EA034142B1 - Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связываться с cd123 и cd3, и их применения - Google Patents

Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связываться с cd123 и cd3, и их применения Download PDF

Info

Publication number
EA034142B1
EA034142B1 EA201690443A EA201690443A EA034142B1 EA 034142 B1 EA034142 B1 EA 034142B1 EA 201690443 A EA201690443 A EA 201690443A EA 201690443 A EA201690443 A EA 201690443A EA 034142 B1 EA034142 B1 EA 034142B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
domain
seq
cells
dart
polypeptide chain
Prior art date
Application number
EA201690443A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201690443A1 (ru
Inventor
Эцио Бонвини
Лесли С. Джонсон
Линг Хуанг
Пол А. Мур
Гурунадх Редди Чичили
Ральф Фроман Алдерсон
Original Assignee
Макродженикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Макродженикс, Инк. filed Critical Макродженикс, Инк.
Publication of EA201690443A1 publication Critical patent/EA201690443A1/ru
Publication of EA034142B1 publication Critical patent/EA034142B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Materials For Photolithography (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Compounds Of Alkaline-Earth Elements, Aluminum Or Rare-Earth Metals (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к диателу, способному специфически связываться с эпитопом CD123 и с эпитопом CD3, причем диатело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, ковалентно связанные друг с другом, и при этом домен VL указанной первой полипептидной цепи и домен VH указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и домен VL указанной второй полипептидной цепи и домен VH указанной первой полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD123. Настоящее изобретение также относится к применению указанного диатела в лечении заболевания или состояния, характеризующегося экспрессией CD123.

Description

Ссылки на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с заявками на выдачу патентов США №№ 61/869510 (поданной 23 августа 2013 г.; в стадии рассмотрения), 61/907749 (поданной 22 ноября 2013 г.; в стадии рассмотрения) и 61/990,475 (поданной 8 мая 2014 г.; в стадии рассмотрения), и заявкой на выдачу Европейского патента №13198784 (поданной 20 декабря 2013 г.), каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Ссылка на перечень последовательностей
Настоящая заявка включает в себя один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. 1.821 et seq., которые раскрыты как на бумажном, так и на машиночитаемом носителе, и чьи бумажные и машиночитаемые раскрытия полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к CD123xCD3 биспецифическим моновалентным диателам, которые способны одновременно связываться с CD123 и CD3, и к применениям таких молекул в лечении гематологических злокачественных опухолей.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
I. CD123
CD123 (альфа-рецептор инерлейкина 3, IL-3Ra) представляет собой молекулу с молекулярной массой 40 кДа и является частью комплекса рецепторов интерлейкина 3 (Stomski, F.C. et al. (1996) Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding, Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046). Интерлейкин 3 (IL-3) управляет ранней дифференциацией мультипотентных стволовых клеток в клетки эритроидных, миелоидных и лимфоидных предшественников. CD123 экспрессируется на CD34+ коммитированных клетках - предшественниках (Taussig, D.C. et al. (2005) Hematopoietic Stem Cells Express Multiple Myeloid Markers: Implications For The Origin And Targeted Therapy Of Acute Myeloid Leukemia Blood 106:4086-4092), но не на CD34+/CD38- нормальных гемопоэтических стволовых клетках. CD123 экспрессируется базофилами, тучными клетками, плазмацитоидными дендритными клетками, некоторая экспрессия наблюдается у моноцитов, макрофагов и эозинофилов, и низкая экспрессия или ее отсутствие наблюдается у нейтрофилов и мегакариоцитов. Некоторые не относящиеся к гемопоэтическим ткани (плацента, клетки Лейдига в яичках, определенные клеточные элементы головного мозга и некоторые эндотелиальные клетки) экспрессируют CD123; тем не менее, экспрессия является, главным образом, цитоплазматической.
Сообщалось, что CD123 экспрессируется лейкобластами и лейкозными стволовыми клетками (LSC) (Jordan, СТ. et al. (2000) The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells Leukemia 14:1777-1784; Jin, W. et al. (2009) Regulation Of Th17 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK Blood 113: 6603-6610) (фиг. 1). В нормальных популяциях клеток - предшественников у человека CD123 экспрессируется подклассом гемопоэтических клеток предшественников (НРС), но не нормальными гемопоэтическими стволовыми клетками (HSC). CD123 также экспрессируется плазмацитоидными дендритными клетками (pDC) и базофилами и в меньшей степени моноцитами и эозинофилами (Lopez A.F. et al. (1989) Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor To Human Eosinophils Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022-7026; Sun Q. et al. (1996) Monoclonal Antibody 7G3 Recognizes The N-Terminal Domain Of The Human Interleukin-3 (IL-3) Receptor Alpha Chain And Functions As A Specific IL-3 Receptor Antagonist Blood 87: 83-92; Munoz L. et al. (2001) Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies Haematologica 86(12): 1261-1269; Masten B.J. et al. (2006) Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung J. Immunol. 177: 7784-7793; Korpelainen, E.I. et al. (1995) Interferon-Gamma Upregulates Interleukin-3 (IL-3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production Blood 86: 176-182).
Сообщалось, что CD123 избыточно экспрессируется на злокачественных клетках в широком спектре гематологических злокачественных опухолей, включая в себя острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) и миелодиспластический синдром (МДС) (Munoz L. et al. (2001) Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies Haematologica 86(12): 1261-1269). Избыточная экспрессия CD123 связана с более неблагоприятным прогнозом при ОМЛ (Tettamanti M.S. et at. (2013) Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123Specific Chimeric Antigen Receptor Br. J. Haematol. 161: 389-401).
Считается, что ОМЛ и МДС возникают и поддерживаются небольшой популяцией лейкозных стволовых клеток (LSC), которые, как правило, являются дремлющими (т.е. не быстро делящимися клетками) и, следовательно, являются устойчивыми к клеточной смерти (апоптозу) и традиционным химиотерапевтическим средствам. LSC характеризуются высокими уровнями экспрессии CD123, что отсутствует в соответствующей нормальной популяции гемопоэтических клеток в нормальном костном мозге человека (Jin, W. et al. (2009) Regulation Of Th17 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK Blood
- 1 034142
113:6603-6610; Jordan, C.T. et al. (2000) The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells Leukemia 14:1777-1784). CD123 экспрессируется в 45%95% случаев ОМЛ, 85% случаев волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ) и 40% случаев острого Bлимфобластного лейкоза (B-ОЛЛ). Экспрессия CD123 также связана с другими многочисленными злокачественными опухолями/предраковыми состояниями: клетки - предшественники хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) (включая в себя ХМЛ с бластным кризом); клетки Рид-Штернберга (RS) при ходжкинской лимфоме; трансформированная неходжкинская лимфома (НХЛ); некоторые типы хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) (CDllc+); подкласс острого Т-лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ) (16%, наиболее незрелый подкласс, главным образом поражает взрослых), злокачественные опухоли из плазмацитоидных дендритных клеток (pDC) (DC2) и злокачественные опухоли из CD34+/CD38- клеток костного мозга при миелодиспластическом синдроме (МДС).
ОМЛ представляет собой клональное заболевание, характеризующееся пролиферацией и накоплением трансформированных миелоидных клеток предшественников в костном мозге, которое в итоге приводит к гемопоэтической недостаточности. Частота возникновения ОМЛ увеличивается с возрастом, и пациенты более старшего возраста, как правило, имеют худшие исходы лечения, чем более молодые пациенты (Robak, Т. et al. (2009) Current And Emerging Therapies For Acute Myeloid Leukemia Clin. Ther. 2:2349-2370). К сожалению, в настоящее время большинство взрослых пациентов с ОМЛ умирает вследствие своего заболевания.
Лечение ОМЛ изначально фокусируется на индукции ремиссии (индукционная терапия). Как только достигается индукция, фокус лечения сдвигается на закрепление этой ремиссии (послеремиссионная, или консолидационная терапия) и в некоторых случаях на поддерживающую терапию. Стандартная парадигма индукции ремиссии для ОМЛ представляет собой химиотерапию с помощью комбинации антрациклина и цитарабина с последующей либо консолидационной химиотерапией (как правило, с помощью повышенных доз тех же лекарственных средств, которые использовались в течение периода индукции ремиссии), либо трансплантацией стволовых клеток человека в зависимости от способности пациента переносить интенсивное лечение и вероятности выздоровления только с помощью химиотерапии (см., например, Roboz, G.J. (2012) Current Treatment Of Acute Myeloid Leukemia Curr. Opin. Oncol. 24:711719).
Средства, часто используемые в индукционной терапии, включают в себя цитарабин и антрациклин. Цитарабин, также известный как AraC, уничтожает злокачественные клетки (и другие быстро делящиеся нормальные клетки), препятствуя синтезу ДНК. Побочные эффекты, связанные с лечением с помощью AraC, включают в себя сниженную устойчивость к инфекции как результат сниженной продукции лейкоцитов; кровотечение как результат сниженной продукции тромбоцитов; и анемию вследствие потенциального снижения количества эритроцитов. Другие побочные эффекты включают в себя тошноту и рвоту. Антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин и идарубицин) характеризуются несколькими механизмами действия, включая в себя ингибирование синтеза ДНК и РНК, разрушение структур ДНК более высоких порядков и производство повреждающих клетки свободных кислородных радикалов. Наиболее значительный побочный эффект антрациклинов представляет собой кардиотоксичность, которая существенно ограничивает вводимую в течение жизни дозу и в некоторой степени применимость антрациклинов.
Таким образом, к сожалению, несмотря на существенный прогресс в лечении впервые выявленного ОМЛ, 20-40% пациентов не достигают ремиссии с помощью стандартной индукционной химиотерапии, и у 50-70% пациентов, достигших вначале полной ремиссии, как предполагают, возникнет рецидив не позже чем через 3 года. Оптимальная стратегия в период рецидива или для пациентов с устойчивым к лечению заболеванием, остается неясной. Установлено, что трансплантация стволовых клеток является наиболее эффективной формой противолейкозной терапии у пациентов с ОМЛ при первой или последующей ремиссии (Roboz, G.J. (2012) Current Treatment Of Acute Myeloid Leukemia Curr. Opin. Oncol. 24:711-719).
II. CD3
CD3 представляет собой Т - клеточный корецептор, состоящий из четырех различных цепей (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14). У млекопитающих комплекс CD3 содержит цепь CD3y, цепь CD35 и две цепи CD3e. Указанные цепи связываются с молекулой, известной как Т - клеточный рецептор (TCR), для создания сигнала активации в Т-лимфоцитах. При отсутствии CD3 не происходит правильная сборка TCR, и они распадаются (Thomas, S. et al. (2010) Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer Immunology 129(2): 170-177). CD3 обнаружен связанным с мембранами всех зрелых Т - клеток и практически ни с каким другим типом клеток (см. Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease, 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun Z. J. et al. (2001) Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3e:y Heterodimer Cell 105(7):913-923; Kuhns M.S. et al. (2006) Decon
- 2 034142 structing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139).
III. Биспецифические диатела
Способность интактного, немодифицированного антитела (например, IgG) связывать эпитоп антигена зависит от присутствия вариабельных доменов на легких и тяжелых цепях иммуноглобулина (т.е. доменов VL и VH, соответственно). Конструкция диатела основана на одноцепочечном конструкте Fv (scFv) (см., например, Holliger et al. (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; патентную публикацию США № 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454 (l-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity J. Biol. Chem. 280(20): 1966519672; WO 02/02781 (Mertens et al); Olafsen T. et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Protein Eng. Des. Sel. 17(l):21-27; Wu A. et al. (2001) Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8): 583-588; Baeuerle P.A. et al. (2009) Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy, Cancer Res. 69(12): 4941-4944).
Взаимодействие легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела и, в частности, взаимодействие его доменов VL и VH формирует один из сайтов связывания эпитопа антитела. Напротив, конструкт scFv содержит домен VL и VH антитела, содержащиеся в одной полипептидной цепи, причем в домены отделены гибким линкером, длина которого достаточна для обеспечения возможности самосборки двух доменов в функциональный сайт связывания эпитопа. Если самосборка доменов VL и VH становится невозможной вследствие недостаточной длины линкера (меньше чем приблизительно 12 аминокислотных остатков), два конструкта scFv взаимодействуют друг с другом с образованием бивалентной молекулы, в которой VL одной цепи ассоциируются с VH другой (рассмотрено в Marvin et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).
Природные антитела способны связываться только с одним видом эпитопов (т.е. являются моноспецифическими), хотя они могут связываться с множественными копиями этого вида (т.е. проявляя бивалентность или мультивлентность). В известном уровне техники сообщалось о способности производить диатела, которые отличаются от таких природных антител в том, что они способны связывать два или больше различных видов эпитопов (т.е. проявляя биспецифичность или мультиспецифичность в дополнение к бивалентности или мультивалентности) (см., например, Holliger et al. (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al); Mertens, N. et al, New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives In: Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use, A. VanBroekhoven et al (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), pages 195-208; Wu A. et al. (2001) Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange, Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain Abstract 3P683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy Cancer Res. 69(12): 4941-4944).
Обеспечение не моноспецифическими диателами предоставляет существенное преимущество: способность колигирования и колокализации клеток, которые экспрессируют различные эпитопы. Таким образом, биспецифические диатела характеризуются широким диапазоном применений, включая в себя терапию и иммунодиагностику. Биспецифичность обеспечивает возможность большой гибкости в конструировании и разработке диатела в различных применениях, обеспечивая повышенную авидность в отношении мультимерных антигенов, перекрестную сшивку различных антигенов и направленное нацеленное воздействие на конкретные типы клеток на основании присутствия обоих целевых антигенов. В связи с их повышенной валентностью низкие скорости диссоциации и быстрое выведение из циркуляции (для диател небольшого размера, составляющего ~50 кДа или ниже), известные в настоящей области техники молекулы диател также продемонстрировали конкретное применение в области визуализации опухолей (Fitzgerald et al. (1997) Improved Tumor Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris, Protein Eng. 10:1221). Особое значение представляет колигирование различных клеток, например, перекрестная сшивка цитотоксических Т-клеток с опухолевыми клетками (Staerz et al. (1985) Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells, Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, Protein Eng. 9: 299-305).
- 3 034142
Домены связывания с эпитопом диатела также могут быть направлены на поверхностную детерминанту любой иммунной эффекторной клетки, такой как CD3, CD16, CD32 или CD64, которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, клетках -естественных киллерах (NK) или других мононуклеарных клетках. Во многих исследованиях также обнаружили, что связывание диатела с детерминантами эффекторных клеток, например, рецепторами Fey (FcyR), активирует эффекторную клетку (Holliger et al. (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3xAnti-CEA Bispecific Diabodies And B7xAnti-CEA Bispecific Fusion Proteins, Cancer Res. 59:2909-2916; международные патентные публикации №№ WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Как правило, активация эффекторных клеток запускается связыванием антигена, связанного антителом, с эффекторной клеткой посредством взаимодействия Fc-FcyR; таким образом, в связи с этим, молекулы диател могут проявлять Ig-подобную функциональность, независимо от того, содержат ли они домен Fc (например, согласно результатам любого анализа эффекторной функции, известного в настоящей области техники или представленного в качестве примера в настоящем документе (например, анализа ADCC)). Путем перекрестной сшивки опухолевых и эффекторных клеток диатело не только приводит эффекторную клетку в пространственную близость относительно опухолевых клеток, но приводит к эффективному лизису опухолевых клеток (см., например, Cao et al. (2003) Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics, Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
Тем не менее, вышеперечисленные преимущества сталкиваются с существенной стоимостью. Образование таких не моноспецифических диател требует успешной сборки двух или больше отдельных и различных полипептидов (т.е. такое образование требует, чтобы диатела образовывались посредством гетеродимеризации различных видов полипептидных цепей). Этот факт контрастирует с моноспецифическими диателами, которые образуются посредством гомодимеризации идентичных полипептидных цепей. Поскольку необходимо предоставить по меньшей мере два несходных полипептида (т.е. два вида полипептидов) для образования не моноспецифического диатела, и поскольку гомодимеризация таких полипептидов приводит к неактивным молекулам (Takemura S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8): 583-588), получение таких полипептидов должно осуществляться таким путем, который предотвратит образование ковалентных связей между полипептидами одного и того же вида (т.е. так, чтобы предотвратить гомодимеризацию) (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8): 583-588). В связи с этим в настоящей области техники раскрыто нековалентное связывание таких полипептидов (см., например, Olafsen et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Lu D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
Тем не менее, в настоящей области техники установлено, что биспецифические диатела, состоящие из нековалентно связанных полипептидов, являются нестабильными и легко диссоциируются до нефункциональных мономеров (см. например, Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
Ввиду такой проблемы, в настоящей области техники добились успеха в разработке стабильных, ковалентно связанных гетеродимерных не моноспецифических диател (см., например, международные патентные публикации №№ WO 2006/113665; WO/2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO/2012/162068; Johnson S. et al. (2010) Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity ReTargeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion J. Molec. Biol. 399(3): 436449; Veri M.C. et al. (2010) Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor lib (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold Arthritis Rheum. 62(7): 19331943; Moore P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma Blood 117(17): 4542-4551). Такие подходы предусматривают конструирование одного или нескольких цистеиновых остатков в каждом из используемых видов полипептидов. Например, было показано, что добавление цистеинового остатка к C-концу таких конструктов обеспечивает образование дисульфидной связи между полипептидными цепями, стабилизируя полученный гетеродимер, не создавая помехи для характеристик связывания бивалентной молекулы.
Несмотря на такой успех, получение стабильных, функциональных гетеродимерных, не моноспецифических диател может быть дополнительно оптимизировано путем тщательного рассмотрения и размещения цистеиновых остатков в одной или нескольких используемых полипептидных цепях. Такие оптимизированные диатела можно получить с более высоким выходом и с повышенной активностью, чем
- 4 034142 не оптимизированные диатела. Таким образом, настоящее изобретение относится к проблеме получения полипептидов, которые специально разработаны и оптимизированы для образования гетеродимерных диател. Настоящее изобретение решает указанную проблему путем обеспечения иллюстративных, оптимизированных CD123xCD3 диател.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к CD123xCD3 биспецифическим диателам, которые способны одновременно связываться с CD123 и CD3, и к применениям таких молекул в лечении заболевания, в частности гематологических злокачественных опухолей.
CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере две различных полипептидных цепи, которые ассоциируются друг с другом гетеродимерным образом с образованием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD123, и одного сайтом связывания, специфического в отношении эпитопа CD3. Таким образом, CD123xCD3 диатело согласно настоящему изобретению является моновалентным в том смысле, что оно способно связываться только с одной копией эпитопа CD123 и только с одной копией эпитопа CD3, но является биспецифическим в том смысле, что отдельное диатело способно связываться одновременно с эпитопом CD123 и с эпитопом CD3. Отдельные полипептидные цепи диател ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи. Согласно конкретным вариантам осуществления диатела согласно настоящему изобретению дополнительно содержат домен Fc иммуноглобулина или альбуминсвязывающий домен для увеличения периода полужизни in vivo.
Более конкретно, согласно настоящему изобретению также предусмотрено характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое моновалентное диатело, способное специфически связываться с эпитопом CD123 и с эпитопом CD3, причем диатело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, ковалентно связанные друг с другом, причем:
A) первая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к C-концу:
i) домен 1, содержащий:
(1) субдомен (1A), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLcds) (SEQ ID NO:21); и (2) субдомен (1B), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123) (SEQ ID NO:26);
причем субдомены 1A и 1B отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:29);
ii) домен 2, причем домен 2 представляет собой E-спиральный домен (SEQ ID NO:34) или Kспиральный домен (SEQ ID NO:35), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:30); и
B. вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к C-концу:
i) домен 1, содержащий:
(1) субдомен (1A), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123) (SEQ ID NO:25); и (2) субдомен (1B), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHcd3) (SEQ ID NO:22);
причем субдомены 1A и 1B отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:29);
ii) домен 2, причем домен 2 представляет собой K-спиральный домен (SEQ ID NO:35) или Eспиральный домен (SEQ ID NO:34), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:30); и причем домен 2 первой и второй полипептидных цепей не представляют собой оба Eспиральных домена или оба K-спиральных домена; и при этом:
(a) указанный домен VL указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VH указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и (b) указанный домен VL указанной второй полипептидной цепи и указанный домен VH указанной первой полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD123.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрено характеризующееся неоптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое моновалентное диатело, способное специфически связываться с эпитопом CD123 и с эпитопом CD3, причем диатело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, ковалентно связанные друг с другом, причем:
A) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу:
i) домен 1, содержащий:
(1) субдомен (1A), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLCD3) (SEQ ID NO:23); и (2) субдомен (1B), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123) (SEQ ID NO:28);
- 5 034142 причем субдомены 1А и 1B отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID N0:29);
ii) домен 2, причем домен 2 представляет собой E-спиральный домен (SEQ ID NO:34) или Kспиральный домен (SEQ ID NO:35), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:30); и
B) вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к C-концу:
i) домен 1, содержащий:
(1) субдомен (1A), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123) (SEQ ID NO:27); и (2) субдомен (1B), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHcds) (SEQ ID NO:24);
причем субдомены 1A и 1B отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:29);
ii) домен 2, причем домен 2 представляет собой K-спиральный домен (SEQ ID NO:35) или Eспиральный домен (SEQ ID NO:34), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:30); и причем домен 2 первой и второй полипептидных цепей не представляют собой оба Eспиральных домена или оба K-спиральных домена; и при этом:
(a) указанный домен VL указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VH указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и (b) указанный домен VL указанной второй полипептидной цепи и указанный домен VH указанной первой полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD123.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления описанных выше биспецифических моновалентных диател, в котором первая или вторая полипептидная цепь дополнительно содержит альбуминсвязывающий домен (SEQ ID NO:36), соединенный на C-конце с доменом 2 или на N-конце с доменом 1 посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:31).
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления описанных выше биспецифических моновалентных диател, в котором первая или вторая полипептидная цепь дополнительно содержит домен 3, содержащий домен CH2 и CH3 домена Fc иммуноглобулина IgG (SEQ ID NO:37), причем домен 3 соединен на N-конце с доменом 1А посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:33).
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления описанных выше биспецифических моновалентных диател, в котором первая или вторая полипептидная цепь дополнительно содержит домен 3, содержащий домен CH2 и CH3 домена Fc иммуноглобулина IgG (SEQ ID NO:37), причем домен 3 соединен на C-конце с доменом 2 посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:32).
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления любого из описанных выше биспецифических моновалентных диател, в котором домен 2 первой полипептидной цепи представляет собой K-спиральный домен (SEQ ID NO:35), и домен 2 второй полипептидной цепи представляет собой E-спиральный домен (SEQ ID NO:34).
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления любого из описанных выше биспецифических моновалентных диател, в котором домен 2 первой полипептидной цепи представляет собой E-спиральный домен (SEQ ID NO:34), и домен 2 второй полипептидной цепи представляет собой K-спиральный домен (SEQ ID NO:35).
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления биспецифического моновалентного диатела, способного специфически связываться с эпитопом CD123 и с эпитопом CD3, причем диатело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, ковалентно связанные друг с другом, причем указанное биспецифическое диатело содержит следующее:
A) первую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1; и
B) вторую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3;
причем указанная первая и указанная вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидной связью.
Диатела согласно настоящему изобретению проявляют неожиданно усиленные функциональные активности, как дополнительно описано ниже.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны перекрестно реагировать с белками CD123 и CD3 как человека, так и примата, предпочтительно белками CD123 и CD3 яванского макака.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны подвергать деплеции в vitro клеточном анализе плазмацитоидные дендритные клетки (pDC) из культуры первичных РВМС со значением IC50, составляющим приблизительно 1 нг/мл или меньше, приблизительно 0,8 нг/мл или меньше, приблизительно 0,6 нг/мл или меньше, приблизительно 0,4 нг/мл или меньше, приблизительно 0,2 нг/мл
- 6 034142 или меньше, приблизительно 0,1 нг/мл или меньше, приблизительно 0,05 нг/мл или меньше, приблизительно 0,04 нг/мл или меньше, приблизительно 0,03 нг/мл или меньше, приблизительно 0,02 нг/мл или меньше или приблизительно 0,01 нг/мл или меньше. Значение IC50 предпочтительно составляет приблизительно 0,01 нг/мл или меньше. В описанном выше анализе культура первичных РВМС может происходить от яванского макака, в этом случае указанная деплеция представляет собой деплецию плазмацитоидных дендритных клеток яванского макака (pDC). Необязательно диатела согласно настоящему изобретению могут быть способны подвергать деплеции плазмацитоидные дендритные клетки (pDC) из первичной культуры РВМС, как описано выше, причем анализ проводят согласно или в соответствии с протоколом примера 14, как описано в настоящем документе, или путем модификации такого анализа, что будет понятно специалистам в настоящей области техники, или другими способами, известными специалистам в настоящей области техники.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно проявляют цитотоксичность в in vitro анализе Kasumi-3 со значением EC50, составляющим приблизительно 0,05 нг/мл или меньше. Значение EC50 предпочтительно составляет приблизительно 0,04 нг/мл или меньше, приблизительно 0,03 нг/мл или меньше, приблизительно 0,02 нг/мл или меньше или приблизительно 0,01 нг/мл или меньше. Необязательно диатела согласно настоящему изобретению могут проявлять цитотоксичность, как описано выше, причем анализ проводят согласно или в соответствии с протоколом примера 3, как описано в настоящем документе, или путем модификации такого анализа, что будет понятно специалистам в настоящей области техники, или другими способами, известными специалистам в настоящей области техники.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно проявляют цитотоксичность в in vitro анализе Molm-13 со значением EC50, составляющим приблизительно 5 нг/мл или меньше. Значение EC50 предпочтительно составляет приблизительно 3 нг/мл или меньше, приблизительно 2 нг/мл или меньше, приблизительно 1 нг/мл или меньше, приблизительно 0,75 нг/мл или меньше или приблизительно 0,2 нг/мл или меньше. Необязательно диатела согласно настоящему изобретению могут проявлять цитотоксичность, как описано выше, причем анализ проводят согласно или в соответствии с протоколом примера 3, как описано в настоящем документе, или путем модификации такого анализа, что будет понятно специалистам в настоящей области техники, или другими способами, известными специалистам в настоящей области техники.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата MOLM-13 у мыши. Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно могут быть способны ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата MOLM-13 у мыши в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 20 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 4 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,8 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,6 мкг/кг или по меньшей мере приблизительно 0,4 мкг/кг. Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению будут ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата MOLM-13 у мыши по меньшей мере на 25%, но возможно по меньшей мере приблизительно на 40% или больше, по меньшей мере приблизительно на 50% или больше, по меньшей мере приблизительно на 60% или больше, по меньшей мере приблизительно на 70% или больше, по меньшей мере приблизительно на 80% или больше, по меньшей мере приблизительно на 90% или больше или даже полностью ингибировать рост опухоли MOLM-13 через некоторый период времени или вызывая регрессию или исчезновение опухоли. Указанное ингибирование наблюдается по меньшей мере для линии мышей NSG. Необязательно диатела согласно настоящему изобретению могут быть способны ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата MOLM-13 у мыши описанным выше образом согласно или в соответствии с протоколом примера 6, как описано в настоящем документе, или путем модификации такого анализа, что будет понятно специалистам в настоящей области техники, или другими способами, известными специалистам в настоящей области техники.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата RS4-11 у мыши. Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно могут быть способны ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата RS4-11 у мыши в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,2 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,1 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,02 мг/кг или по меньшей мере приблизительно 0,004 мг/кг. Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению будут ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата RS4-11 у мыши по меньшей мере приблизительно на 25%, но возможно по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90% или даже полностью ингибировать рост опухоли RS4-11 через некоторый период времени или вызывая регрессию или исчезновение опухоли. Указанное ингибирование наблюдается по меньшей мере для линии мышей NSG. Необязательно диатела согласно настоящему изобретению могут быть способны ингибировать рост опухолевого ксенотрансплантата RS4-11 у мыши описанным выше образом согласно или в соответствии с протоколом примера 6, как описано в настоящем документе, или путем модификации такого анализа, что будет понятно специалистам в настоящей области техники, или другими способами, известными специа
- 7 034142 листам в настоящей области техники.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны подвергать деплеции лейкозные бластные клетки in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ. Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно могут быть способны подвергать деплеции лейкозные бластные клетки in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ при концентрациях, составляющих по меньшей мере приблизительно 0,01 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,02 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,04 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,06 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,08 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 0,1 нг/мл. Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно могут быть способны подвергать деплеции лейкозные бластные клетки in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ меньше чем на 20% от общей популяции первичных лейкозных бластных клеток при концентрациях диатела, составляющих по меньшей мере приблизительно 0,01 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,02 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,04 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,06 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,08 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 0,1 нг/мл, необязательно после инкубации первичной культуры с диателом в течение приблизительно 120 ч. Лейкозные бластные клетки предпочтительно подвергают деплеции in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ меньше чем на 20% от общей популяции первичных лейкозных бластных клеток при концентрациях диатела, составляющих приблизительно 0,01 нг/мл или 0,1 нг/мл, после инкубации первичной культуры с диателом в течение приблизительно 120 ч.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны индуцировать экспансию Тклеточной популяции in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ. Такая экспансия предпочтительно может составлять приблизительно 70% или больше от максимальной Т-клеточной популяции, которая может быть подвергнута экспансии в анализе. Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно могут быть способны индуцировать экспансию Т-клеточной популяции in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ приблизительно на 70% или больше от максимальной Тклеточной популяции, которая может быть подвергнута экспансии в анализе при концентрациях диатела, составляющих по меньшей мере приблизительно 0,01 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,02 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,04 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,06 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,08 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 0,1 нг/мл, необязательно после инкубации первичной культуры с диателом в течение приблизительно 120 ч. Т-клеточная популяция предпочтительно увеличивается in vitro в первичной культур клеток костного мозга ОМЛ приблизительно на 70% или больше от максимальной Т-клеточной популяции, которая может быть подвергнута экспансии в анализе при концентрациях диатела, составляющих приблизительно 0,01 нг/мл или приблизительно 0,1 нг/мл после инкубации первичной культуры с диателом в течение приблизительно 120 ч.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны индуцировать активацию Тклеточной популяции in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ. Такая активация может происходить при концентрациях диатела, составляющих по меньшей мере приблизительно 0,01 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,02 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,04 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,06 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,08 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 0,1 нг/мл, необязательно после инкубации первичной культуры с диателом в течение приблизительно 72 часов. Такую активацию можно измерить по экспрессии маркера Т-клеточной активации, такого как CD25. Активация Т-клеточная популяция in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ, измеряемая по экспрессии CD25, предпочтительно происходит при концентрациях диатела, составляющих приблизительно 0,01 нг/мл или приблизительно 0,1 нг/мл, после инкубации первичной культуры с диателом в течение приблизительно 72 ч.
Диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно способны подвергать деплеции лейкозные бластные клетки in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ меньше чем на 20% от общей популяции первичных лейкозных бластных клеток и в то же время индуцировать экспансию Тклеточной популяции in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ приблизительно на 70% или больше от максимальной Т-клеточной популяции, которая может быть подвергнута экспансии в анализе, при концентрациях диатела, составляющих по меньшей мере приблизительно 0,01 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,02 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,04 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,06 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 0,08 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 0,1 нг/мл, необязательно после инкубации первичной культуры с диателом в течение приблизительно 120 ч. Концентрации диатела предпочтительно составляют приблизительно 0,01 нг/мл или приблизительно 0,1 нг/мл, и первичную культуру инкубируют с диателом в течение приблизительно 120 ч.
Диатела согласно настоящему изобретению могут быть способны подвергать деплеции лейкозные бластные клетки in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ и/или индуцировать экспансию Т-клеточной популяции in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ и/или индуцировать активацию Т-клеточной популяции in vitro в первичной культуре клеток костного мозга ОМЛ описанным выше образом согласно или в соответствии с протоколом примера 8, как описано в настоящем документе, или путем модификации такого анализа, что будет понятно специалистам в настоящей облас
- 8 034142 ти техники, или другими способами, известными специалистам в настоящей области техники.
Во избежание неверного толкования диатела согласно настоящему изобретению могут проявлять один, два, три, больше трех или все из функциональных признаков, описанных в настоящем документе. Таким образом, диатела согласно настоящему изобретению могут проявлять любую комбинацию функциональных признаков, описанных в настоящем документе.
Диатела согласно настоящему изобретению являются пригодными для применения в качестве фармацевтического средства. Диатела предпочтительно являются пригодными для применения в лечении заболевания или состояния, связанного с экспрессией CD123 или характеризующегося экспрессией CD123. Настоящее изобретение также относится к применению диатела согласно настоящему изобретению в производстве фармацевтической композиции, предпочтительно для лечения заболевания или состояния, связанного с экспрессией CD123 или характеризующегося экспрессией CD123, как дополнительно определено в настоящем документе.
Заболевание или состояние, связанное с экспрессией CD123 или характеризующееся экспрессией CD123, может представлять собой злокачественную опухоль. Например, злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из следующего: острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), включая в себя бластный криз ХМЛ и онкоген Абельсона, связанный с ХМЛ (транслокация Bcr-ABL), миелодиспластический синдром (МДС), острый B-лимфобластный лейкоз (B-ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), включая в себя ХЛЛ с синдромом Рихтера или трансформацией Рихтера, волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток (ОБПДК), нехождкинские лимфомы (НХЛ), включая в себя мантийноклеточную лимфому (МКЛ) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МЛЛ), лимфома Ходжкина, системный мастоцитоз и лимфома Беркитта.
Заболевание или состояние, связанное с экспрессией CD123 или характеризующееся экспрессией CD123, может представлять собой воспалительное состояние. Например, воспалительное состояние может быть выбрано из группы, состоящей из следующего: системная красная волчанка (СКВ), аллергия, бронхиальная астма и ревматоидный артрит.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая любое из описанных выше диател и физиологически приемлемый носитель.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрено применение описанной выше фармацевтической композиции в лечении заболевания или состояния, связанного с экспрессией CD123 или характеризующегося экспрессией CD123.
В частности, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления такого применения, в котором заболевание или состояние, связанное с экспрессией CD123 или характеризующееся экспрессией CD123, представляет собой злокачественную опухоль (особенно злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из следующего: острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), включая в себя бластный криз ХМЛ и онкоген Абельсона, связанный с ХМЛ (транслокация Bcr-ABL), миелодиспластический синдром (МДС), острый B-лимфобластный лейкоз (BОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), включая в себя ХЛЛ с синдромом Рихтера или трансформацией Рихтера, волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток (ОБПДК), нехождкинские лимфомы (НХЛ), включая в себя мантийноклеточную лимфому (МКЛ) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МЛЛ), лимфома Ходжкина, системный мастоцитоз и лимфома Беркитта).
В частности, согласно настоящему изобретению предусмотрен вариант осуществления такого применения, в котором заболевание или состояние, связанное с экспрессией CD123 или характеризующееся экспрессией CD123, представляет собой воспалительное состояние (особенно воспалительное состояние, выбранное из группы, состоящей из следующего: системная красная волчанка (СКВ), аллергия, бронхиальная астма и ревматоидный артрит).
Такие термины, как приблизительно следует понимать как среднее в пределах 10%, более предпочтительно в пределах 5% от указанного значения, если контекстом не предусмотрено иное.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано, что CD123, как известно, экспрессируется на лейкозных стволовых клетках.
На фиг. 2 проиллюстрированы структуры первой и второй полипептидных цепей двухцепочечного CD123xCD3 биспецифического моновалентного диатела согласно настоящему изобретению.
На фиг. 3A и 3B проиллюстрированы структуры двух версий первой, второй и третьей полипептидных цепей трехцепочечного CD123xCD3 биспецифического моновалентного Fc - диатела согласно настоящему изобретению (версия 1, фиг. 3A; версия 2, фиг. 3B).
На фиг. 4 (панели А-Е) показана способность различных CD123xCD3 биспецифических диател опосредовать Т-клеточный перенаправленный цитолиз клеток - мишеней, проявляющих изменяющееся количество CD123. На фиг. представлены кривые зависимости от дозы, указывающие на то, что характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A), содержащее альбуминсвязывающий домен (DART-A с ABD w/ABD) проявило большую цитотоксич- 9 034142 ность, чем контрольное биспецифическое диатело (контрольное DART) или характеризующееся неоптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-B) в многочисленных типах клеток-мишеней: RS4-11 (панель A); TF-1 (панель B); Molm-13 (панель С); Kasumi-3 (панель D); и ТНР-1 (панель Е) в соотношении Е:Т (эффектор : мишень), составляющем 10:1.
На фиг. 5 (панели A-D) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A), характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела, содержащего альбуминсвязывающий домен (DART-A с ABD w/ABD) и характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела, содержащего домен Fc иммуноглобулина IgG (DART-A с Fc w/Fc), опосредовать Т-клеточную активацию в процессе перенаправленного цитолиза клеток-мишеней. На фиг. представлены кривые зависимости от дозы, показывающие цитотоксичность, опосредованную DART-A, DART-A w/ABD и DART-A w/Fc в клетках Kasumi-3 (панель A) и ТНР-1 (панель B) и очищенных CD8 Т-клетках при соотношении Е:Т (эффекторная клетка : клетка -мишень), составляющем 10:1 (18 ч инкубация). На панелях С и D показаны кривые зависимости от дозы Т-клеточной активации с использованием маркера CD25 на CD8 Т-клетках в присутствии (панель D) и при отсутствии (панель С) клеток мишеней.
На фиг. 6 (панели A-B) показаны содержания гранзима В и перфорина в CD4 и CD8 Т-клетках после обработки с помощью характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) (панель A) или контрольного биспецифического диатела (контрольного DART) (панель B) в присутствии клеток-мишеней Kasumi-3 и дремлющих Т-клеток в соотношении Е:Т, составляющем 10:1.
На фиг. 7 (панели A-B) показана in vivo противоопухолевая активность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) при уровнях дозировки в нг/кг. Клетки MOLM-13 (промежуточный уровень экспрессии CD123) смешивали с Тклетками и имплантировали подкожно (Т:Е 1:1) мышам NSG. Внутривенное лечение осуществляли один раз в день в течение 8 дней (QDx8), начиная со дня имплантации. Различные концентрации DART-A сравнивали с контрольным биспецифическим диателом (контрольным DART). На панели A показаны клетки Molm-13 отдельно или с Т-клетками, и эффект различных доз DART-A на объем опухоли, даже во временные точки за пределами 30 дней. На панели В показан эффект повышающихся доз DART-A на объем опухоли, наблюдаемый у мышей NSG, получивших клетки MOLM-13 и Т-клетки (Т:Е 1:1) в течение периода времени, составляющего 0-18 дней.
На фиг. 8 показана in vivo противоопухолевая активность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) на клетки RS4-11 (ОЛЛ с признаками моноцитов). Клетки смешивали с Т-клетками и имплантировали подкожно (Т:Е 1:1) мышам NSG. Внутривенное лечение осуществляли один раз в день в течение 4 дней (QDx4), начиная со дня имплантации. Различные концентрации DART-A сравнивали с контрольным биспецифическим диателом (контрольное DART).
На фиг. 9 (панели A-B) показаны CD123+ бластные клетки в мононуклеарах костного мозга (ВМ MNC) и мононуклеарах периферической крови (РВМС) от пациента 1 с ОМЛ (панель A) по сравнению с клеточной линией ОМЛ Kasumi-3 (панель B).
На фиг. 10 (панели А-С) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) опосредовать сокращение бластных клеток при первичном ОМЛ через 120 ч (панель A), управлять экспансией Т-клеточной популяции при первичном ОМЛ через 120 ч (панель B) и индуцировать Т-клеточную активацию при ОМЛ через 48 и 72 ч (панель С).
На фиг. 11 (Панели А-Н) показана идентификация популяции CD123+ бластных клеток в первичном образце РВМС ОЛЛ. На панелях A и Е показано прямое и боковое светорассеяние вводимой популяции нормальных РВМС (панель A) и РВМС ОЛЛ (панель Е). На панелях В и F показана идентификация популяции лимфоцитов в качестве, главным образом, B-клеток (панель B) и лейкозных бластных клеток (панель F). На панелях С и G показана идентификация популяции лимфоцитов, которые являются CD123+. На панелях D и H показана идентификация CD19+ клеток и CD123+ клеток.
На фиг. 12 (панели A-B) показана идентификация CD4 и CD8 популяций Т-клеток в первичном образце РВМС ОЛЛ. На панели A показано прямое и боковое светорассеяние вводимой популяции РВМС ОЛЛ. На панели В показаны CD4 или CD8 популяции Т-клеток, присутствующие в образцах. Количества указывают, что CD4 Т-клетки представляют приблизительно 0,5% от общего количества клеток, и CD8 Т-клетки представляют приблизительно 0,4% от общего количества клеток, присутствующих в образце РВМС ОЛЛ.
На фиг. 13 (панели А-Н) показана способность характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) опосредовать деплецию бластных клеток при ОЛЛ с помощью аутологических CTL (цитотоксические Т-лимфоцитов). На панелях A и Е показано прямое и боковое светорассеяние вводимой популяции нормальных РВМС (панель A) и РВМС ОЛЛ (па
- 10 034142 нель Е). РВМС оставляли не обработанными (панели В и F), обрабатывали с помощью контрольного биспецифического диатела (контрольного DART) (панели С и G) или обрабатывали с помощью DART-A (панели D и Н) и инкубировали в течение 7 дней, после чего окрашивали в отношении CD34 и CD19.
На фиг. 14 (панели A-L) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) опосредовать Т-клеточную экспансию (панели А, B, С, G, H и I) и активацию (панели D, E, F, J, К и L) в нормальных РВМС (панели A-F) и РВМС ОЛЛ (панели G-L). Клетки оставляли не обработанными (панели A, D, G и J) или обрабатывали с помощью контрольного биспецифического диатела (контрольного DART) (панели B, E, H и K) или DART-A (панели С, F, I и L) в течение 7 дней.
На фиг. 15 (панели А-С) показана идентификация бластной популяции ОМЛ и Т-клеток в первичном образце ОМЛ. На панели A показано прямое и боковое светорассеяние вводимой популяции РВМС ОМЛ. На панели В показана идентификация бластной популяции ОМЛ в образце ОМЛ. На панели С показана идентификация Т-клеточной популяции в образце ОМЛ.
На фиг. 16 (панели А-С) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) опосредовать деплецию бастных клеток при ОМЛ с помощью аутологических CTL и Т-клеточной экспансии. Первичные РВМС ОМЛ от пациента 2 инкубировали с PBS, контрольным биспецифическим диателом (контрольным DART) или DART-A в течение 144 ч. Подсчитывали бластные клетки (панель A), CD4 Т-клетки (панель B) и CD8 Т-клетки (панель С).
На фиг. 17 (панели A-D) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) опосредовать Т-клеточную активацию при ОМЛ. Экспрессию CD25 (панель A) и Ki-67 (панель B) определяли для CD4 и CD8 Т-клеток от пациента 2 с ОМЛ после инкубации с контрольным биспецифическим диателом (контрольным DART) или DART-A с аутологическими РВМС. Содержание перфорина (панель С) и гранзима В (панель D) определяли для CD4 и CD8 Т-клеток от пациента 2 с ОМЛ после инкубации с контрольным DART или DART-А с аутологическими РВМС.
На фиг. 18 (панели A-D) показано, что характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) способно перекрестно реагировать с белками CD123 и CD3 как человека, так и примата. На панелях показаны кривые сенсограмм BIACORE™ результатов анализов, проведенных для оценки способности DART-A связываться с белками CD3 (панели A и B) и CD123 (панели С и D) человека (панели A и С) и нечеловекообразного примата (панели В и D). Представлены значения KD.
На фиг. 19 (панели A-B) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) опосредовать деплецию аутологических моноцитов in vitro с РВМС человека и яванского макака. На панелях представлены результаты кривых зависимости от дозы опосредованной DART-A цитотоксичности с первичными РВМС человека (панель A) или РВМС яванского макака (панель B).
На фиг. 20 (панели A-N) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) опосредовать деплецию pDC у яванских макак без системной индукции цитокинов. На панелях A-D показаны контрольные результаты, полученные через 4 ч и 4 дней с инертным носителем и носителем. На панелях E-Н показаны контрольные результаты, полученные через 4 ч и 4 дней с контрольным биспецифическим диателом (контрольным DART). На панелях I-N показаны результаты, полученные через 4 ч и 4 дней в дозе DART-А, составляющей 10 нг/кг/день, и через 4 дня в дозе DART-А, составляющей 30 нг/кг/день.
На фиг. 21 (панели A-D) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) опосредовать зависимую от дозы деплецию pDC у яванских макак. Яванским макакам вводили дозы DART-A, составляющие 0,1, 1, 10, 30 100, 300 или 1000 нг/кг. РВМС оценивали в указанное время и определяли общее количество B-клеток (панель A), моноцитов (панель B), NK-клеток (панель С) и pDC (панель D).
На фиг. 22 (панели A-D) показана способность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) периодически модулировать Т-клетки у яванских макак. Яванским макакам вводили дозы DART-А, составляющие 0,1, 1, 10, 30 100, 300 или 1000 нг/кг. РВМС оценивали в указанное время и определяли общее количество Т-клеток (панель A), CD4 Тклеток (панель B), CD69 клеток (панель С) и CD8 Т-клеток (панель D).
На фиг. 23 показан анализ SDS-PAGE очищенного белка DART-A при восстанавливающих (слева) и невосстанавливающих (справа) условиях.
На фиг. 24А-24В показаны физико-химические характеристики очищенного DART-A. На фиг. 24А: профиль SEC белка DART-A на калиброванной колонке TSK G3000SWxL.
На фиг. 24В - масс-спектр белка DART-A.
На фиг. 25A-25D показан анализ SPR связывания DART-A с иммобилизированными CD123 и CD3 человека или яванского макака. Пунктирными линиями представлена глобальная аппроксимация к 1:1
- 11 034142 модели Ленгмюра экспериментальных кривых связывания, полученных при концентрациях DART-A, составляющих 0, 6,25, 12,5, 25, 50 или 100 нМ (непрерывные линии). Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.
На фиг. 26А-26Е показано, что DART-A способно одновременно связываться как с CD3, так и CD123. На фиг. 26А-26В представлены результаты бифункционального анализа ELISA и продемонстрировано одновременное вовлечение обоих антигенов-мишеней DART-A. На планшеты ELISA наносили CD123 человека (фиг. 26A) или яванского макака CD123 (фиг. 26B). За титрованием концентраций DART-A и контрольного DART следовало обнаружение с помощью CD3-биотин человека. На фиг. 26C26Е продемонстрировано связывание клеточной поверхностью DART-A на CD123+ Molm-13 клеткемишени (фигура 26С), Т-клетках человека (фигура 26D) и Т-клетках яванского макака (фиг. 26Е). Связывание обнаруживали с помощью анализа FACS с использованием моноклонального антитела, специфического в отношении E-спиральной и K-спиральной области молекулы DART-A или контрольного DART.
На фиг. 27А-27Н показана способность DART-A опосредовать перенаправленный цитолиз клетки мишени эффекторными клетками человек или обезьяны против CD123+ Kasumi-3 лейкозных клеточных линий, показана способность молекул связываться с подклассом нормальных циркулирующих в кровотоке лейкоцитов, включая в себя pDC и моноциты, и показана способность молекул подвергать деплеции CD14-CD123high клетки (pDC и базофилы), не поражая моноциты (CD14+ клетки). На фиг. 27А показаны относительные сайты связывания с антителом к CD123-PE U937 и лейкозные клеточные линии Kasumi-3, определенные с помощью анализа QFACS. На фиг. 27В показана относительно низкая процентная цитотоксичность, опосредованная DART-A или контрольным DART на клеточной линии ОМЛ (клетках U937), которые, как показано на фиг. 27А, содержат относительно немного сайтов связывания с CD123). На фиг. 27С показана процентная цитотоксичность, опосредованная DART-A или контрольным DART в присутствии очищенных Т-клеток человека (в качестве эффекторных клеток) на клеточной линии ОМЛ (клетках Kasumi-3), которые, как показано на фиг. 27А, содержат значительное количество сайтов связывания с CD123. На фиг. 27B-27С соотношение Е:Т составляет 10:1. На фиг. 27D показана процентная цитотоксичность, опосредованная DART-A или контрольным DART в присутствии очищенных РВМС яванского макака (в качестве эффекторных клеток) на клетках Kasumi-3 (соотношение Е:Т составляет 15:1), и продемонстрировано, что DART-A может связываться с Т-клетками яванского макака. На фиг. 27Е показаны относительные сайты связывания с антителом к CD123-PE на клетках Kasumi-3, моноцитах человека, плазмацитоидных дендритных клетках человека (pDC), моноцитах яванского макака и плазмацитоидных дендритных клетках яванского макака, что определяли с помощью анализа QFACS. На фиг. 27F показана способность DART-A подвергать деплеции CD14- CD12310 клетки. На фиг. 27G показана способность DART-A подвергать деплеции CD14- CD123H1 клетки человека. На фиг. 27Н показана способность DART-A подвергать деплеции CD14- CD123Hi клетки яванского макака. Цитотоксичность определяли по высвобождению LDH, при этом значения EC50 определяли с помощью программного обеспечения GraphPad PRISM®.
На фиг. 28 показано применение двухкомпартментной модели для оценки фармакокинетических параметров DART-A. Данные показывают концентрации DART-A в сыворотке в конце инфузии (EOI) у яванских макак после получения 96-часовой инфузии в дозе, составляющей 100 нг/кг/день, 300 нг/кг/день, 600 нг/кг/день и 1000 нг/кг/день. Каждая точка представляет отдельное животное; горизонтальные линии представляют среднее значение для группы дозирования.
На фиг. 29А-29С показан эффект инфузии DART-A на продукцию цитокина, IL-6. Содержания IL-6 в сыворотке (среднее ± SEM) у обезьян, которым вводили инфузии DART-A, показаны по группам лечения. Яванским макакам вводили инертный носитель - контроль в 1 день, после чего вводили 4 еженедельных инфузии или инертного носителя (группа 1) (фиг. 29A), или DART-А, вводимого в виде 4дневных инфузий каждую неделю, начиная с 8 дня, в 15, 22 и 29 день (группы 2-5) (фиг. 29B) или в виде инфузии 7 дней в неделю в течение 4 недель, начиная на 8 день (группа 6) (фиг. 29С). Интервалы лечения указаны серыми столбиками.
На фиг. 30A-30F показан эффект инфузии DART-A на деплецию CD14-/CD123+ клеток (фиг. 30А30С) и CD303+ клеток (фиг. 30D-30F). Показано среднее ± SEM циркулирующих в кровотоке содержаний CD14-/CD123+ (фиг. 30А-300) или CD303+ (фиг. 30D-30F) по дням исследования и группам. Яванским макакам вводили инертный носитель - контроль в 1 день, после чего вводили 4 еженедельных инфузии или инертного носителя (группа 1) (фиг. 30A и 30D), или DART-A, вводимого в виде 4-дневных инфузий каждую неделю, начиная с 8 дня, в 15, 22 и 29 день (группы 2-5) (фиг. 30A и 30E) или в виде инфузии 7 дней в неделю в течение 4 недель, начиная на 8 день (группа 6) (фиг. 30C и 30F). Интервалы лечения указаны серыми столбиками.
На фиг. 31A-31I показаны наблюдаемые изменения в Т-клеточных популяциях (фигуры 31А-31С), CD4+ клеточных популяциях (фигуры 31D-31F) и CD8+ клеточных популяциях (фигуры 31G-31I), получающих DART-A, вводимое в виде 4-дневных инфузий, начиная на 8 день, в 15, 22 и 29 день. Легенда: CD25+ (серые квадраты); CD69+ (серые треугольники), PD-1+ (белые треугольники); Tim-3+ (белые
- 12 034142 квадраты). Т-клетки подсчитывали с помощью маркеров CD4 и CD8, а не канонического CD3, для устранения возможного взаимовлияния со стороны DART-А. Яванским макакам вводили инертный носитель контроль в 1 день, после чего вводили 4 еженедельных инфузий или инертного носителя (группа 1), или DART-А, вводимого в виде 4-дневных инфузий каждую неделю, начиная с 8 дня, в 15, 22 и 29 день (группа 5) или в виде инфузий 7 дней в неделю в течение 4 недель, начиная на 8 день (группа 6). Интервалы лечения указаны серыми столбиками. Показано среднее ± SEM от абсолютного количества циркулирующих в кровотоке Т-клеток по дням исследования и группам (фиг. 31А-31С). Показаны относительные значения (средний процент ± SEM) CD25+, CD69+, PD-1+ и Tim-3+ на CD4 (фиг. 31D-31E) или CD8 Т-клетках (фиг. 31F-31H) по дням исследования и группам.
На фиг. 32A-32F показаны наблюдаемые изменения в CD4+ Т-клеточных популяциях (фигуры 32А32С) и CD8+ Т-клеточных популяциях (фигуры 32D-32F) во время и после непрерывной 7-дневной инфузии DART-A. Показано среднее ± SEM в процентах от CD25+, CD69+, PD-1+ и Tim-3+ на CD4 (фиг. 32А-32С) или CD8 (фиг. 32D-32F) Т-клетках по дням исследования и группам 2, 3 и 4. Интервалы лечения указаны серыми столбиками. Легенда: CD25+ (серые квадраты); CD69+ (серые треугольники), PD-1+ (белые треугольники); Tim-3+ (белые квадраты).
На фиг. 33A-33F показаны наблюдаемые изменения в CD4+ Т-клеточных популяциях (фиг. 33A33С) и CD8+ Т-клеточных популяциях (фиг. 33D-33F) во время и после непрерывной 7-дневной инфузии DART-A. Показано среднее ± SEM в процентах от CD4+ наивных клеток (CD95-/CD28+), СМТ (CD95+/CD28+) и ЕМТ (CD95+/CD28-) Т-клеток в CD4+ популяции (фиг. 33A-33O) или CD8 популяции (фиг. 33D-33F) по дням исследования и группам 2, 3 и 4. Яванским макакам вводили инертный носитель контроль в 1 день, после чего вводили 4 еженедельных инфузии или инертного носителя или DART-A, вводимого в виде 4-дневных инфузий каждую неделю, начиная с 8 дня, в 15, 22 и 29 день (группы 2-4). Интервалы лечения указаны серыми столбиками. Легенда: наивные клетки (белые треугольники); СМТ (черные треугольники), ЕМТ (серые квадраты).
На фиг. 34 показана опосредованная DART-A цитотоксичность против клеток Kasumi-3 с РВМС либо от не подвергшихся воздействию обезьян, либо обезьян, получивших лечение с помощью многочисленных инфузий DART-A.
На фиг. 35A-35F показано, что воздействие DART-A повышало относительную частоту центральных CD4 клеток памяти и эффекторных CD8+ клеток памяти за счет соответствующей ранее не подверженной воздействиям Т-клеточной популяции. Показано среднее ± SEM в процентах от CD4+ наивных клеток (CD95-/CD28+), СМТ (CD95+/CD28+) и ЕМТ (CD95+/CD28-) Т-клеток в CD4+ популяции (фиг. 35А-35С) или в CD8+ популяции (фиг. 35D-35F по дням исследования и группам. Яванским макакам вводили инертный носитель - контроль в 1 день, после чего вводили 4 еженедельных инфузии или инертного носителя (группа 1), или DART-А, вводимого в виде 4-дневных инфузий каждую неделю, начиная с 8 дня, в 15, 22 и 29 день (группа 5) или в виде инфузии 7 дней в неделю в течение 4 недель, начиная на 8 день (группа 6). Интервалы лечения указаны серыми столбиками. Легенда: наивные (белые треугольники); СМТ (черные треугольники), ЕМТ (серые квадраты).
На фиг. 36A-36F показан эффект DART-A на параметры эритроцитов у обезьян, которые получили инфузии молекул. Показаны содержания циркулирующих эритроцитов (фиг. 36А-36С) или ретикулоцитов (фиг. 36D-36F) (среднее ± SEM) в образцах, собранных в указанные временные точки от обезьян, получивших лечение с помощью DART-A.
На фигурах 37А-37В показана частота встречаемости (средний процент ± SEM) CD123+ клеток (фиг. 37A) или HSC (CD34+/CD38-/CD45-/CD90+ клеток) (фиг. 37B) в Lin-клеточной популяции в образцах костного мозга, собранных в указанные временные точки от обезьян, получивших лечение с помощью DART-A. Яванским макакам вводили инертный носитель - контроль в 1 день, после чего вводили 4 еженедельных инфузии или инертного носителя (группа 1), или DART-А, вводимого в виде 4-дневных инфузий каждую неделю, начиная с 8 дня, в 15, 22 и 29 день (группы 2-5) или в виде инфузии 7 дней в неделю в течение 4 недель, начиная на 8 день (группа 6).
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим моновалентным диателам, которые способны одновременно связываться с CD123 и CD3, и к применениям таких молекул в лечении гематологических злокачественных опухолей. Несмотря на то, что неоптимизированные CD123xCD3 биспецифические диатела являются полностью функциональными, аналогично усовершенствованиям, полученным в экспрессии генов посредством оптимизации кодонов (см., например, Grosjean, H. et al. (1982) Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes Gene 18(3): 199-209), возможно дополнительно усилить стабильность и/или функцию CD123xCD3 биспецифических диател путем модификации или оптимизации их последовательностей.
Предпочтительные CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению состоят из по меньшей мере двух полипептидных цепей, которые ассоциируются друг с другом с образованием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD123, и одного сайта связывания,
- 13 034142 специфического в отношении эпитопа CD3 (фиг. 2). Отдельные полипептидные цепи диатела ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи. Каждая полипептидная цепь содержит антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи, антигенсвязывающий домен вариабельного домена тяжелой цепи и домен гетеродимеризации. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи от антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи. Антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи первой полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи второй полипептидной цепи с образованием первого функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении первого антигена (т.е. или CD123, или CD3). Аналогично, антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи второй полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи первой полипептидной цепи с образованием второго функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении второго антигена (т.е. или CD123, или CD3, в зависимости от идентичности первого антигена). Таким образом, выбор антигенсвязывающего домена вариабельного домена легкой цепи и антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи первой и второй полипептидных цепей скоординирован так, чтобы две полипептидных цепи совместно содержали антигенсвязывающие домены вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, способные связываться с CD123 и CD3.
Образование гетеродимеров первой и второй полипептидных цепей может управляться доменами гетеродимеризации. Такие домены включают в себя GVEPKSC (SEQ ID NO:50) (или VEPKSC; SEQ ID NO:51) на одной полипептидной цепи и GFNRGEC (SEQ ID NO:52) (или FNRGEC; SEQ ID NO:53) на другой полипептидной цепи (US2007/0004909). Альтернативно, такие домены можно сконструировать так, чтобы они содержали спирали противоположных зарядов. Домен гетеродимеризации одной из полипептидных цепей содержит последовательность по меньшей мере из шести, по меньшей мере из семи или по меньшей мере из восьми положительно заряженных аминокислот, и домен гетеродимеризации другой полипептидной цепи содержит последовательность по меньшей мере из шести, по меньшей мере из семи или по меньшей мере из восьми отрицательно заряженных аминокислот. Например, первый или второй домен гетеродимеризации предпочтительно будет содержать последовательность из восьми положительно заряженных аминокислот, и другой из доменов гетеродимеризации предпочтительно будет содержать последовательность из восьми отрицательно заряженных аминокислот. Положительно заряженная аминокислота может представлять собой лизин, аргинин, гистидин и т.д. и/или отрицательно заряженная аминокислота может представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и т.д. Положительно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой лизин и/или отрицательно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой глутаминовую кислоту.
CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению сконструированы так, чтобы такие первые и вторые полипептидные цепи были ковалентно связаны друг с другом посредством цистеиновых остатков вдоль их длины. Такие цистеиновые остатки могут быть введены в промежуточный линкер, который отделяет домены VL и VH полипептидов. Альтернативно и более предпочтительно, второй пептид (линкер 2) введен в каждую из полипептидных цепей, например, на амино-конце полипептидных цепей или в положении, которое помещает линкер 2 между доменом гетеродимеризации и антигенсвязывающим доменом вариабельного домена легкой цепи или вариабельного домена тяжелой цепи.
Согласно конкретным вариантам осуществления характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические моновалентные диатела согласно настоящему изобретению дополнительно содержат домен Fc иммуноглобулина или альбуминсвязывающий домен для увеличения периода полужизни in vivo.
CD123xCD3 биспецифические моновалентные диатела согласно настоящему изобретению, которые содержат домен Fc иммуноглобулина (т.е. CD123xCD3 биспецифические моновалентные Fc-диатела) состоят из первой полипептидной цепи, второй полипептидной цепи и третьей полипептидной цепи. Первая и вторая полипептидные цепи ассоциируются друг с другом с образованием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD123, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3. Первая полипептидная цепь и третья полипептидная цепь ассоциируются друг с другом с образованием домена Fc иммуноглобулина (фиг. 3A и 3B). Первая и вторая полипептидные цепи биспецифического моновалентного Fc-диатела ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи.
Первая и третья полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи. Каждая из первой и второй полипептидных цепей содержит антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи, антигенсвязывающий домен вариабельного домена тяжелой цепи и домен гетеродимеризации. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет антигенсвязывающий домен
- 14 034142 вариабельного домена легкой цепи от антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи. Антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи первой полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи второй полипептидной цепи с образованием первого функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении первого антигена (т.е. или CD123, или CD3). Аналогично, антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи второй полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи первой полипептидной цепи с образованием второго функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении второго антигена (т.е. или CD3, или CD123, в зависимости от идентичности первого антигена). Таким образом, выбор антигенсвязывающего домена вариабельного домена легкой цепи и антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи первой и второй полипептидных цепей скоординирован так, чтобы две полипептидные цепи совместно содержали антигенсвязывающие домены вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, способные связываться с CD123 и CD3. Каждая из первой и третьей полипептидных цепей содержат некоторую часть или весь домен CH2 и/или некоторую часть или весь домен CH3 полного домена F c иммуноглобулина и цистеинсодержащий пептид. Некоторая часть или весь домен CH2 и/или некоторая часть или весь домен CH3 ассоциируются с образованием домена Fc иммуноглобулина биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению. Первая и третья полипептидные цепи биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах цистеинсодержащего пептида полипептидных цепей.
I. Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело, DART-А
Согласно настоящему изобретению предусмотрено характеризующееся оптимизированной последовательностью биспецифическое диатело, способное одновременно и специфически связываться с эпитопом CD123 и с эпитопом CD3 (CD123xCD3 биспецифическое диатело или DART-A). Как обсуждается ниже, обнаружено, что DART-A проявляет повышенную функциональную активность относительно других характеризующихся неоптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател сходного состава, и, в связи с этим, называется характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело.
Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь. Первая полипептидная цепь биспецифического диатела будет содержать в направлении от N-конца к C-концу N-конец, вариабельный домен легкой цепи (домен VL) моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLCD3), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), вариабельный домен тяжелой цепи (домен VH) моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123), и C-конец. Предпочтительная последовательность такого домена VLCd3 представляет собой SEQ ID NO:21:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRA PWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
Антигенсвязывающий домен VLCD3 содержит CDR1 SEQ ID NO:38: RSSTGAVTTSNYAN, CDR2 SEQ ID NO:39: GTNKRAP и CDR3 SEQ ID NO:40: ALWYSNLWV.
Предпочтительная последовательность такого линкера 1 представляет собой SEQ ID NO:29: GGGSGGGG. Предпочтительная последовательность такого домена VHCD123 представляет собой SEQ ID NO:26:
EVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSS
Антигенсвязывающий домен VHCD123 содержит CDR1 SEQ ID NO:47: DYYMK, CDR2 SEQ ID NO:48: DIIPSNGATFYNQKFKG и CDR3 SEQ ID NO:49: SHLLRAS.
Вторая полипептидная цепь будет содержать в направлении от N-конца к C-концу N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123), промежуточный линкерный пептид (например, линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3), и C-конец. Предпочтительная последовательность такого домена VLCD123 представляет собой SEQ ID NO:25:
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK
Антигенсвязывающий домен VLCD123 содержит CDR1 SEQ ID NO:44: KSSQSLLNSGNQKNYLT, CDR2 SEQ ID NO:45: WASTRES и CDR3 SEQ ID NO:46: QNDYSYPYT.
Предпочтительная последовательность такого домена VHCD3 представляет собой SEQ ID NO:22:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNN YATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
Антигенсвязывающий домен VHCD3 содержит CDR1 SEQ ID NO:41: TYAMN, CDR2 SEQ ID NO:42:
- 15 034142
RIRSKYNNYATYYADSVKD и CDR3 SEQ ID NO:43: HGNFGNSYVSWFAY.
Характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению сконструированы так, чтобы первый и второй полипептиды были ковалентно связаны друг с другом посредством цистеиновых остатков по их длине. Такие цистеиновые остатки могут быть введены в промежуточный линкер (например, линкер 1), который отделяет домены VL и VH полипептидов. Альтернативно и более предпочтительно, второй пептид (линкер 2) введен в каждую полипептидную цепь, например, в положении на N-конце относительно домена VL или на Cконце относительно домена VH такой полипептидной цепи. Предпочтительная последовательность такого линкера 2 представляет собой SEQ ID NO:30: GGCGGG.
Образование гетеродимеров может управляться с помощью дополнительной инженерии таких полипептидных цепей, чтобы они содержали полипептидные спирали противоположных зарядов. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления одна из полипептидных цепей будет сконструирована так, чтобы она содержала Е-спиральный домен (SEQ ID NO:34: EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK), чьи остатки образуют отрицательный заряд при pH 7, тогда как другая из двух полипептидных цепей будет сконструирована так, чтобы содержать K-спиральный домен (SEQ ID NO:35: KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE), чьи остатки образуют положительный заряд при pH 7. Присутствие таких заряженных доменов обеспечивает ассоциацию между первым и вторым полипептидами и, таким образом, способствует гетеродимеризации.
Несущественно, спираль обеспечивается первой или второй полипептидными цепями. Тем не менее, предпочтительное характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело согласно настоящему изобретению (DART-A) содержит первую полипептидную цепь, характеризующуюся следующей последовательностью (SEQ ID NO:1):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRA PWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGS GGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIP SNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYW GQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Цепь 1 DART-A состоит из следующего: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:26 - SEQ ID
NO:30 - SEQ ID NO:34. Кодирующий цепь 1 DART-A полинуклеотид представляет собой SEQ ID NO:2:
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgacc ctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtg cagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggct ccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgact attaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagc aatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatcc ggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccgga gcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatg aagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattcct tccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtg gacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagataca gccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattgg ggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggcc gcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggag gtcgcagccctggagaaa
Вторая полипептидная цепь DART-A характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:3):
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGR IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNS YVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Цепь 2 DART-A состоит из следующего: SEQ ID NO:25 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:22 - SEQ ID
NO:30 - SEQ ID NO:35. Кодирующий цепь 2 DART-A полинуклеотид представляет собой SEQ ID NO:4:
- 16 034142 gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtg actatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactat ctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggct tccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagat tttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcag aatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaagga ggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtc cagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcaca tacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaagg atcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggataga ttcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctg aaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattct tacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccgga ggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagag aaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
Как обсуждается ниже, обнаружено, что характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) характеризуется способностью одновременно связывать CD123 и CD3 клетки как человека, так и обезьяны. Обнаружено, что обеспечение DART-A вызывало Т-клеточную активацию, опосредовало уменьшение бластных клеток, управляло экспансией Тклеточной популяции, индуцировало Т-клеточную активацию и вызывало перенаправленный цитолиз злокачественных клеток - мишеней.
II. Характеризующееся неоптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело сравнения, DART-B
DART-B представляет собой характеризующееся неоптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело, характеризующееся макроструктурой, сходной с таковой у DART-A. Первая полипептидная цепь DART-B будет содержать в направлении от N-конца к C-концу Nконец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLCD3), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123), промежуточный линкер 2, E-спиральный домен и C-конец. Домен VLCD3 первой полипептидной цепи DART-B характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:23):
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGV PYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
Домен VHCD123 первой полипептидной цепи DART-B характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:28):
QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSS
Таким образом, цепь 1 DART-B состоит из следующего: SEQ ID NO:23 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:28 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:34. Последовательность первой полипептидной цепи DART-B представляет собой следующее (SEQ ID NO:5):
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGV PYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGSGGGG QVQLVQS GAELKKPGASVKVS OKAS GYT FTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGD11P SNGA TFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGT LVTVS S GGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Кодирующий цепь 1 DART-B полинуклеотид представляет собой SEQ ID NO:6: gacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtc accatgacctgcagagccagttcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaag tcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaagtggcttctggagtc ccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcatactctctcacaatcagcagc atggaggctgaagatgctgccacttattactgccaacagtggagtagtaacccgctc acgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaaggaggcggatccggcggcggaggc caggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaag gtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcagg caggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggcc actttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaaca agcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactat tgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcacc ctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaa gaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctg gagaaa
Вторая полипептидная цепь DART-B будет содержать, в направлении от N-конца к C-концу Nконец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123), промежуточный линкерный пептид (линкер 1) и домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3), промежуточный линкер 2, K-спиральный домен и C-конец.
Домен VLCd123 второй полипептидной цепи DART-B характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:27):
- 17 034142
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK
Домен VHCD3 второй полипептидной цепи DART-B характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:24):
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGY TNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTT LTVSS
Таким образом, цепь 2 DART-B состоит из следующего: SEQ ID NO:27 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:24 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:35. Последовательность второй полипептидной цепи DART-B представляет собой следующее (SEQ ID NO :7):
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA
STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKG
GGSGGGGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGY INPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLD YWGQGTTLTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Кодирующий цепь 2 DART-B полинуклеотид представляет собой SEQ ID NO:8:
Gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtg actatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactat ctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggct tccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagat tttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcag aatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaagga ggcggatccggcggcggaggcgatatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggca agacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactagg tacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatac attaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccaca ttgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatct gaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattactgccttgac tactggggccaaggcaccactctcacagtctcctccggaggatgtggcggtggaaaa gtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaag gaaaaggtcgcagccctgaaagag
III. Модифицированные варианты характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A)
А. Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело, содержащее альбуминсвязывающий домен (DART-A с ABD w/ABD)
Согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) будет содержать один или несколько альбуминсвязывающих доменом (ABD) (DART-A с ABD w/ABD) на одной или обеих полипептидных цепях диатела.
Как раскрыто в международной патентной публикации № WO 2012/018687, для улучшения in vivo фармакокинетических свойств диател диатела можно модифицировать так, чтобы они содержали полипептидную часть белка, связывающегося с сывороточными белками, на одном или нескольких концах диатела. Такая полипептидная часть белка, связывающегося с сывороточными белками, наиболее предпочтительно будет встроена на C-конце молекулы диатела. Особенно предпочтительная полипептидная часть белка, связывающегося с сывороточными белками, для этой цели представляет собой альбуминсвязывающий домен (ABD) из белка G стрептококка. Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus G148 является особенно предпочтительным.
Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus G148 состоит из 46 аминокислотных остатков, образующих стабильный трехспиральную структуру и характеризуется широкой альбуминсвязывающей специфичностью (Johansson, M.U. et al. (2002) Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). Альбумин представляет собой наиболее распространенный белок в плазме и характеризуется периодом полувыведения, составляющим 19 дней у людей. Альбумин содержит несколько низкомолекулярных сайтов связывания, которые позволяют ему нековалентно связываться с другими белками и, тем самым, продлевать их периоды полужизни в сыворотке.
Таким образом, первая полипептидная цепь такого характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела, содержащего альбуминсвязывающий домен, содержит третьей линкер (линкер 3), который отделяет E-спираль (или K-спираль) такой полипептидной цепи от альбуминсвязывающего домена. Предпочтительная последовательность такого линкера 3 представляет собой SEQ ID NO:31: GGGS. Предпочтительный альбуминсвязывающий домен (ABD) характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO: 36):
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP.
Таким образом, предпочтительная первая цепь характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела, содержащего альбуминсвязывающий домен, харак
- 18 034142 теризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:9):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRA PWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGS GGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIP SNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYW GQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGSLAEAKVLAN RE L DKYGVS DYYKNLIDNAKSAE GVKALIDEILAAL P
Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 диатело, содержащее альбуминсвязывающий домен, состоит из: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:26 - SeQ ID NO:30 - SEQ ID NO:34 - SEQ ID NO:31 -SEQ ID NO:36. Полинуклеотид, кодирующий такое характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 диатело, содержащее дериватив альбуминсвязывающего домена, представляет собой SEQ ID NO:10:
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgacc ctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtg cagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggct ccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgact attaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagc aatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatcc ggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccgga gcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatg aagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattcct tccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtg gacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagataca gccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattgg ggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggcc gcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggag gtcgcagccctggagaaaggcggcgggtctctggccgaagcaaaagtgctggccaac cgcgaactggataaatatggcgtgagcgattattataagaacctgattgacaacgca aaatccgcggaaggcgtgaaagcactgattgatgaaattctggccgccctgcct
Вторая полипептидная цепь такого характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 диатела, содержащего альбуминсвязывающий домен, характеризуется последовательностью, описанной выше (SEQ ID NO:3), и кодируется полинуклеотидом, характеризующимся последовательностью SEQ ID NO:4.
В. Характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела, содержащие домен Fc IgG (DART-A с Fc w/Fc)
Согласно третьему варианту осуществления согласно настоящему изобретению предусмотрено характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело, состоящее из трех полипептидных цепей и содержащее домен Fc IgG (версия 1 и версия 2 DART-A с Fc w/Fc) (фиг. 3A-3B).
Для образования такого домена Fc IgG первая и третья полипептидная цепь диатела содержат в направлении от N-конца к C-концу цистеинсодержащий пептид, (наиболее предпочтительно пептид 1, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:55): DKTHTCPPCP), некоторую часть или весь домен CH2 и/или некоторую часть или весь домен CH3 полного домена Fc иммуноглобулина и C-конец. Некоторая часть или весь домен CH2 и/или некоторая часть или весь домен CH3 ассоциируются с образованием домена Fc иммуноглобулина биспецифических моновалентных содержащих Fc домен диател согласно настоящему изобретению. Первая и вторая полипептидные цепи биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах цистеинсодержащего пептида полипептидных цепей.
Домены CH2 и/или CH3 первого и третьего полипептидов необязательно должны быть идентичными и предпочтительно модифицированы так, чтобы содействовать образованию комплекса между двумя полипептидами. Например, аминокислотная замена (предпочтительно замена на аминокислоту, содержащую объемную боковую группу, образующую 'выступ', например, триптофан) может быть введена в домен CH2 или CH3 так, чтобы стерическое влияние предотвращало взаимодействие с аналогично мутированным доменом и вынуждало мутированный домен образовывать пару с доменом, в котором была сконструирована комплементарная, или обеспечивающая размещение мутация, т.е. 'впадина' (например, замена на глицин). Такие наборы мутаций можно сконструировать в любой паре полипептидов, содержащих молекулу биспецифического моновалентного Fc-диатела, и, кроме того, сконструировать в любой части полипептидных цепей указанной пары. Способы белковой инженерии, чтобы способствовать гетеродимеризации вместо гомодимеризации, хорошо известны в настоящей области техники, в частности, в отношении инженерии иммуноглобулиноподобных молекул, и предусмотрены в настоящем документе (см., например, Ridgway et al. (1996) Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, Protein Engr. 9: 617-621, Atwell et al. (1997) Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, J. Immunol. Methods 296: 95-101; каждая из которых полностью включена в настоящий
- 19 034142 документ посредством ссылки). Предпочтительно, что 'выступ' конструируют в доменах CH2-CH3 первой полипептидной цепи, а 'впадину' конструируют в доменах CH2-CH3 третьей полипептидной цепи. Таким образом, 'выступ' будет содействовать в предотвращении гомодимеризации первой полипептидной цепи посредством своих доменов CH2 и/или CH3. Поскольку третья полипептидная цепь предпочтительно содержит замену, обеспечивающую образование 'впадины', она будет гетеродимеризоваться с первой полипептидной цепью, а также гомодимеризоваться самим с собой. Предпочтительный выступ создается путем модификации домена Fc нативного домена Fc IgG так, чтобы она содержала модификацию T366W. Предпочтительная впадина создается путем модификации домена Fc нативного домена Fc IgG, чтобы она содержала модификацию T366S, L368A и Y407V. Для содействия в очищении гомодимера третьей полипептидной цепи от конечного биспецифического моновалентного Fc-диатела, содержащего первую, вторую и третью полипептидные цепи, сайт связывания с белком A доменов CH2 и CH3 третьей полипептидной цепи предпочтительно подвергают мутации с помощью аминокислотной замены в положении 435 (H435R). Таким образом, гомодимер третьей полипептидной цепи не будет связываться с белком А, тогда как биспецифическое моновалентное Fc - диатело будет сохранять свою способность связывать белок A через сайт связывания с белком A на первой полипептидной цепи.
Предпочтительная последовательность для доменов CH2 и CH3 домена Fc антитела, присутствующего в первой полипептидной цепи, представляет собой (SEQ ID NO:56):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNS ТYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Предпочтительная последовательность для доменов CH2 и CH3 домена Fc антитела, присутствующего в третьей полипептидной цепи, представляет собой (SEQ ID NO: 11):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
С. Конструкт версии 1 DART-A w/Fc
Чтобы проиллюстрировать такие Fc-диатела, согласно настоящему изобретению предусмотрен конструкт версии 1 DART-A w/Fc. Первый полипептид конструкта версии 1 DART-A w/Fc содержит в направлении от N-конца к C-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3), линкер 2, E-спиральный домен, линкер 5, пептид 1, полипептид, который содержит домены CH2 и CH3 домена Fc, и C-конец. Предпочтительный линкер 5 характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:32): GGG. Предпочтительный полипептид, который содержит домены CH2 и CH3 домена Fc, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:37):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Таким образом, первый полипептид такого конструкта версии 1 DART-A w/Fc состоит из следующего : SEQ ID NO:25 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:22 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:34 - SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:55 - SEQ ID NO:37.
Предпочтительная последовательность первого полипептида такого конструкта версии 1 DART-A w/Fc характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:13):
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKG
GGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGR IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNS YVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Предпочтительный полинуклеотид, кодирующий такой полипептид, представляет собой (SEQ ID NO:14):
- 20 034142 gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtg actatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactat ctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggct tccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagat tttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcag aatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaagga ggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtc cagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcaca tacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaagg atcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggataga ttcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctg aaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattct tacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccgga ggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaag gaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcggggacaaa actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttc ctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtg gacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagc acgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatc tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg gaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatccc agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtg gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggct ctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
Вторая цепь такого конструкта версии 1 DART-A w/Fc будет содержать в направлении от N-конца к C-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLCD3), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123), линкер 2, K-спиральный домен и C-конец. Таким образом, второй полипептид такого конструкта версии 1 DART-A w/Fc состоит из следующего: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:26 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:35. Такой полипептид характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:15):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRA PWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGS GGGGEVQLVQS GAELKKPGASVKVS CKAS GYT FT DYYMKWVRQAPGQGLEWIGD11P SNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYW GQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Предпочтительный полинуклеотид, кодирующий такой полипептид, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:16):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgacc ctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtg cagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggct ccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgact attaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagc aatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatcc ggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccgga gcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatg aagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattcct tccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtg gacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagataca gccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattgg ggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggcc gcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaag gtcgcagccctgaaagag
Третья полипептидная цепь такой версии 1 DART-A w/Fc будет содержать домены CH2 и CH3 домена Fc IgG. Предпочтительный полипептид состоит из пептида 1 (SEQ ID NO:55) и доменов CH2 и CH3 домена Fc (SEQ ID NO:11) и характеризуется последовательностью SEQ ID NO:54:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует такой полипептид, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:12):
- 21 034142 gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtca gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtac aacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccca tcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttc tatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactac aagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctc accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat gaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
D. Конструкт версии 2 DART-A w/Fc
В качестве второго примера такого диатела DART-A w/Fc, согласно настоящему изобретению предусмотрено трехцепочечное диатело, версия 2 диатела DART-A w/Fc (фиг. 3B).
Первый полипептид такого конструкта версии 2 DART-A w/Fc содержит, в направлении от N-конца к C-концу, N-конец, пептидный линкер (пептид 1), полипептид, который содержит домены CH2 и CH3 домена Fc, соединенный (посредством линкера 4) с доменом VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3), линкер 2, K-спиральный домен и C-конец.
Предпочтительный полипептид, который содержит домены CH2 и CH3 домена Fc, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:37):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Линкер 4 предпочтительно будет содержать аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:57): APSSS. Предпочтительный линкер 4-характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:33): APSSSPME. Таким образом, первый полипептид такого конструкта версии 2DART-A w/Fc состоит из следующего: SEQ ID NO:55 - SEQ ID NO:37 - SEQ ID NO:33 - SEQ ID NO:25 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:22 - SEQ ID NO:30 - SEQ ID NO:35. Полипептид, характеризующийся такой последовательностью, представляет собой (SEQ ID NO:17):
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKA PSSSPMEDFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQG TKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGK GLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAAL KE
Предпочтительный полинуклеотид, кодирующий такой полипептид, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:18):
- 22 034142 gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtca gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtac aacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccca tcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttc tatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactac aagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat gaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagcc ccttccagctcccctatggaagacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggcc gtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaac agcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccct aaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagc ggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggac gtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccagggg accaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtg gagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcc tctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaag gggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactat gccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactg tatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgaga cacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggaca ctggtgactgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggag aaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctg aaagag
Вторая полипептидная цепь такого конструкта версии 2 DART-A w/Fc содержит, в направлении от N-конца к C-концу, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLCD3), промежуточный линкерный пептид (линкер 1) и домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123)- Указанная часть молекулы соединена (посредством линкера 2) с Eспиральным доменом. Таким образом, третий полипептид такого конструкта версии 2 DART-A w/Fc состоит из следующего: SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:26 - SEQ ID NO:30 -SEQ ID NO:34. Полипептид, характеризующийся такой последовательностью, представляет собой (SEQ ID NO:1), и предпочтительно кодируется полинуклеотидом, характеризующимся последовательностью SEQ ID NO:2.
Третья полипептидная цепь будет содержать домены CH2 и CH3 домена Fc IgG. Предпочтительный полипептид состоит из пептида 1 (SEQ ID NO:55) и доменов CH2 и CH3 домена Fc (SEQ ID NO:11) и характеризуется последовательностью SEQ ID NO: 54.
Для оценки активности вышеупомянутых CD123xCD3 биспецифических диател (DART-A, DARTA w/ABD, DART-A w/Fc, DART-B) получили контрольное биспецифическое диатело (контрольное DART). Контрольное DART способно одновременно связываться с FITC и CD3. Его две полипептидных цепи характеризуются следующими соответствующими последовательностями:
Цепь 1 контрольного DART (SEQ ID NO:19):
DWMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKGG GSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARI RSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSY VSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Цепь 2 контрольного DART (SEQ ID NO:20):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRA PWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGS GGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRN KPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQ GTSVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
IV. Фармацевтические композиции
Композиции согласно настоящему изобретению включают в себя композиции нерасфасованного лекарственного средства, пригодные в производстве фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиции) и фармацевтических композиций (т.е. композиций, которые являются подходящими для введения субъекту или пациенту), которые можно использовать в получении стандартных лекарственных форм. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател согласно настоящему изобретению или комбинацию таких средств и фармацевтически приемлемый носитель. Композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат профилактически или терапевтически эффективное количество характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
- 23 034142
Согласно настоящему изобретению также предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению и второе терапевтическое антитело (например, опухолеспецифическое моноклональное антитело), которое является специфическим в отношении конкретного антигена злокачественной опухоли, и фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно конкретному варианту осуществления термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регуляторным органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более конкретно у людей. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), вспомогательное вещество или инертный носитель, с которым водят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая в себя масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и подобное. Вода представляет собой предпочтительный носитель, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и растворы глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и подобное. Композиция при необходимости также может содержать незначительные количества смачивающих средств или эмульгаторов, или pH буферных средств. Указанные композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, драже, капсул, порошков, составов замедленного высвобождения и подобное.
Как правило, ингредиенты композиций согласно настоящему изобретению поставляются либо отдельно, либо смешанными вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически запаянном контейнере, таком как ампула или саше с указанием количества активного средства. Если композиция предназначена для введения с помощью инфузии, она может продаваться с инфузионным флаконом, содержащим стерильную воду или солевой раствор фармацевтической степени чистоты. Если композиция предназначена для введения с помощью инъекции, ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором может быть предоставлена с тем, чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены в состав в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя без ограничения соли, образованные такими анионами, как анионы, происходящие из соляной, ортофосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные катионами, такими как катионы, происходящие из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрен фармацевтический пакет или набор, содержащий одна или несколько контейнеров, заполненных характеризующимися оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическими диателами согласно настоящему изобретению отдельно или таким фармацевтически приемлемым носителем. Кроме того, одно или несколько других профилактических или терапевтических средств, пригодных для лечения заболевания, также могут быть включены в фармацевтический пакет или набор. Согласно настоящему изобретению также предусмотрен фармацевтический пакет или набор, содержащий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Необязательно такой(ие) контейнер(ы) может сопровождать уведомление в форме, предусмотренной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, причем указанное уведомление отражает разрешение соответствующим органом производства, применения или продажи для введению людям.
Согласно настоящему изобретению предусмотрены наборы, которые можно использовать в описанных выше способах. Набор может содержать характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению. Набор может дополнительно содержать одно или несколько другие профилактических и/или терапевтических средств, пригодных для лечения злокачественной опухоли, в одном или нескольких контейнерах; и/или набор может дополнительно содержать одно или несколько цитотоксических антител, которые связываются с одним или несколькими антигенами злокачественной опухоли, связанными со злокачественной опухолью. Согласно определенным вариантам осуществления другое профилактическое или терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. Согласно другим вариантам осуществления профилактическое или терапевтическое средство представляет собой биологическое или гормональное терапевтическое средство.
- 24 034142
V. Способы введения
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть предусмотрены для лечения, профилактики и уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или инфекцией, путем введения субъекту эффективного количества белка слияния или конъюгированной молекулы согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей белок слияния или конъюгированную молекулу согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтигельному аспекту такие композиции являются, по существу, очищенными (т.е. по существу не содержат веществ, которые ограничивают ее действие или производят нежелательные побочные эффекты). Согласно конкретному варианту осуществления субъект представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, такое как не относящееся к приматам млекопитающее (например, корова, лошадь, кошка, собака, грызун и т.д.) или примат (например, обезьяна, такая как, яванский макак, человек и т.д.). Согласно предпочтительному варианту осуществления субъект представляет собой человека.
Известны различные системы доставки и их можно использовать для введения композиций согласно настоящему изобретению, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или слитый белок, опосредованный рецептором эндоцитоз (см., например, Wu et at. (1987) Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструкция из нуклеиновой кислоты в виде части ретровирусного или другого вектора и т.д.
Способы введения молекулы согласно настоящему изобретению включают в себя без ограничения парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и мукозальное введение (например, интраназальный и пероральный пути). Согласно конкретному варианту осуществления характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным путем, например, с помощью инфузии или болюсной инъекции, путем поглощения через эпителиальные или кожнослизистые оболочки (например, слизистую ротовой полости, слизистую прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, пульмонарное введение также можно использовать, например, с помощью применения ингалятора или небулайзера и состава с аэрозольным средством. См., например, патенты США №№ 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540 и 4880078 и международные патентные публикации согласно РСТ №№ WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346 и WO 99/66903, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрено, что характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению упакованы в гереметически запаянный контейнер, такой как ампула или саше с указанием количества молекулы. Согласно одному варианту осуществления характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению поставляют в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в гереметически запаянном контейнере и его можно развести, например, водой или солевым раствором до соответствующей концентрации для введения субъекту. Характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в гереметически запаянном контейнере в стандартной дозировке, составляющей по меньшей мере 5 мкг, более предпочтительно по меньшей мере 10 мкг, по меньшей мере 15 мкг, по меньшей мере 25 мкг, по меньшей мере 50 мкг, по меньшей мере 100 мкг или по меньшей мере 200 мкг.
Лиофилизированные, характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению, необходимо хранить при температуре от 2 до 8°С в их оригинальном контейнере и молекулы необходимо вводить не позднее чем через 12 ч, предпочтительно не позднее чем через 6 ч, не позднее чем через 5 ч, не позднее чем через 3 часа или не позднее чем через 1 ч после их разведения. Согласно альтернативному варианту осуществления характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению поставляют в жидкой форме в гереметически запаянном контейнере с указанием количества и концентрации молекулы, слитого белка или конъюгированной молекулы. Жидкую форму характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател согласно настоящему изобретению предпочтительно поставляют в гереметически запаянном контейнере, в котором молекулы находятся в концентрации, составляющей по меньшей мере 1 мкг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 2,5 мкг/мл, по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл или по меньшей мере 100 мкг/мл.
Количество композиции согласно настоящему изобретению, которое будет эффективным в лечении, профилактике или уменьшении интенсивности одного или нескольких связанных с нарушением
- 25 034142 симптомов, можно определить с помощью стандартных клинических техник. Точная доза, применяемая в составе, также будет зависеть от пути введения и серьезности состояния, и должна определяться в соответствии с решением лечащего врача и всех соответствующих обстоятельств пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости от дозы из in vitro тестовых систем или тестовых систем - животных моделей.
Для предусмотренных настоящим изобретением характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател вводимую пациенту дозировку предпочтительно определяют на основании массы тела (кг) субъекта - реципиента. Вводимая дозировка, как правило, составляет от по меньшей мере приблизительно 0,3 до приблизительно 0,9 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 1 до приблизительно 3 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 3 до приблизительно 9 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 10 до приблизительно 30 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 30 до приблизительно 90 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 100 до приблизительно 300 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 200 до приблизительно 600 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 300 до приблизительно 900 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 400 до приблизительно 800 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 500 до приблизительно 1000 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 600 до приблизительно 1000 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 700 до приблизительно 1000 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 800 до приблизительно 1000 нг/кг в день, от по меньшей мере приблизительно 900 до приблизительно 1000 нг/кг в день или по меньшей мере приблизительно 1000 нг/кг в день.
Согласно другому варианту осуществления пациенту вводят схему лечения, предусматривающую одну или несколько доз такого профилактически или терапевтически эффективного количества характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател, предусмотренных согласно настоящему изобретению, причем схему лечения вводят в течение 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней или 7 дней. Согласно определенным вариантам осуществления схема лечения предусматривает периодическое введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател, предусмотренных согласно настоящему изобретению (например, введение дозы в 1 день, 2 день, 3 день и 4 день данной недели и отсутствие введения доз профилактически или терапевтически эффективного количества характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател, предусмотренных согласно настоящему изобретению в 5 день, 6 день и 7 день этой же недели). Как правило, проводят 1, 2, 3, 4, 5 или больше курсов лечения. Каждый курс может проходить по одинаковой схеме или по различным схемам.
Согласно другому варианту осуществления вводимая доза увеличивается за первую четверть, первую половину или первые две трети или три четверти схемы(схем) (например, за первую, вторую или третью схему лечения из 4 курсов), пока не будет достигнуто дневное профилактически или терапевтически эффективное количество характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател.
В табл. 1 представлены 5 примеров различных схем дозировок, описанных выше, для типичного курса лечения. ___________________________________________________________________
Таблица 1
Схема День Дозировка диатела (нг диатела на кг массы тела субъекта в день)
1 1,2,3,4 100 100 100 100 100
5,6,7 нет нет нет нет нет
2 1,2,3,4 300 500 700 900 1,000
5,6,7 нет нет нет нет нет
3 1,2,3,4 300 500 700 900 1,000
5,6,7 нет нет нет нет нет
4 1,2,3,4 300 500 700 900 1,000
5,6,7 нет нет нет нет нет
Дозировку и частоту введения характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател согласно настоящему изобретению снизить или изменить путем усиления поглощения и проникновения характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател в ткани с помощью таких модификаций, как, например, липидизация.
Вводимую пациенту дозировку характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател согласно настоящему изобретению можно рассчитать для применения в качестве монотерапии. Альтернативно, характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению используют в комбинации другими терапевтическими композициями, и вводимая пациенту дозировка является меньше, чем при использовании указанных молекул в качестве монотерапии.
- 26 034142
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить местно в нуждающуюся в лечении область; этого можно достичь, например, без ограничения с помощью местной инфузии, инъекции или посредством имплантата, причем указанный имплантат изготовлен из пористого, непористого или желатинообразного материала, включая в себя такие мембраны, как мембраны Sialastic, или волокна. При введении молекулы согласно настоящему изобретению предпочтительно необходимо уделить внимание применению материалов, которые не абсорбируют молекулу.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть доставлены в везикуле, в частности липосоме (см. Langer (1990) New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533); Treat et al., в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327; см., главным образом, там же).
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть доставлены в системе контролируемого или замедленного высвобождения. Любую технику, известная специалисту в настоящей области техники, можно использовать для получения составов замедленного высвобождения, содержащих одно или несколько характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател согласно настоящему изобретению. См., например, патент США № 4526938; международные патентные публикации согласно РСТ №№ WO 91/05548; WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A SustainedRelease Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Согласно одному варианту осуществления насос можно использовать в системе контролируемого высвобождения (См. Langer, ранее; Sefton, (1987) Implantable Pumps, CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, Surgery 88:507-516; и Saudek et al. (1989) A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, N. Engl. J. Med. 321:574-579). Согласно другому варианту осуществления полимерные материалы можно использовать для достижения контролируемого высвобождения молекул (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate, Science 228:190-192; During et al. (1989) Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization, Ann. Neural. 25:351-356; Howard et al. (1989) Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits, J. Neurosurg. 7(1): 105-112); патенты США №№ 5679377; 5916597; 5912015; 5989463; 5128326; международные патентные публикации согласно РСТ №№ WO 99/15154 и WO 99/20253). Примеры полимеров, используемых в составах замедленного высвобождения, включают в себя без ограничения полимер 2-гидроксиэтилметакрилата, полимер метилметакрилата, полимер акриловой кислоты, сополимер этилена и винилацетата, полимер метакриловой кислоты, полигликолиды (PLG), полиангидриды, полимер N-винилпирролидона, полимер винилового спирта, полиакриламид, полиэтиленгликоль, полилактиды (PLA), сополимер лактидов и гликолидов (PLGA) и полиортоэфиры. систему контролируемого высвобождения можно разместить вблизи к терапевтической мишени (например, легким), таким образом, будет необходима только доля системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, ранее, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Композиции, пригодные в качестве имплантатов контролируемого высвобождения, можно использовать согласно Dunn с соавт. (см. патент США № 5945155). Указанный конкретный способ основан на терапевтическом эффекте in situ контролируемого высвобождения биоактивного материала из полимерной системы. Имплантация, как правило, происходит в любом месте в организме пациента, нуждающегося в терапевтическом лечении. Можно использовать неполимерную систему замедленной доставки, при помощи которой неполимерный имплантат в организме субъекта используется в качестве системы доставки лекарственного средства. При имплантации в организм органический растворитель имплантата будет рассеиваться, диспергироваться или выщелачиваться из композиции в окружающую тканевую жидкость, и неполимерный материал будет постепенно коагулировать или осаждаться с образованием твердой, микропористой матрицы (см. патент США № 5888533).
Системы контролируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (1990, New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533). Любую технику, известную специалисту в настоящей области техники, можно использовать для получения составов замедленного высвобождения, содержащих одно или несколько терапевтических средств согласно настоящему изобретению. См., например, патент США №4526938; международные патентные публикации №№ WO 91/05548 и WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et at. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of Long
- 27 034142
Circulating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Если композиция согласно настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело согласно настоящему изобретению, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для стимуляции экспрессии кодируемого ею характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела путем конструирования ее в виде части соответствующего нуклеиновокислотного экспрессионного вектора и введения ее так, чтобы она стала внутриклеточной, например, путем применения ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или путем прямой инъекции, или путем использования бомбардировки микрочастицами (например, генной пушки; Biolistic, Dupont), или покрытия липидами, или рецепторами клеточной поверхности, или средствами трансфекции, или путем введения ее, соединенной с гомеобокс-подобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al. (1991) Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868) и т.д. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и встроена в ДНК клетки - хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации.
Лечение субъекта с помощью терапевтически или профилактически эффективного количества характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател согласно настоящему изобретению может предусматривать однократное лечение или предпочтительно может включать в себя серию лечений. Согласно предпочтительному примеру субъект получает лечение с помощью характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател согласно настоящему изобретению один раз в неделю приблизительно 1-10 недель, предпочтительно 2-8 недель, более предпочтительно приблизительно 3-7 недель и даже более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или 6 недель. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить один раз в день, два раза в день или три раза в день. Альтернативно, фармацевтические композиции можно вводить один раз в неделю, два раза в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, каждые шесть недель, один раз в два месяца, дважды в год или один раз в год. Кроме того, следует понимать, что эффективная дозировка молекул, используемых для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в течение курса конкретного лечения.
VI. Применения композиций согласно настоящему изобретению
Характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела согласно настоящему изобретению характеризуются способность обеспечивать лечение любого заболевания или состояния, связанного с экспрессией CD123 или характеризующегося экспрессией CD123. Таким образом, без ограничений такие молекулы можно использовать в диагностике или лечении острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), включая в себя бластный криз ХМЛ и онкоген Абельсона, связанный с ХМЛ (транслокацию Всг-ABL), миелодиспластического синдрома (МДС), острого B-лимфобластного лейкоза (B-ОЛЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), включая в себя ХЛЛ с синдромом Рихтера или трансформацией Рихтера, волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ), новообразования из бластных плазмацитоидных дендритных клеток (ОБПДК), нехождкинских лимфом (НХЛ), включая в себя мантийноклеточную лимфому (МКЛ) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МЛЛ), лимфомы Ходжкина, системного мастоцитоза и лимфомы Беркитта (см. пример 2); аутоиммунной волчанки (СКВ), аллергии, бронхиальной астмы и ревматоидного артрита. Кроме того, биспецифические диатела согласно настоящему изобретению можно использовать в производстве лекарственных средств для лечения описанных выше состояний.
Представив описание настоящего изобретения в общих чертах, оно станет более понятным со ссылкой на следующие примеры, которые представлены для иллюстрации и не предусмотрено, что они ограничивают настоящее изобретение, если не указано иное.
Пример 1.
Конструкция CD123xCD3 биспецифических диател и контрольного белка В таблице 2 представлен перечень биспецифических диател, которые экспрессировали и очищали. Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) и характеризующееся неоптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-B) способны одновременно связываться с CD123 и CD3. Контрольное биспецифическое диатело (контрольное DART) способно одновременно связываться с FITC и CD3. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры или гетеротримеры с перечисленными аминокислотными последовательностями. Способы образования биспецифических диател представлены в международных патентных публикациях №№ WO 2006/113665, WO 2008/157379, WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO 2012/162068 и WO 2012/162067.
- 28 034142
Таблица 2
Биспецифические диатела Аминокислотные последовательности полипептидной цепи Нуклеиновокислотные кодирующие последовательности
Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123 х CD3 биспецифическое диатело (DART-A) (связывается с CD3 на эпитопе 1) SEQ ID N0:1 SEQ ID N0:3 SEQ ID N0:2 SEQ ID N0:4
Характеризующееся неоптимизированной последовательностью CD123 х CD3 биспецифическое диатело (DART-B) (связывается с CD3 на эпитопе 2) SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:7 SEQ ID N0:6 SEQ ID N0:8
Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123 х CD3 биспецифическое диатело, содержащее альбуминсвязывающий домен (DART-A w/ABD) (связывается с CD3 на эпитопе 1), содержит альбуминсвязывающий домен (ABD) для увеличения периода полужизни in vivo SEQ ID N0:9 SEQ ID N0:3 SEQ ID N0:10 SEQ ID N0:4
Версия 1 характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123 х CD3 биспецифического диатела, содержащего домен Fc IgG (версия 1 DART-A w/Fc) (связывается с CD3 на эпитопе 1), содержит домен Fc для увеличения периода полужизни in vivo SEQ ID N0:54 SEQ ID N0:13 SEQ ID N0:15 SEQ ID N0:12 SEQ ID N0:14 SEQ ID N0:16
Таблица 2
Биспецифические диатела Аминокислотные последовательности полипептидной цепи Нуклеиновокислотные кодирующие последовательности
Версия 2 характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123 х CD3 биспецифического диатела, содержащего домен Fc IgG (версия 2 DART-A w/Fc) (связывается с CD3 на эпитопе 1), содержит домен Fc для увеличения периода полужизни in vivo SEQ ID N0:54 SEQ ID N0:17 SEQ ID N0:1 SEQ ID N0:12 SEQ ID N0:18 SEQ ID N0:2
Контрольное биспецифическое диатело (контрольное DART) (связывается с CD3 на эпитопе 1) (связывается с нерелевантной мишенью - FFTC) SEQ ID N0:19 SEQ ID N0:20
Пример 2. Мечение антителом клеток - мишеней для количественного FACS (QFACS)
В общем 10 клеток - мишеней собирали из культуры, ресуспендировали в 10% сыворотке АВ человека в буфере для FACS (PBS + 1% BSA+ 0,1% NaAzide) и инкубировали в течение 5 мин для блокирования рецепторов Fc. Мечение антителом микросфер с различными способностями связываться с антителом (Quantum™ Simply Cellular® (QSC), Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) и клетки - мишени метили с помощью РЕ антитела к CD123 (BD Biosciences) согласно инструкциям производителя. Кратко, одну каплю каждой микросферы QSC добавляли в 5 мл полипропиленовую пробирку и меченное РЕ антитело к CD123 добавляли в концентрации 1 мкг/мл как к клеткам - мишеням, так и микросферам. Пробирки инкубировали в темноте в течение 30 мин при 4°С. Клетки и микросферы промывали путем добавления 2 мл буфера для FACS и центрифугирования при 2500xG в течение 5 мин. Одну каплю популяции пустых микросфер добавляли после промывания. Микросферы анализировали вначале на проточном цитометре для установления специфических для анализа установок прибора (напряжения РМТ и компенсация). С использованием таких же установок прибора регистрировали геометрическое среднее значений флуоресценции микросфер и клеток - мишеней. Стандартную кривую сайтов связывания с антителом на популяциях микросфер получали из геометрического среднего значений флуоресценции популяций микросфер.
- 29 034142
Сайты связывания с антителом на клетках -мишенях рассчитывали на основании среднего геометрического значений флуоресценции клеток - мишеней с использованием стандартной кривой, полученной для микросфер в электронной таблице QuickCal (Bangs Laboratories).
Для определения подходящих клеточных линий - мишеней для оценки CD123xCD3 биспецифических диател, уровни поверхностной экспрессии CD123 на линиях -мишенях Kasumi-3 (ОМЛ), Molml3 (ОМЛ), ТНР-1 (ОМЛ), TF-1 (эритролейкоз) и RS4-11 (ОЛЛ) оценивали с помощью количественного анализа FACS (QFACS). Абсолютные количества сайтов связывания с антителом CD123 на клеточной поверхности рассчитывали с использованием набора QFACS. Как показано в таблице 3, абсолютное количество сайтов связывания с антителом CD123 на клеточных составляли порядок Kasumi-3 (высокое) > Molml3 (среднее) > ТНР-1 (среднее) > TF-1 (умеренно низкое) > RS4-11 (низкое). Три клеточных линии с самыми высокими уровнями экспрессии представляли собой клеточные линии ОМЛ: Kasumi-3, MOLM13 и ТНР-1. Не относящиеся к ОМЛ клеточным линиям: TF-1 и RS4-11, характеризовались умеренно низкой/низкой экспрессией CD123 соответственно._______________
Таблица 3
Клеточная линия мишень Поверхностная экспрессия CD123 (сайты связывания с антителом)
Kasumi-3 118620
Molml3 27311
ТНР-1 58316
TF-1 14163
RS4-11 957
А498 Отрицательная
НТ29 Отрицательная
Пример 3. Анализ цитотоксичности CTL (анализ высвобождения LDH)
Прикерпленные опухолевые клетки - мишени открепляли с помощью 0,25% раствора трипсинаEDTA и собирали путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин. Суспензию клеточных линий - мишеней собирали из культуры, отмывали с помощью среды для анализа. Концентрацию и жизнеспособность клеток измеряли по вытеснению трипанового синего с использованием счетчика клеток Beckman Coulter Vi-Cell. Клетки - мишени разводили до 4x105 клеток/мл в среде для анализа. 50 мкл разведенной клеточной суспензии добавляли в 96-луночный U-донный обработанный клеточной культурой планшет (№ по кат. BD Falcon 353077).
Устанавливали три набора контролей для измерения максимального высвобождения из мишени (MR), независимой от антитела Т-клеточной цитотоксичности (AICC) и спонтанного высвобождения из клетки - мишени (SR) следующим образом:
1) MR: 200 мкл среды для анализа без CD123xCD3 биспецифических диател и 50 мкл клеток - мишеней; детергент добавляли в конце эксперимента для определения максимального высвобождения LDH.
2) AICC: 50 мкл среды для анализа без CD123xCD3 биспецифических диател, 50 мкл клеток - мишеней и 100 мкл Т-клеток.
3) SR: 150 мкл среды без CD123xCD3 биспецифических диател и 50 мкл клеток - мишеней.
CD123xCD3 биспецифические диатела (DART-A, DART-A w/ABD и DART-B) и контроли изначально разводили до концентрации, составляющей 4 мкг/мл, и затем получали серийные разведения до конечной концентрации, составляющей 0,00004 нг/мл (т.е. 40 фмг/мл). 50 мкл разведений добавляли к планшету, содержащему 50 мкл клеток - мишеней/лунка.
Очищенные Т-клетки промывали один раз средой для анализа и ресуспендировали в среде для анализа с плотностью Т-клеток, составляющей 2x106 клеток/мл. 2x105 Т-клеток в 100 мкл добавляли к каждой лунке до конечного соотношения эффектора к клетке - мишени (Е:Т), составляющего 10:1. Планшеты инкубировали в течение приблизительно 18 ч при 37°С в 5% CO2. После инкубации 25 мкл 10x лизирующего раствора (Promega, № по кат. G182A) или 1 мг/мл дигитонина добавляли к контрольным лункам максимального высвобождения, перемешивали с помощью пипетки 3 раза и планшеты инкубировали в течение 10 мин до полного лизиса клеток - мишеней. Планшеты центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут и 50 мкл супернатанта переносили из каждой лунки аналитического планшета в плоскодонный планшет для ELISA и 50 мкл раствора субстрата LDH (Promega, № по кат. G1780) добавляли к каждой лунке. Планшеты инкубировали в течение 10-20 мин при комнатной температуре (RT) в темноте, затем добавляли 50 мкл стоп - раствора. Оптическую плотность (O.D.) измеряли при 490 нм в пределах 1 ч на планшет-ридере Victor2 Multilabel (Perkin Elmer, № по кат. 420-014).
Цитотоксичность в % рассчитывали, как описано ниже, и кривые ответа на дозу получали с использованием программного обеспечения GraphPad PRISM5®.
Лизис конкретных клеток рассчитывали из данных O.D. с использованием следующей формулы:
Цитотоксичность (%) = 100x(OD образца - OD AICC)/(OD MR - OD SR)
Перенаправленный цитолиз клеточных линий - мишеней с помощью различных уровней поверхностного CD123
- 30 034142
CD123xCD3 биспецифические диатела проявили выраженную способность к перенаправленному цитолизу с концентрациями, которые должны достигать 50% от максимальной активности (EC50s) в диапазоне суб-нг/мл, независимо от специфичности связывания с эпитопом CD3 (DART-A по сравнению с DART-B) в клеточных линиях - мишенях с высоким уровнем экспрессии CD123, Kasumi-3 (EC50=0,01 нг/мл) (фиг. 4, панель D), средним уровнем экспрессии CD123, Molml3 (EC50=0,H,8 нг/мл) и ТНР-1 (EC50=0,24 нг/мл) (фиг. 4, панель С и E соответственно) и умеренно низким или низким уровнем экспрессии CD123, TF-1 (EC50=0,46 нг/мл) и RS4-11 (EC50=0,5 нг/мл) (фиг. 4, панель В и А соответственно). Аналогично, опосредованный CD123xCD3 биспецифическими молекулами перенаправленный цитолиз также наблюдали с многочисленными клеточными линиями - мишенями с Т-клетками из различных доноров и отсутствие активности в виде перенаправленного цитолиза наблюдали в клеточных линиях, которые не экспрессируют CD123. Результаты обобщенно представлены в табл. 4.
Таблица 4
Клеточная линия мишень Поверхностная экспрессия CD123 (сайты связывания с антителом) ЕС50 характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123 х CD3 биспецифических диател (нг/мл) Е:Т=10:1 Макс. % цитолиза
Kasumi-3 118620 0,01 94
Molml3 27311 0,18 43
ТНР-1 58316 0,24 40
TF-1 14163 0,46 46
RS4-11 957 0,5 60
А498 Отрицательная Нет активности Нет активности
НТ29 Отрицательная Нет активности Нет активности
В случае необходимости воспроизвести указанный пример, следует понимать, что специалист в настоящей области техники сможет в пределах целесообразных и приемлемых границах изменить описанный выше протокол подходящим образом для воспроизведения описанных результатов. Таким образом, не подразумевается, что проиллюстрированный протокол должен соблюдаться точно определенным образом.
Пример 4. Т-клеточная активация во время перенаправленного цитолиза с помощью характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател (DART-A, DART-A w/ABD и DART-A w/Fc)
Характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела проявили выраженную способность к перенаправленному цитолизу независимо от присутствия или отсутствия технология увеличения периода полужизни (DART-A по сравнению с DART-A w/ABD по сравнению с DART-A w/Fc) в клеточных линиях - мишенях с высокой экспрессией CD123, Kasumi-3, и средней экспрессией CD123, ТНР-1 (фиг. 5, панели A и B соответственно). Чтобы получить характеристики Т-клеточной активации в течение процесса опосредованного характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом перенаправленного цитолиза, Тклетки из анализов перенаправленного цитолиза окрашивали в отношении маркера Т-клеточной активации CD25 и анализировали с помощью FACS. Как показано на фиг. 5, панели D, CD25 подвергался положительно регуляции в CD8 Т-клетках зависимым от дозы образом, указывая на то, что характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела индуцировали Тклеточную активацию в процессе перенаправленного цитолиза. Напротив, при отсутствии клеток - мишеней не наблюдалась активация CD8 Т-клеток (фиг. 5, панель С), что указывает на то, что характеризующиеся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифические диатела не активируют Т-клетки при отсутствии клеток - мишеней. Аналогично, CD8 Т-клетки не активировались при инкубации с клетками - мишенями и контрольным биспецифическим диателом (контрольным DART) (фиг. 5, панель D), указывая на необходимость перекрестной сшивки Т-клетки и клетки - мишени с характеризующимися оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическими диателами.
Пример 5. Внутриклеточное окрашивание в отношении гранзима В и перфорина
Для определения внутриклеточных содержаний гранзима В и перфорина в Т-клетках анализ CTL настраивали, как описано выше. Через приблизительно 18 ч клетки из аналитического планшета окрашивали антителами к CD4 и к CD8 путем инкубации в течение 30 мин при 4°С. После поверхностного окрашивания клетки инкубировали в 100 мкл буфера для фиксации и пермеабилизации (BD BioSciences) в течение 20 мин при 4°С. Клетки промывали буфером для пермеабилизации/отмывки (BD BioSciences) и инкубировали в 50 мкл смеси антител к гранзиму В и перфорину (полученной в IX буфере для пермеабилизации/отмывки) при 4°С в течение 30 мин. Затем клетки промывали с помощью 250 мкл буфера для пермеабилизации/отмывки и ресуспендировали в буфере для пермеабилизации/отмывки для получения
- 31 034142 данный FACS.
Положительная регуляция гранзима В и перфорина характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) в Т-клетках во время перенаправленного цитолиза
Для исследования возможного механизма опосредованной характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) цитотоксичности Т-клетками, внутриклеточные содержания гранзима В и перфорина измеряли в Т-клетках после перенаправленного цитолиза. Зависимую от дозы положительную регуляцию содержаний гранзима В и перфорина как в CD8, так и CD4 Т-клетках наблюдали после инкубации Т-клеток и клеток Kasumi-3 с DART-A (фиг. 6, панель A). Интересно, что положительная регуляция была почти в два раза выше в CD8 Т-клетках по сравнению с CD4 Т-клетками (фиг. 6, панель A). Если анализ проводили в присутствии ингибиторов гранзима В и перфорина, клеточный лизис не наблюдался. Положительная регуляция гранзима В или перфорина отсутствовала в CD8 или CD4 Т-клетках, если Т-клетки инкубировали с клетками -мишенями Kasumi-3 и контрольным биспецифическим диателом (контрольным DART) (фиг. 5, панель B). Приведенные данные указывают на то, что опосредованный DART-A лизис клеток - мишеней может быть опосредован через механизмы с участием гранзима В и перфорина.
Пример 6. In vivo противоопухолевая активность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A)
Выделение РВМС и Т-клеток из цельной крови человека
РВМС от здоровых доноров - людей выделяли из цельной крови с использованием центрифугирования в градиенте Фиколла. Кратко, цельную кровь разводили 1:1 стерильным PBS. 35 мл разведенной крови наносили на 15 мл Ficoll-Paque™ Plus в 50 мл пробирках и пробирки центрифугировали при 1400 об/мин в течение 20 мин с растормаживанием. Лейкоцитарную пленку между двумя фазами собирали в 50 мл пробирку с 45 мл PBS путем центрифугирования пробирок при 600xg (1620 об/мин) в течение 5 мин. Супернатант удаляли и клеточный осадок отмывали один раз с помощью PBS и количество жизнеспособных клеток определяли путем вытеснения красителя трипанового синего. РВМС ресуспендировали до конечной концентрации, составляющей 2,5х106 клеток/мл в полной среде (RPMI 1640, 10% FBS, 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 100 мкМ/100 мкМ/мл пенициллина/стрептомицина (P/S).
Выделение Т-клеток
Не подвергнутые воздействию Т-клетки выделяли путем отрицательной селекции из РВМС из цельной крови человека с использованием набора для выделения Т-клеток человека Dynabeads Untouched (Life Technologies) согласно инструкциям производителя. После выделения Т-клетки культивировали в течение ночи в среде RPMI с 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина.
Модель опухоли
Т-клетки и опухолевые клетки человек (Molml3 или RS4-11) комбинировали в соотношении 1:5 (1x106 и 5x106 соответственно) и суспендировали в 200 мкл стерильного солевого раствора и вводили с помощью подкожной инъекции (SC) в 0 день исследования (SD0). Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) или контрольное биспецифическое диатело (контрольное DART) вводили внутривенно (IV) посредством инъекций в хвостовую вену по 100 мкл, как представлено в табл. 5 (MOLM13) и табл. 6 (RS4-11).
Таблица 5 Схема исследования для модели MOLM13
Группа лечения Доза (мг/кг) Схема Количество животных
Контроль - инертный носитель (клетки MOLM-13 отдельно имплантированные или + Т-клетки) - SD0, 1, 2, 3 8
DART-A 0,5 SD0, 1, 2, 3 8
DART-A 0,2 SD0, 1, 2, 3 8
DART-A 0,1 SD0, 1, 2, 3 8
DART-A 0,02 SD0, 1, 2, 3 8
DART-A 0,004 SD0, 1, 2, 3 8
DART-A 0,0008 SD0, 1, 2, 3 8
DART-A 0,00016 SD0, 1, 2, 3 8
- 32 034142
Таблица 6 Схема исследования для модели RS4-11
Группа лечения Доза (мг/кг) Схема Количество животных
Контроль - инертный носитель(клетки RS4-11 отдельно имплантированные) - SDO, 1, 2, 3 8
Контроль - инертный носитель (RS4-11 + Т-клетки имплантированные) - SDO, 1, 2, 3 8
Контрольное DART 0,2 SDO, 1, 2, 3 8
DART-A 0,5 SDO, 1, 2, 3 8
DART-A 0,2 SDO, 1, 2, 3 8
DART-A ο,ι SDO, 1, 2, 3 8
DART-A 0,02 SDO, 1, 2, 3 8
DART-A 0,004 SDO, 1, 2, 3 8
Сбор данных и статистический анализ:
Массы животных - Массы отдельных животных регистрировали два раза в неделю до завершения исследования, начиная с момента инъекции опухолевых клеток.
Состояние агонии/смертность - Проводили наблюдения за животными два раза в неделю в отношении общего состояния агонии и ежедневно в отношении смертности. Смертельные исходы животных оценивали как связанные с лекарственным средством или технические на основании факторов, включая в себя макроскопические наблюдения и потеря массы тела; смертельные случаи у животных регистрировали ежедневно.
Объем опухоли - Объемы отдельных опухолей регистрировали дважды в неделю, начиная не позже одной недели после имплантации опухоли и продолжая до завершения исследования.
длина (мм) х ширина2 Объем опухоли (мм3) =----------------Животные, умерших вследствие технической или связанной с лекарственным средством смерти, исключали из расчетов данных.
Ингибирование роста опухоли - Значения ингибирования роста опухоли (TGI) рассчитывали для каждой группы, содержащей получивших лечение животных, с использованием следующей формулы:
Средний конечн. объем опухоли (подверг. лечению)-средний нач. объем опухоли (подверг, лечению) Ί--:-------------------------------------------------:----------- XIUU
Средний конечн. объем опухоли (контроль)-средний нач. объем опухоли (контроль)
Животных, испытывающих частичную или полную ремиссию, или животных, умерших вследствие технической или связанной с лекарственным средством смерти, исключали из расчетов TGI. Критерии Национального института рака для активности соединения составляет TGI>58% (Corbett et al. (2004) Anticancer Drug Development Guide; Totowa, NJ: Humana 99-123).
Частичный/полный ответ опухоли - Отдельных мышей, характеризующихся наличием опухолей размером меньше чем 1 мм3 на 1 день, классифицировали как характеризующихся частичной ремиссией (PR) и значение регрессии опухоли в % (%TR) определяли с использованием следующей формулы:
I Конечный объем опухоли (мм3) _------- ------------» ч . χ 1000/о
Начальный объем опухоли (мм )
Отдельных мышей, у которых отсутствовали пальпируемые опухоли, классифицировали как подвергшихся полной ремиссии (CR).
Статистические данные в отношении объема опухоли- Статистический анализ проводили между получившими лечение и контрольными группами, сравнивая объемы опухолей. Для этих анализов использовали двухфакторные анализы дисперсии с последующим апостериорным критерием Бонферрони. Все анализы проводили с использованием программного обеспечения GraphPad PRISM® (версии 5.02). Данные в отношении массы и опухоли от отдельных животных, умерших вследствие технической или связанной с лекарственным средством смерти, исключали из анализа.
Тем не менее, данные в отношении опухолей животных, которые продемонстрировали частичный или полный ответы, включали в указанные расчеты.
Результаты MOLM13
Клеточную линию ОМЛ, MOLM13, предварительно смешивали с активированными Т-клетками и имплантировали SC NOD/SCID гамма (NSG) нокаутным мышам (N = 8/группа) в день SD0, как подробно описано ниже. Опухоли MOLM13 в получившей лечение с помощью инертного носителя группе (клетки MOLM13 отдельно или вместе с Т-клетками) продемонстрировали профиль относительно агрессивного роста in vivo (фиг. 7, панели A и B). В день SD8e средний объем опухолей получившей лечение с помощью инертного носителя группе составлял 129,8 ± 29,5 мм и ко дню SD15 опухоли достигли среднего объема, составляющего 786,4 ± 156,7 мм. К концу эксперимента в день SD18 опухоли достигали средне
- 33 034142 го объема, составляющего 1398,8 ± 236,9 мм.
Лечение с помощью DART-A начинали в тот же день, как была имплантирована смесь опухолевых клеток и Т-клеток [(SD0)] и продолжали далее с ежедневными инъекциями в течение дополнительных 7 дней для достижения в общем 8 ежедневных инъекций. Животных лечили с помощью DART-A при 9 уровнях дозы (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 и 0,004 мг/кг и 20, 4, 0,8 и 0,16 мкг/кг). Результаты показаны на фиг. 7, панели A (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 и 0,004 мг/кг) и фиг. 7, панели В (20, 4, 0,8 и 0,16 мкг/кг). В день исследования 11 рост опухолей MOLM13 значительно ингибировался при уровнях дозы, составляющих 0,16, 0,5, 0,2, 0,1, 0,02 и 0,004 мг/кг (р < 0,001). Более того, лечение мышей с опухолью MOLM13 при уровнях доз, составляющих 20 и 4 мкг/кг доза, приводило к 8/8 и 7/8 CR, соответственно. К концу эксперимента в день SD18 средний объем опухолей, обработанных с помощью DART-А в дозе, составляющей 0,8 - 20 мкг/кг, находился в диапазоне от 713,6,0 ± 267,4 до 0 мм3, причем все опухоли были значительно меньше, чем опухоли в получившей лечение с помощью инертного носителя контрольной группе. Значения TGI составляли 100, 94 и 49% для групп, получивших дозы 20, 4 и 0,8 мкг/кг соответственно. По сравнению с получившей лечение с помощью инертного носителя группе с опухолевыми клетками MOLM13, группы, которые получили DART-A при уровне дозы, составляющем 20 и 4 мкг/кг, достигли статистического уровня значимости ко дню SD15, тогда как группа, получившая лечение с помощью 0,8 мкг/кг, достигла статистического уровня значимости ко дню SD18.
Результаты RS4-11
Клеточную линию ОЛЛ, RS4-11, предварительно смешивали с активированными Т-клетками и имплантировали SC NOD/SCID гамма (NSG) нокаутным мышам (N = 8/группа) в день SD0, как подробно описано ниже. Опухоли RS4-11 в получившей лечение с помощью инертного носителя группе (клетки RS4-11 отдельно или вместе с Т-клетками) продемонстрировали профиль относительно агрессивного роста in vivo (фиг. 8).
Лечение с помощью DART-A начинали в тот же день, как была имплантирована смесь опухолевых клеток и Т-клеток [(SD0)] и продолжали далее с ежедневными инъекциями в течение дополнительных 3 дней для достижения в общем 4 ежедневных инъекций. Животных лечили с помощью DART-A при 5 уровнях доз (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 и 0,004 мг/кг). Результаты показаны на фиг. 8.
Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) эффективно ингибировало рост как MOLM13 ОМЛ, так и RS4-11ОЛЛ опухолей, имплантированных SC NOD/SCID мышам в контексте модели Winn, если введение доз начинали в день имплантации и продолжали в течение 3 или больше последовательных дней. На основании критериев, установленных Национальным институтом рака, DART-A при уровне дозы, составляющем 0,1 мг/кг и выше (TGI >58), считается активным в модели RS4-11, и доза DART-A, составляющая 0,004 мг/кг и выше, была активной в модели MOLM13. Более низкие дозы DART-А, связанные с ингибированием роста опухолей в модели MOLM13 по сравнению с моделью RS4-11, согласуются с данными in vitro, демонстрирующими, что клетки MOLM13 характеризуются повышенным уровнем экспрессии CD123, чем клетки RS4-11, что коррелирует с повышенной чувствительностью к опосредованной DART-А цитотоксичностью in vitro в клетках MOLM13.
В случае необходимости воспроизвести указанный пример, следует понимать, что специалист в настоящей области техники сможет в пределах целесообразных и приемлемых границах изменить описанный выше протокол подходящим образом для воспроизведения описанных результатов. Таким образом, не подразумевается, что проиллюстрированный протокол должен соблюдаться точно определенным образом.
Пример 7. Поверхностная экспрессия CD123 на лейкозных властных клетках и стволовых клетках в первичном образце ткани от пациента 1 с ОМЛ
Для определения паттерна экспрессии CD123 в первичных образцах от пациента 1 с, криоконсервированные первичные образцы костного мозга и РВМС пациента с ОМЛ оценивали в отношении поверхностной экспрессии CD123 на лейкозных бластных клетках.
Образец костного мозга ОМЛ - клинический отчет
Возраст: 42
Пол: женский
Подтип ОМЛ: М2
Процентное отношение злокачественных клеток на основании морфологии:
67,5%
Иммунофенотипирование костного мозга:
CD15=19%, CD33=98,5%, CD38=28,8%, CD45=81,8%, CD64=39,7%,
CD117=42,9%, HLA-DR=17%, CD2=1,8%, CD5=0,53%, CD7=0,2%, CD10=0,41%, CD19=1,1%, CD20=l,4%, CD22=0,71% CD34=0,82%
Экспрессия CD123 в лейкозных бластных клетках в мононуклеарах костного мозга (ВМ MNC)
В общем 0,5х106 мононуклеаров костного мозга (ВМ MNC) и мононуклеаров периферической кро
- 34 034142 ви (РВМС)) от пациента 1 с ОМЛ оценивали в отношении экспрессии CD123. Клеточную линию Kasumi3 включали в качестве контроля. Лейкозные бластные клетки идентифицировали с использованием миелоидного маркера CD33. Как показано на фиг. 9, панели А, 87% клеток из костного мозга ОМЛ от пациента 1 экспрессировали CD123 и CD33. Уровни экспрессии CD123 были немного ниже, чем у экспрессирующей CD123 на высоком уровне клеточной линии ОМЛ, Kasumi-3 (фиг. 9, панель B).
Пример 8. Анализ аутологического цитолиза CTL с использованием первичных образцов от пациента с ОМЛ
Криоконсервированный первичный образец ОМЛ (мононуклеары костного мозга (BMNC) и мононуклеары периферической крови (РВМС)) от пациента 1 с ОМЛ оттаивали в RPMI 1640 с 10% FBS и оставляли для восстановления в течение ночи при 37°С в 5% CO2- Клетки промывали средой для анализа (RPMI 1640+10% FBS) и количество жизнеспособных клеток определяли по вытеснению трипанового синего. 150000 клеток/лунка в 150 мкл среды для анализа добавляли к 96-луночному U-донному планшету (BD Biosciences). Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) разводили до 0,1 и 0,01 нг/мл и 50 мкл каждого разведения добавляли к каждой лунке (конечный объем = 200 мкл). Контрольное биспецифическое диатело (контрольное DART) разводили до 0,1 нг/мл и 50 мкл каждого разведения добавляли к каждой лунке (конечный объем = 200 мкл). Отдельный аналитический планшет устанавливали для каждой временной точки (48, 72, 120 и 144 часа) и планшеты инкубировали при 37 °С в инкубаторе с 5% СО2. В каждую временную точку клетки окрашивали с помощью антител к CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 и CD123. Меченые клетки анализировали в проточном цитометре FACS Calibur, оснащенном программным обеспечением для сбора данных CellQuest Pro, версии 5.2.1 (BD Biosciences). Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Flowjo v9.3.3 (Treestar, Inc). Т-клеточную экспансию измеряли путем гейтирования на популяциях CD4+ и CD8+ и активацию определяли путем измерения среднего значения интенсивности флуоресценции CD25 (MFI) на гейтированных в отношении CD4+ и CD8+ популяциях. Популяцию лейкозных бластных клеток идентифицировали с помощью гейтирования CD45+CD33+.
Аутологическая деплеция опухолевых клеток, Т-клеточная экспансия и активация с помощью характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) в первичных образцах от пациента 1 с ОМЛ
Для определения опосредованной характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) активности у пациента 1 с ОМЛ, образцы от пациента инкубировали с 0,1 или 0,01 нг/мл DART-A и процентные отношения лейкозных бластных клеток и Тклеток измеряли в различные временные точки после лечения. Лейкозные бластные клетки идентифицировали путем CD45+/CD33+ гейтирования. Инкубация первичных образцов костного мозга при ОМЛ с DART-A приводила к деплеции популяции лейкозных клеток с течением времени (фиг. 10, панель A), что сопровождалось сопутствующей экспансией остаточных Т-клеток (фиг. 10, панель B) и индукцией маркеров Т-клеточной активации (фиг. 10, панель С). В обработанных DART-A образцах Т-клетки подвергались экспансии от приблизительно 7 до приблизительно 80% к 120 ч. Т-клеточная активация, измеряемая по экспрессии CD25 на CD4 и CD8 клетках, достигала пика через 72 ч и снижалась к временной точке 120 ч.
В случае необходимости воспроизвести указанный пример, следует понимать, что специалист в настоящей области техники сможет в пределах целесообразных и приемлемых границах изменить описанный выше протокол подходящим образом для воспроизведения описанных результатов. Таким образом, не подразумевается, что проиллюстрированный протокол должен соблюдаться точно определенным образом.
Пример 9. Поверхностная экспрессия CD123 на лейкозных властных клетках и стволовых клетках в первичном образце ткани от пациента с ОЛЛ
Для определения паттерна экспрессии CD123 в первичных образцах от пациента с ОЛЛ, криоконсервированный первичный образец РВМС от пациента с ОЛЛ оценивали в отношении поверхностной экспрессии CD123 на лейкозных бластных клетках.
Экспрессия CD123 в лейкозных бластных клетках в мононуклеарах периферической крови (РВМС)
В общем 0,5х106 мононуклеаров периферической крови (РВМС)) от здорового донора и пациента с ОЛЛ оценивали в отношении экспрессии CD123. Как показано на фиг. 11, панелях E-Н, преобладающее большинство клеток из костного мозга ОЛЛ экспрессировали CD123. Напротив, как предполагалось, у нормального донора B-клетки являются отрицательными в отношении CD123 и pDC и моноциты являются положительными в отношении CD123 (фиг. 11, панель D).
Т-клеточную популяцию идентифицировали в образце пациента с ОЛЛ по окрашиванию клеток в отношении CD4 и CD8. Как показано на фиг. 12, панели B, только небольшая фракция общих РВМС в образце пациента с ОЛЛ представляла собой Т-клетки (приблизительно 0,5% представляли собой CD4 Тклетки и приблизительно 0,4% представляли собой CD8 Т-клетки).
- 35 034142
Пример 10.
Анализ аутологического цитолиза CTL с использованием первичных образцов от пациента с ОЛЛ
Криоконсервированный первичный образец ОЛЛ (мононуклеары периферической крови (РВМС)) оттаивали в RPM 11640 с 10% FBS и оставляли восстанавливаться в течение ночи при 37°С в 5% CO2. Клетки промывали средой для анализа (RPMI 1640+10%FBS) и количество жизнеспособных клеток определяли по вытеснению трипанового синего. 150000 клеток/лунка в 150 мкл среды для анализа добавляли к 96-луночному U-донному планшету (BD Biosciences). Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) разводили до 10, 1 нг/мл и 50 мкл каждого разведения добавляли к каждой лунке (конечный объем = 200 мкл). Отдельный аналитический планшет устанавливали для каждой временной точки (48, 72, 120 и 144 ч) и планшеты инкубировали при 37°С в инкубаторе с 5% CO2. В каждой временной точке клетки окрашивали с помощью антител к CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 и CD123. Меченые клетки анализировали в проточном цитометре FACS Calibur, оснащенном программным обеспечением для сбора данных CellQuest Pro, версии 5.2.1 (BD Biosciences). Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Flowjo v9.3.3 (Treestar, Inc). Тклеточную экспансию измеряли путем гейтирования на популяциях CD4+ и CD8+ и активацию определяли путем измерения MFI CD25 на гейтированных в отношении CD4+ и CD8+ популяциях. Популяцию лейкозных бластных клеток идентифицировали с помощью гейтирования CD45+CD33+.
Аутологическая деплеция опухолевых клеток, Т-клеточная экспансия и активация с помощью характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) в первичных образцах от пациентов с ОЛЛ
Для определения опосредованной характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) активности в первичных образцах от пациента с ОЛЛ образцы пациента инкубировали с 1 нг/мл DART-A и процентные отношения лейкозных бластных клеток и Т-клеток измеряли в различные временные точки после лечения. Лейкозные бластные клетки идентифицировали по CD45+/CD33+ гейтированию. Инкубация первичных образцов костного мозга при ОЛЛ с DART-A приводила к деплеции популяции лейкозных клеток с течением времени по сравнению с необработанным контролем или контрольным DART (фиг. 13, панель H по сравнению с панелями F и G). Если Т-клетки подсчитывали (окрашивание в отношении CD8 и CD4) и активацию (окрашивание в отношении CD25) анализировали, Т-клетки подвергались экспансии и активировались в образце DART-A (фиг. 14, панели I и L соответственно) по сравнению с необработанными образцами или обработанными контрольным DART образцами (фиг. 14, панели Н, G, К и J соответственно).
Пример 11. Поверхностная экспрессия CD123 на лейкозных властных клетках и стволовых клетках в первичном образце ткани от пациента 2 с ОМЛ
Для определения паттерна экспрессии CD123 в первичных образцах пациента 2 с ОМЛ криоконсервированные первичные образцы костного мозга и РВМС пациента с ОМЛ оценивали в отношении поверхностной экспрессии CD123 на лейкозных бластных клетках.
Экспрессия CD123 в лейкозных бластных клетках в мононуклеарах костного мозга (BMNC)
В общем 0,5x106 мононуклеаров костного мозга (ВМ MNC) и мононуклеаров периферической крови (РВМС)) от пациента 2 с ОМЛ оценивали для идентификации лейкозных бластных клеток. Лейкозные бластные клетки идентифицировали с использованием миелоидных маркеров CD33 и CD45. Как показано на фиг. 15, панели B, 94% клеток из костного мозга с ОМЛ представляли собой лейкозные бластные клетки. Т-клеточную популяцию идентифицировали по экспрессии CD3. Как показано на фиг. 15, панели С, приблизительно 15% клеток из образца костного мозга ОМЛ и РВМС представляли собой Т-клетки.
Пример 12. Анализ аутологического цитолиза CTL с использованием первичных образцов от пациента 2 с ОМЛ
Криоконсервированный первичный образец ОМЛ (мононуклеары костного мозга (ВМ MNC) и мононуклеары периферической крови (РВМС)) от пациента 2 с ОМЛ оттаивали в RPM 11640 с 10% FBS и оставляли восстанавливаться в течение ночи при 37°С в 5% CO2. Клетки промывали средой для анализа (RPMI 1640+10% FBS) и количество жизнеспособных клеток определяли по вытеснению трипанового синего. 150000 клеток/лунка в 150 мкл среды для анализа добавляли к 96-луночному U-донному планшету (BD Biosciences). Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) и контрольное биспецифическое диатело (контрольное DART) разводили до 0,1 и 0,01 нг/мл и 50 мкл каждого разведения добавляли к каждой лунке (конечный объем = 200 мкл). Отдельный аналитический планшет устанавливали для каждой временной точки (48, 72, 120 и 144 ч) и планшеты инкубировали при 37°С в инкубаторе с 5% CO2. В каждой временной точке клетки окрашивали с помощью антител к CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 и CD123. Меченые клетки анализировали в проточном цитометре FACS Calibur, оснащенном программным обеспечением для сбора данных CellQuest Pro, версии 5.2.1 (BD Biosciences). Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Flowjo v9.3.3 (Treestar, Inc). Т-клеточную экспансию измеряли путем гейтирования на популяциях CD4+ и CD8+ и активацию определяли путем измерения MFI CD25 на гейтированных в отношении CD4+ и CD8+ популяциях. Популяцию лейкозных бластных клеток идентифицировали с помощью гей
- 36 034142 тирования CD45+CD33+.
Аутологическая деплеция опухолевых клеток, Т-клеточная экспансия и активация в первичных образцах от пациента 2 с ОМЛ
Для определения опосредованной характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) активности в первичных образцах от пациента 2 с ОМЛ образцы пациента инкубировали с 0,1 или 0,01 нг/мл DART-А и процентные отношения лейкозных бластных клеток и Т-клеток измеряли в различные временные точки после лечения. Инкубация первичных образцов костного мозга при ОМЛ с DART-A приводила к деплеции популяции лейкозных клеток с течением времени (фиг. 16, панель A), что сопровождалось сопутствующей экспансией остаточных Тклеток (как CD4, так и CD8) (фиг. 16, панель В и фиг. 16, панель С соответственно). Для определения того, были ли Т-клетки активированы, клетки окрашивали в отношении CD25 или Ki-67, обоих маркеров Т-клеточной активации. Как показано на фигуре 17, панелях A и B, инкубация первичных образцов костного мозга при ОМЛ с DART-A приводила к Т-клеточной активации. Указанные данные представляли временную точку 144 ч.
Внутриклеточное окрашивание в отношении гранзима В и перфорина
Для определения внутриклеточных содержаний гранзима В и перфорина в Т-клетках проводили анализ CTL. Через приблизительно 18 ч клетки из аналитического планшета окрашивали антителами к CD4 и к CD8 путем инкубации в течение 30 мин при 4°С. После поверхностного окрашивания клетки инкубировали в 100 мкл буфера для фиксации и пермеабилизации в течение 20 мин при 4°С. Клетки промывали буфером для пермеабилизации/ и инкубировали в 50 мкл смеси антител к гранзиму В и перфорину, полученной в IX буфере для пермеабилизации/отмывки, при 4°С в течение 30 мин. Затем клетки промывали с помощью 250 мкл буфера для пермеабилизации/отмывки и ресуспендировали в буфере для пермеабилизации/отмывки для получения данный FACS
Положительная регуляция гранзима В и перфорина характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) в Т-клетках во время перенаправленного цитолиза
Для исследования возможного механизма опосредованной характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) цитотоксичности Т-клетками, внутриклеточные содержания гранзима В и перфорина измеряли в Т-клетках после перенаправленного цитолиза. Если Т-клетки инкубировали с контрольным биспецифическим диателом (контрольным DART), положительную регуляцию гранзима В и перфорина не наблюдали. Положительную регуляцию содержаний гранзима В и перфорина как в CD8, так и CD4 Т-клетках наблюдали под действием характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DARTA) (фиг. 17, панели С и D). Интересно, что положительная регуляция была почти в два раза выше в CD8 Т-клетках по сравнению с CD4 Т-клетками (фиг. 17, панель С и фиг. 17, панель D). Приведенные данные указывают на то, что опосредованный DART-A лизис клеток - мишеней опосредован через путь с участием гранзима В и перфорина.
Пример 13.
Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело перекрестно реагирует с белками CD123 и CD3 нечеловекообразного примата
Для количественного определения степени связывания между характеризующимся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическим диателом (DART-A) и CD3 человека или яванского макака, проводили анализы BIACORE™. В анализах BIACORE™ измеряют константу скорости диссоциации, kd. Аффинность связывания (KD) между антителом и его мишенью представляет собой функцию кинетических констант для ассоциации (константа скорости ассоциации, ka) и диссоциации (константа скорости диссоциации, kd) согласно формуле: KD = [kd]/[ka]. В анализе BIACORE™ используется поверхностный плазмонный резонанс для измерения напрямую указанных кинетических параметров. Рекомбинантный CD3 человека или яванского макака напрямую иммобилизировали на подложку. Очищенный CD123 человека или яванского макака захватывали и иммобилизировали на подложку. Измеряли время продолжительности диссоциации и проводили бивалентную аппроксимацию данных. Константы связывания и аффинности получали с использованием 1:1 аппроксимации связывания. Результаты анализов BIACORE , в которых сравнивали связывание с белками CD123 и CD3 человека по сравнению с белками CD123 и CD3 яванского макака, показаны на фигуре 18. Аффинности связывания с белками CD123 яванского макака (фиг. 18D) и CD3 яванского макака (фиг. 18B) являются сопоставимыми с аффинностями связывания для белков CD123 человека (фиг. 18С) и CD3 человека (фиг. 18A).
Пример 14. Аутологическая деплеция моноцитов in vitro с РВМС человека и яванского макака
РВМС из образцов цельной крови человека или яванского макака добавляли к U-донным планшетам с плотностью Т-клеток, составляющей 200000 клеток/лунка в 150 мкл среды для анализа. Разведения характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател (DART-А или DART-A w/ABD) получали в среде для анализа. 50 мкл каждого разведения DART-A или DART- A w/ABD добавляли к планшету, содержащему РВМС в лунках в двух параллелях. Планшеты
- 37 034142 инкубировали в течение -18-24 ч при 37°С. Супернатанты использовали для определения цитотоксичности, как описано выше. Как показано на фиг. 19 (панели A и B), деплецию клеток pDC наблюдали как в РВМС человека (фиг. 19, панель A), так и РВМС яванского макака (фиг. 19, панель B). Указанные результаты указывают на то, что циркулирующие в кровотоке pDC можно использовать в качестве фармакодинамического маркера для доклинических токсикологических испытаний у яванских макак.
В случае необходимости воспроизвести указанный пример, следует понимать, что специалист в настоящей области техники сможет в пределах целесообразных и приемлемых границах изменить описанный выше протокол подходящим образом для воспроизведения описанных результатов. Таким образом, не подразумевается, что проиллюстрированный протокол должен соблюдаться точно определенным образом.
Пример 15.
Деплеция плазмацитоидных дендритных клеток у яванских макак, получивших лечение с помощью характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A)
В качестве части токсикологического исследования по поиску диапазона доз яванским макакам вводили характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) в виде 4-дневных инфузий в дозах, составляющих 0,1, 1, 10, 30 100, 300 или 1000 нг/кг. Контрольное DART вводили в дозе 100 нг/кг. Для идентификации pDC и популяций моноцитов РВМС яванского макака, клетки метили с помощью антитело к CD14-FITC. Моноциты идентифицировали как CD14+ популяцию и pDC идентифицировали как CD14CD1231 популяцию. Как показано на фиг. 20, панелях К и L, pDC подвергались деплеции не позднее чем через 4 дня после инфузий при дозе не выше 10 нг/кг DART-A. Не наблюдали деплецию pDC у получивших лечение с помощью контрольного биспецифического диатела (контрольного DART) обезьян или получивших лечение с помощью инертного носителя вместе с наполнителем обезьян во временной точке - 4 дня (фиг. 20, панели G, Н, С и D, соответственно). Содержания цитокинов: интерферона-гамма, TNF-альфа, IL6, IL5, IL4 и IL2, определяли через 4 ч после инфузий. Наблюдалось небольшое повышение или отсутствие повышения содержаний цитокинов у получивших лечение с помощью DART-A животных по сравнению с получившими лечение с помощью контрольного DART или получившими лечение с помощью инертного носителя животными.
На фиг. 21 и 22 представлены результаты анализа FACS для B-клеток (CD20+) (фиг. 21, панель A), моноцитов (CD14+) (фиг. 21, панель B), NK-клеток (CD159+CD16+) (фиг. 21, панель С), pDC (CD123HI, CD14-) (фиг. 21, панель D) и Т-клеток (в общем, CD4+ и CD8+) (фиг. 22, панель А, фиг. 22, панель В и фиг. 22, панель D соответственно).
Лечение обезьян с помощью контрольного DART не приводило к заметным эффектам на Т- или Bлимфоциты, NK-клетки, моноциты и pDC. Лечение обезьян с помощью DART-А в дозах, составляющих 10 нг/кг/день или выше, приводило к устранению pDC (фиг. 21, панель D). Деплеция pDC была полной и длительной, возвращаясь к уровням до лечения через несколько недель после завершения введения доз. Содержания циркулирующих в кровотоке Т-лимфоцитов снижалось при введении DART-A, но возвращалось к уровням до лечения к концу каждого недельного цикла, что указывает на изменения в миграции, а не на настоящую деплецию. Как CD4, так и CD8 Т-лимфоциты характеризовались одинаковым паттерном. Маркер активации Т-лимфоцитов, CD69 (фиг. 22, панель С), был лишь в небольшой степени положительным среди циркулирующих клеток и не изменялся вслед за введение дозы DART-A. Содержания B-лимфоцитов, моноцитов и NK-клеток колебались в течение курса введения доз DART-A с существенной изменчивостью, наблюдаемой среди обезьян. Тенденция в сторону повышенных содержаний циркулирующих B-лимфоцитов и моноцитов наблюдали у обеих обезьян при самых высоких дозах.
Итак, вышеприведенные результаты демонстрируют терапевтическую эффективность характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A). Характеризующееся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифическое диатело (DART-A) можно использовать в качестве терапевтического средства для лечения многочисленных заболеваний и состояний, включая в себя следующее: ОМЛ, ABL (ОЛЛ), ХЛЛ, МДС, pDCL, мантийноклеточная лимфома, волосатоклеточный лейкоз, ХЛЛ с трансформацией Рихтера, бластный криз при ХМЛ, BLL (подкласс является CD123+) (см. пример 2); системная красная волчанка (СКВ), аллергия (базофилы являются CD123+), бронхиальная астма и т.д.
Пример 16. Сравнительные свойства характеризующегося оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-A) и характеризующегося неоптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифического диатела (DART-B)
Неожиданное преимущество и свойства характеризующихся оптимизированной последовательностью CD123xCD3 биспецифических диател
Как обсуждалось выше, DART-A и DART-B конструировали аналогичным образом, и первый полипептид обоих конструктов содержат, в направлении от N-конца к C-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLCD3), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123), линкер 2, E
- 38 034142 спиральный домен и C-конец. Аналогично, второй полипептид обоих конструктов содержат, в направлении от N-конца к C-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3), линкер 2, K-спиральный домен и C-конец.
Как показано в примере 1, было обнаружено, что оба CD123xCD3 биспецифических диатела способны одновременно связываться с CD3 и CD123. Кроме того, как раскрыто в примере 3 и на фиг. 4, панелях С и D, два CD123xCD3 биспецифические диатела проявили выраженную способность к перенаправленному цитолизу с концентрациями, которые должны достигать 50% от максимальной активности (EC50) в диапазоне суб-нг/мл, независимо от специфичности связывания с эпитопом CD3 (DART-А по сравнению с DART-B) в клеточных линиях - мишенях с высокой экспрессией CD123. Таким образом, небольшие вариации в конкретных последовательностях CD123xCD3 биспецифических диател не полностью аннулируют биологическую активность.
Тем не менее, во всех исследованных клеточных линиях было обнаружено, что DART-A являлся более активным и более эффективным в перенаправленном цитолизе, чем DART-B (см., например, фигуру 4, панели А, С и D). Таким образом, DART-A проявило неожиданное преимущество по сравнению со сходным DART-B.
Пример 17. Фармакология DART-А у нечеловекообразного примата для лечения гематологических злокачественных опухолей
Альфа-цепь рецептора интерлейкина 3 (IL-3), CD123, избыточно экспрессируется на злокачественных клетках в широком диапазоне гематологических злокачественных опухолей (Munoz L. et al. (2001) Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies Haematologica 86:1261-1269; Testa, U. et al. (2014) CD123 Is A Membrane Biomarker And A Therapeutic Target In Hematologic Malignancies Biomark. Res. 2:4) и связан с неблагоприятным прогнозом (Vergez F. et al. (2011) High Levels OfCD34+CD38low/-CD123+ Blasts Are Predictive Of An Adverse Outcome In Acute Myeloid Leukemia: A Groupe Ouest-Est Des Leucemies Aigues Et Maladies Du Sang (GOELAMS) Study Haematologica 96:1792-1798). Более того, сообщалось, что CD123 экспрессируется лейкозными стволовыми клетками (LSC) (Jordan, СТ. et al. (2000) The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells Leukemia 14:1777-1784; Jin L. et al. (2009) Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells Cell Stem Cell 5:31-42), что является перспективным признаком, которые позволяет нацеленно воздействовать на основную причину таких заболеваний. В соответствии с этим заключением CD123 также принимает участие в аутокринной петле IL-3, что поддерживает возникновение и развитие лейкоза, как показано с помощью способности блокирующего CD123 моноклонального антитела снижать приживление лейкозных стволовых клеток и улучшать выживаемость в мышиной модели острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) (Jin, L. et al. (2009) Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells Cell Stem Cell 5:31-42). Тем не менее, в исследовании 1 фазы у пациентов с высоким риском ОМЛ моноклональное антитело не проявило противолейкозную активность (Roberts, A. W. et al. (2010) А Phase I Study Of Anti-CD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML J. Clin. Oncol. 28(Suppl):el3012). Таким образом, необходимы альтернативные подходы в отношении нацеленного воздействия на CD123, включая в себя стратегии деплеции. Хотя CD123 экспрессируется подклассом нормальных гемопоэтических клеток-предшественников (НРС), гемопоэтические стволовые клетки (HSC) экспрессируют CD123 в небольшом количестве или не экспрессируют вообще (Jordan, C.T. et al. (2000) The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells Leukemia 14:1777-1784; Jin, W. et al. (2009) Regulation OfThU Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK Blood 113:6603-6610), указывая на то, что стратегии на основании деплеции клеток с CD123 обеспечивают восстановление посредством нормального гемопоэза.
Нацеливание собственных Т-лимфоцитов пациента на лейкозные клетки -мишени представляет собой перспективную иммунотерапевтическую стратегию для лечения гематологических злокачественных опухолей. Попытку применить терапевтический потенциал указанного подхода осуществили с использованием блинатумомаба (BiTE на основе биспецифического антитела, характеризующегося способностью связываться с CD3 и B-клеточным антигеном CD19) у пациентов с B-клеточными лимфомами и пре-Bклеточным острым лимфобластным лейкозом ((Klinger M. et al. (2012) Immunopharmacologic Response Of Patients With B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell-Engaging CD19/CD3-Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab Blood 119:6226-6233; Topp, M.S. et al. (2012) LongTerm Follow-Up Of Hematologic Relapse-Free Survival In A Phase 2 Study Of Blinatumomab In Patients With MRD In B-Lineage ALL Blood 120:5185-5187; Topp, M.S. et al. (2011) Targeted Therapy With The T-CellEngaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia-Free Survival J. Clin. Oncol. 29:2493-2498).
Молекулы CD123xCD3 биспецифического диатела согласно настоящему изобретению, такие как
- 39 034142
DART-A, содержат альтернативную биспецифическую, основанную на антителе модальность, которая обеспечивает улучшенную стабильность и более надежные свойства для выполнимости производства (Johnson S. et al. (2010) Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion J. Mol. Biol. 399:436-449; Moore P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma Blood 117: 4542-4551).
Чтобы продемонстрировать превосходство и эффективность молекул CD123xCD3 биспецифического диатела согласно настоящему изобретению, подтверждали биологическую активность описанных выше DART-A в in vitro и доклинических моделях лейкоза, а также его фармакокинетику, фармакодинамику и безопасную фармакологию на яванских макаках (Масаса fascicularis) оценивали по отношению либо к описанному выше контрольному DART (биспецифическому в отношении CD3 и флуоресцеина), либо контрольного DART-2, которое является биспецифическим в отношении CD123 и флуоресцеина).
Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи контрольного DART-2 (CD123VL — линкер — 4-4420VH — линкер — E-спираль; линкеры подчеркнуты) (SEQ ID NO:58):
MSCKSSQSLL
SGSGTDFTLT GEVKLDETGG QIRNKPYNYE GSYYGMDYWG LEK
LAVSLGERVT
ESGVPDRFSG
EIKGGGSGGG
SPEKGLEWVA
VEDMGIYYCT
VAALEKEVAA
NSGNQKNYLT ISSLQAEDVA GLVQPGRPMK TYYSDSVKGR QGTSVTVSSG
DFVMTQSPDS KLLIYWASTR PYTFGQGTKL SDYWMNWVRQ SVYLQMNNLR EKEVAALEKE
WYQQKPGQPP VYYCQNDYSY LSCVASGFTF FTISRDDSKS
GCGGGEVAAL
Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи контрольного DART-2 (4420VL - линкер - CD123VH - линкер - K-спираль) (SEQ ID NO:59):
DWMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT
DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY
MELSSLRSED TAVYYCARSH LLRASWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGKVAA
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
Бифункциональный анализ ELISA
Планшет MaxiSorp ELISA (Nunc), на который в течение ночи наносили растворимый IL3R-альфа человека или яванского макака (0,5 мкг/мл) в бикарбонатном буфере, блокировали с помощью 0,5% BSA; 0,1% Tween-20 в PBS (PBST/BSA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Наносили молекулы DART-A, после чего следовало последовательное добавление конъюгата CD3ε5-БИОТИН человек и стрептавидин-HRP (Jackson ImmunoResearch). Активность HRP обнаруживали по превращению тетраметилбензидина (BioFX) в качестве субстрата в течение 5 мин; реакцию прерывали с помощью 40 мкл/лунка 1% H2SO4 и поглощение считывали при 450 нм.
Анализ поверхностного плазмонного резонанса
Способность DART-А связываться с белками CD3 или CD123 человека и яванского макака анализировали с использованием биосенсора BIAcore 3000 (GE, Healthcare), как описано у Johnson, S. et al. (2010) (Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion J. Mol. Biol. 399:436-449) и Moore, P.A. et al. (2011) (Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma Blood 117:4542-4551). Кратко, карбоксильные группы на сенсорном чипе СМ5 активировали с помощью инъекции 0,2М №этил-Л-(3-диэтиламинопропил)карбодиимида и 0,05М N-гидроксисукцинимида. Растворимый CD3 или CD123 (1 мкг/мл) впрыскивали на поверхность активированного СМ5 в 10 мМ ацетата натрия, pH 5,0, при объемной скорости потока, составляющей 5 мкл/мин, после чего добавляли 1 М этаноламина для деактивации. Эксперименты по связыванию проводили в 10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества Р20. Регенерацию иммобилизированных рецепторных поверхностей проводили путем импульсной инъекции 10 мМ глицина, pH 1,5. Значения KD определяли по глобальной аппроксимации кривых связывания к 1:1 модели связывания Ленгмюра (программное обеспечение BIAevaluation v4.1).
Анализ цитолиза
Клеточные линии, используемые для анализов лизиса клеток, получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (Manassas, VA). РВМС выделяли из крови здоровых доноров с использованием набора Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare); T-клетки очищали с помощью набора для отрицательной селекции (Life Technologies). Плотность CD123 на клеточной поверхности определяли с использованием Quantum Simply Cellular гранул (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). Анализы цитотоксичности проводили, как описано Moore, P.A. et al. (2011) (Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma Blood 117:4542-4551). Кратко, клеточные линии мишени (105 клетки/мл) обрабатывали серийными разведениями таких белков, как DART-A или контрольное DART, в присутствии Т-клеток в указанных соотношениях эффекторных клеток к клеткам мишеням и инкубировали при 37°С в течение ночи. Лизис клеток определяли по высвобождению лактатдегидрогеназы (LDH, Promega) в супернатанте культуры. Для анализа цитолиза с помощью проточной
- 40 034142 цитометрии клетки - мишени метили с помощью CMTMR (Life Technologies) и цитолиз подвергали мониторингу с использованием проточного цитометра FACSCalibur. Данные анализировали с использованием программного обеспечения PRISM® 5 (GraphPad) и представляли в виде цитотоксичности в %.
Фармакология в отношении яванского макака
Эксперименты на нечеловекообразном примате проводили в Charles River Laboratories (Reno, NV), согласно руководствам местного институционального комитета по содержанию и использованию животных (IACUC). Специально выведенным, ранее не подверженным экспериментам яванским макакам (Масаса fascicularis) китайского происхождения (возрастной диапазон 2,5-9 лет, диапазон по массам 2,7-5 кг) вводили инертный носитель или DART-A посредством внутривенной инфузии через порт-системы в бедренной и яремной вене с использованием программируемых инфузионных насосов с питанием от аккумуляторной батареи (CADD-Legacy®, SIMS Deltec, Inc., St. Paul, MN). Образцы периферической крови или костного мозга собирали в содержащие антикоагулянт пробирки в указанные временные точки. Анализы фенотипа клеточной поверхности проводили с помощью анализатора LSR Fortessa (BD Biosciences), оснащенного лазерами с длинами волн, составляющими 488, 640 и 405 нм, и с помощью следующих антител: CD4-V450, CD8-V450, CD123-PE-Cy7, CD45-PerCP, CD4-APC-H7, CD8-FITC, CD25PE-Cy7, CD69-PerCP, PD-l-PE, TIM3-APC, CD3-Pacific Blue, CD95-APC, CD28-BV421, CD16-FITC, CD3Alexa488, CD38-PE, CD123-PE-Cy7, CD117-PerCP-Cy5,5, CD34-APC, CD90-BV421, CD45RA-APC -H7 и CD33-APC (BD Biosciences). Абсолютное количество клеток определяли с использованием TruCOUNT (BD Biosciences). Содержания цитокинов IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α и IFN-γ в сыворотке измеряли с использованием набора цитометрических гранул с моноклональными антителами к цитокину Th1/Th2 нечеловекообразного примата (BD Bioscience). Концентрацию DART-А в образцах сыворотки обезьяны измеряли с использованием сэндвич-иммуноанализа с электролюминесцентным обнаружением (MesoScale Diagnostics, MSD, Rockville, MD). Кратко, на аналитический планшет (MSD) наносили рекомбинантный IL-3 Ra человека (R&D System) и планшет блокировали с помощью 5% BSA. Наносили калибровочные стандарты или разведенные исследуемые образцы, после чего добавляли биотинилированное моноклональное антитело, проявляющее специфическое связывание в отношении описанных выше E-спиральных (SEQ ID NO:34) и K-спиральных (SEQ ID NO:35) доменов молекулы. Добавляли меченный SULFO-TAG™ конъюгат стрептавидина (MSD) и образование комплексов анализировали в устройстве формирования изображений MSD SECTOR®. Концентрации DART-A определяли из стандартных кривых, созданных путем аппроксимации данных интенсивности светового излучения в пятипараметрической логистической модели.
Определение физико-химических характеристик очищенного DART-A продемонстрировало гомогенный гетеродимер с молекулярной массой, составляющей 58,9 кДа (фиг. 23; фиг. 24А-24B), который является стабильным при 2-8°С в течение вплоть до 12 месяцев в PBS. Анализ SPR продемонстрировал почти идентичные аффинности связывания DART-A с соответствующими растворимыми антигенами CD3 и CD123 человека и яванского макака (фиг. 25A-25D и табл. 7). Кроме того, DART-A одновременно связывался с обоими антигенами в формате ELISA, в котором использовали CD123 человека или обезьяны для захвата и CD3 человека для обнаружения (фиг. 26А-26B), и продемонстрировало сходное связывание с Т-лимфоцитами человека и обезьяны (фиг. 26C-26L). Данные в табл. 7 представляют собой средние значения от 3 независимых экспериментов, каждый из которых проведены в двух параллелях.
Таблица 7 Равновесные константы диссоциации (KD) для связывания DART-A с CD3 и CD123 человека и яванского макака
Антигены ka(±SD) (mV) kd(±SD) (с'1) Kd(±SD) (нМ)
CD3e/5 человека 5,7 (± 0,6) х 105 5,0 (± 0,9) х 10 3 9,0 ±2,3
CD3e/5 яванского макака 5,5 (± 0,5)х 105 5,0 (± 0,9) х 10_3 9,2 ±2,3
CD 123-His человека 1,6 (± 0,4) х 106 1,9 (± 0,4) х 10’4 0,13 ±0,01
CD 123-His яванского макака 1,5 (± 0,3) х 106 4,0 (± 0,7) х 10’4 0,27 ± 0,02
DART-A опосредует перенаправленный цитолиз Т-лимфоцитами человека или яванского макака
DART-A опосредовал перенаправленный цитолиз клеток-мишеней эффекторными клетками человека или обезьяны против CD123+ лейкозных клеточных линий Kasumi-3 (фиг. 27A-27D), который сопровождался индукцией маркеров активации. Не наблюдали какой-либо активности против CD123отрицательных мишеней (U937 клетки) или с применением контрольного DART, что указывало на то, что Т-клеточная активация строго зависит от вовлечения клеток-мишеней и что моновалентное вовлечение CD3 с помощью DART-A было недостаточным для запуска Т-клеточной активации. Поскольку CD123 экспрессируется на подклассе нормальных циркулирующих лейкоцитов, включая в себя pDC и моноциты (фиг. 27Е), эффект DART-A дополнительно исследовали в нормальных РВМС человека и обезьяны.
Эффект ступенчатого изменения наблюдали среди РВМС человека с зависимой от дозы быстрой
- 41 034142 деплецией CD14-CD123hlgh клеток (pDC и базофилов), наблюдаемой не позднее чем через 3 ч после начала лечения, при этом моноциты (CD14+ клетки) не подвергались воздействию в этой временной точке (фиг. 27F-27G). Деплеция CD14-CD123high клеток увеличивалась с течением времени при всех концентрациях молекулы DART-A, тогда как количество моноцитов слегка снижалось к 6 ч и подвергалось деплеции через 18 ч и в концентрациях выше чем 1 нг/мл. Инкубация РВМС обезьяны с DART-А приводила к сопоставимой зависимой от дозы деплеции CD14-CD123 lg клеток (фиг. 27Н), дополнительно подтверждая релевантность этого вида для фармакологии DART-A (CD14+ клетки обезьяны экспрессируют CD123 в небольшой степени или не экспрессируют вообще, и они не подвергаются деплеции).
Фармакокинетика DART-A у яванских макак
Яванского макака выбирали в качестве приемлемой фармакологической модели для анализа DARTA на основании эквивалентного распределения обоих целевых антигенов в этом виде по сравнению с людьми на основании иммуногистохимии с предшественниками mAb, в соответствии с опубликованной информацией (Munoz L. et al. (2001) Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies, Haematologica 86:1261-1269; Korpelainen, E.I. et al. (1996) IL-3 Receptor Expression, Regulation And Function In Cells Of The Vasculature Immunol. Cell Biol. 74:1-7).
Исследование, проведенное согласно настоящему изобретению, включало в себя 6 групп лечения, состоящих из 8 яванских макак на группу (4 самца, 4 самки) (табл. 8). Все группы получали инертный носитель - контроль для первой инфузии; затем инертный носитель или DART-A вводили внутривенно в течение 4 еженедельных циклов. Животные группы 1 получали инертный носитель - контроль в течение всех 4 последующих инфузий, тогда как группы 2-5 получали еженедельно увеличивающиеся дозы DART-A в течение 4 дней в неделю в течение всех последующих инфузий. Животные группы 6 получали лечение с помощью 7-дневных непрерывных еженедельно увеличивающихся доз DART-A для всех инфузий. Схемы 4 дня введения/3 дня без введения и 7 дней введения разрабатывали для того, чтобы различать длительные и временные эффекты, связанные с введением DART-A. Двое самцов и 2 самок на каждую группу умерщвляли в конце фазы лечения (36 день), тогда как оставшихся обезьян умерщвляли после 4-недельного восстановления (65 день). Подгруппа обезьян, у которых выработались антитела к лекарственному средству (ADA), направленные против гуманизированной Fv как CD3, так и CD123, и данные после возникновения ADA исключали из анализа РК. Всех обезьян подвергали воздействию DART-А в течение периода исследования._______________________________________
Таблица 8
№ инфузии Дни исследования Инертный носите ль Инфузия DART-A
(4 дня введения/3 дня без введения) нг/кг/день [нг/кг/4 дней] (7 дня введения) нг/кг/день [нг/кг/7дней]
Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа 6
1 1 Инертный носитель Инертный носитель Инертный носитель Инертный носитель Инертный носитель Инертный носитель
2 8 Инертный носитель 100 [400] 100 [400] 100 [400] 100 [400] 100 [700]
3 15 Инертный носитель 100 [400] 300 [1200] 300 [1200] 300 [1200] 300 [2100]
4 22 Инертн ый носитель 100 [400] 300 [1200] 600 [2400] 600 [2400] 600 [4200]
5 29 Инертн ый носитель 100 [400] 300 [1200] 600 [2400] 1000 [4000] 1000 [7000]
Восстановление 36-65
Двухкомпартментную модель использовали для оценки параметров РК (табл. 9 и фиг. 28). Τ1/2α был коротким (4-5 мин), отражая быстрое связывание с циркулирующими мишенями; Τ1/2β также был быстрым, как ожидалось для молекулы такого размера, которая подвергается выведению через почки. Анализ образцов сыворотки, собранные в конце каждой инфузии от обезьян группы 6, показали зависимое от дозы увеличение Cmax DART-A. В табл. 9 инертный носитель представлял собой PBS, pH 6,0, содержащий 0,1 мг/мл рекомбинантного альбумина человека, 0,1 мг/мл PS-80 и 0,24% бензиловый спирт использовали для всех инфузий инертного носителя в течение первых 4 дней каждой недели инфузий с последующим введением этого же состава без бензилового спирта в течение оставшихся 3 дней каждой еженедельной инфузий. DART-A вводили в те же временные точки, что и непрерывную внутривенную инфузию раствора PBS, pH 6,0, содержащего 0,1 мг/мл рекомбинантного альбумина человека, 0,1 мг/мл PS80 и 0,24% бензилового спирта в необходимой концентрации.
- 42 034142
Таблица 9 Двухкомпартментный анализ параметров РК DART-А у яванских макак
Показатель 300 нг/кг/день (среднее ± SD) 600 нг/кг/день (среднее ± SD)
Стах <ПГ/МЛ) 77,4 ± 9,4 113,8 ±33,5
AUC (ч*пг/мл) 7465 ±913 11188 ±3282
У^Сл/кг) 1,078 ±0,511 2,098 ± 1,846
t1/2, альфа (ч) 0,07 ±0,018 0,067 ± 0,023
tl/2, бета (ч) 13,79 ±4,928 21,828 ± 18,779
MRT (ч) 6,73 ± 3,327 9,604 ±8,891
Высвобождение цитокина у получивших лечение с помощью DART-A-яванских макак
Принимая во внимание свойства DART-A в отношении Т-клеточной активации, предполагалось увеличение циркулирующих цитокинов, сопровождающее инфузию и, следовательно, использовали низкую начальную дозу в качестве стратегии десенсибилизации на основании предыдущих данных, полученных со сходными соединениями (см., например, Торр M.S. et al. (2011) Targeted Therapy With The TCell-Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia-Free Survival J. Clin. Oncol. 29:2493-2498; Bargou R. et al. (2008) Tumor Regression In Cancer Patients By Very Low Doses Of A T Cell-Engaging Antibody Science 321:974-977). Из исследованных цитокинов IL-6 продемонстрировал самые существенные изменения при инфузий, пусть даже и временные по природе, минимальной величины и с большими величинами изменчивости между животными и между группами (фиг. 29А-29С). Небольшие, временные изменения в IL-6 также наблюдали после инфузий инертного носителя (все инфузии в группе 1 и все инфузии в 1 день), что указывает на чувствительность указанного цитокина к стрессу на манипуляции. Тем не менее, зависимые от DART-A увеличения (<80 пг/мл) IL-6 в сыворотке наблюдали у некоторых обезьян после первой инфузии DART-A (100 нг/кг/день), которые возвращались к исходному значению к 72 ч. Интересно, что величина высвобождения IL-6 снижалась с каждой последующей инфузией DART-A, даже если уровень дозы увеличивался вплоть до 1000 нг/кг/день. Также наблюдали минимальные и временные связанные с DART-A увеличения TNF-α в сыворотке (<10 пг/мл); как и в случае с IL-6, самую высокую величину высвобождения TNF-α наблюдали после первой инфузии. Не наблюдали каких-либо связанных с DART-A изменений в уровнях IL-5, IL-4, IL-2 или IFN-y во время всего исследования по сравнению с контролями. Можно сделать вывод о том, что высвобождение цитокинов в ответ на лечение обезьян с помощью DART-A было минимальным, временным и представляло собой эффект на первую дозу, контролируемый посредством повышения дозы в пределах одного субъекта.
Опосредованная DART-А деплеция циркулирующих CD14-/CD123+ лейкоцитов in vivo
Абсолютные содержания циркулирующих CD14-/CD123+ клеток измеряли во время исследования в качестве фармакодинамического конечного результата. Наряду с тем, что количество CD123+ клеток в контрольной группе 1 оставалось стабильным с течением времени, лечение с помощью DART-A было связано с обширной деплецией циркулирующих CD14-/CD123+ клеток (94-100% от начального значения перед исследованием), наблюдаемой, начиная с первой измеренной временной точкой (72 ч) после начала первой инфузии DART-A (100 нг/кг/день) у всех животных во всех группах активного лечения (фиг. 30А-30С). Деплеция была длительной, поскольку она продолжалась в течение 3-дневного еженедельного перерыва во введении дозы в группе 2-5, возвращаясь к исходным уровням только во время пролонгированного периода восстановления. Для устранения возможности маскирования DART-A или модулирования CD123 (маловероятный сценарий, дающий низкие уровни циркулирующего DART-A), количество pDC подсчитывали с помощью ортогонального маркера, CD303. В соответствии с данными относительно CD123, CD303+ pDC аналогично подвергались деплеции у обезьян, получивших лечение с помощью DART-A (фиг. 30D-30F).
Содержания циркулирующих Т-лимфоцитов, активация и анализ подклассов
В отличие от устойчивой деплеции циркулирующих CD123+ клеток, DART-A, вводимое по схеме 4 дня введения/3 дня без введения (группы 2-5), было связано с еженедельными колебаниями в содержаниях циркулирующих Т-клеток, при этом введение в виде непрерывных 7-дневных инфузий приводило к аналогичному снижению содержаний циркулирующих Т-клеток после первого введения, которое медленно восстанавливалось без колебания даже в течение периода введения доз (фиг. 31А-31С). Различие между двумя стратегиями введения доз указывает на то, что эффект DART-A на Т-лимфоциты согласуется с миграцией и/или скоплением клеток по краю участка воспаления, а не с деплецией. После прекращения введения доз содержание Т-клеток неожиданно поднимались к уровням, приблизительно в 2 раза выше, чем исходные значения в течение длительности восстановительного периода. Инфузия DART-A была связана с зависимой от воздействия, прогрессирующей повышенной частотой встречаемости Тклеток, экспрессирующих маркер поздней активации, PD-1, особенно на CD4+ клетках, при этом группа дозирования 6 проявляла самые высокие общие содержания (фиг. 31D-31I и фиг. 32A-32F и фиг. 33A
- 43 034142
33F). Tim-3, маркер, связанный с истощением Т-клеток, не был обнаружен на CD4+ Т-клетках и только с низкой частотой среди CD8+ клеток (5,5-9,7%) и содержался у 20,5-35,5% CD8+/PD-1+ двойныхположительных клеток. Не наблюдалось какое-либо согласуемое изменение в маркере ранней Тклеточной активации, CD69, и только небольшие изменения в экспрессии CD25 среди циркулирующих клеток.
Чтобы исключить истощение после in vivo воздействия, ex vivo цитотоксический потенциал эффекторных клеток, выделенных от яванских макак, получающих многочисленные инфузий DART-A, сравнивали с этим параметром у ранее не подверженных экспериментам обезьян. Как показано на фигуре 34, РВМС, выделенные от получивших лечение с помощью DART-A обезьян, продемонстрировали цитотоксичность, сопоставимую с таковой у клеток, выделенных от ранее не подверженных экспериментам обезьян, указывая на то, что in vivo воздействие DART-A не оказывало отрицательного влияния на способность Т-клеток уничтожать клетки -мишени.
Воздействие DART-A увеличивало относительную частоту встречаемости центральных CD4 клеток памяти и эффекторных CD8+ клеток памяти за счет соответствующей ранее не подверженной воздействиям Т-клеточной популяции (фиг. 35A-35F и фиг. 32A-32F и фиг. 33A-33F), указывая на то, что воздействие DART-A стимулирвало экспансию и/или мобилизацию указанных клеток.
Эффекты на гемопоэз и предшественники костного мозга
DART-A хорошо переносился обезьянами во всех исследуемых дозах; тем не менее, обратимые снижения параметров эритроцитов наблюдали при самых высоких дозах (фиг. 36А-36С). Быстрый забор крови мог вносить в это свой потенциальный вклад, поскольку получившие лечение с помощью инертного носителя животные продемонстрировали слабое снижение количества эритроцитов. Ретикулоцитартный ответ наблюдали у всех животных; при самом высоком уровне воздействия (группа 6), тем не менее, ответ оказался слегка менее выраженным для сходного снижения количества эритроцитов (фиг. 36D-36F). Морфологический анализ мазков костного мозга в течение исследования был без особенностей. Проточная цитометрия, тем не менее, выявила, что частота встречаемости CD123+ клеток в пределах отрицательных в отношении незрелых клеточных линий (Lin-) популяций костного мозга снижалась у получивших лечение с помощью DART-A животных в конце периода введения доз, возвращаясь к исходным значениям в концу восстановительного периода (фиг. 37А-37В). HSC (определенные как Lin-/ CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+ клетки (Pang, W.W. et al. (2011) Human Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells Are Increased In Frequency And Myeloid-Biased With Age Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108:20012-20017)) показали большую изменчивость между группами; получившие лечение с помощью DART-A обезьяны группы 4-6 показали некоторое видимое снижение по сравнению с соответствующими уровнями перед введением доз, тем не менее, никакого снижения не наблюдалось во всех получивших лечение группах по сравнению с получившими лечение с помощью инертного носителя животными. Эти данные указывают на то, что HSC являлись менее чувствительными к нацеленному воздействию с помощью DART- A и согласуются с наблюдаемой обратимостью отрицательных эффектов лечения DART-А на гемопоэз.
Как продемонстрировано выше, в отношении инфузий в течение 4 недель по еженедельной схеме 4 дня введения/3 дня без введения или по схеме 7 дней введения еженедельно с начальных доз, составляющих 100 нг/кг/день, которые увеличиваются поэтапно еженедельно до 300, 600 и 1000 нг/кг/день, введение DART-A яванским макакам переносилось хорошо. Деплецию циркулирующих CD123+ клеток, включая в себя pDC, наблюдали после начала первого введения и она продолжалась в течение всего исследования при всех дозах и схемах. Также наблюдалось обратимое снижение предшественника CD123+ костного мозга. Высвобождение цитокином, как существенная угроза безопасности при нацеленных на CD3 видах терапии, оказалось корректируемым и согласуется с эффектом введения первой дозы. Незначительную обратимую анемию отмечали при самых высоких дозах, но не отмечали никаких других (связанных с целью воздействия или не связанных с целью воздействия) неблагоприятных эффектов.
Яванский макак представляет собой приемлемую животную модель для фармакологической оценки DART-A, принимая во внимание высокую степень гомологии между ортологами и способность DART-A связываться со сходной аффинностью с антигенами и опосредовать перенаправленный Т-клеточный цитолиз у обоих видов. Кроме того, оба антигена согласованно экспрессируются у обезьян и людей, включая в себя сходную экспрессию гемопоэтическими предшественниками и в цитоплазме эндотелия многочисленных тканей. Небольшие исключения представляют собой экспрессию в клетках Лейдига у людей, а не обезьян и низкое содержание или отсутствие CD123 в моноцитах обезьян по сравнению с людьми.
Первоочередная задача, связанная с терапевтическими стратегиями, в которые вовлечена Тклеточная активация, включает в себя высвобождение цитокинов и не связанные с целью воздействия цитотоксические эффекты. Недавнее исследование с CD3xCD123 биспецифическим иммунным конструктом слияния scFv с бивалентным распознаванием CD3 продемонстрировало противолейкозную активность in vitro, но вызвало неспецифическую активацию Т-клеток и секрецию IFN-y (Kuo S.R. et al. (2012) Engineering A CD123xCD3 Bispecific scFv Immunofusion For The Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells Protein Eng. Des. Sel. 25: 561-569). Моновалентная природа каждого из плечей связывания и в высокой степени гомогенная форма DART-A обеспечивает то, что Т-клеточная активация зависит исключительно от вовлечения клеток-мишеней: Т-клеточная активация не наблюда
- 44 034142 лась при отсутствии клеток-мишеней или при использовании молекулы контрольного DART, которая включала в себя только плечо нацеленного воздействия на CD3. Кроме того, высокие дозы (вплоть до 100 мкг/кг/день) молекулы контрольного DART не запускали высвобождение цитокинов у яванских макак.
Начальная доза молекулы DART-А, составляющая 100 нг/кг/день, хорошо переносилась, при этом наблюдалось минимальное высвобождение цитокинов. Тем не менее, цитокиновая буря действительно начиналась при высокой начальной дозе (5 мкг/кг/день); тем не менее, такая доза могла быть достигнута безопасным образом посредством поэтапных еженедельных повышений дозы, указывая на то, что опосредованное DART-A высвобождение цитокинов, вероятно, является, главным образом, эффектом первой дозы. Деплеция CD123+ клеток - мишеней, тем самым устраняя источник лигирования с CD3, может объяснять эффект первой дозы: почти полную деплецию CD123+ клеток наблюдали в дозах, не превышающих 3-10 нг/кг/день, указывая на то, что в высвобождении цитокинов in vivo прослеживается смещенный дозозависимый эффект по сравнению с цитотоксичностью. Профили зависимости от дозы для цитотоксичности и высвобождения цитокинов Т-клетками человека также согласуются с представленным наблюдением.
Т-клеточная десенсибилизация, в которой может играть роль опосредованная DART-A положительная регуляция PD1, как оказывается, также вносит свой вклад в ограничение высвобождения цитокинов после первой инфузии DART-A. Недавние исследования показывают, что повышенная экспрессия PD-1 после индуцированной антигеном задержки Т-клеток в участках воспаления вносит свой вклад, посредством взаимодействий с PD-L1, в терминацию стоп-сигнала, таким образом, высвобождая и десенсибилизируя клетки (Honda, Т. et al. (2014) Tuning Of Antigen Sensitivity By T Cell Receptor-Dependent Negative Feedback Controls T Cell Effector Function In Inflamed Tissues, Immunity 40: 235-247; Wei F. et al. (2013) Strength Of PD-1 Signaling Differentially Affects T-Cell Effector Functions, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:E2480-E2489). Противодействие PD-1 мощности сигнала TCR не является информативным: наряду с тем, что пролиферация и продукция цитокинов оказываются наиболее чувствительными к ингибированию PD-1, воздействие на цитотоксичность является минимальным (Wei F. et al. (2013) Strength Of PD-1 Signaling Differentially Affects T-Cell Effector Functions, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:E2480E2489). Закономерно, ex vivo цитотоксический потенциал Т-клеток от обезьян, на которых воздействовали многократными инфузиями DART-A, был сопоставим с таковым у Т-клеток от ранее не подверженных экспериментам обезьян, несмотря на повышенные содержания PD-1 у первых. Кроме того, положительная регуляция PD-1 не сопровождалась экспрессией TIM3, отличительного признака истощения Тклеток, как показано для Т-клеток, подвергшихся длительной стимуляции антителами CD3 или хронических инфекций (Gebel H.M. et al. (1989) Г Cells From Patients Successfully Treated With OKT3 Do Not React With The T-Cell Receptor Antibody, Hum. Immunol. 26:123-129; Wherry E.J. (2011) T Cell Exhaustion, Nat. Immunol. 12: 492-499).
Деплеция циркулирующих CD123+ клеток у получивших лечение с помощью DART-A обезьян была быстрой и продолжалась в течение еженедельного перерыва во введении доз в схеме 4 дня введения/3 дня без введения, что согласуется с устранением клеток - мишеней. Напротив, временные колебания в количестве циркулирующих Т-клеток, вероятно, являлись результатом миграции из/в ткани и лимфоидные органы в зависимости от DART-A. Воздействие DART-A стимулирует экспансию и/или мобилизацию подвергнутых воздействию антигена Т-лимфоцитов, клеток, которые предпочтительно находятся в тканях и быстрее проявляют цитотоксическую эффекторную функцию (Mirenda V. et al. (2007) Physiologic And Aberrant Regulation Of Memory T-Cell Trafficking By The Costimulatory Molecule CD28 Blood 109:2968-2977; Marelli-Berg, F.M. et al. (2010) Memory T-Cell Trafficking: New Directions For Busy Commuters, Immunology 130:158-165).
Деплеция CD123+ нормальных клеток может предусматривать потенциальные риски. pDC и базофилы экспрессируют высокие содержания CD123 по сравнению с пониженными содержаниями в моноцитах и эозинофилах (Lopez A.F. et al. (1989) Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor To Human Eosinophils Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022-7026; Munoz, L. et al. (2001) Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies Haematologica 86:1261-1269; Masten B.J. et al. (2006) Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung J. Immunol. 177:7784-7793; Korpelainen E.I. et al. (1995) Interferon-Gamma Upregulates Interleukin-3 (IL-3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production Blood 86:176-182). Было показано, что pDC играет роль в контроле определенных вирусов в моделях инфекций на мышах или обезьянах, хотя они не оказывались критически важными для контроля иммунного ответа при гриппе (Colonna M. et al. (1997) Specificity And Function Of Immunoglobulin Superfamily NK Cell Inhibitory And Stimulatory Receptors Immunol. Rev. 155:127-133; Smit J.J. et al. (2006) Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibit Pulmonary Immunopathology And Promote Clearance Of Respiratory Syncytial Virus J. Exp. Med. 203:1153-1159). Моделях опухолей pDC могут стимулировать рост опухолей и метастазирование, тогда как деплеция pDC приводила к ингибированию опухоли (Sawant, A. et al. (2012) Depletion Of Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibits Tumor Growth And Prevents Bone Metastasis Of
- 45 034142
Breast Cancer Cells J. Immunol. 189:4258-4265). Временный, незначительный, зависимый от дозы отек лица наблюдался у некоторых обезьян, получивших лечение с помощью DART-A; тем не менее, у этих обезьян не наблюдали повышенных содержаний гистамина или в случае, когда базофилы человека лизировали путем опосредованный DART-A Т-клеточный лизис. Деплеция моноцитов может предусматривать потенциальные риски инфекции; последствие pDC, деплеция базофилов или эозинофилов у людей, таким образом, должна подвергаться мониторингу.
Коммитированные гемопоэтические предшественники, которые экспрессируют CD123, такие как общий миелоидный предшественник (CMP) (Jordan СТ. et al. (2000) The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells, Leukemia 14: 1777-1784; Rieger M.A. et al. (2012) Hematopoiesis Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4:a008250), могут быть подвергнуты нацеленному воздействию со стороны DART-A, что является возможным объяснением незначительной анемии, наблюдаемой после введения DART-A в самой высокой дозе. Вероятно, эритропоэтический ретикулоцитарный ответ действует при всех уровнях дозы DART-A; тем не менее, в отношении адекватных снижений параметров эритроцитов, животные, подвергаемые воздействию самых высоких доз DART-A (группа 6, 7-дневная инфузия), показали сниженный ретикулоцитарный ответ, указывая на возможную цитотоксическую активность на предшественников (например, СМР). Эффект был обратимым после прекращения лечения с помощью DART-A, что согласуется с репопуляцией из сохраненных HSC с низким содержанием или отсутствием CD123.
Альтернативные подходы для деплеции CD123+ клеток включают в себя специфическое в отношении CD123 моноклональное антитело второго поколения с усиленной областью Fc (Jin, L. et al. (2009) Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells Cell Stem Cell 5:31-42; Roberts, A. W. et al. (2010) A Phase I Study Of AntiCD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML J. Clin. Oncol. 28(Suppl):el3012), связанный с IL-3 дифтерийный токсин (Frankel, A. et al. (2008) Phase I Clinical Study Of Diphtheria Toxin-Interleukin 3 Fusion Protein In Patients With Acute Myeloid Leukemia And Myelodysplasia Leuk. Lymphoma 49:543-553), индуцированные цитокинами (CIK) клетки-киллеры, экспрессирующие специфические к CD123 химерные антигенные рецепторы (CAR) (Tettamanti, S. et al. (2013) Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor Br. J. Haematol. 161: 389-401) и CD123 CAR Т-клетки (Gill S. et al. (2014) Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros A. et al. (2013) T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia Blood 122: 3138-3148). CAR Тклетки проявили выраженный цитолиз лейкозных бластных клеток in vitro и противолейкозную активность в ксеногенной модели диссеминированного ОМЛ (Mardiros A. et al. (2013) Т Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia Blood 122:3138-3148). В недавнем исследовании сообщалось об абляции нормального гемопоэза у NSG мышей с пересаженными CD34+ клетками человека после переноса CD123 CAR Т-клеток (Gill S. et al. (2014) Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells Blood 123(15): 2343-2354), хотя другие авторы не наблюдали подобных эффектов in vitro или in vivo (Tettamanti S. et al. (2013) Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CDI23-Specific Chimeric Antigen Receptor Br. J. Haematol. 161:389-401; Pizzitola,
I. et al. (2014) Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62). В обсуждаемых выше экспериментах наблюдали деплецию CD123+ популяций предшественников костного мозга, но она была обратимой во время восстановительного периода; кроме того, деплеция этой небольшой популяции не приводила к изменениям в насыщенности клетками костного мозга или в соотношении эритроидных клеток к миелоидным (Е:М) при всех исследованных уровнях доз DART-A. Эти различия подчеркивают потенциальные преимущества DART-A по сравнению с клеточными видами терапии, поскольку это обеспечивает титруемую систему, которая основана на аутологических Т-клетках в отличие от сверхэффективных ex vivo трансдуцированных клеток, которые труднее контролировать. CD123 избыточно экспрессируется в некоторых гематологических злокачественных опухолях, включая в себя ОМЛ, волосатоклеточный лейкоз, новообразования из бластных плазмацитоидных дендритных клеток (ОБПДК), пре-Б-клеточный острый лимфобластный лейкоз (B-ОЛЛ) и хронический лимфоцитарный лейкоз, болезнь Ходжкина с наличием клеток Рид-Штернберга, а также при миелодиспластическом синдроме и системном мастоцитозе (Kharfan-Dabaja, M.A. et al. (2013) Diagnostic And Therapeutic Advances In Elastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm: A Focus On Hematopoietic Cell Transplantation Biol. Blood Marrow Transplant. 19:1006-1012; Florian S. et al. (2006) Detection Of Molecular Targets On The Surface Of CD34+/CD38-Stem Cells In Various My eloid Malignancies Leuk. Lymphoma 47:207-222; Munoz L. et al. (2001) Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies Haematologica 86:1261-1269; Fromm, J.R. (2011) Flow Cytometric Analysis Of CD123 Is Useful For Immunophenotyping
- 46 034142
Classical Hodgkin Lymphoma Cytometry В Clin. Cytom. 80:91-99). Прогнозируемая фармакодинамическая активность и контролируемый профиль безопасности, наблюдаемый у нечеловекообразных приматов дополнительно подтверждает клиническую применимость и эффективность DART-A в качестве иммунотерапии для указанных нарушений.
В заключение следует отметить, что DART-A представляет собой молекулу на основе антитела, вовлекающую субъединицу CD3e TCR для перенаправления Т-лимфоцитов против клеток, экспрессирующих CD123, антиген, подвергаемый положительной регуляции при некоторых гематологических злокачественных опухолях. DART-А связывается обоими антигенами как человека, так и яванского макака со сходными аффинностями и перенаправляет Т-клетки обоих видов на уничтожение CD123+ клеток. Обезьяны, которым вводили инфузии 4 или 7 дней в неделю с еженедельно повышающимися дозами DARTA, продемонстрировали деплецию циркулирующих CD123+ клеток через 72 ч после начала лечения, которая продолжалась в течение 4 недель лечения, независимо от схем введения доз. Снижение циркулирующих Т-клеток также происходило, но восстанавливалось до исходного значения до следующей инфузии у обезьян, получающих лечение по схеме, предусматривающей 4 дня введения дозы, что согласуется с опосредованной DART-A мобилизацией. Введение DART-A увеличивало циркулирующие PD1+, но не TIM-3+, Т-клетки; кроме того, ex vivo анализ Т-клеток от получивших лечение обезьян выявил неизмененных перенаправленный лизис клеток-мишеней, указывая на отсутствие истощения. Токсичность была ограничена минимальным временным высвобождением цитокинов после первой инфузии DART-A, но не после следующих введений, даже если доза повышалась, и минимальным снижением количества эритроцитов с сопутствующим снижением CD123+ предшественников костного мозга. Клиническое испытание DART-A при гематологических злокачественных опухолях является обоснованным.
Все упомянутые в настоящем описании изобретения публикации и патенты включены в настоящий документ в той же степени, как если бы было предусмотрено, что каждая отдельная публикация или патентная заявка специально и индивидуально включена посредством ссылки во всей своей полноте. Наряду с тем, что настоящее изобретение было описано с использованием конкретных его вариантом осуществления, следует понимать, что возможны дополнительные модификации, и предусмотрено, что настоящая заявка охватывает любые изменения, применения или адаптации настоящего изобретения, следуя в целом принципам настоящего изобретения и включая в себя такие отклонения от настоящего раскрытия, которые согласуются с известной или общепринятой практикой в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, изложенным выше в настоящем документе.

Claims (25)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Диатело, способное специфично связываться с эпитопом CD123 и с эпитопом CD3, причем диатело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, ковалентно связанные друг с другом, причем:
    A) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу:
    i) домен 1, содержащий (1) субдомен (1A), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VLCD3) (SEQ ID NO:21); и (2) субдомен (1B), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VHCD123) (SEQ ID NO:26), причем указанные субдомены 1A и 1B отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:29);
    ii) домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой E-спиральный домен (SEQ ID NO:34) или K-спиральный домен (SEQ ID NO:35), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:30); и
    B) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу:
    i) домен 1, содержащий (1) субдомен (1A), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD123 (VLCD123) (SEQ ID NO:25); и (2) субдомен (1B), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3) (SEQ ID NO:22), причем указанные субдомены 1A и 1B отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:29);
    ii) домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой K-спиральный домен (SEQ ID NO:35) или E-спиральный домен (SEQ ID NO:34), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:30); и указанные домены 2 указанной первой и указанной второй полипептидных цепей не представляют собой оба E-спиральные домены и не представляют собой оба K-спиральные домены; где:
    (a) указанный домен VL указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VH указанной
    - 47 034142 второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфично связываться с эпитопом CD3; и (b) указанный домен VL указанной второй полипептидной цепи и указанный домен VH указанной первой полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфично связываться с эпитопом CD123.
  2. 2. Диатело по п.1, в котором указанная первая полипептидная цепь дополнительно содержит альбуминсвязывающий домен (SEQ ID NO:36), соединенный с указанным доменом 2 посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:31).
  3. 3. Диатело по п.1, в котором указанная вторая полипептидная цепь дополнительно содержит домен 3, содержащий домен CH2 и CH3 домена Fc иммуноглобулина (SEQ ID NO:37), причем указанный домен 3 соединен с указанным доменом 1 посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:33).
  4. 4. Диатело по п.1, в котором указанная первая полипептидная цепь дополнительно содержит домен 3, содержащий домен CH2 и CH3 домена Fc иммуноглобулина (SEQ ID NO:37), причем указанный домен 3 соединен с указанным доменом 1 посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:33).
  5. 5. Диатело по п.1, в котором указанная вторая полипептидная цепь дополнительно содержит домен 3, содержащий домен CH2 и CH3 домена Fc иммуноглобулина (SEQ ID NO:37), причем указанный домен 3 соединен с указанным доменом 2 посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:32).
  6. 6. Диатело по п.1, в котором указанная первая полипептидная цепь дополнительно содержит домен 3, содержащий домены CH2 и CH3 домена Fc иммуноглобулина (SEQ ID NO:37), причем указанный домен 3 соединен с указанным доменом 2 посредством пептидного линкера (SEQ ID NO:32).
  7. 7. Диатело по любому из пп.3-6, которое дополнительно содержит третью полипептидную цепь, содержащую домены CH2 и CH3 домена Fc иммуноглобулина (SEQ ID NO: 11).
  8. 8. Диатело по любому из пп.3-7, которое дополнительно содержит цистеинсодержащий пептид (SEQ ID NO:55) с N-конца по отношению к указанным доменам CH2 и CH3 указанного домена Fc иммуноглобулина (SEQ ID NO:11).
  9. 9. Диатело по любому из пп.1-8, в котором указанный домен 2 указанной первой полипептидной цепи представляет собой K-спиральный домен (SEQ ID NO:35) и указанный домен 2 указанной второй полипептидной цепи представляет собой E-спиральный домен (SEQ ID NO:34).
  10. 10. Диатело по любому из пп.1-8, в котором указанный домен 2 указанной первой полипептидной цепи представляет собой E-спиральный домен (SEQ ID NO:34) и указанный домен 2 указанной второй полипептидной цепи представляет собой K-спиральный домен (SEQ ID NO:35).
  11. 11. Диатело по любому из предыдущих пунктов, способное перекрестно реагировать с белками CD123 и CD3 как человека, так и примата.
  12. 12. Диатело по п.1, в котором:
    A) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 и
    B) вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
  13. 13. Диатело по п.1, которое дополнительно содержит третью полипептидную цепь, причем:
    A) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15;
    B) вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 и
    C) третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:54.
  14. 14. Диатело по п.1, которое дополнительно содержит третью полипептидную цепь, причем:
    A) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1;
    B) вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17 и
    C) третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:54.
  15. 15. Применение диатела по любому из предыдущих пунктов в качестве фармацевтического средства для лечения заболевания или состояния, характеризующегося экспрессией CD123.
  16. 16. Применение диатела по любому из пп.1-14 для лечения заболевания или состояния, характеризующегося экспрессией CD123.
  17. 17. Применение по п.15 или 16, где указанное заболевание или состояние, характеризующееся экспрессией CD123, представляет собой злокачественную опухоль.
  18. 18. Применение по п.17, где указанная злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из следующего: острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), включая бластный криз ХМЛ и онкоген Абельсона, связанный с ХМЛ (транслокация Bcr-ABL), миелодиспластический синдром (МДС), острый B-лимфобластный лейкоз (B-ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), включая ХЛЛ с синдромом Рихтера или трансформацией Рихтера, волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток (ОБПДК), нехождкинские лимфомы (НХЛ), включая мантийноклеточную лимфому (МКЛ) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МЛЛ), лимфому Ходжкина, системный мастоцитоз и лимфому Беркитта.
  19. 19. Применение по п.16, где указанное заболевание или состояние, характеризующееся экспрессией CD123, представляет собой воспалительное состояние.
  20. 20. Применение по п.19, где указанное воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из системной красной волчанки (СКВ), аллергии и бронхиальной астмы, ревматоидного артрита.
    - 48 034142
  21. 21. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, характеризующегося экспрессией CD123, содержащая диатело по любому из пп.1-14 и физиологически приемлемый носитель.
  22. 22. Фармацевтическая композиция по п.21, где указанное заболевание или состояние, характеризующееся экспрессией CD123, представляет собой злокачественную опухоль.
  23. 23. Фармацевтическая композиция по п.22, где указанная злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического миелогенного лейкоза (ХМЛ), включая бластный криз ХМЛ и онкоген Абельсона, связанный с ХМЛ (транслокация Bcr-ABL), миелодиспластического синдрома (МДС), острого B-лимфобластного лейкоза (B-ОЛЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), включая ХЛЛ с синдромом Рихтера или трансформацией Рихтера, волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ), новообразования из бластных плазмацитоидных дендритных клеток (ОБПДК), нехождкинских лимфом (НХЛ), включая мантийноклеточную лимфому (МКЛ) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МЛЛ), лимфомы Ходжкина, системного мастоцитоза и лимфомы Беркитта.
  24. 24. Фармацевтическая композиция по п.21, где указанное заболевание или состояние, характеризующееся экспрессией CD123, представляет собой воспалительное состояние.
  25. 25. Фармацевтическая композиция по п.24, где указанное воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из системной красной волчанки (СКВ), аллергии и бронхиальной астмы.
    HSC LSC (IL-3Ra+ve)
EA201690443A 2013-08-23 2014-08-20 Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связываться с cd123 и cd3, и их применения EA034142B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361869510P 2013-08-23 2013-08-23
US201361907749P 2013-11-22 2013-11-22
EP13198784.4A EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2013-12-20 Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
US201461990475P 2014-05-08 2014-05-08
PCT/US2014/051790 WO2015026892A1 (en) 2013-08-23 2014-08-20 Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses therof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201690443A1 EA201690443A1 (ru) 2016-08-31
EA034142B1 true EA034142B1 (ru) 2020-01-09

Family

ID=49882875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201690443A EA034142B1 (ru) 2013-08-23 2014-08-20 Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связываться с cd123 и cd3, и их применения

Country Status (29)

Country Link
US (3) US9822181B2 (ru)
EP (3) EP2839842A1 (ru)
JP (1) JP6524087B2 (ru)
KR (1) KR102287523B1 (ru)
CN (1) CN105873607B (ru)
AP (1) AP2016009029A0 (ru)
AR (1) AR097405A1 (ru)
AU (1) AU2014308905B2 (ru)
BR (1) BR112016003417A2 (ru)
CA (1) CA2920116A1 (ru)
CR (1) CR20160108A (ru)
CY (1) CY1123940T1 (ru)
EA (1) EA034142B1 (ru)
GE (1) GEAP201914100A (ru)
IL (1) IL244237B (ru)
MX (1) MX373374B (ru)
PE (1) PE20160509A1 (ru)
PH (1) PH12016500311B1 (ru)
PL (1) PL3035965T4 (ru)
PT (1) PT3035965T (ru)
RS (1) RS61522B1 (ru)
SA (1) SA516370567B1 (ru)
SG (1) SG11201601317UA (ru)
SI (1) SI3035965T1 (ru)
SM (1) SMT202100123T1 (ru)
TN (1) TN2016000046A1 (ru)
TW (1) TWI669310B (ru)
WO (1) WO2015026892A1 (ru)
ZA (1) ZA201600653B (ru)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CN105051069B (zh) 2013-01-14 2019-12-10 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
UA116479C2 (uk) * 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
KR102497443B1 (ko) 2014-03-28 2023-02-08 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
TWI742423B (zh) * 2014-05-29 2021-10-11 美商宏觀基因股份有限公司 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
US10717778B2 (en) 2014-09-29 2020-07-21 Duke University Bispecific molecules comprising an HIV-1 envelope targeting arm
MX2017005156A (es) * 2014-11-05 2017-08-08 Hoffmann La Roche Metodo para determinacion de anticuerpos de anti-farmaco contra anticuerpo de farmaco humano o humanizado de funcion efectora suprimida.
BR112017011166A2 (pt) 2014-11-26 2018-02-27 Xencor, Inc. anticorpos heterodiméricos que se ligam a cd3 e cd38
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
MY191964A (en) * 2015-01-23 2022-07-21 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
WO2016149698A2 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof (v3 antibodies)
CA2979708A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof
US11071783B2 (en) 2015-03-19 2021-07-27 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
WO2016149695A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University HIV-1 NEUTRALIZING ANTIBODIES AND USES THEREOF (CD4bs ANTIBODIES)
US10100118B2 (en) * 2015-04-08 2018-10-16 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind CD123
MA41279A (fr) * 2015-05-08 2021-04-28 Xencor Inc Anticorps hétérodimériques se liant aux antigènes cd3 et tumoraux
ES2754427T3 (es) * 2015-05-13 2020-04-17 Ablynx Nv Polipéptidos de reclutamiento de células T basados en la reactividad de TCR alfa/beta
SG10202110887PA (en) * 2015-06-09 2021-11-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center T cell receptor-like antibody agents specific for ebv latent membrane protein 2a peptide presented by human hla
TW201709932A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
EP3842459A1 (en) * 2015-06-29 2021-06-30 ImmunoGen, Inc. Anti-cd123 antibodies and conjugates and derivatives thereof
HUE055207T2 (hu) * 2015-07-30 2021-11-29 Macrogenics Inc PD-1 és LAG-3 kötõ molekulák és eljárások azok alkalmazására
EP3337507A4 (en) * 2015-08-17 2019-04-24 MacroGenics, Inc. BIS-SPECIFIC MONOVALENTS DIABODIES WITH ABILITY TO BIND B7-H3 AND CD3 AND USES THEREOF
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
EA201891178A1 (ru) 2015-12-14 2019-01-31 Макродженикс, Инк. Биспецифичные молекулы, обладающие иммунореактивностью в отношении pd-1 и ctla-4, и способы их применения
EP3851457A1 (en) 2016-01-21 2021-07-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
EP3413045B1 (en) * 2016-02-09 2024-04-03 Japanese Foundation For Cancer Research Diagnosis marker for rare hematopoietic tumor, test method, therapeutic agent, and screening method
WO2017210443A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd123 and cd3
US20200255524A1 (en) 2016-06-07 2020-08-13 Macrogenics, Inc. Combination therapy
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
JP7022707B2 (ja) * 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
MX2018016265A (es) 2016-06-28 2019-07-04 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen al receptor 2 de somatostatina.
TWI790206B (zh) * 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11242400B2 (en) * 2016-09-21 2022-02-08 Aptevo Research And Development Llc CD123 binding proteins and related compositions and methods
PE20240950A1 (es) 2016-10-14 2024-05-06 Xencor Inc PROTEINAS DE FUSION FC HETERODIMERICAS IL 15/IL 15R(alfa)
CA3043515A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Ablynx Nv T cell recruiting polypeptides capable of binding cd123 and tcr alpha/beta
WO2018102795A2 (en) 2016-12-02 2018-06-07 University Of Southern California Synthetic immune receptors and methods of use thereof
FI3561057T3 (fi) 2016-12-22 2025-10-07 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cd3-vasta-aine ja vasta-ainetta sisältäviä molekyylejä
SG11201907753TA (en) 2017-02-24 2019-09-27 Macrogenics Inc Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof
CN108728464A (zh) * 2017-04-14 2018-11-02 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种表达抗hiv双特异性抗体的微环dna载体及其制备方法和应用
CA3057866A1 (en) * 2017-04-28 2018-11-01 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treatment with cd80 extracellular domain polypeptides
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
WO2019032827A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Massachusetts Institute Of Technology PEPTIDE ALBUMIN BINDING CONJUGATES AND METHODS THEREOF
US20210061911A1 (en) * 2017-09-07 2021-03-04 Macrogenics, Inc. Dosing Regiments of Bi-Specific CD123 x CD3 Diabodies in the Treatment of Hematologic Malignancies
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
WO2019118266A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Macrogenics Inc. Bispecific cd 16-binding molecules and their use in the treatment of disease
EP3728302A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
WO2019160904A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Macrogenics, Inc. Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
MX2020010910A (es) 2018-04-18 2021-02-09 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas dirigidas a pd-1 que contienen proteinas de fusion il-15 / il-15ra fc y dominios de union al antigeno pd-1 y usos de los mismos.
KR20210003814A (ko) 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
US20210230281A1 (en) * 2018-04-27 2021-07-29 Novartis Ag Dosing of a bispecific antibody that bind cd123 and cd3
CA3102256A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Dosing of a bispecific antibody that bind cd123 and cd3
CN110606891B (zh) * 2018-06-17 2022-12-06 上海健信生物医药科技有限公司 一种针对人cldn18.2的抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
MX2021003765A (es) 2018-10-03 2021-07-15 Xencor Inc Proteínas il-12 de fusión a fc heterodimérico.
CN113286633A (zh) * 2018-10-30 2021-08-20 宏观基因有限公司 用于治疗血液系统恶性肿瘤的双特异性CD123 x CD3双抗体
AU2020232605A1 (en) 2019-03-01 2021-10-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
CN111171155B (zh) * 2020-02-05 2021-02-19 北京智仁美博生物科技有限公司 抗cd3和cd123双特异性抗体及其用途
CA3170330A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Macrogenics, Inc. Cd137 binding molecules and uses thereof
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
US20210363252A1 (en) * 2020-05-19 2021-11-25 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising a t cell redirection therapeutic and a vla-4 adhesion pathway inhibitor
JP7773528B2 (ja) 2020-08-19 2025-11-19 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
SI4284512T1 (sl) 2021-01-28 2025-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in postopki za zdravljenje sindroma sproščanja citokinov
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
JP2024509904A (ja) 2021-03-09 2024-03-05 モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト 新規なＤＡＲＰｉｎに基づく多重特異性Ｔ細胞エンゲージャ
AU2022233791A1 (en) 2021-03-09 2023-09-28 Molecular Partners Ag Novel darpin based cd123 engagers
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
IL322545A (en) 2023-02-17 2025-10-01 Regeneron Pharma Induced NK cells responding to bispecific CD3/TAA antibodies

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100291112A1 (en) * 2007-07-10 2010-11-18 Christian Kellner Recombinant, Single-Chain, Trivalent Tri-Specific or Bi-Specific Antibody Derivatives
WO2011100786A1 (en) * 2010-02-17 2011-08-25 Csl Limited Compositions and methods for targeting type 1 interferon producing cells
WO2012021934A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Csl Limited Humanized anti-interleukin 3 receptor alpha chain antibodies
US20120189540A1 (en) * 2007-04-13 2012-07-26 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Ralpha Antibody Conjugates And Uses Thereof
WO2012162067A2 (en) * 2011-05-21 2012-11-29 Macrogenics, Inc. Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
WO2013092001A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Synimmune Gmbh Bispecific antibody molecule
US20130280220A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
WO2013173820A2 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Scott & White Healthcare Bispecific scfv immunofusion (bif)

Family Cites Families (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985A (en) 1848-12-26 Pianoforte-action
US320A (en) 1837-07-31 John dainty
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4752601A (en) 1983-08-12 1988-06-21 Immunetech Pharmaceuticals Method of blocking immune complex binding to immunoglobulin FC receptors
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5985599A (en) 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
WO1989007142A1 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Morrison Sherie L Domain-modified constant region antibodies
US5169933A (en) 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5576184A (en) 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
GB8916400D0 (en) 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
US5364930A (en) 1990-10-16 1994-11-15 Northwestern University Synthetic C1q peptide fragments
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5223408A (en) 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
AU2605592A (en) 1991-10-15 1993-04-22 Atrix Laboratories, Inc. Polymeric compositions useful as controlled release implants
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
WO1994018330A1 (en) 1993-02-10 1994-08-18 Unilever N.V. Immobilized proteins with specific binding capacities and their use in processes and products
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
WO1995004069A1 (en) 1993-07-30 1995-02-09 Affymax Technologies N.V. Biotinylation of proteins
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
US20020106370A1 (en) 1994-05-13 2002-08-08 Donald Leonard Nicholas Cardy Improvements in or relating to peptide delivery
CA2207961A1 (en) 1995-01-05 1996-07-11 Robert J. Levy Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
WO1998005787A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6025485A (en) 1997-02-14 2000-02-15 Arcaris, Inc. Methods and compositions for peptide libraries displayed on light-emitting scaffolds
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
CA2277801C (en) 1997-01-16 2002-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE19721700C1 (de) 1997-05-23 1998-11-19 Deutsches Krebsforsch Mutierter OKT3-Antikörper
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
PL199659B1 (pl) 1998-02-25 2008-10-31 Merck Patent Gmbh Białko fuzyjne przeciwciała hu-KS IL2, cząsteczka DNA kodująca białko fuzyjne przeciwciała hu-KS IL2 i sposób wytwarzania białka fuzyjnego przeciwciała hu-KS IL2
US6455263B2 (en) 1998-03-24 2002-09-24 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Small molecule library screening using FACS
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
SE9802213D0 (sv) 1998-06-18 1998-06-18 Amersham Pharm Biotech Ab A method for the removal/purification of serum albumins and means for use in the method
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7315786B2 (en) 1998-10-16 2008-01-01 Xencor Protein design automation for protein libraries
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
DE19937264A1 (de) 1999-08-06 2001-02-15 Deutsches Krebsforsch F¶v¶-Antikörper-Konstrukte
US20040038339A1 (en) 2000-03-24 2004-02-26 Peter Kufer Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
CA2444680A1 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Dyax Corp. Binding molecules for fc-region polypeptides
JP4381140B2 (ja) 2001-10-12 2009-12-09 シェーリング コーポレイション 免疫応答を調節するための二重特異性抗体の使用
DE60237704D1 (de) 2001-10-16 2010-10-28 Government Of The Us Secretary Neutralisierende antikörper gegen hiv mit breiter kreuzreaktion, die mit hilfe von env-cd4-co-rezeptorkomplexen selektiert werden
US20050142539A1 (en) 2002-01-14 2005-06-30 William Herman Targeted ligands
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1354600A1 (en) 2002-04-19 2003-10-22 Affimed Therapeutics AG Antibody combination useful for tumor therapy
AU2003233197A1 (en) 2002-04-29 2003-11-17 Genpat77 Pharmacogenetics Ag Novel antibody binding tcr and tirc7 and its use in therapy and diagnosis
EP1513554B9 (en) 2002-05-30 2011-11-09 Macrogenics, Inc. Cd16a binding proteins and use for the treatment of immune disorders
CA2490009A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Dyax Corporation Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor
US8187593B2 (en) 2002-08-14 2012-05-29 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US7425620B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Scott Koenig FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
US8044180B2 (en) 2002-08-14 2011-10-25 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8193318B2 (en) 2002-08-14 2012-06-05 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
WO2004029207A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
EP2052713A3 (en) 2003-01-13 2009-05-20 Macrogenics, Inc. Soluble FcgammaR fusion proteins and methods of use thereof
DE10303664A1 (de) 2003-01-23 2004-08-12 Nemod Immuntherapie Ag Erkennungsmoleküle zur Behandlung und Detektion von Tumoren
US20050100543A1 (en) 2003-07-01 2005-05-12 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
EP1706424B1 (en) 2004-01-12 2009-07-22 Applied Molecular Evolution, Inc. Fc region variants
KR20070004078A (ko) 2004-03-31 2007-01-05 센토코 인코포레이티드 인간 ｇｌｐ-1 모방체, 조성물, 방법 및 용도
JP5634008B2 (ja) 2004-04-06 2014-12-03 アフィボディ・アーベー 新規の使用および方法
MXPA06011796A (es) 2004-04-16 2007-05-07 Macrogenics Inc Anticuerpos especificos de fc(riib y metodos para el uso de los mismos.
MXPA06012601A (es) 2004-05-10 2007-05-10 Macrogenics Inc Anticuerpos especificos de fcy riib humanizados y metodos de uso de los mismos.
US7432419B2 (en) 2004-05-14 2008-10-07 Los Alamos National Security, Llc Compositions and methods for the treatment of Pierce's disease
KR101699142B1 (ko) 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
ES2426817T3 (es) 2004-08-04 2013-10-25 Mentrik Biotech, Llc Regiones Fc variantes
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
US20060193849A1 (en) 2005-02-25 2006-08-31 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
EP3479844B1 (en) 2005-04-15 2023-11-22 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CA2618681C (en) 2005-08-10 2015-10-27 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using same
EP1820513A1 (en) * 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
US7786270B2 (en) 2006-05-26 2010-08-31 Macrogenics, Inc. Humanized FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
ES2702087T3 (es) 2007-06-21 2019-02-27 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos
AU2009299794B2 (en) * 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
SG172254A1 (en) 2008-12-19 2011-07-28 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
CN102666874B (zh) 2009-10-07 2016-06-01 宏观基因有限公司 由于岩藻糖基化程度的改变而表现出改善的效应子功能的含Fc区的多肽及其使用方法
CA2807127C (en) * 2010-08-02 2019-02-12 Leslie S. Johnson Covalent diabodies and uses thereof
WO2012162068A2 (en) 2011-05-21 2012-11-29 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120189540A1 (en) * 2007-04-13 2012-07-26 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Ralpha Antibody Conjugates And Uses Thereof
US20100291112A1 (en) * 2007-07-10 2010-11-18 Christian Kellner Recombinant, Single-Chain, Trivalent Tri-Specific or Bi-Specific Antibody Derivatives
WO2011100786A1 (en) * 2010-02-17 2011-08-25 Csl Limited Compositions and methods for targeting type 1 interferon producing cells
WO2012021934A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Csl Limited Humanized anti-interleukin 3 receptor alpha chain antibodies
WO2012162067A2 (en) * 2011-05-21 2012-11-29 Macrogenics, Inc. Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
WO2013092001A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Synimmune Gmbh Bispecific antibody molecule
US20130280220A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
WO2013173820A2 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Scott & White Healthcare Bispecific scfv immunofusion (bif)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUO S. et al. Engineering A CD123×CD3 Bispecific scFv Immunofusion For The Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells. Protein Engineering, Design & Selection. 27June 2012, vol. 25, No. 10; pages 561-569; abstract; page 562, first column, second paragraph to page 563, first column, first paragraph; DOI:10.1093/protein/gzs040. *
WEIDLE U. et al. The Intriguing Options Of Multispecific Antibody Formats For Treatment Of Cancer. Cancer Genomics Proteomics. January to Febraury 2013, vol. 10, No. 1; pages 1-18; page 2, second column, third paragraph to page 3, first column, first paragraph; page 9, first column, first paragraph; PMID: 23382582. *
WILKINSON I. et al. High Resolution NMR-Based Model For The Structure Of A scFv-IL-1-Beta Complex: Potential For NMR As A Key Tool In Therapeutic Antibody Design And Development. J Biol Chem. 13 November 2009; vol. 284, No. 46; pages 31928-31935. DOI: 10.1074/jbc.M109.025304. *

Also Published As

Publication number Publication date
PE20160509A1 (es) 2016-05-21
MX2016002260A (es) 2016-06-06
SMT202100123T1 (it) 2021-05-07
TWI669310B (zh) 2019-08-21
US20210047426A1 (en) 2021-02-18
PL3035965T3 (pl) 2021-05-17
SA516370567B1 (ar) 2021-09-15
BR112016003417A2 (pt) 2017-12-05
US20180094072A1 (en) 2018-04-05
AP2016009029A0 (en) 2016-02-29
EP3808776A1 (en) 2021-04-21
JP2017504577A (ja) 2017-02-09
ZA201600653B (en) 2017-07-26
JP6524087B2 (ja) 2019-06-05
US9822181B2 (en) 2017-11-21
PH12016500311B1 (en) 2022-02-11
AU2014308905A1 (en) 2016-03-10
WO2015026892A1 (en) 2015-02-26
RS61522B1 (sr) 2021-03-31
AR097405A1 (es) 2016-03-09
EP2839842A1 (en) 2015-02-25
IL244237B (en) 2020-05-31
US10787521B2 (en) 2020-09-29
CA2920116A1 (en) 2015-02-26
PT3035965T (pt) 2021-03-18
IL244237A0 (en) 2016-04-21
TW201542593A (zh) 2015-11-16
PL3035965T4 (pl) 2021-08-16
TN2016000046A1 (en) 2017-07-05
EP3035965B1 (en) 2020-11-11
KR102287523B1 (ko) 2021-08-09
CN105873607A (zh) 2016-08-17
AU2014308905B2 (en) 2019-05-16
EP3035965A4 (en) 2017-03-01
CY1123940T1 (el) 2022-05-27
CR20160108A (es) 2016-07-13
GEAP201914100A (en) 2019-08-26
EP3035965A1 (en) 2016-06-29
EA201690443A1 (ru) 2016-08-31
SI3035965T1 (sl) 2021-07-30
KR20160045134A (ko) 2016-04-26
US20160200827A1 (en) 2016-07-14
PH12016500311A1 (en) 2016-05-16
SG11201601317UA (en) 2016-03-30
CN105873607B (zh) 2020-01-14
MX373374B (es) 2020-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210047426A1 (en) Bi-Specific Monovalent Diabodies That are Capable of Binding CD123 and CD3, and Uses Thereof
US20250313628A1 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
JP2016527314A (ja) ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに結合可能な二重特異性の一価のＦｃダイアボディ、ならびにその使用
ES2860973T3 (es) Diacuerpos monovalentes biespecíficos que pueden unirse a CD123 y CD3 y usos de estos
HK40051640A (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses thereof
HK1225999B (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses thereof
HK1228247B (zh) 能够结合cd123和cd3的双特异性单价双抗体及其用途
OA20146A (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding to GPA33 and CD3, and uses thereof.
NZ716914B2 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses therof
HK1228247A1 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses therof
BR112017005988B1 (pt) Diacorpo de fc monovalente biespecífico cd19 x cd3 capaz de realizar ligação específica a cd19 e a cd3, composição farmacêutica, complexo polipeptídico covalentemente associado, e polinucleotídeo
HK1241895A1 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
HK1241895B (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
EA040028B1 (ru) Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связывать cd19 и cd3, а также их применения

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM