EP0717834A1 - Vorrichtung zur selektion und detektion mindestens zweier spektralbereiche eines lichtstrahls - Google Patents

Vorrichtung zur selektion und detektion mindestens zweier spektralbereiche eines lichtstrahls

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EP0717834A1
EP0717834A1 EP94925347A EP94925347A EP0717834A1 EP 0717834 A1 EP0717834 A1 EP 0717834A1 EP 94925347 A EP94925347 A EP 94925347A EP 94925347 A EP94925347 A EP 94925347A EP 0717834 A1 EP0717834 A1 EP 0717834A1
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spectral range
spectral
masking
beam path
reflecting
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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to a device for the selection and detection of at least two spectral ranges of a light beam, with a selection device and a detection device.
  • the present invention relates to a device of the type in question which is suitable for use in confocal fluorescence microscopy.
  • a confocal fluorescence microscope is known from the literature "Proceedings of Scanning, Vol. 13, Supplement I, 1991, pages 1-76 and 1-77", with which the spectral range of a dye can be detected.
  • a light beam generated by a laser is guided with the aid of optical modules to an object to be microscoped and reflects or excites fluorescent substances there. The reflection or
  • Fluorescence light beam is coupled out by means of a beam splitter and fed to a detector via an optical filter.
  • the filter fulfills the task of hiding the spectral range of the dye. If the relevant dye is contained in the object to be microscoped, this is recognized by the detector due to the high intensity. It is consequently possible in this way, for example in a biomedical application, to detect colored cells or cell structures in an object.
  • the above-mentioned device for the selection and detection of at least two spectral ranges of a light beam, from which the present invention is based has the very considerable disadvantage that a special filter is required for each dye. Particularly with regard to the possibility of detecting different dyes or dye combinations, this has the consequence that a large number of filters must be provided, depending on the system.
  • Another disadvantage of the known device is that the intensity of the light beam reflected by the object is reduced by the filters. This in turn has the consequence that increased optical and possibly electronic requirements have to be placed on the detectors for reliable selection and detection of spectral ranges.
  • the invention is therefore based on the object of specifying a device for the selection and detection of at least two spectral ranges of a light beam which, with the simplest design, is suitable for the reliable selection and detection of different spectral ranges.
  • the selection and detection of the different spectral ranges should take place simultaneously and with high yield.
  • the device according to the invention for the selection and detection of at least two spectral ranges of a light beam achieves the above object by the features of claim 1.
  • a device of the type in question is designed such that the selection device has means for spectra len decomposition of the light beam and means on the one hand for masking out a first spectral range and on the other hand for reflecting at least part of the non-blanked spectral range and the detection device comprises a first detector arranged in the beam path of the blanked out first spectral range and a second detector arranged in the beam path of the reflected spectral range.
  • a first spectral range is masked out from the spectrally split light beam.
  • the non-blanked spectral range is - at least partially - reflected at the same time, both the blanked out first spectral range and the spectral range reflected here being detected by means of one detector each, by arranging the detectors in the respective beam path.
  • the combination of masking out a first spectral range and reflecting the non-masked spectral range leads to a sharp separation and thus individual detection of the spectral ranges separated from one another. Filters tailored to the respective spectral ranges are therefore not required.
  • a first spectral range is masked out from the spectrally split light beam and the spectral range that is not masked out is reflected.
  • the means used for blanking are designed such that the blanked out first spectral range corresponds exactly to the spectral range to be detected here.
  • the reflected spectral range which can be defined by a special design of the reflection surface.
  • this reflected spectral range can be provided by means arranged in the beam path of the reflected spectral range to the extent of a second defined - spectral range can be hidden.
  • the second detector would then be arranged in the beam path of the masked-out second spectral range, and a selection could again take place here - by the second detector itself.
  • the means for masking out the second spectral range - as in the case of the means for masking out the first spectral range - could include measures for reflecting at least a part of the spectral range which is not masked out here.
  • the second detector would be arranged in the beam path of the blanked out second spectral range.
  • a third detector would then have to be arranged in the beam path of the spectral range now further reflected, so that a total of three spectral ranges can be detected.
  • Means for masking out the third spectral range could also be provided in the beam path of the further reflected spectral range, so that the third detector is then arranged in the beam path of the hidden third spectral range.
  • the above-mentioned arrangement namely the provision of a plurality of spectral ranges which block and reflect means and detectors, could also be combined in a cascaded form, so that the respectively hidden spectral range can be detected and the respective reflected spectral range can be masked out again and also detected if necessary.
  • the means for masking and possibly for reflection and the associated detector are designed as an integral assembly.
  • corresponding assemblies would have to be combined here, which only need to be coordinated with respect to their arrangement and dimensioning.
  • the means for spectrally splitting the light beam are designed as a prism. It could also be an optical grating or even a hologram. In any case, it is essential that a spectral decomposition of the incident light beam takes place, so that a diverging light beam is available.
  • the prism or the grating or the hologram could be designed to be pivotable about an axis that is preferably orthogonal to the incident light beam.
  • the spectral range can be influenced in the simplest way with fixed means for masking.
  • the means for masking out a spectral range could be designed as an aperture, preferably as a slit aperture. If these are means on the one hand for masking out a spectral range and on the other hand for reflecting at least part of the non-masked spectral range, these could be designed as mirror diaphragms that have a preferably totally reflective coating or a mirror on at least one of their surfaces facing the incident light having. Both the gap of the slit diaphragm and the reflecting surface or the reflecting surfaces could be changeable in their position and / or angular position, for which purpose these changes could be made continuously, ie continuously, via a motor drive.
  • the spectral range to be selected can also be set or specified here, the combined adjustability on the one hand of the means for spectral decomposition and on the other hand of the means for hiding and reflecting a particularly ex Actual specification or setting of the spectral range of interest can take place.
  • the means for masking out a spectral range and possibly for reflecting at least a part of the spectral range not masked out could advantageously have further means for masking out spectral lines.
  • This could preferably be a so-called light trap.
  • These means for masking spectral lines could be designed as non-reflecting areas or light-absorbing areas, which could simply be blind holes, in which the incident light "runs dead” after multiple reflections.
  • These special means used to hide spectral lines could in turn be designed as integral components of the means used to hide the spectral ranges to be detected.
  • the means for spectral Decomposition of the light beam and the means for masking out a spectral range and possibly for reflecting at least a part of the spectrum mask not masked out can be changed in their angular position and / or position relative to one another.
  • an exact adjustment could take place for specifying the spectral range to be detected.
  • the various means for masking out a spectral range and possibly for reflecting at least a part of the spectrum mask not masked out below or relative to one another could also be changeable in their angular position and / or position relative to one another.
  • an exact setting of the different "blanking levels" would be possible.
  • the angular position and / or position of the detectors could be changeable in their relative position to the means for blanking out a spectral range and possibly for reflecting at least a part of the spectral range not blanked out.
  • the masked and to be detected spectral ranges can again be influenced or specified, all of the aforementioned changes in angular positions and / or positions preferably being able to take place via a motor drive.
  • the device according to the invention previously discussed can be used in the beam path of a confocal fluorescence microscope, the device being connected downstream of the fluorescence microscope which is actually used to record the light beam or fluorescent light beam reflected there.
  • Fig. 1 shows a confocal in a schematic block diagram
  • Fig. 2 in a diagram over the wavelength
  • FIG. 3 in a schematic block diagram a first
  • FIG. 4 in a schematic block diagram a second
  • Fig. 5 shows a third in a schematic block diagram
  • Embodiment of a device according to the invention but with an adjustable selection device.
  • FIG. 1 shows a schematic block diagram of the basic structure of a confocal fluorescence microscope 1, in which a light beam 3 is generated by a laser 2.
  • the Light beam 3 is fed to a beam splitter 8 via a deflecting mirror 4, an excitation filter 5, a lens 6 and an aperture 7.
  • the light beam 3 is deflected by the beam splitter 8 by approximately 90 ° and passes via a further lens 9, a pivotable scan mirror 10, an eyepiece 11 and an objective 12 to the object 13 to be microscoped. At least part of the object 13 becomes of the incident light beam 3 reflected there.
  • the reflected light beam 14 passes through the objective 12, the eyepiece 11, the scan mirror 10 and the lens 9 back to the beam splitter 8. There the reflected light beam 14 is transmitted in a straight line and reaches the device 16 according to the invention via a diaphragm 15 in which the light beam 14 is processed optically.
  • the wavelength of the light is in nanometers (nm) on the abscissa and the relative intensity of the light is plotted on the ordinate.
  • the laser 2 is, for example, an argon-krypton mixed gas laser, it emits in particular an argon line 17 at 488 nm and a krypton line 18 at 568 nm.
  • the dye FITC fluorescein isothiocyanate
  • the dye FITC is excited by the argon line 17 and the dye lissamin-rhodamine by the krypton line 18. In connection with the dye FITC, these excitations result in an absorption 19 in the range of approximately 495 nm and an emission 20 in the range of 528 nm.
  • an absorption 21 takes place in the range of approximately 574 nm and an emission 22 in the range of about 602 nm. If the differently colored components of the object 13 are to be recognized when microscoping, then it is necessary to detect the emissions 20 and 22 of the dyes FITC and lissamin-rhodamine. Consequently, the FITC spectral range 23 and the lissamine-rhodamine spectral range 24 of the emissions 20 and 22 are to be detected. This takes place in the fluorescence microscope 1 shown in FIG. 1 with the aid of the device 16 according to the invention for the selection and detection of different spectral ranges.
  • FIG. 3 now shows a first exemplary embodiment of a device 16 according to the invention for detecting two spectral ranges of a light beam 14, with a selection device 25 and a detection device 26.
  • the selection device 25 has means 27 for spectrally splitting the light beam 14 and means 28 on the one hand for masking out a first spectral range 29 and on the other hand for reflecting at least a part 30 of the spectral range which has not been masked out, and the detection device 26 has one arranged in the beam path of the masked first spectral range 29 first detector 31 and a second detector 32 arranged in the beam path of the reflected spectral range.
  • the selection device 25 comprises means 33 arranged in the beam path of the reflected spectral range 30 for masking out a second spectral range 34 and that the second detector 32 is arranged in the beam path of the hidden second spectral range 34.
  • the selection device 25 points in the beam path of the reflected spectral range 30 arranged means 33 on the one hand for masking out a second spectral range 34 and on the other hand for further reflection of at least a part 35 of the spectral range which is not masked out here.
  • the second detector 32 is arranged in the beam path of the hidden second spectral range 34 and a third detector 36 is arranged in the beam path of the further reflected spectral range 35.
  • the selection device 25 of the embodiment of the device 16 according to the invention shown in FIG. 4 further comprises means 38 arranged in the beam path of the further reflected spectral range 35 for masking out a third spectral range 39, the third detector 36 being arranged in the beam path of the hidden third spectral range 39. Consequently, a total of three spectral ranges 29, 34 and 39 are selected and detected using the exemplary embodiment shown here. According to the explanations in the general description, a cascading of several spectral ranges that block and reflective means and detectors is possible, so that more than three spectral ranges can be selected and detected at the same time.
  • the means 27 for spectrally splitting the light beam 14 are embodied as a prism, the prism in the third exemplary embodiment shown in FIG. 5 extending around an orthogonal to the incident light beam 14 and to the plane of the drawing Axis 37 is pivotable according to arrow 40 in Fig. 5.
  • the means 28, 33 and 38 are each designed as slit diaphragms, with a totally reflective coating 41 being provided on a surface facing the incident light in order to reflect at least a part of the spectral range that is not masked out.
  • the gap 42 of the slit diaphragm can be changed both in its position and in its dimension according to the arrows 43, 44, as a result of which spectral ranges that can be predetermined or set can be masked out.
  • the surfaces carrying the reflective coating 41 can be changed both in their position and in their angular position, as a result of which the reflected spectral range can also be influenced.
  • the means 27 for spectrally splitting the light beam 14 and the means 28 for blanking out a first spectral range 29 or for reflecting at least a part 30 of the non-blanked spectral range in their angular position and Position can be changed relative to each other. This is only indicated by arrow 45. The same applies to the means 28 and 33 for masking out a spectral range 29 and 34, respectively, which is indicated by arrow 46. Finally, the detectors, not shown in FIG. 5, can also be changed in their relative position to the means 28, 33 in their angular position and position.
  • FIGS. 3, 4 and 5 can be used or arranged in the beam path of a fluorescence microscope 1 shown schematically in FIG. 1.

Abstract

Eine Vorrichtung (16) zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls (14), mit einer Selektionseinrichtung (25) und einer Detektionseinrichtung (26) ist zur zuverlässigen gleichzeitigen Selektion und Detektion unterschiedlicher Spektralbereiche bei hoher Ausbeute und bei einfachster Konstruktion derart ausgestaltet, daß die Selektionseinrichtung (25) Mittel (27) zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls (14) und Mittel (28) einerseits zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs (29) und andererseits zur Reflexion zumindest eines Teils (30) des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs und die Detektionseinrichtung (26) einen im Strahlengang des ausgeblendeten ersten Spektralbereichs (29) angeordneten ersten Detektor (31) und einen im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs (30) angeordneten zweiten Detektor (32) umfaßt.

Description

"Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls"
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls, mit einer Selektionseinrichtung und einer Detektionseinrich- tung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung der in Rede stehenden Art, die sich zum Einsatz in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie eignet.
Aus der Literaturstelle "Proceedings of Scanning, Vol. 13, Supplement I, 1991, Seiten 1-76 und 1-77" ist ein konfokales Fluoreszenzmikroskop bekannt, mit dem sich der Spektralbereich eines Farbstoffes detektieren läßt. Ein von einem Laser erzeugter Lichtstrahl wird mit Hilfe optischer Bausteine zu einem zu mikroskopierenden Objekt geführt und von diesem reflektiert bzw. regt dort Fluoreszenzstoffe an. Der Reflexions- oder
Fluoreszenzlichtstrahl wird mittels eines Strahlteilers ausgekoppelt und über ein optisches Filter einem Detektor zugeleitet. Das Filter erfüllt die Aufgabe, den Spektralbereich des Farbstoffes auszublenden. Ist der relevante Farbstoff in dem zu mikroskopierenden Objekt enthalten, so wird dieser aufgrund der hohen Intensität von dem Detektor erkannt. Folglich ist es auf diese Weise bei einer bspw. biomedizinischen Anwendung möglich, eingefärbte Zellen bzw. Zellstrukturen in einem Objekt nachzuweisen.
Auch ist es bereits bekannt, die zuvor beschriebene Mikroskopiertechnik in erweitertem Umfange anzuwenden. So werden bspw. unterschiedliche Zellbestandteile gleichzeitig mit zwei oder mehreren Farbstoffen gefärbt, um die räumliche Korrelation der Zellbestandteile feststellen bzw. untersuchen zu können. Im Rahmen dieser Anwendung ist es jedoch erforderlich, die unterschiedlichen Spektralbereiche der jeweiligen Farbstoffe aus dem insgesamt reflektierten Lichtstrahl auszublenden. Dazu werden bislang Strahlteiler und optische Filter verwendet, die auf den jeweiligen Spektralbereich exakt abgestimmt sind. Jeder ausgeblendete Lichtstrahl wird dann in für sich bekannter Weise einem eigens dafür vorgesehenen Detektor zugeführt.
Die zuvor genannte, zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls dienende Vorrichtung, von der die hier vorliegende Erfindung ausgeht, hat den ganz erheblichen Nachteil, daß für jeden Farbstoff ein besonderes Filter erforderlich ist. Insbesondere im Hinblick auf die Möglichkeit der Detektion verschiedener Farbstoffe bzw. Farbstoffkombinationen hat dies zur Folge, daß eine Vielzahl von Filtern - systembedingt - bereitgestellt sein muß. Ein weiterer Nachteil der bekannten Vorrichtung ist darin zu sehen, daß die Intensität des von dem Objekt reflektierten Lichtstrahls durch die Filter verringert wird. Dies hat wiederum zur Folge, daß für eine zuverlässige Selektion und Detektion von Spektralbereichen an die Detektoren erhöhte optische und ggf. elektronische Anforderungen gestellt werden müssen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls anzugeben, die sich bei einfachster Konstruktion zur zuverlässigen Selektion und Detektion unterschiedlicher Spektralbereiche eignet. Die Selektion und Detektion der unterschiedlichen Spektralbereiche soll gleichzeitig und mit hoher Ausbeute erfolgen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruches 1. Danach ist eine Vorrichtung der in Rede stehenden Art derart ausgebildet, daß die Selektionseinrichtung Mittel zur spektra len Zerlegung des Lichtstrahls und Mittel einerseits zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs und andererseits zur Re flexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs und die Detektionseinrichtung einen im Strahlengang des ausgeblendeten ersten Spektralbereichs angeordneten ersten Detektor und einen im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs angeordneten zweiten Detektor umfaßt.
In erfindungsgemäßer Weise wird aus dem spektral zerlegten Lichtstrahl ein erster Spektralbereich ausgeblendet. Der nicht ausgeblendete Spektralbereich wird - gleichzeitig - zumindest zum Teil reflektiert, wobei sowohl der ausgeblendete erste Spektralbereich als auch der hier reflektierte Spektralbereich mittels jeweils eines Detektors detektiert wird, und zwar durch Anordnung der Detektoren im jeweiligen Strahlengang. In erfindungsgemäßer Weise ist demnach erkannt worden, daß die Kombination von Ausblenden eines ersten Spektralbereichs und Reflektieren des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs zu einer scharfen Trennung und somit einzelnen Detektion der so voneinander getrennten Spektralbereiche führt. Auf die jeweiligen Spektralbereiche abgestimmte Filter sind somit nicht erforderlich.
Wie bereits zuvor erwähnt, wird aus dem spektral zerlegten Lichtstrahl ein erster Spektralbereich ausgeblendet und der nicht ausgeblendete Spektralbereich wird reflektiert. Die zum Ausblenden dienenden Mittel sind dabei derart ausgelegt, daß der ausgeblendete erste Spektralbereich exakt dem hier zu detektierenden Spektralbereich entspricht. Gleiches gilt für den reflektierten Spektralbereich, der durch besondere Ausgestaltung der Reflexionsfläche definierbar ist. Dieser reflektierte Spektralbereich kann im Rahmen einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung durch im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs angeordnete Mittel im Umfange eines zweiten - definierten - Spektralbereichs ausgeblendet werden. Der zweite Detektor wäre dann im Strahlengang des ausgeblendeten zweiten Spektralbereichs angeordnet, wobei auch hier wieder eine Selektion - durch den zweiten Detektor selbst - stattfinden könnte.
Sofern eine Selektion und Detektion weiterer Spektralbereiche erforderlich ist, könnten die Mittel zum Ausblenden des zweiten Spektralbereichs - wie im Falle der Mittel zum Ausblenden des ersten Spektralbereichs - Vorkehrungen zur Reflexion zumindest eines Teils des hier nicht ausgeblendeten Spektralbereichs umfassen. Auch hier wäre der zweite Detektor im Strahlengang des ausgeblendeten zweiten Spektralbereichs angeordnet. Im Strahlengang des nunmehr weiter reflektierten Spektralbereichs wäre dann ein dritter Detektor anzuordnen, so daß insgesamt drei Spektralbereiche detektierbar sind. Auch im Strahlengang des weiter reflektierten Spektralbereichs könnten Mittel zum Ausblenden des dritten Spektralbereichs vorgesehen sein, so daß dann der dritte Detektor im Strahlengang des ausgeblendeten dritten Spektralbereichs angeordnet ist. Die zuvor genannte Anordnung, nämlich die Vorkehrung mehrerer Spektralbereiche ausblendenden und reflektierenden Mittel sowie Detektoren, könnte auch in kaskadierter Form kombiniert sein, so daß der jeweils ausgeblendete Spektralbereich detektiert und der jeweils reflektierte Spektralbereich ggf. abermals ausgeblendet und ebenfalls detektiert werden kann.
Hinsichtlich einer besonders kompakten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es von besonderem Vorteil, wenn die zum Ausblenden und ggf. zur Reflexion dienenden Mittel und der jeweils dazugehörende Detektor als integrale Baugruppe ausgeführt sind. Zur Kaskadierung wären hier entsprechende Baugruppen zu kombinieren, die lediglich hinsichtlich ihrer Anordnung und Dimensionierung aufeinander abzustimmen sind. Hinsichtlich einer konkreten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es im Hinblick auf eine einfache Konstruktion von Vorteil, wenn die Mittel zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls als Prisma ausgeführt sind. Ebenso könnte es sich hierbei um ein optisches Gitter oder gar um ein Hologramm handeln. Wesentlich ist jedenfalls, daß eine spektrale Zerlegung des einfallenden Lichtstrahls stattfindet, so daß ein divergierender Lichtstrahl zur Verfügung steht.
Zur Beeinflussung der zu selektierenden und schließlich zu detektierenden Spektralbereiche könnte das Prisma bzw. das Gitter oder das Hologramm um eine vorzugsweise orthogonal zum einfallenden Lichtstrahl verlaufende Achse schwenkbar ausgeführt sein. Insoweit ließe sich der Spektralbereich bei feststehenden Mitteln zum Ausblenden einfachst beeinflussen.
Die Mittel zum Ausblenden eines Spektralbereichs könnten als Blende, vorzugsweise als Spaltblende, ausgeführt sein. Handelt es sich dabei um Mittel einerseits zum Ausblenden eines Spektralbereichs und andererseits zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs, so könnten diese als Spiegelblende ausgeführt sein, die auf mindestens einer ihrer dem einfallenden Licht zugewandten Oberflächen eine vorzugsweise total reflektierende Beschichtung bzw. einen Spiegel aufweist. Sowohl der Spalt der Spaltblende als auch die reflektierende Fläche bzw. die reflektierenden Flächen könnten in ihrer Position und/oder Winkelstellung veränderbar sein, wozu diese Veränderungen vorzgusweise über einen Motorantrieb kontinuierlich, d.h. stufenlos, erfolgen könnten. In Ergänzung zu der Verstellbarkeit des zuvor beispielhaft genannten Prisma läßt sich auch hier der zu selektierende Spektralbereich einstellen bzw. vorgeben, wobei durch kombinierte Einstellbarkeit einerseits der Mittel zur spektralen Zerlegung und andererseits der Mittel zum Ausblenden und Reflektieren eine besonders ex akte Vorgabe bzw. Einstellung des interessierenden Spektralbereichs stattfinden kann.
Zur Vermeidung von Beeinflussungen durch Streulicht bzw. zur Unterdrückung des primären Anregungslichtes könnten die Mittel zum Ausblenden eines Spektralbereichs und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs in vorteilhafter Weise weitere Mittel zum Ausblenden von Spektrallinien aufweisen. Dabei könnte es sich vorzugsweise um sog. Lichtfallen handeln. Diese Mittel zum Ausblenden von Spektrallinien könnten als nicht reflektierende Bereiche bzw. lichtabsorbierende Bereiche ausgeführt sein, wobei es sich hier schlicht und einfach um Sacklöcher handeln könnte, worin sich das einfallende Licht nach Mehrfachreflexion "totläuft". Diese zum Ausblenden von Spektrallinien dienenden besonderen Mittel könnten wiederum als integrale Bestandteile der zum Ausblenden der zu detektierenden Spektralbereiche dienenden Mittel ausgeführt sein.
Des weiteren wäre es auch denkbar, die als Lichtfallen dienenden, nicht reflektierenden Bereiche in ihrer Position und/oder Winkelstellung veränderbar zu gestalten, so daß auch insoweit eine exakte Einstellbarkeit gegeben ist. Die Veränderung könnte vorzugsweise über einen Motorantrieb kontinuierlich erfolgen, so daß bestimmte Streulichtzustände kompensierbar sind.
Auch wäre es denkbar, in den unterschiedlichen Strahlengängen der ausgeblendeten und/oder reflektierten Spektralbereiche grundsätzlich Mittel zur Reduktion von Streulicht anzuordnen, so daß durch Streulicht bedingte Störeinflüsse weitgehendst vermieden sind.
Hinsichtlich einer exakten Abstimmung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es von Vorteil, wenn die Mittel zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls und die Mittel zum Ausblenden eines Spektralbereichs und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs in ihrer Winkelstellung und/oder Position relativ zueinander veränderbar sind. Insoweit könnte zur Vorgabe des zu detektierenden Spektralbereichs eine exakte Abstimmung stattfinden. Auch könnten die verschiedenen Mittel zum Ausblenden eines Spektralbereichs und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs unter- bzw. zueinander in ihrer Winkelstellung und/oder Position relativ zueinander veränderbar sein. Folglich wäre insoweit eine exakte Einstellung der unterschiedlichen "Ausblendungsstufen" möglich. Schließlich könnten die Detektoren in ihrer Relativlage zu den Mitteln zum Ausblenden eines Spektralbereichs und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs in ihrer Winkelstellung und/oder Position zueinander veränderbar sein. Auch insoweit ließen sich die ausgeblendeten und zu detektierenden Spektralbereiche abermals beeinflussen bzw. vorgeben, wobei sämtliche zuvor genannten Veränderungen von Winkelstellungen und/oder Positionen vorzugsweise über einen Motorantrieb erfolgen können.
Schließlich sei ganz besonders hervorgehoben, daß die zuvor erörterte erfindungsgemäße Vorrichtung im Strahlengang eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops einsetzbar ist, wobei die Vorrichtung dem eigentlich Fluoreszenzmikroskop zur Aufnahme des dort reflektierten Lichtstrahls bzw. Fluoreszenzlichtstrahls nachgeschaltet ist.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung dreier Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt
Fig. 1 in einem schematischen Blockschaltbild ein konfokales
Fluoreszenzmikroskop mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2 in einem Diagramm ein über der Wellenlänge und der
Intensität eines Lichtstrahls aufgetragenes Koordinatensystem, in dem die Spektren zweier Farbstoffe dargestellt sind,
Fig. 3 in einem schematischen Blockschaltbild ein erstes
Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Selektion und Dektektion zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls,
Fig. 4 in einem schematischen Blockschaltbild ein zweites
Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Selektion und Detektion dreier Spektralbereiche eines Lichtstrahls und
Fig. 5 in einem schematischen Blockschaltbild ein drittes
Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, jedoch mit einer verstellbaren Selektionseinrichtung.
Fig. 1 zeigt in einem schematischen Blockschaltbild den grundsätzlichen Aufbau eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops 1, bei dem von einem Laser 2 ein Lichtstrahl 3 erzeugt wird. Der Lichtstrahl 3 wird über einen Umlenkspiegel 4, einen Anregungsfilter 5, eine Linse 6 und eine Blende 7 einem Strahlteiler 8 zugeführt. Von dem Strahlteiler 8 wird der Lichtstrahl 3 um etwa 90° umgelenkt und gelangt über eine weitere Linse 9, einen schwenkbaren Scan-Spiegel 10, ein Okular 11 und ein Objektiv 12 zu dem zu mikroskopierenden Objekt 13. Von dem Objekt 13 wird zumindest ein Teil des dort einfallenden Lichtstrahls 3 reflektiert. Der reflektierte Lichtstrahl 14 durchläuft das Objektiv 12, das Okular 11, den Scan-Spiegel 10 und die Linse 9 zurück zu dem Strahlteiler 8. Dort wird der reflektierte Lichtstrahl 14 geradlinig durchgelassen und gelangt über eine Blende 15 zu der erfindungsgemäßen Vorrichtung 16, in der der Lichtstrahl 14 optisch weiterverarbeitet wird.
Fig. 2 zeigt die Spektren zweier Farbstoffe in einem Koordinatensystem. Auf der Abszisse ist die Wellenlänge des Lichts in Nanometer (nm) und auf der Ordinate ist die relative Intensität des Lichts abgetragen.
Handelt es sich bei dem Laser 2 bspw. um einen Argon-KryptonMischgaslaser, so wird von diesem insbesondere eine Argon-Linie 17 bei 488 nm und eine Krypton-Linie 18 beim 568 nm ausgestrahlt. Sind des weiteren Bestandteile des Objekts 13 selektiv mit dem Farbstoff FITC (Fluoresceinisothiocyanat) und dem Farbstoff Lissamin-Rhodamin eingefärbt, so werden der Farbstoff FITC von der Argon-Linie 17 und der Farbstoff Lissamin-Rhodamin von der Krypton-Linie 18 angeregt. Diese Anregungen bewirken im Zusammenhang mit dem Farbstoff FITC eine Absorption 19 im Bereich von etwa 495 nm und eine Emission 20 im Bereich von 528 nm. Bei dem Farbstoff Lissamin-Rhodamin erfolgt eine Absorption 21 im Bereich von etwa 574 nm und eine Emission 22 im Bereich von etwa 602 nm. Sollen die unterschiedlich eingefärbten Bestandteile des Objekts 13 beim Mikroskopieren erkannt werden, so ist es erforderlich, die Emissionen 20 und 22 der Farbstoffe FITC und Lissamin-Rhodamin zu detektieren. Folglich sind der FITC-Spektralbereich 23 und der Lissamin-Rhodamin-Spektralbereich 24 der Emissionen 20 und 22 zu detektieren. Dies erfolgt bei dem in Fig. 1 dargestellten Fluoreszenzmikroskop 1 mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung 16 zur Selektion und Detektion unterschiedlicher Spektralbereiche.
Fig. 3 zeigt nun ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 16 zur Detektion zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls 14, mit einer Selektionseinrichtung 25 und einer Detektionseinrichtung 26.
In erfindungsgemäßer Weise weist die Selektionseinrichtung 25 Mittel 27 zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls 14 und Mittel 28 einerseits zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs 29 und andererseits zur Reflexion zumindest eines Teils 30 des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs und die Detektionseinrichtung 26 einen im Strahlengang des ausgeblendeten ersten Spektralbereichs 29 angeordneten ersten Detektor 31 und einen im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs angeordneten zweiten Detektor 32 auf.
Fig. 3 zeigt des weiteren deutlich, daß die Selektionseinrichtung 25 im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs 30 angeordnete Mittel 33 zum Ausblenden eines zweiten Spektralbereichs 34 umfaßt und daß der zweite Detektor 32 im Strahlengang des ausgeblendeten zweiten Spektralbereichs 34 angeordnet ist.
Bei dem in Fig. 4 dargestellten zweiten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 16 weist die Selektionseinrichtung 25 im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs 30 angeordnete Mittel 33 einerseits zum Ausblenden eines zweiten Spektralbereichs 34 und andererseits zur weiteren Reflexion zumindest eines Teils 35 des hier nicht ausgeblendeten Spektralbereichs auf. Der zweite Detektor 32 ist im Strahlengang des ausgeblendeten zweiten Spektralbereichs 34 und ein dritter Detektor 36 ist im Strahlengang des weiter reflektierten Spektralbereichs 35 angeordnet.
Die Selektionseinrichtung 25 des in Fig. 4 dargestellten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung 16 umfaßt des weiteren im Strahlengang des weiter reflektierten Spektralbereichs 35 angeordnete Mittel 38 zum Ausblenden eines dritten Spektralbereichs 39, wobei der dritte Detektor 36 im Strahlengang des ausgeblendeten dritten Spektralbereichs 39 angeordnet ist. Folglich werden mit dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel insgesamt drei Spektralbereiche 29, 34 und 39 selektiert und detektiert. Entsprechend den Ausführungen in der allgemeinen Beschreibung ist eine Kaskadierung mehrerer Spektralbereiche ausblendenden und reflektierenden Mittel sowie Detektoren möglich, so daß ohne weiteres auch mehr als drei Spektralbereiche gleichzeitig selektierbar und detektierbar sind.
Bei den in den Fig. 3, 4 und 5 dargestellten Ausführungsbeispielen sind die Mittel 27 zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls 14 als Prisma ausgeführt, wobei das Prisma bei dem in Fig. 5 dargestellten dritten Ausführungsbeispiel um eine orthogonal zum einfallenden Lichtstrahl 14 und zur Zeichenebene verlaufende Achse 37 gemäß Pfeil 40 in Fig. 5 schwenkbar ist. Die Mittel 28, 33 und 38 sind jeweils als Spaltblende ausgeführt, wobei zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs auf einer dem einfallenden Licht zugewandten Oberfläche jeweils eine total reflektierende Beschichtung 41 vorgesehen ist. Gemäß dem in Fig. 5 dargestellten dritten Ausführungsbeispiel ist der Spalt 42 der Spaltblende sowohl in seiner Position als auch in seiner Dimension gemäß den Pfeilen 43, 44 veränderbar, wodurch sich vorgebbare bzw. einstellbare Spektralbereiche ausblenden lassen. Ebenso sind die die reflektierende Beschichtung 41 tragenden Flächen sowohl in ihrer Position als auch in ihrer Winkelstellung veränderbar, wodurch der reflektierte Spektralbereich ebenfalls beeinflußbar ist.
Hinsichtlich der Vorkehrung lichtabsorbierender Bereiche bzw. von Lichtfallen sowie hinsichtlich der Vermeidung bzw. Reduktion von Streulicht wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.
Hinsichtlich der in Fig. 5 dargestellten Ausführungsform wird noch ergänzend darauf hingewiesen, daß die Mittel 27 zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls 14 und die Mittel 28 zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs 29 bzw. zur Reflexion zumindest eines Teils 30 des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs in ihrer Winkelstellung und Position relativ zueinander veränderbar sind. Dies ist durch Pfeil 45 lediglich angedeutet. Gleiches gilt für die Mittel 28 und 33 zum Ausblenden eines Spektralbereichs 29 bzw. 34, was durch Pfeil 46 angedeutet ist. Schließlich lassen sich auch die in Fig. 5 nicht gezeigten Detektoren in ihrer Relativlage zu den Mitteln 28, 33 in ihrer Winkelstellung und Position verändern.
Mit Nachdruck wird nochmals darauf hingewiesen, daß die in den Fig. 3, 4 und 5 dargestellte und zuvor erläuterte erfindungsgemäße Vorrichtung im Strahlengang eines in Fig. 1 schematisch dargestellten Fluoreszenzmikroskops 1 verwendet bzw. angeordnet sein kann.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls (14), mit einer
Selektionseinrichtung (25) und einer Detektionseinrichtung (26),
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Selektionseinrichtung (25) Mittel (27) zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls (14) und Mittel (28) einerseits zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs (29) und andererseits zur Reflexion zumindest eines Teils (30) des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs und die Detektionseinrichtung (26) einen im Strahlengang des ausgeblendeten ersten Spektralbereichs (29) angeordneten ersten Detektor (31) und einen im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs (30) angeordneten zweiten Detektor (32) umfaßt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektionseinrichtung (25) im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs (30) angeordnete Mittel (33) zum Ausblenden eines zweiten Spektralbereichs (34) umfaßt und daß der zweite Detektor (32) im Strahlengang des ausgeblendeten zweiten Spektralbereichs (34) angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektionseinrichtung (25) im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs (30) angeordnete Mittel (33) einerseits zum Ausblenden eines zweiten Spektralbereichs (34) und andererseits zur weiteren Reflexion zumindest eines Teils (35) des hier nicht ausgeblendeten Spektralbereichs umfaßt, daß der zweite Detektor (32) im Strahlengang des ausgeblendeten zweiten Spektralbereichs (34) angeordnet ist und daß ein dritter Detek tor (36) im Strahlengang des weiter reflektierten Spektralbereichs (35) angeordnet ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektionseinrichtung (25) im Strahlengang des weiter reflektierten Spektralbereichs (35) angeordnete Mittel (38) zum Ausblenden eines dritten Spektralbereichs (39) umfaßt und daß der dritte Detektor (36) im Strahlengang des ausgeblendeten dritten Spektralbereichs (39) angeordnet ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Spektralbereiche (29, 34, 39) ausblendende und reflektierende Mittel (28, 33, 38) sowie Detektoren (31, 32, 36) kaskadiert zueinander angeordnet sind, so daß der jeweils ausgeblendete Spektralbereich (29, 34, 39) detektiert und der jeweils reflektierte Spektralbereich (30, 35) ggf. abermals ausgeblendet und ebenfalls detektiert wird.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Ausblenden und ggf. zur Reflexion dienenden Mittel (28, 33, 38) und der jeweils dazugehörende Detektor (31, 32, 36) als integrale Baugruppe ausgeführt sind.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (27) zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls (14) als Prisma, optisches Gitter oder Hologramm ausgeführt sind.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Prisma, Gitter oder Hologramm um eine vorzugsweise orthogonal zum einfallenden Lichtstrahl (14) verlaufende Achse schwenkbar ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (28, 33, 38) zum Ausblenden eines Spektralbereichs (29, 34, 39) als Blende, vorzugsweise als Spaltblende, ausgeführt sind.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (28, 33, 38) einerseits zum Ausblenden eines Spektralbereichs (29, 34, 39) und andererseits zur Reflexion zumindest eines Teils (30, 35) des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs als Spiegelblende ausgeführt sind, die auf mindestens einer ihrer dem einfallenden Licht zugewandten Oberflächen eine vorzugsweise total reflektierende Beschichtung (41) aufweist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Spalt (42) der Spaltblende in seiner Position und/oder Dimension veränderbar ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die reflektierende Fläche bzw. die reflektierenden Flächen in ihrer Position und/oder Winkelstellung veränderbar ist bzw. sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung kontinuierlich, vorzugsweise über einen Motorantrieb, erfolgt.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (28, 33, 38) zum Ausblenden eines Spektralbereichs (29, 34, 39) und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils (30, 35) des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs (30, 35) weitere Mittel zum Ausblenden von Spektrallinien, insbesondere Lichtfallen, aufweisen.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Ausblenden von Spektrallinien als nicht reflektierende Bereiche bzw. lichtabsorbierende Bereiche und als integrale Bestandteile der Mittel zum Ausblenden und ggf. zur Reflexion ausgeführt sind.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht reflektierenden Bereiche in ihrer Position und/oder Winkelstellung veränderbar sind.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung kontinuierlich, vorzugsweise über einen Motorantrieb, erfolgt.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß in den unterschiedlichen Strahlengängen der ausgeblendeten und/oder reflektierten Spektralbereiche (29, 34, 39 bzw. 30, 35) Mittel zur Reduktion von Streulicht angeordnet sind.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (27) zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls (14) und die Mittel (28, 33, 38) zum Ausblenden eines Spektralbereichs (29, 34, 39) und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils (30, 35) des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs in ihrer Winkelstellung und/oder Position relativ zueinander veränderbar sind.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Mittel (28, 33, 38) zum Ausblenden eines Spektralbereichs (29, 34, 39) und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils (30, 35) des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs in ihrer Winkelstellung und/oder Position relativ zueinander veränderbar sind.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoren (31, 32, 36) in ihrer Relativlage zu den Mitteln (28, 33, 38) zum Ausblenden eines Spektralbereichs (29, 34, 39) und ggf. zur Reflexion zumindest eines Teils (30, 35) des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs in ihrer Winkelstellung und/oder Position zueinander veränderbar sind.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung kontinuierlich, vorzugsweise über einen Motorantrieb, erfolgt.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, gekennzeichnet durch die Verwendung im Strahlengang eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops (1).
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