvendes som kontrastmidler i humandiagnostikken, fordrer av medisinsk- toksikologiske grunner et vandig dispersjonsmedium. En særstilling inntar ved denne inndeling partikler som riktignok fremstilles i et ikke-vandig løsningsmiddel, men som imidlertid lar seg stabilt dispergere i et vandig medium etter fremstillingen. Sådanne partikler anvendes generelt i ex vivo-diagnostikk, f.eks. i magnetisk separa-sjonsteknikk [Chagnon, M.S., Groman, E.V., Josephson, L. et al., US 4 554 088], men de ble også foreslått for in vivo-diagnostikk [Pilgrimm, H.; US 5 160 725].

Partikler som ble fremstilt ifølge "tokarmetoden", ble hovedsakelig anvendt ved de tidlige eksperimentelle under-søkelser inntil midten av 80-årene, mens det for tiden bare beskrives undersøkelser med jernoksider som er fremstilt ifølge en "ettkarsyntese". "Ettkarmetoden" for fremstilling av de superparamagnetiske, jernholdige oksider for anvendelse i humandiagnostikken har gjort seg gjel-dende, da partiklene er overlegne i forhold til "tokarmetoden" vedrørende fysikalsk-kjemisk kvalitet og farmasøy-tisk-galenisk stabilitet.

Også de farmasøytisk mer stabile suspensjoner/løsninger av partikler som ble fremstilt ifølge "ettkarmetoden" i vandige medier, kan ytterligere inndeles i jernoksider av forskjellige størrelser. For partiklene i mikrometerom-rådet ble det foreslått bioteknisk anvendelse [Schroder, U., Mosbach, K., WO 83/01738, eller Schrdder, U., WO 83/03426] eller også allerede krevet in vivo-anvendelse i diagnostikken eller terapien [Widder, K.J., Senyei A.E., US 4 247 406, eller Jacobsen, T., Klaveness, J., WO 85/04330]. For medisinsk-diagnostiske anvendelser beskrives likevel for tiden bare partiklene i nanometerområdet. Også nanometerområdet kan inndeles alt etter den foretrukne anvendelse i "store" (ca. > 50 nm totaltverrsnitt) og "små" (ca. < 50 nm totaltverrsnitt) partikler. Det hovedsakelige anvendelsesområdet for de store nanometer-partikler er i dag anvendelsen i MR-diagnostikken av lever og milt, da partikler av denne størrelsesorden opptas raskt og nesten fullstendig av mikrofagene i disse organer [Kresse, M., Pfefferer, D., Lawaczeck, R., EP 516 252 A2, eller Groman, E.v., Josephson, L., US 4 770 183]. Dessuten er det blitt foreslått å anvende dem som forsterkersub-stansen i den kliniske hypertermi [Hasegawa, M., Hirose, K., Hokukoku, S. et al., WO 92/22586 Al og Gordon, R.T., US 4 731 239].

Ved nesten alle partikler som for tiden er foreslått for medisinske anvendelser, dreier det seg om jernoksider som ble fremstilt i nærvær av dekstran som stabilisatorsubstans [Bacic, G., Niesmann, M.R., Magin, R.L. et al., SMRM - Book of abstracts, 328, 1987; Ohgushi, M., Nagayama, K., Wada, A. et al., J. Magnetic Resonance 29, 599-601, 1978; Pouliguen, D., Le Jeune, J.J., Perdrisot, R. et al., Magnetic Resonance Imaging 9, 275-283, 1991; eller Ferrucci, J.T. og Stark, D.D., AJR 155, 311-325, 1990], men det ble også beskrevet å anvende andre polysakkarider, så som arabinogalaktan [Josephson, L., Groman, E.V., Menz, E. et al., Magnetic Resonance Imaging 8, 616-637, 1990], stivelse [Fahlvik, A.K., Holtz, E., Schroder, U. et al., Invest. Radiol. 25, 793-797, 1990], glykosaminoglykaner [Pfefferer, D., Schimpfky, C, Lawaczeck, R., SMRM - Book of abstracts 773, 1993], eller også proteiner [Widder, D.J., Grief, W.L., Widder, K.J. et al., AJR 148, 399-404, 1987].

De nøyaktige syntesebetingelser, så som jernsaltenes art, temperatur, kappepolymer (stabilisator), titrasjonshastig-het, alkalivalg, rensing osv., har innflytelse på de kjemisk- fysikalske egenskaper og dermed den farmasøytisk-galeniske kvalitet og sluttelig den medisinske nytte.

Et viktig skritt i den videre utvikling til en målrettet anvendelse går tilbake til Weissleder og Papisov [Weissleder, R., Papisov, M.I., Reviews of Magnetic Resonance in Medicine 4, 1-20, 1992], som kunne vise at "målevnen" hos de magnetiske jernoksider forholder seg omvendt med partikkelstørrelsen. I denne sammenheng er det problematisk at ved små partikkelstørrelser avtar effekti-viteten (MR-effekten) av partiklene. Fremstillingen av spesielt små magnetiske jernoksider uten fraksjonerings-skritt ble for kort tid siden beskrevet [Hasegawa, M., Ito, Y., Yamada, H. et al., JP 4 227 792]. For spesielt små partikler, MION-er, er det allerede blitt publisert eksperimenter for "funksjonell imaginering", hvor partiklenes dekstrankappe (magnetisk merkelapp) ble oksidert med perjodat og deretter koblet med spesifikke molekyler (a-ntimyosin; polyklonale antistoffer) [Weissleder, R., Lee, A.S., Khaw, B.A. et al., Radiology 182, 381-385, 1992, eller Weissleder, R., Lee, A.S., Fishman, A. et al., Radiology 181, 245-249, 1991].

En spesifikk vei går Menz et al. [Menz, E.T., Rothenberg, J.M., Groman, E.V. et al., WO 90/01295], som omhyller sine store nanopartikler med polymerer (arabinogalaktan) med fysiologiske effektorceller og krever dem, likesom Gordon, som oksiderer sine dekstranstabiliserte partikler med perjodat og deretter kobler dem med transferrin ved reduktiv aminering [Gordon, R.T., US 4 735 796], en spesifikk opp-takelsesmekanisme over reseptorformidlet endocytose.

Fremstillingen av "store" superparamagnetiske jernoksider for anvendelse som kontrastmiddel i MR-diagnostikken av lever og milt er i dag "teknikkens stand", og den diagnostiske utnyttelse av disse indikasjoner er påvist. Repre-sentanter for disse jernoksider befinner seg i klinisk utvikling (SHU 555A, Schering AG, Berlin, Tyskland; Phase II og AMI-25, Advanced Magnetics Inc., Cambridge, Mass., USA, fase III/IV). Betydningen av jernoksidenes hydrodynamiske diameter for mer spesifikke (ekstrahepatiske) forsøk, så som MR-lymfografi eller MR-angiografi, er kjent og under bearbeidelse. Med ellers identiske partikler bør blodhal-veringstiden tilta med mindre tverrsnitt. Fra litteraturen er det kjent syntesevarianter for fremstilling av små jernoksider.

Et vesentlig problem for videreutviklingen av spesifikke kontrastmidler på basis av superparamagnetiske jernoksider har hittil vært at det ikke er mulig å forbedre målegen-skapene, altså anrikningen og fordelingen i målvevet, uten samtidig å måtte inngå kompromisser i de fysikalsk-kjemiske parametere, da stabilisatorene som er spesielt velegnet for fremstilling av de jernholdige kjerner, bare i meget begrenset grad er anvendelige for å sikte inn substansene. Dessuten begrenser reaksjonsbetingelsene ved syntesen {pH-grenser, temperatur, redoksreaksjoner med jernsaltene) utvalget av mulige stabilisatorsubstanser, slik at hele grupper av viktige og høyspesifikke molekyler (proteiner, peptider, oligonukleotider, men også de fleste oligo- og polysakkarider) ikke kan anvendes for stabilisering ved fremstillingen, i det minste ikke når stabilisatorene etter syntesen fremdeles skal være i besittelse av målegenskaper (biologisk aktivitet).

Også vedrørende de hittil anvendte (kjemisk) "ufølsomme" polymerer - hovedsakelig dekstran - er det kjent at det under syntesebetingelsene forekommer mangfoldige og ikke kontrollerbare reaksjoner, så som f.eks. depolymerisasjon i surt pH-område (lavmolekylært dekstran utvinnes teknisk f.eks. ved syrehydrolyse) og forskjellige reaksjoner inntil fullstendig ødeleggelse av polymeren i alkalisk område (fellingsskritt). Under hensyntagen til sukkerkjemien og de nødvendige reaksjonsbetingelser må man altså gå ut fra at "dekstran-magnetitt" ifølge "teknikkens stand" slett ikke er dekstran-magnetitt, da dekstran riktignok ble anvendt for stabilisering, men etter syntesen dreier det seg ikke lenger om dekstran. Ut fra farmasøytiske og tillatel-sesrelevante synspunkter betyr det at en vesentlig be-standdel - stabilisatoren er jo kappen og bestemmer dermed overveiende den biologiske atferd - ikke er kjent eller deklarert.

Av praktiske grunner fremkommer dessuten det problem at en optimering av overflateegenskapene for den videre utvikling synes umulig når overflaten slett ikke er kjent.

I eksemplet med en spesifikk anvendelse, så som den mest undersøkte MR-lymfografi, kan det påvises at med partiklene ifølge "teknikkens stand" under anvendelse av dekstran som stabilisator - andre polymerer for fremstilling av spesielt små jernoksider er hittil ikke blitt publisert - forbedrer optimaliseringen av størrelsen riktignok anvendeligheten, og en meget høy akkumulasjon av partiklene i lymfevevet kan oppnås, men for en klinisk anvendelse har homogeniteten av den interlymfonodale fordeling hittil ikke vært tilstrekkelig [Taupitz, M. et al., SMRM - Book of abstracts 500, New York, USA, 1993]. Den riktignok totalt sett meget høye, men inhomogene anrikning bidrar ved denne anvendelse heller ikke til at man forventer at en videre forbedring ved ytterligere optimalisering av den hydrodynamiske diameter kan oppnås.

Et vesentlig problem i utviklingen av spesifikke diagnostika er den minimale størrelse på målorganene. Således representerer f.eks. de samlede lymfeknuter mindre enn 1 av kroppsvekten. Potensielle diagnostika må også vise høy anrikning i målvevet og muliggjøre allerede i små konsentrasjoner en sterk kontrastinnflytelse.

Da de superparamagnetiske jernoksider for tiden utgjør substansklassen med den sterkeste MR-kontrastinnflytelse, synes partiklene å være spesielt velegnet for spesifikk anvendelse. Ett problem med denne substansklasse er jernoksidenes krystallkjerne, som er en forutsetning for subs-tansenes spesielle karakter, og at partikkelstørrelsen har vesentlig innflytelse på den biologiske atferd. Mindre partikkelstørrelser forbedrer styrbarheten, men kontrast-midlenes effektivitet avtar på grunn av sammenhengen mellom kjernestørrelsen og det magnetiske moment mot de mindre størrelser, så at her må det velges et kompromiss mellom kontrastinnflytende virkning (fysikk) og styrbarhet (biologi). Prinsipielt må det kreves at den jernholdige kjerne må være så stor som mulig for å oppnå høy effektivitet, og selvfølgelig må totalgjennomsnittet forbli lite.

Oppgaven for oppfinnelsen er å tilveiebringe jernholdige nanopartikler som oppfyller de fysikalske og biologiske krav til en spesifikk nanopartikkel.

Overraskende viste det seg at de oppfinnelsesmessige nanopartikler er overlegne i forhold til de hittil kjente jernoksidpartikler ifølge teknikkens stand når det gjelder målrettethet. Ved en kombinasjon av den fysikalske kvalitet med den forbedrede målrettethet hos nanopartiklene kan det fremstilles kontrastmidler og også terapeutika/tera-peut iske bærersysterner med hittil uoppnåelig målsøkende evne.

Fremstillingen av nanopartiklene skjer ut fra enkeltvise byggestener (modulært prinsipp) og garanterer derved den høyeste fleksibilitet ved kombinasjonen av jernholdige kjerner (fysikalsk aktivitet; kontrast) med målkomponenten (biologisk atferd). En modulær oppbygning har den fordel at den kombinerer en lagringsdyktig komponent (jernholdig kjerne) med eventuelt ømfintlige molekyler for styring akkurat tidsnok til den ferdige nanopartikkel. Denne til-slutning til "Cold-Kits", som er kjent fra den kliniske radiofarmasi, gjør det mulig å utnytte f.eks. også individuelle serumkomponenter fra enkelte pasienter som sty-ringsmolekyl (f.eks. autologe antistoffer).

På grunn av sin intensive farging er det mulig å påvise nanopartiklene også visuelt, hvilket er ønskelig f.eks. ved anvendelse som optisk merkesubstans i den kirurgiske medisin.

Dessuten egner nanopartiklene seg også for anvendelse i terapien, f.eks. ved en magnetisk målretting med eksterne magneter over et målvolum forbundet med en magnetisk koblet frigivning av virkestoffer. Nanopartiklene kan f.eks. akkumuleres i tumorer, og de gjør det derfor mulig å anvende dem som spesifikke forsterkningssubstanser i den lokale hypertermi.

De oppfinnelsesmessige nanopartikler består av en jernholdig kjerne, en primærkappe (syntesepolymer) og en sekundærkappe (målpolymer) samt eventuelt farmasøytiske hjelpestoffer, farmaka og/eller adsorpsjonsformidlere, idet syntesepolymeren velges fra gruppen karboksypolyalkoholer, polykarboksypolyalkoholer, polykarboksyalkoholer, karboksyalkoholer, alkoholer, eller fra gruppen monosukker, oligosukker, polysukker, eller fra gruppen syntetiske monomerer, oligomerer eller polymerer, så som f.eks. polyety-lenglykoler (polyoksyetylener), polypropylenglykoler (polyoksypropylener) og blandinger (blokk- og kopolymerer), polyakrylsyre og derivater, polyvinylalkohol, polymelke-syre (polylaktider og polylaktid-glysider), eller fra gruppen tensider eller andre overflateaktive substanser, eller fra gruppen naturlige eller syntetiske eller delvis syntetiske eller kjemisk og/eller enzymatisk modifiserte oligomerer eller polymerer, så som f.eks. dekstraner eller sure grupper inneholdende oligo- eller polysakkarider, idet de sure grupper også kan dannes først ved syntesen av nanopartikler, eller glykosaminoglykaner og hyaluronsyrer, eller stivelser og derivater, eller gelatiner og derivater (f.eks. polyoksygelatiner), eller fra gruppen naturlige eller syntetiske oligo- bis polynukleotider eller polyaminonukleinsyrer, så som ribonukleinsyrer, desoksyribo-nukleinsyrer eller deres analoger eller homologer eller fragmenter eller nedbrytningsprodukter, og målpolymerene utgjør naturlige eller kjemisk og/eller enzymatisk fremstilte derivater eller nedbrytningsprodukter eventuelt med hvilken som helst substitusjon av et mono-, oligo- eller polysakkarid, eller syntetiske oligomerer eller polymerer, eller tensider eller andre overflateaktive substanser, eller celler, cellefragmenter eller bakteriefragmenter, eller bestanddeler eller en blanding av blod-, plasma-, serumkomponenter eller opsoniner, eller metabolitter eller antimetabolitter eller egemiddelkonjugater, eller er valgt fra gruppen lektiner og integriner, hormoner eller andre mediatorsubstanser, eller proteiner og neoproteiner, peptider og polypeptider, antistoffer eller -fragmenter, molekylære erkjennelsesenheter (MRU, Molecular Recognition Units), eller polyaminonukleinsyrer eller DNA og RNA eller derivater eller analoger eller homologer, eller naturlige eller syntetiske oligonukleotider, eller reseptorspesi-fikke substanser, lipoprotiner, lipopolysakkarider, eller glyserinester eller kolesteriner og -ester, like som syntesepolymerene og/eller målpolymerene også kan utgjøre derivater av de nevnte substanser som eventuelt i tillegg bærer funksjonelle grupper som foreligger på én ende eller begge ender eller på et hvilket som helst sted i polymeren som ligger til grunn, idet syntesepolymerene og/eller målpolymerene kan være substituert vilkårlig.

Den jernholdige kjerne foreligger som partikkel, kolloid eller krystall. Fra fremstillingen av kjernen inneholder nanopartiklene en syntesepolymer som omhyller kjernen som primærkappe, og som er nødvendig under fremstillingen for å styre den fysikalske og farmasøytisk-galeniske kvalitet. Deretter innstilles forholdet mellom syntesepolymer og jern ved en desorpsjonsmetode til den ønskede verdi. For anvendelse i den spesifikke diagnostikk adsorberes en målpolymer som utgjør overflaten av nanopartiklene og omhyller grunnbyggestenen av kjerne og primærkappe. For forbedring av adsorpsjonen mellom primær- og sekundærkappen kan adsorpsjonsformidlere være innbefattet. Som ytterligere bestanddeler kan nanopartiklene inneholde farmasøytiske hjelpestoffer eller farmaka.

En skjematisk fremstilling av oppbygningen av en oppfinnelsesmessig nanopartikkel er angitt i illustrasjon 1.

Det hydrodynamiske tverrsnitt av grunnstenen (jernholdig kjerne og primærkappe) i løsning er mindre enn 100 nm, fortrinnsvis mindre enn 50 nm, og høyst fem ganger så stor som den jernholdige kjernes diameter.

De oppfinnelsesmessige nanopartikler utmerker seg videre ved at de foreligger som stabile kolloidale soler i farma-søytisk kvalitet, eller at de foreligger lyofilisert og lett igjen kan bringes i løsning med medisinsk anvendte løsningsmidler {elektrolyttløsning, plasmautvider, gluko-seløsning, fys. koksaltløsning etc), eller at grunnbygg-gesten og målkomponent og eventuelle tilsetninger er atskilte løsninger, som også kan foreligge som lyofilisater, og først blandes sammen ved et passende tidspunkt til en applikasj onsløsning.

Den jernholdige kjerne har et større magnetisk moment enn jern-II- eller jem-III-ioner. Den jernholdige kjerne gjør det mulig ved sine magnetiske egenskaper å danne kontras-ter ved anvendelse som kontrastmiddel i MR-tomografien. For å oppnå en optimal kontraststyrke bør kjernen være su-perparamagnetisk eller i det minste inneholde superparamagnetiske andeler, dvs. at kjernen må foreligge som krystall eller som et polyatomært kompleks ("partikkel"), da denne art magnetisme bare er mulig i faste stoffer.

I henhold til oppfinnelsen kan den jernholdige kjerne være magnetitt eller maghemitt eller inneholde disse.

Inntil 25 vekt% av jernet som foreligger i kjernen, kan erstattes med andre metallioner.

Ikke-jernmetallionene er paramagnetiske, diamagnetiske eller en blanding av begge deler.

Videre utmerker de oppfinnelsesmessige nanopartikler seg ved at den jernholdige kjerne oppviser en ved elektronmikroskopi bestemt diameter som er mindre enn 30 nm, fortrinnsvis mindre enn 15 nm, og inneholder minst 50 metallatomer samt en partikkelstørreIsesfordeling hvor minst 90 % av de jernholdige kjerner ligger i området 0,7* middelverdi til 1,3* middelverdi.

Nanopartiklene inneholder en syntesepolymer i en mengde mellom 0,01 x og 1 x summen av de nærværende metallioner. Foretrukket er en mengde mellom 0,25 x og 0,75 x.

Som syntesepolymer anvendes en monomer- eller polymersubs-tans eller en blanding av disse substanser eller derivater, eller derivater med funksjonelle grupper eller derivater som dessuten er blitt substituert, med en molekylvekt mindre enn 100 000 Da. Fortrinnsvis anvendes substanser med molekylvekter som er mindre enn 10 000 eller 5 000 Da.

Spesielt foretrukket anvendes som syntesepolymer et dekstranderivat eller en blanding av dekstran og/eller dekstranderivater.

Syntesepolymeren kan inneholde én eller flere syregrupper og flere funksjonelle grupper i molekylet, som fortrinnsvis inneholder N-, S-, P- eller 0-atomer.

Mål- og syntesepolymeren kan være forskjellige eller like substanser eller substansblandinger, hvorved målpolymeren imidlertid ikke er prisgitt betingelsene for syntesen og dermed heller ikke syntesepolymerens bireaksjoner ved syntesen, den er altså fremdeles i fysiologisk tilstand.

Grunnsubstansen av den jernholdige kjerne og syntesepolymer bestemmer den fysikalske kvalitet hos nanopartikkelen, mens målpolymeren bestemmer nanopartiklenes biologiske atferd.

Målpolymeren er i nanopartikkelen i en vektmengde mellom 0,5 og 50 ganger, fortrinnsvis mellom 1 og 25 ganger vekten av de foreliggende metallioner.

De oppfinnelsesmessige nanopartikler inneholder adsorpsjonsformidlere, hvis mengde er mindre eller lik summen av vekten til de foreliggende metallioner. På grunn av adsorpsjonsformidlerne forsterkes adsorpsjonen av målpolymeren på grunnbyggestenen av den jernholdige kjerne/syntesepolymer, eller den blir først da mulig.

Foretrukket anvendes som adsorpsjonsformidlere peptider med strukturene RRTVKHHVN, RRSRHH eller RSKRGR, eller delstrukturer derav.

Den hydrodynamiske diameter inklusive alle bestanddeler av nanopartiklene er høyst ti ganger større enn diameteren av den jernholdige kjerne og høyst 20 % større enn grunnbyggestenens diameter.

De oppfinnelsesmessige nanopartikler består av enkeltvise moduler, så som grunnbyggesten, målpolymer, farmakon og adsorpsjonsformidler, som til enhver tid kan kombineres.

Ved fremstillingen av nanopartiklene dreier det seg om lawiskøse, vandige, kolloidale løsninger eller suspensjoner av jernholdige stabiliserte partikler i nanometerområdet. Løsningene av nanopartiklene inneholder ingen større aggregater og kan anvendes intravenøst, så at kravene i internasjonale legebøker til parenteralia vedrørende par-tikkelstørrelsen er oppfylt.

Generelt kan grunnbyggestenen steriliseres ved varmebehandling. Fremgangsmåten for "sterilisasjon" av de ferdige nanopartikler avhenger av sekundærkappens ømfint-lighet, men en kimfri aseptisk fremstilling må i hvert fall garanteres. En sterilfiltrering kan på grunn av partiklenes minimale størrelse alltid utføres. Valget å fremstille en ømfintlig målpolymer med den steriliserbare grunnbyggesten først kort før anvendelsen, er en videre mulighet for å garantere en praktisk talt steril applika-sjonsløsning.

Nanopartiklene er godt tolerable og oppviser f.eks. ved anvendelse som MR-kontrastmiddel en utpreget gunstig sik-kerhetsavstand mellom diagnostisk dose og den letale dose ("sikkerhetsmargin"). Den diagnostiske dose ligger, alt etter spesialanvendelsen, ca. mellom 5 og 200 /rniol (jern) pr. kilogram kroppsvekt, mens den letale dose må innordnes ca. mellom 2 0 og 50 mmol/kg kroppsvekt (målt på rotte).

Substansene er fullstendig bionedbrytbare. Således opplø-ses den jernholdige kjerne, og jernet bringes inn i det fysiologiske jernkretsløp. Generelt kan også de som syntesepolymer og målpolymer benyttede molekyler metabolsk ned-brytes til nyttige grunnbyggeStener (sukker, aminosyrer).

Løsningene av nanopartiklene er meget stabile, og det finner ikke sted noen påvisbar endring av de fysikalske parametere etter fremstillingen (partikkelstørrelse, magnetiske egenskaper). Ved kimfri fremstilling oppviser løs-ningene en lang lagringsevne; det ble f.eks. i løpet av 12 måneder ikke påvist noen instabilitet, så som aggregasjon eller sedimentasjon.

Løsningene eller suspensjonene er farget rødbrune til svarte, hvilket kan føres tilbake til de jernholdige krys-tallers intensive farge. Den utpregede egenfarge kan benyttes for visuell påvisning, f.eks. som merkesubstans i den kirurgiske medisin. For påvisning med MR-teknikk er nanopartiklene superparamagnetiske eller inneholder superparamagnetiske andeler. Partiklene oppviser fysikalsk meget høye metningsmagnetiseringer som oppnås allerede ved lavt anlagte feltstyrker, og oppviser etter utkoblingen av en ekstern magnet ingen restmagnetisme mer, de oppviser ingen remanens.

Nanopartiklene er formulert som løsninger (suspensjoner) og kan uten ytterligere forberedelse anvendes. Da løsnin-gene av nanopartiklene er kompatible med vanlige medisinske løsningsmidler, så som fysiologisk natriumklorid-løsning, elektrolyttløsninger eller sukkerløsninger, kan partiklene fortynnes vilkårlig og f.eks. infunderes for spesielle anvendelser.

Ett alternativ til formulering av "lagringsdyktig" løsning utgjør fremstillingen av lyofilisater. Det er da mulig å lyofilisere grunnbyggestenen, som deretter resuspenderes i oppløst målpolymer, eller grunnbyggestener og nanopartikler lyofiliseres etter adsorpsjonen og gjenoppløses deretter før anvendelsen i fys. NaCl eller aqua ad injec-tabilia. Lagringen kan også skje ved at grunnbyggestener og målpolymerer oppbevares i atskilte løsninger og blandes først før applikasjonen.

Fremstillingen av de finfordelte eller kolloidale jernholdige kjerner skjer fra monomolekylære oppløste jernforbindelser ved endring av pH-verdien og derved bevirket utfelling i nærvær av en stabilisatorsubstans (syntesepolymer) ifølge en "ettkarsyntese". Syntesepolymeren separerer krystallkjernene under fremstillingen og tjener således til å styre partikkelstørrelsen. Syntesepolymeren er vesentlig for de fysikalske og farmasøytisk-galeniske egenskaper ikke bare i krystallkjernen, men også i den totale nanopartikkel. Syntesepolymeren gjør det mulig å erholde en stabil løsning (suspensjon), da kjernene ligger så langt fra hverandre at det ikke mer kan finne sted noen aggregasjon (sterisk stabilisering).

Etter at de jernholdige kjernepartikler er ferdige for bruk, innstilles syntesepolymeren til et jernforhold ved en desorpsjonsmetode på en forhåndsgitt syntesepolymer. Løsningen (suspensjonen) av jernkjerne og restsyntesepolymer, som omhyller den jernholdige kjerne som primærkappe og stabiliserer den, utgjør grunnbyggestenen for det modulære system. Grunnbyggestenen utmerker seg herved ved høy fysikalsk-galenisk kvalitet.

En annen vesentlig byggesten er målpolymeren som postsyntetisk adsorberes på grunnbyggestenen og omgir kjernen med primærkappen med en andre omhylling (sekundærkappe). Sekundærkappen utgjør nanopartiklenes overflate og bestemmer in vivo-atferden. Blandingen mellom grunnbyggestenen og målpolymeren kan skje ved ethvert tidspunkt, slik at også en "umiddelbar" fremstilling er mulig.

Adsorpsjonen mellom restsyntesepolymer og målpolymer kan forbedres ved et me11omkoblet trinn med tilsetning av adsorpsjonsformidlere, eller også først da bli mulig. Tilsetningen av adsorpsjonsformidleren kan også skje i et trinn i en blanding med målpolymeren. På analog måte kan det til ethvert tidspunkt tilsettes farmasøytiske hjelpestoffer eller farmaka.

De spesielle fordeler med oppfinnelsen er åpenbare, da det med den oppfinnelsesmessige fremstillingsmetode for første gang har lykkes å oppfylle de fysikalske og biologiske krav til en spesifikk nanopartikkel optimalt.

På grunn av den modulære oppbygning, dvs. atskilt fremstilling av grunnbyggesten (jernholdig kjerne + primærkappe) og målprinsipp (sekundærkappe), kan det for syntesen velges den syntesepolymer som er optimal for de fysikalske egenskaper uten å bli begrenset av nanopartiklenes ønskede biologiske styrbarhet; - for det første må det altså ikke gjøres noen kompromisser med hensyn til nanopartiklenes fysikalsk-farmasøytiske kvalitet og den ønskede biologiske virkning. Målpolymeren er ikke underlagt de ødeleggende betingelser for syntesen, slik at mange substanser kan anvendes for å finne målet, hvilket hittil i utgangspunktet var utelukket. Likeledes må det ikke anvendes noen postsyntetisk kjemi som på sin side fordrer adekvate reaksjonsbetingelser og innvirker på ligandens integritet; det finner f.eks. ikke sted noen redoksreaksjoner med disulfidbroholdige proteiner som ved perjoda-toksidasjonen med påfølgende reduktiv aminering, - den biologiske aktivitet forblir opprettholdt.

En ytterligere vesentlig fordel er at ingen rensing av grunnbyggesten-målpolymer må foregå, da ingen reaksjons-løsninger, så som f.eks. perjodat, må separeres - metoden er også rask, og det kan derfor også fremstilles nanopartikler "akkurat tidsnok" direkte før applikasjonen, så som det f.eks. er nødvendig med "individuelle" kontrastmidler (f.eks. autologe antistoffer), eller det kan være fordelaktig når målpolymeren er stabil i løsning bare en kort tid.

Også for en ytterligere optimering oppviser den oppfinnelsesmessige fremstilling fordeler, da nanopartiklenes "overflate" kan modifiseres/optimeres separat, og man kan gjennomføre en analyse også med moderne analysemetoder, så som NMR-spektroskopi eller IR-spektroskop!, metoder som ikke kan anvendes i nærvær av den partikulære kjerne.

Da overflaten er definert fremstilt og også kan analyseres på adekvat måte, er en systematisk optimalisering av overflateegenskapene mulig, mens ved fremstillingen ifølge "teknikkens stand", som betrakter partiklene som en enhet-lig substans, er overflaten slett ikke kjent, og en optimalisering er derfor også bare mulig ved "forsøk og feiling".

Nanopartiklene fremstilles i flere trinn. Den jernholdige kjerne syntetiseres prinsipielt ifølge en "ettkarsystem-syntese", altså i nærvær av en stabilisatorsubstans (syntesepolymer) . Stabilisatorsubstansen (syntesepolymeren) oppløses i vann, og de monomolekylære jernforbindelser tilsettes. Ved pH-forhøyning omsettes jernsaltene til fortrinnsvis oksidene og utfelles. Som variant kan stabi-lisatorløsningen også gjøres alkalisk, og deretter tilsettes jernsaltene. Blandingen oppvarmes under tilbakeløp og nøytraliseres deretter, hvorved oppvarming og nøytralise-ring også kan finne sted i omvendt rekkefølge. Råsubstansen renses, og deretter innstilles den overflødige eller ikke fast adsorberte/bundne syntesepolymer ved en desorpsjonsmetode til et nøyaktig vektforhold mellom jern og stabilisator. Denne rensede og desorberte grunnsubstans av kjerne og (rest)syntesepolymer utgjør grunnbyggestenen for den modulært oppbygde nanopartikkel. Eventuelt kan det her tilknyttes en varmesterilisasjon. Etter behov eller "for forrådet" adsorberes den valgte målpolymer, eventuelt under mellomadsorpsjon eller koadsorpsjon av en adsorpsjonsformidler, på grunnbyggestenen. Eventuelt kan ytterligere bestanddeler, så som farmasøytiske hjelpestoffer eller farmaka, tilsettes. Den generelle fremstillingsmetode er skjematisk sammenfattet i illustrasjon 2.

I den følgende beskrivelse av den jernholdige kjerne må man iaktta at syntesen alltid utføres i nærvær av stabilisatoren ifølge en "ettkarsyntese".

Por fremstilling av de jernholdige kjerner blandes støkio-metriske mengder av jern-II- og jern-III-salter med hverandre. Kvaliteten på de fremkomne krystaller påvirkes også av de anvendte salter, og generelt anvendes i litteraturen saltsyresalter, altså jernklorider. Prinsipielt kan imidlertid alle salter av sterke syrer anvendes, altså f.eks. også sulfater eller nitrater. Det er problematisk ved anvendelsen av disse salter å garantere en eksakt støkio-metri, da jern-II-saltene er meget følsomme overfor oksidasjon. Det er herved fordelaktig å anvende komplekse salter, så som f.eks. Mohrs salt, som ikke er så følsomt overfor oksidasjon.

Overraskende har det vist seg at å anvende organiske salter er meget bedre enn å anvende uorganiske salter, da de organiske anioner virker som stabilisator eller hjelpesta-bilisator. Som spesielt egnet har herved f.eks. jern-II-glukonat vist seg å være, eller jern-III-citrat; anvendes kan imidlertid også andre organiske anioner, så som f.eks. fumarater, tartrater, laktater eller salisylater.

Ved en syntesevariant som bare utgår fra jern-III-salt, lykkes for det første fremstillingen uten å anvende de ok-sidasjonsømfintlige jern-II-salter, og for det andre kan antallet "fremmedioner" reduseres. Denne analysevariant utgår bare fra jern-III-salt, hvorfra jern-II først gene-reres in situ med en beregnet mengde reduksjonsmiddel ved reaksjonen. Skjønt prinsipielt alle reduksjonsmidler kan anvendes for å redusere jern-III støkiometrisk eksakt, foretrekkes det å anvende hydroksylamin, da det omsatte hydroksylamin omsettes kvantitativt til lystgass og derved meget enkelt kan fjernes fullstendig fra reaksjonsblandingen.

En ulempe ved alle hittil beskrevne fremgangsmåter blir tydelig når man betrakter jernsaltenes kjemi nærmere.

Målet for fellingstrinnet er å omsette jern-II og jern-III i støkiometrisk sammensetning til en krystall med definert krystallstruktur. Dannelsen av de tilsvarende oksider oppnås ved høyning av pH-verdien. Tar man dog hensyn til at allerede ved en pH-verdi på ca. 2 danner jern-III-ionene [pKL Fe(OH)3 ca. 37<*>] tungt oppløselige hydroksider, mens jern-II-ionene først ved pH 8 faller ut som hydroksider [pKL Fe{OH)2 ca. 13,5], så blir det klart at en direkte dannelse av de ønskede krystaller neppe forekommer mulig, og veien finner bare sted via hydroksidenes følgereaksjon. Ved anvendelse av egnede kompleksdannere er det dog mulig å forskyve fellingsproduktene av jernforbindelsene mot hverandre, så at en samtidig felling og innbygningen på de forskjellige gitterplasser i jernoksidkrystallen kan foregå. Ved valget av kompleksdanner kan fellingsproduktene for de anvendte jernforbindelser styres over store områder.

<*>pKL-verdiene er avhengig av konsentrasjonen, og angivel-sene refererer til en 10"s mol/l løsning.

Som kompleksdannere kan i tillegg til de "klassiske" substanser ifølge tabell l også de ovennevnte organiske anioner anvendes. Komplekse salter, organiske anionesalter og uorganiske salter av jern-II- og jern-III-ioner kan kombineres med hverandre på utallige måter.

I en variant av syntesen foregår først en atskilt fremstilling av jern-II-hydroksid og jern-III-hydroksid. Fremstillingen av jernoksidkrystallene lykkes på overraskende måte også ved å kombinere de separat fremstilte hydroksid-løsninger, hvorved en oppvarming av de kombinerte løs-ninger påskynder krystallisasjonen.

Et viktig skritt ved fremstillingen av de jernholdige kjerner er fellingstrinnet hvorved de partikulære jernforbindelser dannes av de lavmolekylære jernforbindelser ved pH-verdiforhøyning, hvorved dannelsen av partiklene kan skje eventuelt ved dannelse av kolloidale jernhydroksider. Por pH-verdiforhøyningen egner seg prinsipielt enhver substans som kan høyne pH-verdien i den sure løsning av jernsaltene. I tillegg til anvendelse av natronlut er pH-verdihøyningen med ammoniakk, både som gass og som salt, eller anvendelse av basiske aminer og flyktige buffere foretrukket. På overraskende måte er det fremkommet at basen som anvendes for fellingen, påvirker de totale egenskaper således at også "biologiske" virkninger kan iakttas, så som f.eks. forskjeller i partiklenes organforde-ling.

Konsentrasjonen av den basiske substans bør derved ligge i området 0,1-10 N, foretrukket er herved konsentrerte løs-ninger på ca. 1-4 N, da dannelsen av partikler med små kjernestørrelser fortrinnsvis finner sted ved økende has-tighet for pH-verdihøyningen. Tilsetningen av basene skjer i løpet av 3 0 minutter, men fortrinnsvis i løpet av 30 sekunder .

Fellingen av jernforbindeIsene til partikler skjer i tem-peraturområdet 0-120 °C, hvorved området 50-80 °C er foretrukket. Prinsipielt gjelder at temperaturen kan være lav når jernoksidet dannes direkte, og må være høy når dannelsen over hydroksidene som mellomskritt foregår. Etter fellingen skjer nøytralisasjon og deretter, særlig når det først foreligger hydroksider, en oppvarming av råsubstansen under tilbakeløpsbetingelser, hvorved varigheten av oppvarmingen ligger mellom 0 minutter og 24 timer, fortrinnsvis mellom 30 minutter og 1 time. Nøytralisasjon og oppvarming under tilbakeløpsbetingelser kan også utføres i omvendt rekkefølge.

For anvendelse som kontrastmiddel (optisk merkesubstans) ved visuell påvisning er en høy egenfarging ønskelig. Anvendelsen som kontrastmiddel i magnetresonanstomografien (MRT) krever høy aktivitet, som ved denne tomografimetode bestemmes ved nanopartiklenes magnetiske egenskaper. På grunn av den høye metningsmagnetisering allerede ved lavt anlagte feltstyrker, som anvendes i den kliniske MRT, synes jernoksidene maghemitt og magnetitt å være spesielt velegnet ved anvendelsene av nanopartiklene som MR-kontrastmidler. De spesielle magnetiske egenskaper fastlegges her ved de partikulære jernkjerners krystallstruktur. På overraskende måte er det dog mulig å innbygge fremmedioner i krystallkjernen og likevel komme frem til den magnetittaktige krystallstruktur. Denne markering med ikke-jernholdige metallioner kan prinsipielt skje på to måter. For det første kan jern-II- og/eller jern-III-ioner erstattes i sine gitterplasser med andre paramagnetiske metallioner, og for det andre kan substitusjonen skje også med diamagnetiske ioner. For en forståelse av dette skal det minnes om at magnetiseringen i magnetittkrystallen bare stammer fra jern-II-ionene, da jern-III-ionene besetter paral-lelle/antiparallelle gitterplasser og opphever hverandre i sin magnetiske virkning. En forhøyning av krystallens nettomagnetiserbarhet kan skje når ioner med sterkere magnetiske egenskaper enn jern anvendes, eller når det nøy-aktig like besetningsforhold på de parallelle/antiparal-lelle gitterplasser forandres for jern-III-ionene ved para- eller diamagnetiske ioner. For substitusjonen med paramagnetiske metaller med sterkere magnetiske ioner, så som f.eks. gadolinium, kan det derved skje en forhøyning så stor som differansen mellom det magnetiske moment i forhold til det erstattede jern. Ved substitusjonen av jern-III med diamagnetiske metaller kan det nå ikke mer kompenserte moment av et jern-III-ion bidra til total-momentet. I en variant kan også dia- og paramagnetiske ioner innbygges sammen i det magnetittaktige krystallgitter. Markeringen med ikke-jernionene skjer ved delvis substitusjon av de lavmolekylære jernholdige utgangsfor-bindelser i syntesen.

Den generelle fremstilling av de jernholdige kjerner har som mål å syntetisere et magnetittaktig krystallgitter. For dette formål innsettes jern-II- og jern-III-ioner i et forhold på 1:1 til 1:20. Enklest lykkes syntesen når et nøyaktig støkiometrisk forhold på 1:2 anvendes. Forholdene mellom jern-II og jern-III kan også erholdes ved reduksjon av jern-III med et reduksjonsmiddel under syntesen. Jern-II- og/eller jern-III-ioner kan være erstattet med andre metallioner inntil 25 % av totaljernet (vekten). I tillegg til paramagnetiske ioner, så som gadolinium eller mangan, kan også diamagnetiske ioner, så som litium, magnesium eller kalsium, eller en blanding av para- og diamagnetiske ioner, anvendes. Som krystallstruktur foretrekkes dannelsen av magnetitt. Magnetittkrystallen kan derved for det første oppstå sekundært, f.eks. når hydroksidene først opptrer ved fremstillingen, eller magnetittkrystallen kan også reagere videre til andre krystaller, så som f.eks. ved oksidasjonen av magnetitt til maghemitt. Nanopartiklenes spesielle kvalitet som kontrastmidler for MRT krever superparamagnetiske magnetiske egenskaper. Supermagnetisme kan bare forekomme i faste stoffer, så at som ytterligere egenskap kreves at krystallene har faststoffegenskaper, altså er partikulære krystaller. Som minimal jernandel må i det minste 50 jernatomer (henholdsvis metallatomer) foreligge i hver krystall. Størrelsen på de jernholdige kjerner kan styres ved variasjon under syntesen over store områder (1 til ca. 30 nm), foretrukket er imidlertid syntesen av små kjerner med tverrsnitt mindre enn 15 nm, hvorved partikkelstørrelsesfordelingen ligger således at minst 90 % av partiklene er i området 0,7-MW til 1,3-MW (MW lik midlere diameter, bestemt ved elektronmikroskopi).

En av de spesielle fordeler ved den oppfinnelsesmessige fremstillingsmetode er den store fleksibilitet ved valget av syntesepolymer, hvorved begrepet "polymer" ikke må opp-fattes bokstavelig, da både lavmolekylære substanser og blandinger av lav- og høymolekylære substanser kan anvendes for fremstilling av de jernholdige kjerner. Spesielt foretrukket er det å anvende lav- eller høymolekylære substanser som inneholder negative ladningsbærere i molekylet. Foretrukket er her karboksylater eller analoger, fosfater (eller andre P-holdige grupper) og sulfater (eller andre S-holdige grupper). Disse derivater kan da bare bære en eneste funksjonell gruppe eller også inneholde flere funksjonelle grupper. Den tilgrunnliggende teori utgår fra at den jernholdige kjernes affinitet til overflaten foreligger ved vekselvirkning mellom positive jernoksidoverflater og negativ ladning i syntesepolymeren. Inneholder syntesepolymeren flere grupper, så er vekselvirkningen spesielt utpreget ("Multi-Side-Attachment"). Noen spesielt egnede klasser for stabiliseringen under syntesen er: lavmolekylære substanser, så som f.eks. karboksypolyalkoholer, polykarboksypolyalkoholer, polykarboksyalkoholer, karboksyalkoholer, alkoholer, monosukkere, oligomere sukkere og syntetiske polymerer, så som f.eks. polyetylenglykol, polypropylenglykol og blandinger (blokk-og kopolymerer), polyakrylsyre, polyvinylalkohol, poly-melkesyre (polylaktider og polylaktidglysid), samt naturlige eller spesielt partialsyntetiske eller kjemisk og/eller enzymatisk modifiserte naturlige polymerer, så som f.eks. dekstraner og derivater, arabinsyre, glykosaminoglykaner og syntetiske analoger, stivelse og derivater samt gelatinderivater.

Spesielt foretrukket er det å anvende lavmolekyldekstran-derivater som inneholder den negative ladningsbærer. Ett eksempel på dette er (mono)karboksydekstran; fremstillingen er beskrevet f.eks. av Bremner et al. [Bremner, I., Cox, J.S.G., Moss, G.F., Carbohydrate Research 11, 77-84, 1969], og et annet foretrukket eksempel er å anvende polykarboksydekstran, som kan fremstilles ved eterdannelse mellom 6-bromheksansyre og dekstranets hydroksylgrupper [Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, Y.( Takakura, T., Hashida, M., Sezaki, H., Bioconjugate Chemistry 3, 132-137, 1992]. Polykarboksydekstranet kan vekselvirke ved de mange negative ladninger over en "Multi-Side-Attachment" med jernoksidoverflaten.

Mengden av syntesepolymer for stabilisering under fremstillingen er det 0,5-20-dobbelte av vekten av summen av metallionene som foreligger i batchen, hvorved totalan-delen i reaksjonsblandingen velges således at viskositeten ved anvendelse av polymere syntesepolymerer gjør det mulig å blande batchen godt (< 50 % g/v). Det er foretrukket å anvende et ca. 3-15-dobbelt overskudd (vekt) av syntesepolymer i forhold til summen av de foreliggende metallioner.

Etter fremstillingen av råsubstansen skjer reduksjonen av andelen av syntesepolymer i batchen ved en desorpsjonsmetode. For desorpsjonen kan det anvendes kromatografiske metoder, en fremgangsmåte fra området magnetseparasjonsteknikk, en dialyse, en sentrifugering eller ultrasentri-fugering, en ultrafiltrering eller andre egnede fremgangsmåter. Desorpsjonen kan utføres ved anvendelse av forhøyet temperatur i kombinasjon med en av desorpsjonsmetodene. En ytterligere mulighet for å utøve innflytelse på utstrek-ningen av desorpsjonen er å anvende desorberende substanser, så som f.eks. bufferløsninger eller tensider.

Etter desorpsjonen av råsubstansen erholder man en stabil, fysikalsk optimal løsning/suspensjon som utgjør grunnbyggestenen for fremstillingen av spesifikke nanopartikler. Grunnbyggestenene består av den jernholdige kjerne og (rest)syntesepolymeren. Mengden av gjenværende syntesepolymer utgjør, alt etter det forhold som er innstilt ved desorpsjonsmetoden, 0,01-1, foretrukket er området fra 0,25 til 0,75, da det beste kompromiss mellom grunnbyggestenens stabilitet og adsorpsjonsdyktighet fremkommer i dette området. Grunnbyggestenens totalstørrelse (hydrody-namisk diameter) varierer i avhengighet av størrelsen på den jernholdige kjerne og den anvendte syntesepolymer, og ligger i størrelsesordenen mindre enn 100 nm, fortrinnsvis mindre enn 50 nm. Spesielt foretrukket er det å fremstille grunnbyggestener hvor totaldiameteren er maksimalt fem ganger så stor som kjernediameteren.

Grunnbyggestenen kombineres med målpolymeren til den ferdige nanopartikkel. Den adsorberte målpolymer danner om-kring den syntesepolymere/jernholdige kjerne en sekundærkappe og danner overflaten for totalsystemet og bestemmer, i tillegg til partiklenes partikulære karakter, in vivo-atferden. Den spesielle fordel ved fremetillingsmetoden ligger i at praktisk talt enhver substans som kan adsorberes på grunnbyggestenen, er anvendelig for biologisk styring av nanopartiklene. Målpolymerene er ikke underlagt noe syntesestress, så at også ømfintlige og hittil ikke anvendelige substanser kan anvendes som ledermolekyler for styring av den biologiske atferd.

Eksempler på egnede målpolymerer er blant annet: naturlige oligo- og polysakkarider, så som dekstran med molekylvekter mindre enn 100 000, blandinger av forskjellige dekstraner, dekstraner av forskjellig herkomst, spesielt egnede dekstraner (FP = fri pyrogenkvalitet), fukoidan, arabinogalaktan, kondroitin og -sulfater, keratan, polyga-lakturonsyre, polyglukuronsyre, polymannuronsyre, inulin, polylaktose, polylaktosamin, polyinosinsyre, polysukrose, amylose, amylopektin, glykogen, glukan, nigeran, pullulan, irisin, asparagosin, sinistrin, trikitin, kritesin, grami-nin, sitosin, lichenin, isolichenan, galaktan, galaktokao-lose, luteose, mannan, mannokarolose, pustulan, laminarin, xantan, xylan og kopolymerer, araboksylan, arabogalaktan, araban, levan (fruktosan), teichinsyre, blodgruppepolysak-karid, guaran, carubin, alfalfa, glukomannan, galaktoglu-komannan, fosfomannan, fukan, pektin, cyklodekstrin, al-ginsyre, tragant og andre gummisorter, chitin, chitosan, agar, furcellaran, karragen, cellulose, celluronsyre, arabinsyre og de kjemisk og/eller enzymatisk fremstilte derivater, som eventuelt dessuten kan være vilkårlig substituert, og de lavmolekylære nedbrytningsprodukter av de høymolekylære forbindelser. Likeledes er polyamino- og pseudopolyaminosyrer velegnet; syntetiske oligomerer og polymerer, så som polyetylenglykol, polypropylenglykol, polyoksyetyleneter, polyetanolsulfonsyre, polyetylenimin, polymaleimid, polyvinylalkohol, polyvinylklorid, polyvi-nylacetat, polyvinylpyrrolidon, polyvinyl- sulfat, polyakrylsyre, polymetakrylsyre, polylaktid, polylaktidglysid; monomere til oligomere sukkere og beslektede substanser, så som aldo- og ketotrioser til aldo- og ketohepto-ser, ketooktoser og ketononoser, anhydrosukkere, monokar-boksylsyrer og derivater med 5 eller 6 karbonatomer i hovedkjeden, cyklitter, amino- og diaminosukkere, desoksy-sukkere, aminodesoksysukkere aminosukkerkarboksylsyrer, aminocyklitter, fosforholdige derivater av monobisoligo-merer; oligomerer/polymerer med antitumorale egenskaper (høyere planter, sopper, lav og bakterier), så som lipopolysakkarider, 0-2,6-fruktan, 00-1,3-glukan, mannoglukan, mannan, glukomannan, p-1,3/1,6-glukaner, p-1,6-glukan, p-1,3/1,4-glukan, arabinoxylan, hemicellulose, P-l,4-xylan, arabinoglukan, arabinogalaktan, arabinofukoglukan, a-1,6/1,3-glukan, a-1,5-arabinan, a-1,6-glukan, 0-2,1/2,6-fruktan, 0-2,1-fruktan.

En vesentlig forutsetning for virkningen av antitumorpoly-sakkaridene er vannoppløseligheten som er garantert ved 0-1,3/1,6-glukaner ved forgrening i 6-stillingen. Vedrørende vannuløselige polysakkarider kan man forbedre løseligheten ved å innføre hydrofile og lett hydratiserte grupper. Som substituenter kan anvendes blant annet metyl-, etyl-, acetyl-, karboksymetyl- eller sulfatgrupper;

tensider og overflateaktive substanser, så som niotensi-der, alkylglukosider, glukamider, alkylmaltosider, mono-og polydisperst polyoksyetylen, kvartære ammoniumsalter, gallesyrer, alkylsulfater, betainer, CHAP-derivater.

Som eksempel og for å vise mangfoldet av de anvendelige styringsmuligheter, og dermed også demonstrere det modulære systems fortrinn, kan molekylene for styring av in vivo-atferden (spesifisitet) også være cellefragmenter, celler, bakteriefragmenter, substanser fra den store gruppe lektiner, hormoner og mediatorsubstanser, proteiner og neoproteiner, peptider og polypeptider, antistoffer, antistoffragmenter eller "molecular recognition units", integriner (ELAM, LECAM, VCAM osv.) eller reseptorspesi-fikke substanser (f.eks. Lewis-X, sialyl-Lewis-X osv.). Videre hører hertil mangfoldet av blod-/plasma-/serum-bestanddeler og opsoniner, gruppen av oligonukleotider og syntetiske oligonukleotider, DNA og RNA og deres derivater eller fragmenter eller analoger og homologer fra gruppen lipopolysakkarider, lipoproteiner, glyserinestere, kolesterinestere, eller også metabolitter og antimetabolitter, legemidler, legemiddelkonjugater, kjemoterapeutika og cytostatika.

Som målpolymerer kan dessuten, eller istedenfor de ovennevnte eksempler på målpolymerer, også de kjemiske og/eller enzymatisk fremstilte derivater eller nedbrytningsprodukter anvendes. Derivatene eller de "native" målpolymerer kan dessuten bære funksjonelle grupper. Disse funksjonelle grupper kan være i enden eller i begge ender eller på ethvert sted i det tilgrunnliggende målmolekyl. I dette tilfellet kan de funksjonelle grupper alle være like, eller også kan forskjellige grupper være kombinert med hverandre. Både i derivatene selv og i de funksjonelle grupper er de foretrukket som inneholder N-, S-, 0- eller P-atomer, syre- eller analoger, hydroksy-, eter- eller estergrupper.

Den nøyaktige sammensetning av nanopartiklene retter seg etter de krav som er fastsatt ved indikasjonen. Som målpolymerer kan både enkelte substanser og vilkårlige kombinasjoner av målpolymerene, f.eks. syntetiske og ikke-syntetiske, lav- eller høymolekylære, derivatiserte og ikke-derivatiserte, anvendes.

En spesiell variant av fremstillingen består i at målpolymeren og syntesepolymeren kan være like. I denne sammenheng betyr det at målpolymeren er lik den polymer som anvendes i syntesen, da, som allerede beskrevet ovenfor, syntesepolymeren etter syntesen ikke mer er identisk med polymeren som ble anvendt i syntesen. Målpolymeren er her altså den deklarerte syntesepolymer, men den var ikke som denne utsatt for de drastiske betingelser under fremstillingen og befinner seg derfor fremdeles i "fysiologisk" tilstand.

Mengden av målpolymer i den ferdige løsning av nanopartikler kan varieres over store områder. Prinsipielt er området fra den 0,5- til 50-dobbelte vekt av summen av vekten av de nærværende metallioner anvendelig, men det er foretrukket å anvende mengder tilsvarende det 1-25-dobbelte.

Som adsorpsjonsformidlere kan man oppfatte stoffer som forbedrer eller muliggjør adsorpsjonen mellom målpolymeren eller blandingen av målpolymerer på overflaten av den jernholdige kjerne eller kjernen pluss primærkappen. Prinsipielt må adsorpsjonsformidlerne også oppvise bifunksjo-nelle egenskaper, hvorved en molekyldel har affinitet til grunnbyggestenen, mens en annen molekyldel, som naturlig-vis kan være identisk med den første funksjonelle del, er ansvarlig for affiniteten til målmolekylet. Egnet er f.eks. stoffer med to funksjonelle grupper eller én hydro-fob og én hydrofil molekyldel. Foretrukne adsorpsjonsmid-ler er peptider som oppviser affinitet til jernkjernen eller til jernkjernen pluss primærkappen. Sådanne peptider lar seg selektere med moderne biokjemiske metoder i pep-tidlitteraturen. Foretrukket er peptider som inneholder RRTVKHHVN- eller RRSRHH- eller RSKRGR-sekvensen eller deler derav i molekylet [for enbokstavkodene for amino-syrene se f.eks. Stryer, Biochemistry, Freeman and Comp.; New York, 1988].

En ytterligere fordel ved å anvende peptider som adsorp-sjons formidler er at molekyldelen som ikke er nødvendig

for affiniteten, også kan kobles kovalent med vanlige biokjemiske metoder til målpolymeren(e), så at her må affiniteten til målpolymeren bare foreligge optimalt. Mengden av adsorpsjonsformidler avhenger av den anvendte substans<*>

egenskap(er) (adsorpsjonsformidlingens styrke) og av mål-polymerens eller målpolymerenes egenskaper; den maksimale tilsetning er likevel mindre eller høyst lik vekten av summen av metallionene som forekommer i kjernen.

Farmasøytiske hjelpestoffer som kan foreligge i løsningen av nanopartiklene, kan innordnes ifølge sin oppgave i klassene konserveringsmidler, pH-stabilisatorer, antioksi-danter, isotoniseringstilsetningsstoffer, peptisatorer og løsningsformidlere. Som ytterligere hjelpestoffer kan det anvendes medisinsk akseptable løsningsmidler, så som suk-kerløsninger, plasmautvidere, elektrolyttløsninger, fysiologisk koksaltløsning eller også vann ad injectionem, samt parenteralt anvendelige, oljeaktige "løsningsmidler".

Eksempler på farmaka som kan foreligge i nanopartikkel-løsningene, kan innordnes i gruppene antiallergika, anti-anafylaktika eller profylaktika, vasodilatorer eller vaso-konstriktorer, stoffer med innflytelse på gjennomblød-ningen, stoffer som innvirker på nanopartiklenes metabo-lisme, stoffer som innvirker på nanopartiklenes farmakoki-netikk, stoffer som forandrer jernbalansen, stoffer fra området for enzyminduktorer og inhibitorer, eller generelt mediatorer og antimediatorer. For anvendelse i terapien er hovedsakelig legemidler fra gruppene cytostatika, kjemoterapeutika, hormoner og antidiabetika av spesiell interesse .

De farmasøytiske midler kan derved være tilsatt i nanopar-tikkelløsningene som eventuell komponent eller også bundet til målpolymerene, og da kan polymerlegemiddelkonjugatet anvendes som målpolymeren.

Nanopartiklenes "fysiologiske" fordelingsatferd kan forandres ikke bare via innflytelse av "fysiologiske" faktorer, så som gjennomblødning, lymfestrøm og lymfeproduk-sjon og lignende ved farmaka, men in vivo-fordelingen kan også forandres ved enkle fysioterapeutiske foranstaltninger. Her skal bevegelse spesielt fremheves, som f.eks. målrettet kan "appliseres" ved en spasergang eller øvelse på ergometeret, og i motsetning til dette bevegelsesløs-het, så som f.eks. hos sengeliggende pasienter, og/eller anvendelse under narkose og lignende som fører til en fullstendig annen fordelingsatferd og -mønster. For det andre skal det spesielt nevnes tilførsel av varme som kan oppnås ved enkel anvendelse av rødt lys eller hel- henholdsvis delkroppsbad. Spesielt foretrukket er varmetil-førsel ved en hypertermianordning som anvendes i mange klinikker for målrettet varmetilførsel i den adjuvante tumorterapi. Ved målrettet lokal oppvarming kan "selekti-viteten" forbedres ved fysioterapeutisk samtidig behandling.

Den modulære fremstillings høye fleksibilitet muliggjør fri kombinasjon av målpolymer(ene), adsorpsjonsformidler(ne), farmasøytiske hjelpestoffer og farmaka samt å anvende vilkårlige sammensetninger av nanopartiklene i kombinasjon med fysioterapeutiske foranstaltninger.

Nanopartiklene henholdsvis løsningene kan sammensettes av mange forskjellige bestanddeler, så at det kan gis bare alminnelige angivelser om den eksakte sammensetning som er rettet mot den aktuelle anvendelse:

Nanopartiklenes samlede diameter inklusive alle tilset-ningsstoffer er høyst 10 ganger høyere (målt ved en laser-lysbrytningsmetode, PCS) enn diameteren for den jernholdige kjerne (målt ved elektronmikroskopi i en trans-misjonsanordning, TEM). Foretrukket er de kombinasjoner hvor diameteren av grunnbyggestenen (kjerne + primærkappe) forhøyes bare uvesentlig på grunn av målpolymeren eller kombinasjonen målpolymer og eventuelle tilsetninger, diameteren målt med PCS skal maksimalt ligge 20 % over grunnbyggestenens diameter.

Ved kombinasjonen av optimale fysikalske egenskaper hos grunnbyggestenene og et mangfold av mulige målpolymerer kan det fremstilles nanopartikler med hittil uoppnådd fleksibilitet og kvalitet for anvendelser som fordrer høy biologisk spesifisitet og høy fysikalsk kvalitet (f.eks. partikkelstørrelse, magnetiske egenskaper). Ved den modulære oppbygningsmåte og de dermed forbundne mange kombina-sjonsmuligheter fremkommer et bredt spektrum av mulige anvendelser: På grunn av sin høye fysikalske kvalitet og den spesielt gode styringsevne {"målsøkende evne") hos nanopartiklene ved fleksibel tilpasning (modulær oppbygning) hos målpolymeren (sekundærkappen) ved enhver oppgavestilling fremkommer mange bruksområder for spesielle indikasjoner, så som MR-lymfografi etter intravenøs eller lokal interstitiell avgivelse, tumorfremstilling, fremstilling av funksjoner eller ødelagte funksjoner, plakkfremstilling (ateroskle-rose imaginer ing) , fremstilling av tromber og karlukninger, MR-angiografi, perfusjonsundersøkelser, fremstilling av infarkter, fremstilling av endotelskader, reseptorimagine-ring, fremstilling av integriteten for blod-hjerneskranker osv. og for differensialdiagnose, spesielt for under-søkelse av tumorer/metastaser og hyperplastisk vev.

Partiklene egner seg på grunn av den meget gode fleksibilitet ved fremstillingen også for de forskjelligste bruksområder i in vi tro-diagnostikken, så som f.eks. som spesifikke bærere i magnetseparasjonsteknikken i EIA (Enzyme-Immuno-Assays). En kombinasjon av in vitro-metoder med et terapeutisk forsøk er selektiv uttømning av spesifikke faktorer fra blodet ("ex vivo-blodvasking").

De oppfinnelsesmessige nanopartikler oppviser høy egenfarging, og ved kombinasjon med en målpolymer som fører til spesielt høy akkumulasjon i lymfeknutene, egner partiklene seg fremragende som intraoperative markeringssubstanser for å farge lymfeknuter. Ved mange kirurgiske tumorfjer-ninger fjernes lymfeknutene samtidig, og forhåndsapplika-sjonen av nanopartiklene gjør det betydelig lettere for kirurgen å identifisere de delvis ytterst små lymfeknuter i det omgivende vev. Nanopartiklene oppviser for denne indikasjon et spesielt bredt utnyttbart tidsvindu og kan appliseres fra 60 minutter til mer enn 24 timer før opera-sjonens begynnelse.

I tillegg til den visuelle fremstilling av lymfeknuter fremkommer ved intratumoral applikasjon eller applikasjon i tumorperiferien den mulighet for det første å farge tumorperiferien, og dermed høyne tumorens avgrensbarhet til det omgivende vev, og for det andre bortføres partiklene fra tumorarealet over de samme fjernende lymfekar, over hvilke også tumoren ville metastaseres. Nanopartiklene oppviser altså lymfeveiene henholdsvis lymfeknutene som er spesielt predestinert for en metastasering.

I tillegg til anvendelsen som intravenøst kontrastmiddel kan partiklene også appliseres lokalt. Den lokale anvendelse kan f.eks. være fordelaktig ved et mammakarsinom, da det bare skal fremstilles et begrenset område, og ved målrettet anvendelse deponeres på den ene side høye konsentrasjoner av kontrastmidlet i målområdet, og for det andre belastes ikke resten av organismen. Indirekte målrettet applikasjon i interstitium rundt bestemte lymfeknuter kan også være nødvendig for å bekrefte en diagnose hvis det etter intravenøs avgivelse er fremkommet et mistenkelig, men usikkert funn.

Et ytterligere anvendelsesområde for nanopartiklene er å anvende dem som forsterkersubstans i in vivo~diagnostikken på grunnlag av høyømfintlige målemetoder (SQUID) for å måle magnetiseringen eller de magnetiske felt/strømtettheter. Utviklingen av høyømfintlige målemetoder på dette området har gjort det mulig å forfølge magnetiske partikler in vivo, så at, på samme måte som i scintigrafien med radioaktive substanser, magnetiske partikler kan brukes for diagnose av funksjonsforstyrrelser og lesjoner.

I terapien kan partiklene anvendes som medisinbærere. Nanopartiklenes spesifisitet utnyttes for transport av legemidler til virkestedet. Medisinene kan da være inkor-porert i den jernholdige kjerne, adsorberes på overflaten eller også være kjemisk bundet til syntesepolymeren og/eller målpolymeren. Ett alternativ er å adsorbere legemiddel -polymerkonjugater eller å binde legemidler til adsorpsjonsformidlere, således er det f.eks. mulig å fremstille bestemte peptidsekvenser med høy adsorpsjon på jernoksidoverflaten. En mulig indikasjon er her også å an-rike høye konsentrasjoner av lavmolekylære kjemoterapeutika i fagocytterende celler, hvilket f.eks. er terapeutisk nødvendig ved mange sykdommer med mikroorganismer som er resistente i RES-celler. Ved alle terapeutiske forsøk kan nanopartikkellegemiddelsystemene også akkumuleres se-lektivt i målområdet ved eksterne magnetfelt. Ved spesielle problemstillinger finnes også den mulighet å implan-tere små magneter for styring mot målområdet, f.eks. i et tumorareal.

I tillegg til å anvende nanopartiklene som bærere for målrettet transport av legemidler inn i bestemte vev, kan det fremstilles legemiddelformer med modifisert virkestoffri-givelse. Frigivelsen av virkestoffet kan da styres ved biologisk spaltbare legemiddelkonjugater, eller den kan foregå ved innleiring av legemidlet i forskjellige kompo-nenter i nanopartikkelen med forskjellig bionedbrytning. En mulig indikasjon er f.eks. å anvende nanopartiklene som depotlegemiddelform for administrasjon av hormoner.

Også anvendelse i nye terapeutiske systemer hvor frigivelsen av legemidlet induseres og styres via nanopartiklenes magnetiske egenskaper over en "magnetisk bryter", som f.eks. også kan reguleres eksternt, er tenkelig. En viktig indikasjon er her utviklingen av terapeutiske systemer med regulerbar frigivelse av antidiabetika for behandling av diabetes mellitus.

Som legemidler som kan transporteres med nanopartiklene målrettet til virkestedet, kommer spesielt kjemoterapeutika og cytostatika i betraktning. Også den mikrobielle terapi fordrer ofte målrettet transport av legemidlet til virkestedet (f.eks. tuberkulose, resistente mikroorganismer i makrofager). Som legemidler for terapeutiske systemer, hvor frigivelsen skjer via nanopartiklenes magnetiske egenskaper, kommer i tillegg til andre spesielle anti-mikrobiotika hormoner, antidiabetika, cytostatika og kjemoterapeutika i betraktning.

I tillegg til indirekte terapeutisk anvendelse kan nanopartiklene også selv benyttes som "legemiddel", således f.eks. som adsorberingsmiddel i hypertermien eller i M6ssbauer-kjerneabsorpsjonsterapien, eller ved tilsvarende merking med bor eller gadolinium i elektroninnfangingsterapien. Også ved merking av nanopartiklene med radioaktive elementer, som kan skje i kjernen eller også ved adsorpsjon av egnede molekyler med isotoper eller molekyler på grunnbyggestenen, foreligger det en mulighet for anvendelse av nanopartiklene i den medisinske stråleterapi.

En foretrukket anvendelse av nanopartiklene i stråletera-pien er f.eks. gitt ved at nanopartiklene enten inneholder en "selvstråler" via den radioaktive isotop <ss>Fe eller ved at nanopartiklene inneholder en isotop som kan aktiveres via en ekstern "aktivering" i en strålende isotop. For eksempel kan kjernen inneholde <1S7>Gd, og den eksterne aktivering kan gå tilbake til nøytroner.

En ytterligere anvendelse av nanopartiklene i stråletera-pien fremkommer ved muligheten til å forandre nanopartiklene i kjernen, i syntese- eller i målpolymeren eller også i adsorpsjonsformidleren således at de inneholder selvstrålere, så som f.eks. <123>I eller <125>l. Alternativt kan nanopartiklene også inneholde en isotop som først ved ekstern aktivering overføres til en strålende isotop. Ett eksempel på dette er f.eks. markeringen av målpolymeren med jod og ekstern aktivering av jod-K-kanten med mono-energetisk røntgenstråling.

De oppfinnelsesmessige nanopartikler kan også anvendes for fjerning av bakterier, virus, endo- og eksotoksiner fra vasalrommet, hvorved for det første vekselvirkningen med nanopartiklene i seg selv kan føre til inaktivering, og for det andre kan vekselvirkningen for gjenkjennelse av konjugatet/adsorbatet foregå ved RES med påfølgende intra-cellulær inaktivering.

Oppfinnelsen illustreres nærmere ved hjelp av de påføl-gende eksempler under anvendelse av illustrasjonene 1-35.

I detalj vises:

Eksempler for fremstilling og anvendelse

A: Fremstilling av syntesepolymerer

Al Syntese av ( mono) karboksydekstran ( CDx)

100 g dekstran 4 oppløses i 500 ml vann og oppvarmes til 60 °C. Under omrøring tilsettes ca. 55 ml ca. 10 N natronlut. Etter 5 timers reaksjonstid nøytraliseres (delvis) løsningen til pH 8. Den brune løsning renses deretter over en blandingssjiktioneutbytter. Fraksjonene med sure egenskaper slås sammen og konsentreres i et rotasjonsinndamp-ningsapparat ved 40 °C i vakuum. Deretter foretas fryse-tørking .

FTIR-spekteret (kaliumbromid) for det modifiserte dekstran {= karboksydekstran) er fremstilt i illustrasjon 3.

A2 Syntese av polvkarboksvdekstran ( P- CDx)

10 g dekstran T10 innveies i en 250 ml 2-halset kolbe, og det tilsettes 100 ml 4 N NaOH. Kolbens hals utstyres med en tilbakeløpskjøler, og løsningen oppvarmes deretter til ca. 80 °C. Under omrøring (magnetrører) tilsettes porsjons-vis gjennom den andre inngang 30 g 6-bromheksansyre. Etter tilsetningen lukkes tilgangen med en kork, og reaksjonsblandingen omrøres videre i 3 timer. Etter reaksjonen nøytraliseres løsningen under et avtrekk med 6 N HCl, og deretter forhåndskonsentreres i et rotasjonsinndampnings-apparat (60 °C, vakuum). Separasjonen av det ikke omsatte reagens henholdsvis rensingen av det modifiserte karboksydekstran skjer ved felling med etanol. Den hvite felling vaskes, oppløses i destillert vann og filtreres deretter gjennom 0,22 fim filter og lyofiliseres.

FTIR-spekteret for polykarboksydekstranet er angitt i illustrasjon 4.

B: Fremstilling av råsubstansene

Bl Fremstilling fra CDx med ammoniakkgass

5,0 g monokarboksydekstran (CDx, eksempel Al) med en molekylvekt på ca. 2000 Da oppløses i 17,5 ml destillert vann. Løsningen utgasses ved innblåsning av nitrogen. I et reagensglass innføres 6,7 ml 1 molar jern-III-klorid-heksa-hydratløsning og utgasses med nitrogen. Til jern-III-løs-ningen tilsettes 648 mg jern-II-klorid-tetrahydrat og opp-løses i nitrogenstrømmen. Polymerløsningen oppvarmes til 75 °C og tilsettes til jernløsningen (under nitrogenutgassing) . Reaksjonsblandingen gjøres alkalisk mens den er varm under god omrøring ved hurtig innledning av ammoniakk

fra en gassflaske. Deretter oppvarmes reaksjonsløsningen i ca. 1 time under tilbakeløpsbetingelser. Deretter oppvarmes enda i 10 minutter i en åpen kolbe for å drive ut den ikke omsatte ammoniakk. Etter avkjøling sentrifugeres i 30 minutter ved 2500 g, og filtratet konsentreres i et rota-sjons inndampningsapparat til ca. 7 ml, pH-verdien kontrolleres og nøytraliseres eventuelt, og etter konsentrasjonsbestemmelsen med destillert vann innstilles til en ca. 1 molar jernkonsentrasjon, og deretter filtreres løsningen gjennom 0,22 nm filter. Løsningen kan steriliseres i en autoklav med vanndamp (fremgangsmåte A121).

Under eternarkose implanteres i forsøksdyrenes aorta caro-tis communis (rotte, ca. 200 g) et 50,5 cm langt kateter som er fylt med heparinisert koksaltløsning (0,2 ml) og skyves ca. 1,5 cm nærmere hjertet. Kateterets fritt beve-gelige ende ble ført utover og festet med histoakryl. Cirka 1 time etter operasjonen appliseres prøvesubstansen i.v. over halevenen (ca. 1 ml/minutt). Bloduttakene skjedde ved forskjellige tidspunkter tilsvarende den for-ventede eliminasjonshastighet for prøvesubstansene i det våkne dyr. Mot slutten av forsøket ble dyrene avlivet under eternarkose ved blødning fra vena cava.

• Halveringstid for TA- og T2-effekten

Blodprøvene sentrifugeres i 15 minutter ved 2900 rpm

(1000 g), og deretter tas fra supernatanten 0,250 ml og fortynnes med destillert vann til 2,0 ml, og blandingen tempereres deretter til 40 °C. "Konsentrasjonsbestemmelsen" foretas ved måling av Tx a-relaksasjonstidene med et relak-someter pcl20 (Bruker, Tyskland). Målingen ble utført med en 180°-90°-lR{Inversion Recovery)-sekvens (TJ henholdsvis med en CPMG-sekvens (T2) .

Vurderingen ble foretatt med en farmakokinetisk tokompartimentmodell, og beregningen av dataene skjedde ved hjelp av det farmakokinetiske dataprogram TOPFIT, idet konsentrasjonene, uttrykt som resiproke T12-tider (relaksa-sjonsrater), med fradrag av tomverdien ble fremstilt som funksjon av tiden. TOPFIT beregner ved lineær regresjon av den halvlogaritmiske "konsentrasjons"-tid-fremstilling kurvenes stigning og derav effekthalveringstidene.

• Halveringstid over jerninnholdet

Fra løsningene for relaksasjonstidsbestemmelsen ble det avpipettert 800 /il som ble oppløst i konsentrert salpeter-syre og fylt opp til 10,0 ml destillert vann, og deretter ble jerninnholdet kvantifisert med atomemisjonsspektroskopi (AES). Under hensyntagen til fortynningsfak-torene foretas deretter omregningen i blodkonsentrasjonene og beregningen via et konsentrasjonstidsdiagram med

TOPFIT.

B2 Fremstilling fra P- CDx med NaOH og Fe- III- sitrat og Fe- II- glukonat

5,0 g polykarboksydekstran {eksempel A2) med en molekylvekt på ca. 12000 Da oppløses i 17,5 ml destillert vann. Løsningen utgasses ved innblåsning av nitrogen. I et reagensglass innføres 6,7 ml 1 molar jern-III-sitrat-mono-hydratløsning og utgasses med nitrogen. Til jern-III-løs-ningen tilsettes 1,635 g jern-II-glukonat-trihydrat og oppløses i nitrogenstrømmen. Polymerløsningen oppvarmes til ca. 75 °C, og jernløsningen tilsettes (under nitrogenutgassing). Til reaksjonsblandingen tilsettes mens den er varm og godt omrørt ca. 12 ml 3 N natronlut i løpet av 30 sekunder. Deretter nøytraliseres reaksjonsløsningen med ca. 6 N saltsyre og oppvarmes i ca. 1 time under tilbake-løpsbetingelser. Etter avkjølingen sentrifugeres i 30 minutter ved 2500 g, og filtratet konsentreres i en rotasjonsinndamper til ca. 7 ml, pH-verdien kontrolleres, og etter konsentrasjonsbestemmelsen innstilles blandingen med destillert vann til en ca. 1 molar jernkonsentrasjon og filtreres deretter gjennom et 0,22 fim filter. Løsningen kan steriliseres i en autoklav {fremgangsmåte A121) .

B3 Fremstillin<g> fra CDx med Fe- III- NTA og ammoniumhydrok-sid 5,0 g (mono)karboksydekstran (CDx, eksempel Al) med en mo-lekyl vekt på ca. 2000 Da oppløses i 35 ml destillert vann. Løsningen utgasses ved innblåsning av nitrogen. Reaksjonsblandingen oppvarmes, og det tilsettes under god omrøring konsentrert ammoniumhydroksidløsning (32 %) til det er oppnådd en pH-verdi på 10. I et reagensglass innføres 6,85 ml 1 molar jern-III-løsning, det tilsettes den ekvimolare mengde NTA og utgasses med nitrogen. Til jern-III-løs-ningen tilsettes 667 mg jern-II-klorid-tetrahydrat og op-pløses i nitrogenstrømmen. Jernløsningen tilsettes i løpet av 20 sekunder til den alkaliske polymerløsning. Deretter nøytraliseres reaksjonsløsningen med ca. 6 N saltsyre og oppvarmes i ca. 1 time under tilbakeløpsbetingelser. Etter avkjølingen sentrifugeres i 30 minutter ved 2500 g, og filtratet konsentreres i en rotasjonsinndamper til ca. 6 ml, pH-verdien kontrolleres, og etter konsentrasjonsbestemmelsen innstilles løsningen til en ca. 1 molar jernkonsentrasjon, og deretter filtreres gjennom et 0,22 fim filter. Løsningen kan steriliseres i en autoklav.

B4 Fremstillin<g> fra P- CDx med jern- III og reduksjonsmiddel , natronlut

5,0 g polykarboksydekstran {eksempel A2) med en molekylvekt på ca. 12000 Da oppløses i 17,5 ml destillert vann. Løsningen utgasses ved innblåsning av nitrogen. Til poly-

merløsningen tilsettes 10 ml l molar jern-III-klorid-hek-sahydratløsning, og det utgasses igjen med nitrogen. Poly-merløsningen oppvarmes til ca. 75 °C, og deretter tilsettes 113,6 mg hydroksylamin-HC1 (under nitrogenutgassing). Til reaksjonsblandingen tilsettes mens den er varm og under omrøring ca. 12 ml 3 N natronlut i løpet av 30 sekunder. Deretter nøytraliseres reaksjonsløsningen med ca. 6 N saltsyre og oppvarmes i ca. 1 time under tilbakeløpsbe-tingelser. Etter avkjølingen sentrifugeres i 30 minutter ved 2500 g, og filtratet konsentreres i en rotasjonsinndamper til ca. 7 ml, pH-verdien kontrolleres, og etter konsentrasjonsbestemmelsen innstilles med destillert vann til en ca. 1 molar jernkonsentrasjon, og deretter filtreres løsningen gjennom et 0,22 /xm filter. Løsningen kan steriliseres i en autoklav (fremgangsmåte A121).

B5 Fremstilling med en blanding av dekstran 4 og dekstran 15

5,0 g av en l:l-blanding av dekstran 4 og dekstran 15 med en molekylvekt på ca. 4000-6000 Da henholdsvis 15000-20000 oppløses i 20 ml destillert vann. Den fargeløse polymer-

løsning innstilles med 3 natronlut til en pH-verdi på ca. 12 og kokes i 1 time under tilbakeløp og nøytraliseres deretter med ca. 6 N HC1. Den mørkerød-brune løsning utgasses ved innblåsning av nitrogen. I et reagensglass inn-føres 6,7 ml 1 molar jern-III-klorid-heksahydratløsning, og det utgasses med nitrogen. Til jern-III-løsningen tilsettes 648 mg jern-II-klorid-tetrahydrat og oppløses i nitrogenstrømmen. Polymerløsningen opp-varmes ved ca. 75 °C, og jernløsningen tilsettes (under nitrogenutgassing). Til reaksjonsblandingen tilsettes mens den er varm og under omrøring ca. 11,5 ml 3 N natronlut i løpet av 30 sekunder. Deretter nøytraliseres reaksjonsløsningen med ca. 6 N saltsyre og oppvarmes i ca. l time under tilbake-løpsbetingelser. Etter avkjølingen sentrifugeres i 30 minutter ved 2500 g, og filtratet konsentreres i en ro-tas jonsinndamper til ca. 8 ml, pH-verdien kontrolleres, og etter konsentrasjonsbestemmelsen innstilles med destillert vann til en ca. 1 molar jernkonsentrasjon, og deretter filtreres gjennom et 0,22 jim filter. Løsningen kan steriliseres i en autoklav ifølge fremgangsmåten A121.

C: Fremstilling av grunnsubstansene

Cl Dialyse mot vann

5 ml av løsningen ifølge eksempel Bl fylles i en Visking-dialyseslange og dialyseres under omrøring fem ganger i 6 timer mot 1 1 friskt destillert vann. Retentatet innstilles ved fortynning med destillert vann til en jernkonsentrasjon på 200 mmol/1, og deretter fylles løsningen gjennom sterilt 0,22 fim filter (celluloseacetat) i porsjoner å 5 ml på sterile 10 ml flasker. Den desorberte løsning kan steriliseres i en autoklav.

C2 Dialyse mot 20 mmol natriumlaktat

5 ml av løsningen ifølge eksempel Bl fylles i en Visking-dialyseslange og dialyseres under omrøring fem ganger i 6 timer mot 1 1 frisk natriumlaktatløsning (20 mmol/1, pH 7). Deretter dialyseres enda to ganger i 5 timer mot 1 1 friskt destillert vann. Retentatet innstilles ved fortynning med destillert vann til en jernkonsentrasjon på 200 mmol/1, og deretter fylles løsningen gjennom sterilt 0,22 fim filter (celluloseacetat) i porsjoner å 5 ml på sterile 10 ml flasker.

C3 Ultrafiltrering med amicon

5 ml av løsningen ifølge eksempel Bl pipetteres i prepara-tive ultrafiltreringsenheter og fylles opp med destillert vann til 15 ml (Centriprep 100, "Cut off" 100 kDa) og ultrafiltreres i 1 time ved 1000 g. Deretter kastes filtratet, og retentatbeholderen oppfylles igjen til 15 mm-merket med friskt destillert vann og ultrafiltreres på nytt. Retentatet innstilles ved fortynning med destillert vann til en jernkonsentrasjon på 200 mmol/1, og deretter fylles det gjennom sterilt 0,22 fim filter (celluloseacetat) i porsjoner å 5 ml på sterile 10 ml flasker.

C4 Kromatoarafisk separasjon

5 ml av løsningen ifølge eksempel Bl tilsettes med en 10 ml "Superloop" på en S400HR Sephacryl-søyle (100 x 5 cm) og elueres med 50 mM sitronsyre/250 mM mannitt med en

strøm på 300 ml/time. Fraksjonen på 450 ml til 840 ml opp-samles og konsentreres i en rotasjonsinndamper ved 60 °C i vakuum til ca. 50 ml. Konsentratet dialyseres tre ganger i 6 timer mot destillert vann, konsentreres på nytt i en rotasjonsinndamper og innstilles etter jernbestemmelsen

til en konsentrasjon på 200 mmol jern/l. Løsningen filtreres gjennom 0,22 /*m celluloseacetat f ilter og fylles i porsjoner å 5 ml på steriliserte 10 ml flasker. Løsningen kan steriliseres i en autoklav.

De fysikokjemiske data for de magnetiske egenskaper og størrelsesparametrene er i samsvar med utgangsforbindel-sens verdier (eksempel Bl).

D: Applikasjonsløsninger

Dl Dekstran T10

5,0 ml løsning ifølge eksempel Cl med en konsentrasjon på 200 mmol Fe/l (tilsvarende 56 mg totaljern) innføres i en 10 ml flaske. 33,6 mg dekstran T10 som målpolymer oppløses i 6,0 ml destillert vann, og 5,0 ml tilsettes via en sprøyte med filterinnlegg (0,22 jun) til jernoksidløsningen under aseptiske betingelser. Vektkvotienten polymer til jern er 1 (restsyntesepolymer = 28 mg + målpolymer =28 mg). Tilberedningen inneholder nå 10 ml 100 mmolar (jern) løsning som er egnet for direkte anvendelse i intravenøs MR-lymfografi.

D2 Dekstran FP1- fremstilling fra to løsninger

5,0 ml løsning ifølge eksempel Cl med en konsentrasjon på 200 mmol Fe/l (tilsvarende 56 mg totaljern) innføres i en 10 ml flaske. 302,4 mg dekstran FP1 som målpolymer opp-løses i 6,0 ml destillert vann, og 5,0 ml tilsettes via en sprøyte med f ilterinnlegg (0,22 /im) til jernoksidløsningen under aseptiske betingelser. Vektkvotienten polymer til jern er 5 (restsyntesepolymer = 28 mg + målpolymer =252 mg). Tilberedningen inneholder nå 10 ml 100 mmolar (jern) løsning som er egnet for direkte anvendelse i intravenøs MR-lymfografi.

D3 Dekstran FP1 som lyofilisat

5,0 ml løsning ifølge eksempel Cl med en konsentrasjon på 200 mmol Fe/l (tilsvarende 56 mg totaljern) innføres i en 10 ml flaske. 302,4 mg dekstran FP1 som målpolymer opp-løses i 6,0 ml destillert vann, og 5,0 ml tilsettes via en sprøyte med f ilterinnlegg (0,22 /im) til jernoksidløsningen under aseptiske betingelser. Vektkvotienten polymer til jern er 5 (restsyntesepolymer = 28 mg + målpolymer = 252 mg). Løsningen lyofiliseres i injeksjonsflasken og lukkes deretter.

Tilberedningen av applikasjonsløsningen skjer ved tilsetning av 10 ml fysiologisk koksaltløsning; flasken inneholder nå 10 ml 100 mmolar (jern) løsning som er egnet for intravenøs MR-lymfografi.

D4 Dekstran FP1

252 mg dekstran PFI som målpolymer innveies i en 5 ml in-jeksjonsflaske, og det fylles på 5,0 ml løsning ifølge eksempel Cl med en konsentrasjon på 200 mmol Fe/l (tilsvarende 56 mg totaljern), og flasken lukkes deretter. Ved dreining av injeksjonsflasken oppløses dekstran FP1. Vektkvotienten polymer til jern er 5 (restsyntesepolymer = 28 mg + målpolymer =252 mg). Tilberedningen inneholder nå 5 ml 200 mmolar (jern) løsning som er egnet for direkte anvendelse i intravenøs MR-lymfografi.

D5 Laminarin

5,0 ml løsning ifølge eksempel Cl med en konsentrasjon på 200 mmol Fe/l (tilsvarende 56 mg totaljern) innføres i en 10 ml flaske. 33,6 mg laminarin som målpolymer oppløses i 6,0 ml destillert vann, og 5,0 ml tilsettes via en sprøyte med f ilterinnlegg (0,22 /im) til jernoksidløsningen under aseptiske betingelser. Vektkvotienten polymer til jern er 5 (restsyntesepolymer = 28 mg + målpolymer = 28 mg). Tilberedningen inneholder nå 10 ml 100 mmolar (jern) løsning som er egnet for direkte anvendelse i intravenøs MR-lymfografi.

D6 Med transferrin

5,0 ml løsning ifølge eksempel Cl med en konsentrasjon på 200 mmol Fe/l (tilsvarende 56 mg totaljern) innføres i en 10 ml flaske. 33,6 mg humant Fe2-transferrin som målpolymer oppløses i 6,0 ml destillert vann, og 5,0 ml tilsettes via en sprøyte med f ilterinnlegg (0,22 /im) til jernoksidløs-ningen under aseptiske betingelser. Vektkvotienten polymer til jern er 1 (restsyntesepolymer = 28 mg + målpolymer = 28 mg). Tilberedningen inneholder nå 10 ml 100 mmolar

(jern) løsning som er egnet for anvendelse som spesifikt kontrastmiddel for fremstilling av prolifererende celler (tumorer).

D7 Med endotelinagonist

5,0 ml løsning ifølge eksempel Cl med en konsentrasjon på 200 mmol Fe/l (tilsvarende 56 mg totaljern) innføres i en 10 ml flaske. 33,6 mg av et endotelinreseptorspesifikt heptapeptid [Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp] som målpolymer oppløses i 6,0 ml destillert vann, og 5,0 ml tilsettes via en sprøyte med f ilterinnlegg (0,22 fim) til jernoksidløs-ningen under aseptiske betingelser. Vektkvotienten polymer til jern er 1 (restsyntesepolymer = 28 mg + målpolymer = 28 mg). Tilberedningen inneholder nå 10 ml 100 mmolar (jern) løsning som er egnet for anvendelse i intravenøs MR-plakkimaginering (ateroskleroseimaginering).

E: Anvendelser

Anvendelseseksempel El

• MR-lymfografi i rotte

Mål: Sammenligning av den relative signalintensitet i forskjellige lymfeknuter/lymfeknutegrupper mellom utgangsfor-bindelsen (syntesepolymer = målpolymer) og en etter desorpsjons-adsorpsjonsmetoden fremstilt modifikasjon (syntesepolymer £ målpolymer) i dyremodellen rotte.

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D5);

sammenligning = grunnbyggesten ifølge eksempel Cl {= D5 uten målpolymer)

Dyr: Rotte, SPF Han-Wistar; ca. 150 g

Dosering: 100 fimol Fe/kg kroppsvekt (KGW)

Tidspunkt: 24 t p.i. (etter injeksjonen)

MR-metode:

Apparat: Siemens Magnetom 1,5 T

MR-helkroppstomograf med ekstremitetsspole MR-parameter: Synsfelt (FOV) = 150 mm, matriks = 256 x 256; skive = 3 mm, sjiktorientering = frontal

Sekvens 1: Protontetthetsbetont "Spin-Echo"-sekvens

(SE) med TR = 2000 ms og TE = 15 ms Sekvens 2: T2-vektlagt gradient-ekkosekvens (GE) med TR

= 135 ms og TE = 15 ms; FA = 15°.

Ex vivo-mode11:

• Lymfeknuteanrikning i rotter og kaniner

For undersøkelse av anrikningen og fordelingen av substansene i forskjellige lymfeknuter/lymfeknutegrupper ble et ex vivo-agarfantom anvendt. Denne ex vivo-modell har den fordel at også i små forsøksdyr (mus, rotte, kanin) kan man vurdere akkumulasjonen i forskjellige sentrale og perifere lymfeknuter (grupper) og muliggjør dermed også utsagn om homogeniteten i fordelingen; en kvantifisering av signalinnflytelsen er mulig.

Forsøksdyrene (mus, rotte eller kanin) injiseres med en løsning av nanopartiklene via nålevenen (bolus). Etter 24 timer avlives dyrene, og forskjellige lymfeknuter henholdsvis lymfeknutegrupper prepareres (Lnn. popliteales, Lnn. mandibulares, Lnn. iliacales, Lnn. axillares, Lnn. mandibulares, Lnn. inguinales). Lymfeknutene helles deretter i et agarfantom og oppbevares i kjøleskap inntil MR-målingen (maks. 24 timer).

• Fremstilling av ex vivo-agarosefantomet

For fremstilling av fantomet suspenderes 10 g agar-agar for mikrobiologi i 500 ml destillert vann som er tilsatt 0,5 ml magnevist (0,5 mol/l gadolinium-DTPA-dimeglumin) for en signalhomogen bakgrunn i MR-bildet. Suspensjonen kokes opp og avkjøles deretter til ca. 80 °C og holdes ved denne temperatur. Cirka halvparten av agarløsningen helles i et sjikt på 0,5-1 cm i en plastikkskål. Etter avkjøling anordnes organprøvene på agarsjiktet (tilsvarende venstre-høyre kroppshalvdel henholdsvis i "fysiologisk rekkefølge" ovenfra og nedover) og fikseres med litt agarløsning (Pasteur-pipette). Deretter helles et andre sjikt agarløs-ning over vevsprøvene. Fantomet måles i løpet av 24 timer og lagres i kjøleskap inntil undersøkelsen.

For kontroll (organtomverdier) medtas dyr uten injeksjon av nanopartikler, og vevene prepareres identisk henholdsvis det lages et tilsvarende fantom.

I tillegg til den visuelle vurdering foretas for det første en kvantifisering av den relative signalreduksjon ved hjelp av ligningen

og for det andre tas vevsprøvene etter MR-målingen igjen forsiktig ut av agarfantomet, oppløses i konsentrert sal-petersyre, og deretter kvantifiseres jerninnholdet med ICP-AES ("inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy"). Fra adekvat behandlede kontrolldyr uten applikasjon av nanopartikler fikk man tomverdiene som det ble tatt hensyn til ved jernbestemmelsen i prøvene.

Resultater:

Illustrasjon 5: MR-bilde av lymfeknuter innleiret i aga- rose; reseksjon 24 t etter applikasjon av sammenligningssubstansen (eksempel C2, venstre) henholdsvis den modifiserte substans ifølge eksempel D2 (høyre);

dosen var hver gang 100 /imol Fe/kg.

Illustrasjon 6: Modifisert ladning versus originalsub-stans: kvantitativ beregning (fra illustrasjon 5) av de relative signalintensiteter for SE 2000/15 i forskjellige lymfeknuter hos rotte 24 t etter magnetittapp-likasjon (100 /«noi Fe/kg) .

Illustrasjon 7: Modifisert ladning versus originalsubs-tans: kvantitativ beregning (fra illustrasjon 5) av de relative signalintensiteter GE 135/15/15° i forskjellige lymfeknuter hos rotte 24 t etter magnetittapp-likasjon (100 /imol Fe/kg) .

Vurderingen av innflytelsen av den relative lymfonodale signalintensitet (illustrasjon 6 = SE; illustrasjon 7 = GE) av de spesifikke nanopartikler henholdsvis utgangssubstansen viser tydelig den mer homogene anrikning av den modifiserte substans i lymfeknutene. Den lymfonodale sig-nal reduksjon av mandibulæe, aksillære, iliakale, popliteale lymfeknuter samt den midlere anrikning i alle lymfeknutegrupper ved den med dekstran FP1 som sekundærkappe modifiserte ladning atskiller seg signifikant (t-Test, p < 0,05) fra den umodifiserte utgangsforbindelse (illustrasjonene 6 og 7). De spesifikke nanopartiklers overlegenhet vises tydelig allerede ved den optiske bedømmelse av "svertingen" av de enkelte lymfeknuter i illustrasjon 5. Spesielt bemerkelsesverdig er homogeniteten i fordelingen i alle undersøkte lymfeknuter.

Anvendelseseksempel E2

■ MR-lymfografi i kanin

Mål: Sammenligning av den relative signalintensitet i forskjellige lymfeknuter/lymfeknutegrupper mellom utgangsfor-bindelsen (syntesepolymer = målpolymer) og en etter desorpsjons-adsorpsjonsmetoden fremstilt modifikasjon (syntesepolymer ^ målpolymer) i dyremodellen kanin.

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D2);

sammenligning = grunnbyggesten ifølge eksempel C2 (= D2 uten målpolymer)

Dyr: New-Zealandere, ca. 3 kg

Dosering: 150 /rniol Fe/kg kroppsvekt (KGW)

Tidspunkt: 24 t p.i. (etter injeksjonen)

MR-metode: MR-tomografi i SE- og GE-teknikk (se anvendelseseksempel El)

Tn vivo-

modell: Kanin med stimulerte lymfeknuter.

* Lymfeknutestimulering med eggeplomme

Kaninene ble behandlet på forhånd i ca. 1 uke før applikasjonen av prøvesubstansen. For induksjon av en reaktiv hy-perplasi (lymfeknuteforstørrelse) ble forsøksdyrene injisert tre ganger i en avstand av 2 dager med 0,5 ml av en steril eggeplommesuspensjon (oksoid) i.m. i låret og s.c. i siden.

Ex vivo-modell: agarosefantom (se anvendelseseksempel El)

Resultater:

Illustrasjon 8: Frontale pre- og postkontrast-MR-bilder av bekkenpartiet hos kanin i den proton-tetthetsaweide " Spin-Echo" - sekvens (SE 2000/15) (venstre: prekontrast;

høyre: spesifikk substans D2 (150 /xmol Fe/kg)).

Illustrasjon 9: Frontale pre- og postkontrast-MR-bilder av bekkenpartiet hos kanin i den protontetthetsveide "Spin-Echo"-sekvens (SE 2000/15) (venstre: prekontrast;

høyre: utgangs forbinde Ise C2 (150 jimol Fe/kg)).

Illustrasjon 10: Spesifikke nanopartikler versus uspesifikke utgangspartikler: relative signalintensiteter for SE 2000/15 i forskjellige lymfeknuter hos kanin 24 t p.i. (150 /imol Fe/kg, n = 3) (kvantitativ beregning ifølge illustrasjoner 8 og 9).

Illustrasjon 11: Frontale pre- og postkontrast-MR-bilder av bekkenpartiet hos kanin i den T2<*->veide "Gradient-Echo"-sekvens (GE 135/15/15°) (venstre: prekontrast; høyre: spesifikk substans D2 (150 /mol Fe/kg)).

Illustrasjon 12: Frontale pre- og postkontrast-MR-bilder av bekkenpartiet hos kanin i den T2<*->veide "Gradient-Echo"-sekvens (GE 135/15/15°) (venstre: prekontrast; høyre: utgangsforbindelse C2 (150 /imol Fe/kg)).

Illustrasjon 13: Spesifikke nanopartikler versus uspesifikke utgangspartikler: relative signalintensiteter for GE 135/15/15° i forskjellige lymfeknuter hos kanin 24 t p.i. (150 /imol Fe/kg, n = 3) (kvantitativ beregning ifølge illustrasjoner 11 og 12).

Illustrasjon 14: Ex vivo-MR-bilder (GE-sekvens) av agaroseinnleirede lymfeknuter i kanin;

dose 100 /imol Fe/kg; venstre: uspesifikke sammenligningspartikler; høyre: spesifikke nanopartikler.

Illustrasjon 15: Spesifikke nanopartikler versus uspesifikke utgangspartikler: relative signalintensiteter for GE 135/15/15° i forskjellige lymfeknuter hos kanin 24 t p.i. (150 /tmol Fe/kg, n = 3) .

Vurderingen av innflytelsen av den relative lymfonodale signalintensitet (illustrasjoner 8, 9 = SE; illustrasjoner 11, 12 = GE) av de spesifikke nanopartikler henholdsvis utgangspartikler viser mer homogen signalreduksjon i lymfeknuter ved den modifiserte substans. Den lymfonodale signalreduksjon (GE-sekvens) i de subiliakale, iliakale og popliteale lymfeknuter samt den midlere anrikning i alle lymfeknutegrupper ved de FP1-modifiserte nanopartikler atskiller seg signifikant {paret t-Test, p < 0,05) fra de umodifiserte sammenligningspartikler (illustrasjonen 13). Den mer homogene interlymfonodale signalinnflytelse {illustrasjon 15) av de spesifikke partikler kan også tydelig skjelnes på de MR-tomografiske bilder av agaroseinnleirede lymfeknuter (illustrasjon 14); her viser sammenligningssubstansen, likesom hos rotte, en sterk signalreduksjon, som imidlertid er begrenset til de mesenteriale lymfeknuter .

Anvendelseseksempel E3

* Lymfeknuteanrikningens doseavhengighet i rotte

Sammenligning av den relative signalintensitet i forskjellige lymfeknuter/lymfeknutegrupper mellom utgangsforbin-delsen (syntesepolymer = målpolymer) og en etter desorpsjons-adsorpsjonsmetoden fremstilt modifikasjon {syntesepolymer ^ målpolymer) i avhengighet av den appliserte dose.

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D2);

sammenligning = grunnbyggesten ifølge eksempel C2 {= D2 uten målpolymer)

Dyr: se anvendelseseksempel El

Dosering: 50-200 /imol Fe/kg kroppsvekt (KGW) (n =

3/dose)

Tidspunkt: 24 t p.i. (etter injeksjonen)

Metode: MR-tomografi i SE- og GE-teknikk (se anvendelseseksempel El)

Ex vivo-

modell: Agarosefantom (se anvendelseseksempel El).

Resultater:

Illustrasjon 16: Spesifikke nanopartikler ifølge eksempel D2 versus uspesifikke partikler ifølge eksempel C2: relative signalintensiteter i avhengighet av den appliserte dose for SE 2000/15 i forskjellige lymfeknuter hos rotte 24 t etter applikasjon av partiklene .

Illustrasjon 17: Spesifikke nanopartikler ifølge eksempel D2 versus uspesifikke partikler ifølge eksempel C2: relative signalintensiteter i avhengighet av den appliserte dose for GE 135/15/15° i forskjellige lymfeknuter hos rotte 24 t etter applikasjon av partiklene .

I alle lymfeknutegrupper med unntak av de mesenteriale og inguinale lymfeknuter fremkommer en signifikant (p < 0,05) bedre signalreduksjon ved den ifølge eksempel D2 modifiserte utgangsforbindelse allerede ved halvparten så høy dosering (200 /imol Fe/kg (C2) versus 100 /imol Fe/kg (D2)). De tydelige forskjeller viser seg også når man betrakter den midlere signalinnflytelse i alle lymfeknutestasjoner (se tabell 11).

Anvendelseseksempel E4

• Lymfeknuteanrikningens tidsavhengighet

Mål: Sammenligning av den relative signalintensitet i forskjellige lymfeknuter/lymfeknutegrupper mellom utgangsfor-bindelsen {syntesepolymer = målpolymer) og en etter desorpsjons-adsorpsjonsmetoden fremstilt modifikasjon (syntesepolymer + målpolymer) i avhengighet av tiden etter applikasj onen.

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D2);

sammenligning = grunnbyggesten ifølge eksempel C2 (= D2 uten målpolymer)

Dyr: rotte (se anvendelseseksempel El)

Dosering: 200 /imol Fe/kg kroppsvekt (KGW) (n =

3/tidspunkt)

Tidspunkt: 4-168 t p.i. (etter injeksjonen)

Metode: MR-tomografi i SE- og GE-teknikk (se anvendelseseksempel El)

Ex vivo-

modell: Agarosefantom (se anvendelseseksempel El).

Resultater:

Illustrasjon 18: Sammenlignlngssubstans ifølge eksempel C2: relative signalintensiteter for

SE 2000/15 i forskjellige lymfeknuter hos rotte i avhengighet av tiden etter applikasjonen.

Illustrasjon 19: Spesifikke nanopartikler ifølge eksempel D2: relative signalintensiteter for

SE 2000/15 i forskjellige lymfeknuter hos rotte i avhengighet av tiden etter applikasjonen.

Illustrasjon 20: Sammenligningssubstans ifølge eksempel C2: relative signalintensiteter for

GE 135/15/15° i forskjellige lymfeknuter hos rotte i avhengighet av tiden etter applikasjonen.

Illustrasjon 21: Spesifikke nanopartikler ifølge eksempel D2: relative signalintensiteter for

GE 135/15/15° i forskjellige lymfeknuter hos rotte i avhengighet av tiden etter applikasjonen.

De tidsavhengige MR-tomografiske undersøkelser for lymfo-nodal signalreduksjon etter intravenøs applikasjon av substansene viser tydelig at også avhengig av tiden forår-saker den ikke-spesifikke utgangssubstans en dårligere signalreduksjon i lymfeknutene enn den spesifikke modifikasjon ifølge eksempel D2.

Anvendelseseksempel E5

Kombinasjon med fysioterapeutiske foranstaltninger i eksemplet temperatur

Mål: Sammenligning av den relative signalintensitet i forskjellige lymfeknuter/lymfeknutegrupper i avhengighet av den ved et varmebad regulerte perifere kroppstemperatur.

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D2);

100 nmol Fe/kg kroppsvekt (KGW) (n = 7/gruppe)

Tider: 24 t p.i. (etter injeksjonen)

Metode: MR-tomografi i GE-teknikk (se anvendelseseksempel El) .

Hypertermimodell:

a Applikasjon av varme

For å undersøke innflytelsen av varme på anrikningen av kontrastmidlet i forskjellige lymfeknutegrupper ble rotter lagt i narkose i 3-4 timer, for deretter å legge dem i 2 timer i et vannbad. I dette vannbadet lå rottene med den venstre kroppsside på en varmeplate og med den høyre kroppsside på en like høy isolerende kunststoffplate som ikke ble oppvarmet. Derved oppstod en temperaturforskjell mellom vanntemperaturen på den venstre kroppsside og vanntemperaturen på den høyre kroppsside. Vanntemperaturen under rottenes venstre skulder var til å begynne med 41,0-41,5 °C, og etter 30 minutter pendlet temperaturen seg inn på den konstante verdi 41,5-42,0 °C. Under den høyre skulder var vanntemperaturen til å begynne med 37,0-37,5 °C, og etter 30 minutter ble det oppnådd en konstant temperatur på 37,5-38,0 °C. Etter at rottene hadde ligget 30 minutter i vannbadet, ble de injisert intravenøst med nanopartiklene i en dose på 100 pimol Fe/kg KGW som bolus. Etter ytterligere 1,5 time i vannbad ved konstante temperaturer ble rottene igjen lagt tilbake i buret, og 24 timer etter injeksjonen ble lymfeknutene preparert og undersøkt MR-to-mograf i sk.

Resultater:

Illustrasjon 22: Innflytelse av lymfeknuteanrikningen ved målrettet applikasjon av varme. På det venstre prekontrastbildet kan man ane de popliteale lymfeknuter bare som lyse flekker. På det høyre bildet er innflytelsen av varmebehandlingen tydelig vist. Den narkotiserte rottes venstre side lå på en isolerende kunststoffplate og hadde normal kroppstemperatur, mens den høyre side ble oppvarmet i et vannbad til 41,5-42,0. °C. Den "kalde" side viser praktisk talt ingen anrikning, mens den oppvarmede side oppviser en høy og homogen intralymfonodal akkumulasjon av nanopartikler (nanopartikler ifølge eksempel D2; 100 /unol/kg KGW; 24 t p.i.;

GE 135/15/15}.

Jn vivo-bildet (illustrasjon 22) viser på overbevisende måte varmebehandlingens virkninger. Mens den kalde, ikke-oppvarmede venstre side på rotten ikke viser noen synlig anrikning i de popliteale lymfeknuter, har den oppvarmede høyre side en høy og homogen signalutløsning (anrikning) i den iakttatte Lnn. popliteales.

For å kunne vise virkningene av oppvarmingen spesielt tydelig ble rottene narkotisert og lagt i varmebadet. Nar-kosen førte til en stillstand i den perifere muskelaktivi-tet, en redusert lymfestrøm og nedsatt karpermeabilitet, med den følge at uten oppvarming kan man praktisk talt ikke påvise noen anrikning av nanopartikler.

Anvendelseseksempel E6

• MR-angiografi

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D2)

Dyr: Rotte (se anvendelseseksempel El)

Dose: 20 /unol Fe/kg i.v.

Tidspunkt: 0-2 t p.i.

MR-teknikk:

Apparat: Siemens Magnetom 1,5 T

MR-helkroppstomograf med ekstremitetsspole MR-parameter: Siemens Magnetom 1,5 T, ekstremitetsspole,

dynamikk (transversal) med Tl-veid SE-sekvens (TR: 200 ms, TE: 10 ms), FOV 170 mm, matriks 256 x 256, SD: 3 mm; koronar MIPS av 3D-blitS (TR: 40 (60) ms, TE: 6 ms, FA 60 (40) °) og 3D-FISP-sekvens (TR: 40 ms,

TE: 7 ms, FA 35°), FOV 240 mm, matriks 256 x 256, SD: 17 mm

MR-vurdering: Signalintensiteter i benyttelsesdefinerte partier av interesse av kar (v. cava), lever, fett og muskel. Signalintensitetene kalkuleres standardisert med hensyn til bakgrunnen.

Resultater:

Illustrasjon 23: Transversaldynamikkstudie av rotteabdomen med en Tl-aweid SE-sekvens (TR: 200 ms, TE: 10 ms) etter bolusinjeksjon av de spesifikke nanopartikler ifølge eksempel D2 (dose 20 pmol Fe/kg; tydelig signal-forsterkning (1 minutt p.i.) i de intra-hepatiske kar og v. cava).

Illustrasjon 24: Sammenligning av de relative signalintensiteter for SE TR/TE 200 ms/10 ms i venøse kar og leverparenkym for de spesifikke nanopartikler ifølge eksempel D2 og den uspesifikke sammenligningssubstans ifølge eksempel C2; dose 20 /imol Fe/kg.

Illustrasjon 25: Koronare MIPS ("maximum-intensity projec-tions") av 3D-blitsbilder (TR: 40 ms, TE: 6 ms, FA 60°) ; sammenligning av de spesifikke nanopartikler ifølge eksempel D2 (venstre) med sammenligningssubstansen C2 (høyre) - dose hver gang 20 pmol Fe/kg.

Illustrasjonene 23 og 25 viser tydelig fordelene med de spesifikke nanopartikler (ifølge eksempel D2) i forhold til utgangssubstansen ifølge eksempel C2. Den grafiske sammenfatning av det tidsmessige signalforløp (illustrasjon 24) i vena cava henholdsvis i leverparenkym viser de spesifikke nanopartiklers fremragende egenskaper for anvendelse som kontrastmiddel i MR-angiografi. Forsterk-ningen er tre ganger høyere enn med kontrollsubstansen, og den opplysende virkning holder seg lenge og er meget konstant (diagnostisk vindu > 60 minutter).

Anvendelseseksempel E7

Visuell fremstilling av lymfeknuter i frisk rotte og i tumorbærende kanin

Mål: Påvisning av de oppfinnelsesmessige nanopartiklers egnethet for anvendelse som visuell merkesubstans i kirur-gisk medisin.

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D2)

Dyr: Rotte, SPF Han-Wistar; ca. 150 g. Russer-kaniner (Chbb: HM, Thomae GmbH) med implantert VX2-tumor (tumorbank fra det tyske kreftforskningssenter, Heidelberg); ca. 2,6 kg. Tumoren ble implantert ved inj ek-sjon av 3*10<*> levende tumorceller i den kau-dolaterale lårmuskulatur. Avbildningen skjer 20 dager etter implantasjonen

Dosering: Rotte: intravenøs injeksjon av 500 junol Fe/kg kroppsvekt. Kanin: interstitiell applikasjon av 20 /unol pr. pote

Tidspunkt: Rotte: 1, 4 og 24 t p.i. Kanin: 12 t p.i.

Resultater:

Illustrasjon 26: Oppfinnelsesmessige nanopartikler som "intraoperative" merkesubstanser for visuell påvisning av lymfeknuter (over-siktsbilde) .

Illustrasjon 27: Oppfinnelsesmessige nanopartikler som "intraoperative" merkesubstanser for visuell påvisning av lymfeknuter (detalj-bilde).

Illustrasjon 28: Demonstrasjon av metastaser i lymfeknuter ved visuell påvisning i metastatiske lymfeknuter i kanin. Metastasene fremtrer som lyse utsparinger i ellers homogent mørkfargede lymfeknuter.

Bildene av rottene (illustrasjoner 26 og 27) viser at et stort antall forskjellige lymfeknuter/lymfeknutegrupper kan farges ved intravenøs engangsapplikasjon av løsningen av nanopartikler. Lymfeknutene fremtrer tydelig fra det omgivende vev og kan derfor tydelig påvises for eventuelt å bli fjernet av en kirurg.

Undersøkelsene i VX2-tumorbærende kanin viser at ved anvendelse av de spesifikke nanopartikler er lymfeknutene i inntrekksområdet homogent farget også etter interstitiell applikasjon, og at også små metastaser kan avgrenses som lyse utsparinger i mørkt farget, friskt lymfeknutevev (illustrasjon 28).

Anvendelseseksempel E8

Celleeksperiment for påvisning av nanopartiklenes spesifisitet

Mål: Påvisning av spesifikt cellulært opptak (reseptorformidlet endocytose) av nanopartikler med transferrin som sekundærkappe (målpolymer).

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D6)

Sammenligning: Grunnsubstans ifølge eksempel Cl (D6 uten

transferrin)

Konsentrasjon: 0,5 mmol Fe/l medium

Tidspunkt: 18 timers inkubasjon ved 37 °C; 5 % C02 -

95 % luft.

Cellekultur:

• Celleopptak i humane myelomceller

Humane myelomceller (ATCC CRL 9068; cellelinje NCI H929) opptas i en konsentrasjon av minst 1-10<6> celler/ml i RPMI 1640 med 10 % FCS og 0,05 mmol/1 2-merkaptoetanol i en kultur (37 °C, 5 % karbondioksid; kulturflasker 225 cm<a>. Når cellene har oppnådd en konsentrasjon av ca. l,5-10s celler/ml, blir de sentrifugert og resuspendert i friskt medium. Cellene inkuberes med nanopartiklene i en konsentrasjon på 0,5 mmol/1 (beregnet som jern) i 18 timer. Cellene pelleteres og vaskes to ganger med PBS, og deretter bestemmes celletallet i en aliquot (Neubauer-telle-kammer) . Cellepelleten oppløses i 500 /il konsentrert sal-petersyre/100 /il hydrogenperoksid ved oppvarming og oppfylles til et volum på 5,0 ml. Deretter bestemmes jernkon-sentrasjonen med atomemisjonsspektroskopi (AES, påvis-ningsgrense 0,1 ppm) .

Resultater:

Illustrasjon 29: Celleopptak av spesifikke nanopartikler (med transferrin) sammenlignet med uspesifikk kontroll (nanopartikler uten transferrin). NCI-cellene (human myelom-cellelinje) akkumulerer de spesifikke partikler mer enn dobbelt så sterkt som kontrollpartiklene.

De spesifikke nanopartikler viser et tydelig høyere opptak ved myelom-NCI-929-cellene. Det over 50 % lavere opptak av nanopartikler uten målpolymer viser fordelene ved den oppfinnelsesmessige modifikasjon av de spesifikke nanopartikler .

Anvendelseseksempel E9

Ateroskleroseimaginering i Watanabe-kanin

(plakkfremstilling)

Mål: Fremstilling av aterosklerotisk plakk i kanin med nanopartikler, på hvilke det etter desorpsjonsad-sorpsjonsmetoden ble anbrakt et plakkaffint peptid (sekundærkappe, målpolymer).

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D7)

Dyr: Watanabe-kanin

Dosering: 200 pmo! Fe/kg kroppsvekt (KGW)

Tidspunkt: 5 t p.i. (etter injeksjonen)

MR-teknikk:

Apparat: Siemens Magnetom 1,5 T

MR-helkroppstomograf med ekstremitetsspole MR-parameter: Synsfelt (FOV) = 150 mm, matriks - 256 x 256; åpning = 3 mm, sjiktorientering = frontal

Sekvens 1: Protontetthetsbetont "Spin-Echo"-sekvens (SE) med TR = 2000 ms og TE = 15 ms

Sekvens 2: T2-veid gradient-ekkosekvens (GE) med TR =

135 ms og TE = 15 ms; FA = 15°

Ex vivo-

modell: Agarosefantom (se anvendelseseksempel El).

Aorta ble tatt ut, forsiktig oppskåret og deretter vasket med kald PBS-løsning for å fjerne ikke-bundne eller opp-tatte nanopartikler. Deretter ble aorta delt i to deler, et agarosefantom ble fremstilt og deretter MR-tomografisk undersøkt.

Histologi: Berliner-blått-farging.

Resultater:

Illustrasjon 30: Ex vivo-MR-tomografisk fremstilling av aterosklerotisk plakk i aorta fra en kanin med modifikasjonen D7 (dose 200 ( mol Fe/kg; reseksjon av aorta 5 t p.i.);

venstre: protontetthetsaweid "Spin-Echo"-sekvens; høyre: T2<*->veid gradient-ekkosekvens.

Illustrasjon 31: Histologisk jernpåvisning i den atero-sklerotiske membran fra kaninaorta med Berliner-blått-farging. Sammenligningen med det MR-tomografiske bildet

(GE 135/15/15°) viser at det histologisk påviste jern befinner seg på de steder hvor avbildningen av signalet på grunn av anrikning av de spesifikke nanopartikler er tydelig redusert. Reseksjon av aorta 5 t etter intravenøs applikasjon av

200 /imol Fe/kg av de spesifikke partikler ifølge eksempel D7.

Illustrasjon 32: Histokjemisk påvisning (Berliner-blått-farging) av de akkumulerte nanopartikler ifølge eksempel D7 i aorta fra en Watanabe -kanin. Den øvre avbildning viser en oversikt av den preparerte aorta på agar, og den nedre del viser den gode korrela-sjon mellom jernfargingen (blå granuler) og den også visuelt synlige plakk i den spesielt sterkt forandrede aortabue.

Det MR-tomografiske bildet ("ex vivo-bildet") av den preparerte aorta viser plakken som mørke flekker (signalreduksjon). Den histologiske påvisning ved hjelp av Berliner-blått-farging (jern) viser i sammenligning med det MR-tomografiske bildet (GE 135/15/15°) at det histologisk påviselige jern befinner seg på steder hvor signal-gjengivelsen er tydelig redusert på grunn av nanopartik-kelanrikningen. Funnet fra MR-biIdene korrelerer med den også visuelt tydelig synlige plakk. Mest plakk befinner seg i aortabuens område og bekreftes av det MR-tomografiske bildet og det histologiske bildet; også mindre plakk er godt synlig både i MR-bildet og med den histologiske j ernfarging.

Anvendelseseksempel E10

• Tumoranrikning i tumorbærende mus

Mål: Det skulle påvises at de oppfinnelsesmessige nanopartikler kan anrikes i tumorer. Undersøkelsene skal for det første vise at partiklene utgjør egnede legemiddelbærere for kjemoterapeutika og for det andre dokumentere at ved hjelp av nanopartiklene kan det kontrolleres om de terapeutiske midler i det hele tatt kan nå frem til det ønskede virkested, altså tumoren, slik at her foreligger et eksempel på kombinasjon av diagnose og terapi.

Substans: Spesifikke nanopartikler (eksempel D2)

Dyr: Nakne mus (Swiss nude) med implantert tumor

(n = 5/dose)

(LS 174T, s.c. - applikasjon 10 dager før forsøkets begynnelse)

Narkose: Rompun/Ketavet (1:1), ca. 0,5 ml pr. kg

kroppsvekt i.m.

Dosering: 200 /imol Fe/kg kroppsvekt (KGW)

Tidspunkt: 0-120 minutter og 12 henholdsvis 24 timer

etter applikasjon

MR-metode:

Apparat: Siemens Magnetom 1,5 T

MR-helkroppstomograf med ekstremitetsspole MR-parameter: Synsfelt (FOV) = 150 mm, matriks = 256 x 256; åpning = 3 mm, sjiktorientering = frontal

Sekvens 1: Protontetthetsbetont "Spin-Echo"-sekvens

(SE) med TR = 2000 ms og TE = 15 ms Sekvens 2: Dynamiske bilder: SE-sekvens med TR/TE =

300 ms/15 ms

MR-vurdering: Signalintensiteter i benyttelsesdefinerte områder av interesse fra tumor, muskel, fett og bakgrunn. De relative signalintensiteter i de forskjellige vev beregnes standardisert på signalintensiteten i fett.

Resultater -.

Illustrasjon 33: Transversal Tl-aweid "Spin-Echo"-dynamikkstudie (TR: 300 ms, TE: 15 ms) av den tumorale signalatferd etter bolusinjeksjon av nanopartikler ifølge eksempel D2 (200 /imol Fe/kg) . Bildene viser en tidsmessig langsomt stigende signalfor-sterkning (anrikning) i tumoren med tydelig økende avgrensning av romfordringen.

Illustrasjon 34: Forløp for den relative signalintensitet (anrikning) i tumoren. Det tidsmessige

signalforløp (forsterkning) for en dose på 200 /imol/kg kroppsvekt tydeliggjør den sterke og med tiden økende forsterkning

(økende anrikning) i tumoren (SE 2000/15).

Illustrasjon 35: Tidsavhengige transversale protontett-hetsaweide (SE 2000/15) bilder etter applikasjon av nanopartiklene ifølge eksempel D2 (200 /imol Fe/kg) .

I den Tl-veide og den protontetthetsveide "Spin-Echo"-sekvens kan man iaktta en økende akkumulasjon av nanopartiklene i tumoren med tidsavhengig, lineær økende signalfor-sterkning (illustrasjoner 33, 35). Inntil 135 minutter etter injeksjon iakttas en 35-40 % forsterkning, hvilket muliggjør en tydelig avgrensning av tumoren fra det sunne vev og bekrefter anrikningen av nanopartiklene. I motsetning til iakttakelsene som her er gjort, ble det ved angi-ografiske undersøkelser fastslått at en ved perfusjon for-årsaket forsterkning i tumoren allerede etter senest 30 minutter (p.i.) er fullstendig forsvunnet.

Claims (32)

1. Nanopartikler, karakterisert ved at de består av en jernholdig kjerne, en primærkappe (syntesepolymer) og en sekundærkappe (målpolymer), samt eventuelt farmasøytiske hjelpestoffer, farmaka og/eller adsorpsjonsformidlere, idet syntesepolymeren velges fra gruppen karboksypolyalkoholer, polykarboksypolyalkoholer, polykarboksyalkoholer, karboksyalkoholer, alkoholer, eller fra gruppen monosukker, oligosukker, polysukker, eller fra gruppen syntetiske monomerer, oligomerer eller polymerer, såsom f.eks. poly-etylenglykoler (polyoksyetylener), polypropylenglykoler (polyoksypropylener) og blandinger (blokk- og kopolymerer) , polyakrylsyre og derivater, polyvinylalkohol, poly-melkesyre (polylaktider og polylaktid-glysider), eller fra gruppen tensider eller andre overflateaktive substanser, eller fra gruppen naturlige eller syntetiske eller delvis syntetiske eller kjemisk og/eller enzymatisk modifiserte oligomerer eller polymerer, såsom f.eks. dekstraner eller sure grupper inneholdende oligo- eller polysakkarider, idet de sure grupper også kan dannes først ved syntesen av nanopartikler, eller glykosaminoglykaner og hyaluronsyrer, eller stivelser og derivater, eller gelatiner og derivater (f.eks. polyoksygelatiner), eller fra gruppen naturlige eller syntetiske oligo- bis polynukleotider eller polyaminonukleinsyrer, såsom ribonukleinsyrer, desoksyribo-nukleinsyrer eller deres analoger eller homologer eller fragementer eller nedbrytningsprodukter, og målpolymerene utgjør naturlige eller kjemisk og/eller enzymatisk fremstilte derivater eller nedbrytningsprodukter eventuelt med hvilken som helst substitusjon av et mono-, oligo- eller polysakkarid, eller syntetiske oligomerer eller polymerer, eller tensider eller andre overflateaktive substanser, eller celler, cellfragmenter eller bakteriefragmenter, eller bestanddeler eller en blanding av blod-, plasma-, serumkomponenter eller opsoniner, eller metabolitter eller antimetabolitter eller legemiddelkonjugater, eller er valgt fra gruppen lektiner og integriner, hormoner eller andre mediatorsubstanser, eller proteiner og neoproteiner, peptider og polypeptider, antistoffer eller -fragmenter, molekylære erkjennelsesenheter (MRD, Molecular Recognition Units), eller polyaminonukleinsyrer eller DNA og RNA eller derivater eller analoger eller homologer, eller naturlige eller syntetiske oligonukleotider, eller reseptor-spesifikke substanser, lipoprotiner, lipopolysakkarider, eller glyserinester eller kolesteriner og -ester, like som syn-te sepolymerene og/eller målpolymerene også kan utgjøre derivater av de nevnte substanser som eventuelt i tillegg bærer funksjonelle grupper som foreligger på én ende eller begge ender eller på et hvilket som helst sted i polymeren som ligger til grunn, idet syntesepolymerene og/eller målpolymerene kan være substituert vilkårlig.

2. Nanopartikler ifølge krav l, karakterisert ved at den hydrodynamiske diameter av grunnbyggestenen av den jernholdige kjerne og primærkappen i løsning er mindre enn 100 nm og høyst fem ganger så stor som den jernholdige kjernes diameter.

3. Nanopartikler ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den jernholdige kjerne er magnetitt eller maghemitt eller inneholder minst én av disse forbindelser.

4. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-3, karakterisert ved at inntil 25 vekt% av jernet i kjernen er erstattet med andre metallioner.

5. Nanopartikler ifølge krav 4, karakterisert ved at ikke-jernmetallionene er paramagnetiske, diamagnetiske eller en blanding av para- og diamagnetiske metallioner.

6. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-5, karakterisert ved at den jernholdige kjerne oppviser en med elektronmikroskopi bestemt diameter på mindre enn 30 nm og inneholder minst 50 metallatomer samt oppviser en partikkelstørrelsesfordeling hvor minst 90 % av den jernholdige kjerne ligger i området 0, 7 • middelverdien til 1,3 • middelverdien.

7. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-6, karakterisert ved at de inneholder en syntesepolymer i en mengde mellom 0,01 og 1 ganger summen av de foreliggende metallioner.

8. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-7, karakterisert ved at syntesepolymeren utgjør en monomer eller polymer substans eller en blanding av disse substanser eller derivater, eller derivater med funksjonelle grupper, eller derivater som i tillegg er blitt substituert, med en molekylvekt som er mindre enn 100 000 Da.

9. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-8, karakterisert ved at syntesepolymeren utgjør et dekstranderivat eller en blanding av dekstran og/eller dekstranderivater.

10. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-9, karakterisert ved at syntesepolymeren og/ eller målpolymerene bærer funksjonelle syre- eller analoger, hydroksy- eller analoger, eter-, estergrupper, eller har funksjonelle grupper som inneholder N-, S-, P-og/eller 0-atomer i molekylet.

11. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-10, karakterisert ved at målpolymeren og syntesepolymeren utgjør like eller forskjellige substanser eller substansblandinger.

12. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-11, karakterisert ved at de inneholder en målpolymer i en vektmengde mellom 0,5 og 50 ganger vekten av de foreliggende metallioner.

13. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-12, karakterisert ved at de inneholder adsorpsjonsformidlere hvis mengde er mindre eller lik summen av vekten av de foreliggende metallioner.

14. Nanopartikler ifølge krav 13, karakterisert ved at de inneholder peptider som adsorpsjonsformidlere.

15. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-14, karakterisert ved at den hydrodynamiske diameter av alle bestanddeler er høyst 10 ganger større enn diameteren for den jernholdige kjerne og høyst 20 % større enn grunnbyggestenens diameter.

16. Nanopartikler ifølge minst ett av kravene 1-15, karakterisert ved at de består av enkeltvise moduler, så som grunnbyggesten, målpolymer, farmakon og adsorpsjonsformidler, som til enhver tid kan kombineres.

17. Fremgangsmåte ved fremstilling av nanopartikler ifølge krav 1,karakterisert ved at det i et første trinn fremstilles en jernholdig kjerne i nærvær av en syntesepolymer ved basebehandling, i et andre trinn forandres forholdet mellom jern og syntesepolymer ved en desorpsjonsmetode, og i et tredje trinn adsorberes en målpolymer, og eventuelt tilsettes adsorpsjonsformidlere, farmasøytiske hjelpestoffer og/eller farmaka.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at det for fremstilling av den jernholdige kjerne anvendes en jern-II-, jern-III-saltblanding, hvorved forholdet mellom toverdig og treverdig jern er 1:1 til 1:20.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 17 eller 18, karakterisert ved at det for fremstilling av den jernholdige kjerne anvendes en jern-III-saltblan-ding i kombinasjon med et reduksjonsmiddel, hvorved mengden av reduksjonsmiddel velges således at det genererte jern-II- til jern-III-forhold er 1:1 til 1:20.

20. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-19, karakterisert ved at de anvendte jernforbindelser utgjør vilkårlige blandinger av uorganiske og organiske salter samt komplekser derav.

21. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-20, karakterisert ved at de jernholdige krystaller fremstilles ved blanding av de på forhånd fremstilte jern-II-hydroksid- og jern-III-hydroksidløsninger.

22. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 17-21, karakterisert ved at inntil 25 vekt% av de anvendte metallioner er ikke-jernioner.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at ikke-jernmetallionene er paramagnetiske, diamagnetiske eller en blanding av para- og diamagnetiske metallioner.

24. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-23, karakterisert ved at det som syntesepolymer anvendes substanser eller kombinasjoner av forskjellige substanser som separerer krystallene som oppstår under utfellingen, hvorved mengden av syntesepolymer i reaksjonsblandingen, i relasjon til vekten av de foreliggende metallioner, ligger 0,5-20 ganger høyere, men totalt utgjør mindre enn 50 % (g/v) i reaksjonsblandingen.

25. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-24, karakterisert ved at det for utfelling av jernforbindelsene anvendes en 0,1-10 N base, hvis tilsetning foregår hurtig.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at det for utfelling av jernforbindelsene anvendes ammoniakk som gass eller salt, et amin eller et aminderivat.

27. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-26, karakterisert ved at syntesen av grunnbyggestenen foregår i et temperaturområde mellom 0 °C og 120 °C.

28. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-27, karakterisert ved at forholdet mellom jern og syntesepolymer innstilles til et vektforhold på 1:0,01 til 1:1.

29. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-28, karakterisert ved at mengden av tilsatt målpolymer velges således at forholdet mellom de foreliggende metallioner og målpolymeren er 1:0,5 til 1:50.

30. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-29, karakterisert ved at nanopartiklene foreligger som stabile kolloidale soler eller lyofilisert og kan igjen bringes i løsning med medisinsk anvendte løs-ningsmidler, eller at grunnbyggestenen, målkomponenten og eventuelle tilsetninger er atskilte løsninger eller lyofilisater, som først ved et passende tidspunkt blandes sammen til en applikasjonsløsning.

31. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 17-30, karakterisert ved at nanopartiklenes enkelte moduler kan kombineres til enhver tid.

32. Anvendelse av nanopartiklene som kontrastmiddel i diagnostikken som visuell merkesubstans i den kirurgiske medisin og/eller som legemiddelbærer eller virkestoff i terapien.