EA004634B1 - Лечение и диагностика рака - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение направлено на использование антител или их связывающих частей, зондов, лигандов или других биологических агентов, которые либо распознают внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена, либо связываются и интернализуются с простат-специфичным антигеном. Эти биологические агенты могут быть помечены и использованы для обнаружения онкологических тканей, особенно онкологических тканей, находящихся рядом с эндотелиальными клетками сосудов или содержащих их, которые экспрессируют внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена. Меченые биологические агенты также могут быть использованы для определения нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты или их частей. Они также могут быть использованы отдельно или в связи с веществом, эффективным для удаления или умерщвления таких клеток, в качестве терапии рака простаты или других типов рака. Также раскрыты четыре клеточные линии гибридом, каждая из которых продуцирует моноклональное антитело, распознающее внеклеточные домены простат-специфичных мембранных антигенов нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты или их частей.

Description

Настоящая заявка защищает преимущества предварительной заявки на патент США 60/022,125, поданной 18 июля 1996 года, и являющейся частичным продолжением заявки на патент США с порядковым номером 08/838,682, поданной 9 апреля 1997 года, в которой заявлены преимущества предварительной заявки на патент США с порядковым номером 60/016,976, поданной 6 мая 1996 года.

Область техники

Настоящее изобретение относится к лечению и диагностике рака при помощи биологических агентов.

Предпосылки изобретения

Несмотря на улучшенные способы лечения определенных форм рака, он продолжает оставаться ведущей причиной смертности в Соединенных Штатах. Поскольку шанс на полную ремиссию рака в большинстве случаев сильно увеличивается при ранней диагностике, то является крайне желательным, чтобы врачи имели возможность определять рак до значительного развития опухоли. Однако развитие способов, которые позволяют проводить быстрое и достоверное определение многих форм рака, продолжает являться проблемой для медицинского сообщества. Одной из таких иллюстративных форм рака является рак простаты.

Рак простаты является наиболее частым типом рака у мужчин с оценкой 317 000 случаев до 1996 года в Соединенных Штатах. Это вторая причина смертности среди мужчин, умирающих от неоплазии, оцениваемая в 40 000 смертей в год. Своевременное определение и лечение необходимы для снижения смертности, вызванной раком простаты.

Определение рака простаты

Когда рак простаты дает метастазы, он отдает особое предпочтение кости и лимфатическим узлам. 8айой е! а1., Ме!аз!а!1с Ра!!етз о£ Ргоз!абс Сапсег. Согге1абои Ье!теееи 8йез Аиб ЫитЬег О£ Огдаиз 1иуо1уеб, Саисег. 54:30783084 (1984). На момент клинической диагностики до 25% пациентов имеют метастазы в костях, подтвержденные радиоизотопным сканированием. Мигрйу, О.Р., е! а1., Тйе Ыа1юиа1 8шуеу о£ Ргоз1а1е Саисег 1и Тйе Иш!еб 81а1ез Ву Тйе Атепсаи Со11еде о£ 8игдеоиз, 1. Иго1., 127:928939 (1982). Доказано, что точная клиническая оценка вовлечения узлов является затрудненной. Визуальные методы, такие как компьютерная томография (СТ) или магнитный резонанс (МВ), не дают возможности отличить вовлечения лимфатических узлов при давшем метастазы раке простаты по другому критерию, кроме размера (т.е., >1 см). Поэтому, определенно, эти визуальные способы по своей природе нечувствительны при определении заболеваний малого объема (<1 см), также как и неспецифичны при определении аденопатии большего объема. Недавними исследованиями была определена точность МВ у пациентов с клинически локализованным раком простаты. ВИкш е! а1., Сотрапзои о£ Мадиебс Везоиаисе 1тадшд Аиб ИИгазоиодгарЬу 1и 81адшд Еаг1у Ргоз1а!е Саисег, N. Еид1. 1. Меб., 323:621-626 (1990). В этом исследовании МВ подверглись 194 пациента, и у 185 из них проводили вскрытие лимфатических узлов. 23 (13%) пациента имели патологически измененные лимфатические узлы. Подозрение по МВ было только у 1 из этих 23 случаев, т. е. чувствительность составляла 4%. Сходные результаты были отмечены и при использовании СТ сканирования. Оаззег е! а1., МВ1 Аиб ИИгазоиодгарйу 1и 8!адшд Ргоз!а!е Саисег. N. Еид1. К. Меб. (Соггезроибеисе), 324 (7):49-495 (1991).

Повышение активности кислой фосфатазы в сыворотке пациентов, имеющих метастазирующую карциному простаты, было впервые описано Гутманом с соавторами (СШтам е! а1., 1. Сйи. 1иуез! 17:473 (1938). При раке простаты кислая фосфатаза простаты высвобождается из онкологической ткани в кровяное русло, приводя к тому, что общий уровень сывороточной кислой фосфатазы может быть значительно увеличен относительно нормальных количеств. С того времени были осуществлены многочисленные исследования этого фермента и его отношение к раку простаты, например, у Уат, Атег. 1. Меб. 56:604 (1974). Однако, количество сывороточной кислой фосфатазы повышено у, примерно, 65-90% пациентов, имеющих карциному простаты с метастазами в кости; у, примерно, 30% пациентов без рентгенологического доказательства метастазирования в кости; и у только, примерно, 5-10% пациентов, не имеющих клинически достоверных метастазов.

При предшествующих попытках разработать специфический тест на простатическую кислую фосфатазу исследования в этой области имели лишь ограниченный успех, так как методами, которые основаны на активности фермента или так называемом специфическом субстрате, невозможно принять во внимание другие биохимические и иммунохимические различия между многими кислыми фосфатазами, которые не имеют отношения к активности фермента простатического происхождения. В случае изоферментов, т.е. генетически обусловленных ферментов, имеющих одинаковую характерную ферментативную активность и сходную молекулярную структуру, но различающихся по аминокислотным последовательностям и/или по содержанию и, поэтому, иммунохимически различных, казалось бы невозможно по самой природе различить формы различных изоферментов просто путем выбора определенного субстрата. Поэтому неудивительно, что ни один из этих известных способов не является высокоспецифичным для прямого определения активности кислой фосфатазы простаты; например, смотрите Саисег 5:236 (1952); 1. ЬаЬ. Сйи. Меб. 82:486 (1973); Сйи. Сйет. Ас!а. 44:21 (1973); и 1. РЬуяоТ Сйет. 356:1775 (1975).

В дополнение к указанным проблемам неспецифичности, которые, оказываются присущими многим реагентам, используемым в известных аналогах для определения кислой фосфатазы простаты, имеются данные о повышении сывороточной кислой фосфатазы, связанном с другими заболеваниями, что еще более усложняет проблему получения достоверного клинического обнаружения рака простаты. Например, у Тисйтап е! а1., Ат. I. Меб. 27:959 (1959) было отмечено, что уровни сывороточной кислой фосфатазы оказывается повышенным у пациентов с заболеванием Гоше.

Из-за неизбежных сложностей в разработке специфического субстрата для кислой фосфатазы простаты некоторые исследователи разработали иммунохимические методы для определения кислой фосфатазы простаты. Однако ранее описанные иммунохимические методы обладают собственными недостатками, которые помешали их широкому распространению. Например, Шульман с соавторами (8йи1тап е! а1., 1ттипо1о§у 93:474 (1964)) описывали иммунодиффузионный тест для определения кислой фосфатазы простаты человека. Используя антисыворотку, приготовленную из антигена жидкости простаты, полученной у пациента с заболеванием простаты ректальным массажем, обнаружили отсутствие кросс-реактивной линии преципитина при использовании метода двойной диффузии против экстрактов нормальных почек, яичек, печени и легких. Однако этот способ имеет недостаток ограниченной чувствительности, даже при использовании больших количеств антигена и антисыворотки, которые могут иметь перекрестную реакцию с другими, не имеющими антигенного отношения к сыворотке, белковыми компонентами, присутствующими в простатической жидкости.

\УО 79/00475, выданный С1ш е! а1., описывает способ для определения прототипов изоферментов кислой фосфатазы простаты, связанных с раком простаты, который лишен многих вышеперечисленных недостатков. Однако практические проблемы возникают вследствие необходимости получения онкологической ткани простаты, из которой экстрагируют диагностически необходимые прототипы изоферментов кислой фосфатазы простаты, связанные с раком простаты, для приготовления антител к ним.

В последние годы были приложены значительные усилия для идентификации фермента или антигенных маркеров для различных типов злокачественных новообразований с целью развития специфических диагностических реагентов. Идеальный опухолевый маркер должен проявлять, помимо прочих характеристик, тканевую или клеточную специфичность. Предшествующие исследователи продемонстрировали наличие ткане-специфичных антигенов простаты человека.

Лечение рака простаты

Как описано у \У.ГСа1а1опа. Мападетеп! о£ Сапсег о£ Т1е Рго§1а!е, №\ν Епд1. 1. Меб., 331(15):996-]004 (1994), лечение рака простаты может быть достигнуто пристальным наблюдением, лекарственным лечением и временным облегчением боли.

Для мужчин с ожидаемой длительностью жизни менее, чем 10 лет, пристальное наблюдение является допустимым, если рак простаты начальной стадии, низкого уровня обнаружен во время частичной простатэктомии при доброкачественной гиперплазии. Такие типы рака редко прогрессируют в течение первых пяти лет после обнаружения. С другой стороны, для более молодых мужчин лекарственное лечение зачастую является более подходящим.

Если рак простаты локален и ожидаемая длительность жизни пациента составляет 10 лет или более, радикальная простатэктомия обеспечивает наилучший шанс для остановки заболевания. Исторически, препятствием этой процедуры является то, что большинство типов рака распространяется за пределами операции к тому времени, когда рак обнаружен. Однако использование теста на простат-специфичный антиген позволяет раннюю диагностику рака простаты. В результате, операция является менее интенсивной с меньшими осложнениями. Пациенты с большими, развитыми опухолями имеют меньше шансов быть удачно прооперированными радикальной простатэктомией.

После операции в случае наличия детектируемых концентраций сывороточного простатспецифичного антигена имеется индикация продолжающегося рака. Во многих случаях концентрация простат-специфичного антигена может быть снижена радиационным лечением. Однако эта концентрация часто снова повышается в течение двух лет.

Радиационная терапия также была широко распространена как альтернатива радикальной простатэктомии. Пациентами, которым обычно применяли радиационную терапию, являются пациенты более старшего возраста и менее здоровые, с развитыми, клинически более распространенными опухолями. Особенно распространенными процедурами являются внутрилучевая терапия, которая включает пространственную, конформационную терапию, при которой поле радиации создано, чтобы соответствовать объему обрабатываемой ткани; внутритканевая радиационная терапия, при которой лучи радиоактивных соединений вводят с использованием ультразвукового контроля; и комбинация внутрилучевой терапии и внутритканевой лучевой терапии.

Для лечения пациентов с локально распространенным заболеванием используют гормональную терапию до или после радикальной простатэктомии или радиационной терапии. Гормональная терапия является основной фор мой лечения мужчин с диссеминированным раком простаты. Удаление яичка снижает концентрации сывороточного тестостерона, в то время, как лечение эстрогеном является сходным по результату. Диэтилстилбестрол из эстрогена является другой используемой гормональной терапией, которая имеет недостаток, вызывая сердечно-сосудистую токсичность. Когда вводят агонисты гонадотропин-рилизинг гормона, концентрации тестостерона, в конечном счете, снижаются. Флутамид и другие нестероидные, антиандрогенные агенты блокируют связывание тестостерона с его внутриклеточными рецепторами. В результате это блокирует эффект тестостерона, увеличивая концентрации сывороточного тестостерона, и позволяет пациентам сохранять потенцию - значительная проблема после радикальной простатэктомии и радиационного лечения.

Цитотоксическая химиотерапия является крайне неэффективной при лечении рака простаты. Ее токсичность делает эту терапию неподходящей для престарелых пациентов. В дополнение, рак простаты относительно устойчив к цитотоксическим агентам.

Использование моноклональных антител в определении и лечении рака простаты

Теоретически радиоактивно меченые моноклональные антитела (тАЬз) содержат потенциал для усиления и чувствительности, и специфичности при определении рака простаты внутри лимфатических узлов и в других органах. Поскольку много тАЬз было ранее получено против антигенов, имеющих отношение к простате, ни одно из этих тАЬз не было специально получено как объект для визуализации. Несмотря на это, клинические нужды требуют оценки некоторых из этих тАЬз как возможных визуальных агентов. УШко е! а1., Яабюшадшд οί Ргоз!а!е Сатсшота \νί!1ι Ртоз1абс Аск Р1озрка!азе - 8рсс1Пс АпбЬоб1ез, Вю!ес1шо1оду ίη П1адпозбсз, 131-134 (1985); ВаЬа1ап е! а1., Яабю1ттипо1одюа1 1тадшд ок Ме!аз1а11с Ргоз1абс Сапсег \νί!1ι Ш-1пбшт-ЕаЬе1еб Мопос1опа1 АпйЬобу РАУ 276, 1. иго1., 137:439-443 (1987); Ьегоу е! а1., Яабюшшшпобе!ес!юп Ок Ьутрй Ыобе 1пуазюп 1п Рго81айс Сапсег. Т1е Изе Ок 1обше 123 (123-1)-ЕаЬе1еб Мопос1опа1 АпбРгоз!а!к Аск Р1юзрНа!азе (РАР) 227 А Е (аЬ') 2 Ап! Фобу ЕтадтеШз 1п У1уо, Сапсег, 64:1-5 (1989); Меуегз е! а1., Пеуе1ортеп1 Ок Мопос1опа1 АпбЬобу 1тадшд Ок Ме!аз!аОс Ргоз1абс Сатсшота, Т1е Ргоз!а!е, 14:209-220 (1989).

В некоторых случаях моноклональные антитела, полученные для определения и/или лечения рака простаты, распознают антитела, специфичные к злокачественным тканям простаты. Таким образом, такие антитела используются для распознания злокачественных тканей простаты (для лечения или определения) от доброкачественных тканей простаты. См. патент США № 4,970,299, выданный Вахше! е! а1., и патент США № 4,902,615, выданный Егеетап е! а1.

Другие моноклональные антитела реагируют с поверхностными антигенами на всех эпителиальных клетках простаты, являются ли они злокачественными или доброкачественными. См. патенты США № 4,446,122 и Яе 33,405, выданные С1и е! а1., патент США № 4,863,851, выданный МсЕ^ап е! а1., и патент США № 5,055,404, выданный Иеба е! а1. Однако антигены, определяемые этими моноклональными антителами, присутствуют в крови и, поэтому, конкурируют с антигенами в месте опухоли за моноклональные антитела. Это создает фоновый сигнал, что делает использование таких антител не отвечающими требованиям визуализации ш У1уо. В терапии такие антитела, будучи связанными с цитотоксичным агентом, могли бы быть опасными для других органов.

Ногозхе\\псх е! а1., Мопос1опа1 АпбЬоб1ез !о а Ыеа Апбдешс Магкег ш Ерййе11а1 Ргоз!аОс Се11з апб 8егит ок Ргоз!аОс Сапсег РаОепК Апйсапсет Яезеатсй, 7:927-936 (1987) (Нотозхе\\зсх) и патент США № 5,162,504, выданный Ногозхе\\зсх. описывают антитело, названное 7Е11, которое распознает простат-специфичный мембранный антиген (Р8МА). 1зтаей е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд ок а Сотр1етеп!агу ЭЫА Епсобшд а Ргоз!а!е-зрес|Пс МетЬгапе Апбдеп, Сапсег Яезеагсй, 53:227-230 (1993) (1зтаей) описывает клонирование и секвенирование Р8МА и демонстрирует, что Р8МА является простат-специфичным и проявляет повышенные уровни экспрессии в местах метастазов и при гормонально стабильных состояниях. Другие исследования показали, что Р8МА более высоко экспрессируется в клетках рака простаты, нежели в клетках из нормальной простаты или из простаты с доброкачественной гиперплазией. Дополнительно, Р8МА не обнаруживается в сыворотке (Тгоуег е! а1., Эе!ес!юп апб Сйатас!епха!юп ок !1е Ргоз!а!е-8рес|Пс МетЬгапе Апбдеп (Р8МА) ш Пззие Ех!гас!з апб Вобу Е1шбз, 1п!. 1. Сапсег. 62:552-558 (1995)).

Эти характеристики делают Р8МА привлекательной целью для опосредованной антителами мишени для визуализации и терапии рака простаты. Исследования по визуализации с использованием меченого индием 7Е11 показали, что антитело достаточно хорошо локализуется и на простате, и в местах метастазов. В дополнение, оказывается, 7Е11 имеет значительно лучшую чувствительность для определения повреждений по сравнению с другими доступными в настоящее время способами визуализации, такими, как СТ и МЯ изображения или сканирование костей. Вапбег, Сиггеп! 8!а!из ок Мопос1опа1 АпбЬоб1ез ког 1тадшд апб Тйетару ок Ргоз!а!е Сапсег, 8ет. 1п Опсо1оду, 21:607-612 (1994).

Однако использование 7Е11 и других известных антител к Р8МА для помощи в визуа

Ί лизации и терапии имеет некоторые недостатки. Во-первых, Ρ8ΜΆ является интегральным мембранным белком, о котором известно, что он имеет короткий внутриклеточный хвост и длинный внеклеточный домен. Биохимической характеристикой и картированием (Тгоуег с1 а1., Вюсйетюа1 С11агас1епха1юп апб Марршд о£ 111е 7Т11-С5.3 Ерйоре о£ 111е Рго51а1е-5рес|Пс МетЬгапе Апйдеп, Иго1. Опсо1., 1:29-37 (1995)) было показано, что эпитоп или антигенный сайт, с которыми 7Е11 антитело связывается, присутствует на внутриклеточной части молекулы. Поскольку молекулы антител, при нормальных обстоятельствах, не пересекают клеточную мембрану, если только они не связаны с внеклеточной частью молекулы и становятся транслоцироваными внутриклеточно, антитело 7Е11 не имеет доступа к своему антигенному сайтумишени в других здоровых живых клетках.

Следовательно, визуализация с использованием 7Е11 ограничена до определения мертвых клеток внутри опухоли. Дополнительно, терапевтическое использование антитела 7Е11 ограничено, так как эффективной целью могут быть только клетки, которые уже мертвы, или ткани, содержащие большую часть мертвых клеток.

Несмотря на то, что неудобства и проблемы в диагностике и лечении одного определенного типа рака являются предметом настоящей дискуссии, рак простаты является просто демонстрационной моделью. Диагностика и лечение других многочисленных типов рака имеют сходные проблемы.

Настоящее изобретение направлено на преодоление недостатков, известных в области антител в диагностике и лечении рака простаты и других типов рака.

Краткое изложение изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к способу удаления или умерщвления онкологических клеток. Процесс включает обеспечение биологическим агентом, который, контактируя с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена, распознает внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена. Эти биологические агенты подвергают контакту с эндотелиальными клетками сосудов около онкологических клеток при условиях, эффективных для обеспечения и связывания биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов около онкологических клеток, и умерщвления или удаления онкологических клеток. Биологический агент может быть использован единственно или может быть связан с веществом, эффективным для умерщвления или удаления онкологических клеток после связывания биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов около онкологических клеток.

В особенно предпочтительном воплощении способа удаления или умерщвления онко логических клеток в соответствии с настоящим изобретением биологический агент, контактируя с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена, связывается и интернализуется простат-специфичным мембранным антигеном таких клеток. Предпочтительными биологическими агентами для использования в способе удаления или умерщвления онкологических клеток в соответствии с настоящим изобретением являются антитела или их связывающие части, зонды или лиганды. Способы настоящего изобретения особенно полезны для умерщвления или удаления онкологических клеток почек, уротелия, толстой кишки, прямой кишки, легких и молочных желез и онкологических клеток метастатической аденокарциномы в печени.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу определения злокачественной ткани в биологической пробе. Этот способ включает обеспечение биологическим агентом, который, контактируя с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена, связывается с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена. Биологический агент связывают с меткой, эффективной для осуществления определения эндотелиальных клеток сосудов около или внутри онкологической ткани после связывания биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов около или внутри онкологической ткани. Биологическую пробу подвергают контакту с биологическим агентом, имеющим метку, при условиях, эффективных для осуществления связывания биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов около или внутри онкологической ткани в биологической пробе. Присутствие онкологической ткани в биологической пробе определяют путем обнаружения метки.

В особенно предпочтительном воплощении способа определения онкологической ткани в соответствии с настоящим изобретением биологический агент является таковым, что контактируя с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена, он связывается и интернализуется внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена. Предпочтительными биологическими агентами для использования в способе определения онкологической ткани в соответствии с настоящим изобретением являются антитела или их связывающие части, зонды или лиганды. Способ особенно полезен для определения онкологической ткани почек, уротелия, толстой кишки, прямой кишки, легких и молочных желез и онкологических клеток метастатической аденокарциномы в печени.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу удаления или умерщвления нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты. Процесс включает обеспечение био логическим агентом, который распознает внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена. Биологический агент может быть использован единственно или может быть связан с веществом, эффективным для уничтожения клеток после связывания биологического агента с клетками. Эти биологические агенты дополнительно подвергают контакту с клетками при условиях, эффективных для обеспечения и связывания биологического агента с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена, и уничтожения или удаления клеток.

В особенно предпочтительном воплощении способа удаления или умерщвления нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты в соответствии с настоящим изобретением биологический агент связывается и интернализуется простат-специфичным мембранным антигеном таких клеток. Предпочтительными биологическими агентами для использования в способе удаления или умерщвления нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты в соответствии с настоящим изобретением являются антитела или их связывающие порции, зонды или лиганды.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу определения нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты или их частей в биологической пробе. Этот способ включает обеспечение биологическим агентом, который связывается с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена. Биологический агент связывается с меткой, эффективной для осуществления определения клеток или их частей после связывания биологического агента с клетками или их частями. Биологическую пробу подвергают контакту с биологическим агентом, имеющим метку, при условиях, эффективных для осуществления связывания биологического агента с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена любых клеток или их частей в биологической пробе. Присутствие любых клеток или их частей в биологической пробе определяют путем обнаружения метки.

В особенно предпочтительном воплощении способа определения нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты в соответствии с настоящим изобретением биологический агент связывается и интернализуется простат-специфичным мембранных антигеном таких клеток. Предпочтительными биологическими агентами для использования в способе определения нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты в соответствии с настоя щим изобретением являются антитела или их связывающие части, зонды или лиганды.

Другой аспект настоящего изобретения относится к биологическому агенту, который распознает внеклеточный домен простатспецифичного мембранного антигена. В предпочтительном воплощении изолированный биологический агент связывается и интернализуется простат-специфичным мембранным антигеном. Предпочтительными изолированными биологическими агентами, которые распознают внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена, в соответствии с настоящим изобретением являются изолированные антитела или их связывающие части, зонды или лиганды. Раскрываются также клеточные линии гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела этих типов.

Биологические агенты настоящего изобретения распознают внеклеточный домен антигенов нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты. В отличие от антитела 7Е11, которое распознает эпитоп простатассоциированных антигенов, которые экспонируются внеклеточно только после лизиса клеток, биологические агенты настоящего изобретения связываются с антигенными эпитопами, которые экспонированы внеклеточно в живых клетках простаты. Используя биологические агенты настоящего изобретения, клеткамимишенями могут быть живые, нефиксированные нормальные, доброкачественные гиперпластические и злокачественные эпителиальные клетки простаты, что делает лечение и диагностику более эффективными. В предпочтительном воплощении для лечения рака простаты биологические агенты настоящего изобретения также связываются и интернализуются простатспецифичным мембранным антигеном, что позволяет терапевтически использовать внутриклеточно действующие цитотоксические агенты.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 является иммуноэлектронной микрофотографией меченого золотом моноклонального антитела 1591 на поверхности клеток БХСаР после инкубирования при 4°С.

Фиг. 2 является иммуноэлектронной микрофотографией клеток ЬИСаР, обработанных меченым золотом моноклональным антителом 1591 после 5 мин инкубирования при 37°С.

Фиг.3 является иммуноэлектронной микрофотографией клеток ЬИСаР, обработанных меченым золотом моноклональным антителом 1591 после 10 мин инкубирования при 37°С.

Фиг. 4 является иммуноэлектронной микрофотографией клеток ЬИСаР, обработанных меченым золотом моноклональным антителом 1591 после 15 мин инкубирования при 37°С.

Фиг. 5 является иммуноэлектронной микрофотографией клеток ЬИСаР, обработанных меченым золотом моноклональным антителом 1591 после 15 мин при 37°С, показывающая 1591 внутри эндосом.

Фиг. 6 обобщает стратегию секвенирования тяжелой цепи моноклонального антитела 1591.

Фиг. 7 показывает нуклеотидную последовательность тяжелой цепи моноклонального антитела 1591 (обозначенную 8ΕΟ.ΙΟ.Νο.1), нуклеотидную последовательность, соответствующей обратной некодирующей нити (обозначенную 8Ερ.ΙΩ.Νο.2). и соответственно выведенные аминокислотные последовательности (обозначенные 8Ερ.ΙΌ.Νοδ.3, 4 и 5).

Фиг. 8 является сравнением тяжелой цепи моноклонального антитела 1591 со смысловой последовательностью для мышиных тяжелых цепей, подгруппы ΙΙΆ.

Фиг. 9 обобщает стратегию секвенирования каппа легкой цепи моноклонального антитела 1591.

Фиг. 10 показывает нуклеотидные последовательности каппа легкой цепи моноклонального антитела 1591 (обозначенную 8ΕΟ.ΙΩ. Νο.9), нуклеотидную последовательность соответствующей обратной некодирующей нити (обозначенную 8ΕΟ.ΙΩ.Νο.10). и соответственно выведенные аминокислотные последовательности (обозначенную 8ΕΟ.ΙΩ.Νο5.3. 4 и 5).

Фиг. 11 является сравнением каппа легкой цепи моноклонального антитела 1591 со смысловой последовательностью для мышиных тяжелых цепей, подгруппы V.

Фиг. 12Л-12Б являются микрофотографиями (250х увеличение), показывающими иммуногистохимическую реактивность шЛЬ 1591 к вновь образованным сосудам различных карцином.

Подробное описание изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к способу удаления или умерщвления нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты. Процесс включает обеспечение биологическим агентом, таким как антитело или его связывающая часть, зонд или лиганд, которые связываются с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена (т.е., частью простат-специфичного мембранного антигена, которая является наружной) таких клеток. Биологический агент может быть использован единственно или может быть связан с веществом, способным эффективно убивать клетки после связывания биологического агента с этими клетками. Эти биологические агенты дополнительно подвергают контакту с клетками при условиях, эффективных для осуществления и связывания биологического агента с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена, и умерщвления или удаления клеток. В его предпочтительной форме, такой контакт проводят у живых млекопитающих путем введения биологического агента млекопитающему при условиях, эффективных для осуществления и связывания биологического агента с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена, и умерщвления или удаления клеток. Такое введение может быть осуществлено орально или парентерально.

В особенно предпочтительном воплощении способа удаления или умерщвления нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты в соответствии с настоящим изобретением биологический агент связывается и интернализуется простат-специфичным мембранным антигеном таких клеток. Снова биологический агент может быть использован единственно. Альтернативно, биологический агент может быть связан с веществом, эффективным для умерщвления клеток после связывания биологического агента с простат-специфичным мембранным антигеном и после интернализации биологического агента простат-специфичным мембранным антигеном.

Механизм, путем которого биологический агент представляется простат-специфичным мембранным антигеном, не является критическим для практики настоящего изобретения. Например, биологический агент может индуцировать интернализацию простат-специфичного мембранного антигена. Альтернативно, интернализация биологического агента может являться результатом обычной интернализации простат-специфичного мембранного антигена.

Описанные выше биологические агенты (т.е., биологические агенты, такие как антитело или его связывающая часть, зонд или лиганд, которые, контактируя с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена, распознают внеклеточный домен простатспецифичного мембранного антигена и, предпочтительно, интернализуются им) могут быть использованы для удаления или умерщвления онкологических клеток. В этом аспекте настоящего изобретения биологический агент может быть использован единственно или может быть связан с веществом, эффективным для умерщвления онкологических клеток после связывания биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся рядом с онкологическими. Эти биологические агенты подвергают контакту с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся рядом с онкологическими. Контактирование проводят при условиях, которые эффективны для обеспечения связывания биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся рядом с онкологическими, и, в дополнение, которые способны эффективно обеспечивать умерщвление или удаление онкологических клеток. Механизм, при помощи которого происходит умерщвление или удаление онкологических клеток, не явля ется принципиальным для практики настоящего изобретения. Например, онкологические клетки могут быть убиты или удалены напрямую биологическим агентом вследствие их близости к эндотелиальным клеткам сосудов, с которыми биологический агент связывается. Альтернативно, биологический агент может убивать, удалять или другим способом изменять свойства эндотелиальных клеток сосудов, с которыми он связался, таким образом, что кровоток по направлению к онкологическим клеткам, находящимся рядом, останавливается или иным способом снижается, обеспечивая таким образом умерщвление или удаление онкологических клеток. Таким образом, способ настоящего изобретения является особенно полезным для умерщвления или удаления эндотелиальных клеток сосудов в злокачественных тканях, как и в злокачественных клетках, контактирующих со злокачественными тканями.

В особенно предпочтительном воплощении способа удаления или умерщвления онкологических клеток в соответствии с настоящим изобретением используемый биологический агент таков, что контактируя с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена, он связывается и интернализуется внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена. Способы настоящего изобретения особенно полезны для умерщвления или удаления онкологических эпителиальных клеток простаты, как и других клеток, нежели онкологические эпителиальные клетки простаты. Примерами онкологических клеток, которые являются онкологическими не эпителиальными клетками простаты, являются злокачественные клетки почек, уротелия, толстой кишки, прямой кишки, легких и молочной железы, и злокачественные клетки метастатической аденокарциномы печени. Несмотря на то, что способ настоящего изобретения может быть использован для умерщвления или удаления любых клеток, которые экспрессируют внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена или его часть, или чье существование зависит от клеток, которые экспрессируют внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена или его часть, способ настоящего изобретения является особенно полезным для умерщвления или удаления онкологических клеток, так как эндотелиальные клетки сосудов, доставляющих кровь к злокачественным тканям (например, опухолям, объединениям онкологических клеток или другим злокачественным массам), экспрессируют внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена вне зависимости от того, какой тип рака имеет место. В контрасте, эндотелиальные клетки сосудов, доставляющих кровь к нормальным тканям, не экспрессируют внеклеточный домен простат-специфичного мембранного антигена.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу определения нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток или их частей в биологической пробе. Этот способ включает обеспечение биологическим агентом, таким, как антитело или его связывающая часть, зонд или лиганд, которые связываются с внеклеточным доменом простат-специфичного мембранного антигена таких клеток. Биологический агент связывают с меткой, способной эффективно обеспечить определение клеток или их частей (например, простат-специфичный мембранный антиген или его фрагмент, выделенный из таких нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных клеток) после связывания биологического агента с клетками или их частями. Биологическую пробу подвергают контакту с биологическим агентом, имеющим метку, при условиях, эффективных для осуществления связывания биологического агента с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена любых клеток или их частей в биологической пробе. Присутствие любых клеток или их частей в биологической пробе определяют путем обнаружения метки. В его предпочтительной форме такое контактирование проводят у живых млекопитающих и оно включает введение биологического агента млекопитающему при условиях, эффективных для осуществления связывания биологического агента с простат-специфичным мембранным антигеном или с любой из клеток, или их частей в биологической пробе. Снова такое введение может быть осуществлено орально или парентерально.

Способ настоящего изобретения может быть использован для обследования пациентов на предмет заболевания, связанного с присутствием нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток или их частей. Альтернативно он может быть использован для идентификации возврата таких заболеваний, особенно, когда заболевание локализовано в определенном биологическом материале пациента. Например, возврат простатического заболевания в простатическую ямку может встречаться после радикальной простатэктомии. Используя способ настоящего изобретения, этот возврат может быть определен путем введения млекопитающему антитела с близкодействующей радиоактивной меткой и затем путем определения метки ректально, например, при помощи трансректального детекторного зонда.

В качестве альтернативы шаг контактирования может быть осуществлен в пробе сыворотки или мочи, или других жидкостях организма, например, для определения присутствия Р8МА в жидкости организма. Когда контактирование проводят в сыворотке или пробе мочи, предпочтительно, чтобы биологический агент не распознавал других, нежели Р8МЛ, антигенов, циркулирующих в крови. Поскольку целые клетки простаты не экскретируют или секретируют Р8МЛ во внеклеточное окружение, определение Р8МЛ в сыворотке, моче или других жидкостях организма, обычно, обозначает, что клетки простаты лизированы. Таким образом, биологические агенты или способы настоящего изобретения могут быть использованы для определения эффективности протокола лечения рака простаты путем анализа уровня Р8МЛ в сыворотке, моче или других жидкостях организма.

В особенно предпочтительном воплощении способа определения нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты в соответствии с настоящим изобретением, биологический агент, такой, как антитело или его связывающая часть, зонд или лиганд, связывается и интернализуется простат-специфичным мембранным антигеном таких клеток. Снова биологический агент связывают с меткой, способной эффективно обеспечить определение клеток или их частей после связывания биологического агента и интернализации биологического агента простат-специфичным мембранным антигеном.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу определения злокачественной ткани в биологической пробе. Этот способ включает обеспечение вышеописанным биологическим агентом (например, таким биологическим агентом, как антитело или его связывающая часть, зонд или лиганд, которые, контактируя с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена, распознают внеклеточный домен простатспецифичного мембранного антигена). Биологический агент связывают с меткой, которая способна обеспечить эффективное определение эндотелиальных клеток сосудов, находящихся около или внутри онкологической ткани, после связывания биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся около или внутри онкологической ткани. Биологическую пробу затем подвергают контакту с биологическим агентом, имеющим метку. Контактирование проводят при условиях, позволяющих эффективно провести связывание биологического агента с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся около или внутри онкологической ткани, в биологической пробе. Присутствие злокачественных клеток или их частей в биологической пробе определяют путем обнаружения метки.

Вместо того, чтобы подвергать контакту с биологическим агентом целую биологическую пробу, предполагается, что может быть использована часть биологической пробы. Например, проба из тканевой биопсии может быть подвергнута контакту с биологическим агентом для определения присутствия злокачественной тка ни в пробе тканевой биопсии, также как и в большей биологической пробе, из которой она взята. Альтернативно, биологический агент может быть подвергнут контакту с пробой сыворотки или мочи для того, чтобы удостовериться, присутствуют ли в ней какие-либо эндотелиальные клетки сосудов, экспрессирующие внеклеточный домен простат-специфичного антигена. Если эндотелиальные клетки сосудов, экспрессирующие внеклеточный домен простатспецифичного антигена, обнаруживаются в сосудистой сети злокачественных тканей, но не в сосудистой сети нормальных тканей, обнаружение метки в пробе сыворотки или мочи означает присутствие злокачественной ткани в большей биологической пробе, из которой она взята (т.е., в пациенте).

В особенно предпочтительном воплощении способа определения злокачественных тканей в соответствии с настоящим изобретением используемый биологический агент таков, что контактируя с внеклеточным доменом простатспецифичного мембранного антигена, он связывается и интернализуется простат-специфичным мембранным антигеном. Способ настоящего изобретения может быть использован для определения злокачественных эпителиальных клеток простаты, как и злокачественных тканей, содержащих другие онкологические клетки, нежели онкологические эпителиальные клетки простаты. Примеры злокачественных тканей, содержащих другие злокачественные клетки, нежели злокачественные эпителиальные клетки простаты, которые могут быть определены способами настоящего изобретения, включают онкологические клетки почек, уротелия, толстой кишки, прямой кишки, легких и молочной железы, и онкологическую ткань метастатической аденокарциномы печени.

Как указано выше, биологические агенты, подходящие для либо умерщвления, удаления, либо определения злокачественных клеток и нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты, включают антитела, такие как моноклональные или поликлональные антитела. В дополнение, могут быть использованы фрагменты антител, половины антител, гибридные производные, зонды или лиганды, связанные с внеклеточным доменом простат-специфичных мембранных антигенов или их частей в нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клетках простаты. В результате, при использовании способов настоящего изобретения для умерщвления, удаления или определения нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты, биологические агенты связываются со всеми такими клетками, не только с клетками, которые зафиксированы или с клетками, чьи внутриклеточные антигенные домены другим образом экспонированы внеклеточному окружению. Следовательно, связывание биологических агентов сконцентрировано в областях, где существуют эпителиальные клетки простаты, вне зависимости от того, фиксированы или не фиксированы эти клетки, живые они или некротические. Дополнительно или альтернативно, эти биологические агенты, такие, как антитела, их связывающие части, зонды или лиганды, связываются и интернализуются простат-специфичными мембранными антигенами или их частями в нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты.

Продукция моноклональных антител может быть обеспечена методами, которые являются хорошо известными в области. В основном, процесс сначала включает получение иммунных клеток (лимфоцитов) из селезенки млекопитающего (например, мыши), которое было предварительно иммунизировано интересующим антигеном либо ίη νίνο, либо ίη νίΐτο. Лимфоциты, секретирующие антитела, дополнительно сливают с клетками миеломы (мыши) или трансформированными клетками, которые способны длительно реплицироваться в клеточной культуре, продуцируя таким образом долгоживущую клеточную линию, секретирующую иммуноглобулин. Полученные слитые клетки, или гибридомы, культивируют и анализируют полученные колонии на продукцию желаемых моноклональных антител. Колонии, продуцирующие такие антитела, клонируют и выращивают либо ίη νίνο, либо ίη νίΐτο для получения больших количеств антител. Описание теоретической основы и практической методологии слияния таких клеток изложено у Κοίιΐοτ анб Μίΐχΐοίη. №1Ц1гс 256:495 (1975), что внесено здесь в ссылки.

Лимфоциты млекопитающих иммунизируют путем иммунизации ίη νίνο животного (например, мыши) белком или полипептидом настоящего изобретения. Такие иммунизации повторяют, если необходимо, с интервалами до нескольких недель для получения достаточного титра антител. После последней иммунизации животных забивают и удаляют клетки селезенки.

Слияние с клетками миеломы млекопитающих или другими партнерами слияния, способными к длительной репликации в клеточной культуре, обеспечивается стандартными и хорошо известными методами, например, путем использования полиэтиленгликоля (РЕО) или других агентов для слияния (см. Мййсш аиб ΚοΗΙθγ, Еиг. 1. Iттиηο1. 6:511 (1976), что внесено здесь в ссылки). Эту длительноживущую клеточную линию, которая является, предпочтительно, мышиной, но также может быть получена из клеток других видов млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, крыс и человека, селектируют так, чтобы она имела дефицит в ферменте, необходимом для утилизации определенных питательных веществ, была способна к быстрому росту и имела хорошую способность к слиянию. Профессионалам в области известны многие такие клеточные линии, другие линии регулярно описывают.

Процедуры получения поликлональных антител также хорошо известны. Обычно такие антитела могут быть получены путем введения белка или полипептида настоящего изобретения подкожно новозеландским белым кроликам, у которых сначала отбирают кровь для получения пре-иммунной сыворотки. Антигены могут быть инъецированы в общем объеме 100 цл на один укол в шесть разных мест укола. Каждый инъекционный материал будет содержать синтетический поверхностный адъювант плурониковых полиолов или порошкообразный акриламидный гель, содержащие белок или полипептид после δΌδ-полиакриламидного гель-электрофореза. Дополнительно в течение двух недель после первой инъекции у кроликов забирают кровь и периодически иммунизируют тем же антигеном три раза каждые шесть недель. Пробу сыворотки дополнительно собирают 10 дней после каждой иммунизации. Поликлональные антитела затем удаляют из сыворотки аффинной хроматографией, используя соответствующий антиген для захвата антитела. В конце кроликов умерщвляют пентобарбиталом в дозе 150 мг/кг внутривенно. Эта и другие процедуры для получения поликлональных антител раскрыты в Ε.ΗατΙο^, е1 а1., еб1Югх. Ληΐίόο6ίοχ: Α Ьа^гакгу Маша1 (1988), что внесено здесь в ссылки.

В дополнение к использованию целых антител процессы настоящего изобретения включают использование связывающих частей таких антител. Такие связывающие части включают ЕаЬ фрагменты, Е(аЬ') фрагменты и Εν фрагменты. Эти фрагменты антител могут быть получены подходящими процедурами, такими, как процедуры протеолитической фрагментации, как описано у 1.Οο6ίη§, Мοηοс1οηа1 ΑηΐΦο6ίοχ: Ρτίηοίρίοχ апб Ргасбсе, рр.98-118 (КУ.Асабешю Ргсхх 1983), что внесено здесь в ссылки.

В качестве альтернативы, в процессах настоящего изобретения могут быть использованы зонды или лиганды, обнаруженные либо в природе, либо полученные синтетическими методами рекомбинантных ДНК, или другими биологическими или молекулярными методами. Подходящими зондами или лигандами являются молекулы, которые связываются с внеклеточными доменами простат-специфичных мембранных антигенов, идентифицированные моноклональными антителами настоящего изобретения. Другими подходящими зондами или лигандами являются молекулы, которые связываются и интернализуются простат-специфичными мембранными антигенами. Такими зондами или лигандами могут быть, например, бел ки, пептиды, пектины или зонды нуклеиновых кислот.

Особенно предпочтительно использовать моноклональные антитела, идентифицированные ниже в табл. 1.

Таблица 1

Название моноклонального антитела	Номер АТСС для клеточной линии гибридомы
Е99	НВ-12101
Л415	НВ-12109
Л533	НВ-12127
Л591	НВ-12126

Эти антитела могут быть использованы единственно или как компонент в смеси с другими антителами или другими биологическими агентами для лечения рака или визуализации онкологических тканей (особенно, эндотелиальных клеток сосудов в них) или эпителиальных клеток простаты с различающимися характеристиками поверхностных антигенов.

Вне зависимости от того, используются ли биологические агенты для лечения или для диагностики, они могут быть введены орально, парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, введением в нос, внутриполостными или внутрипузырными омываниями, введением в глаз, введением в артерии, введением в места поражений или путем приложения к слизистым оболочкам, таким, как оболочки носа, горла и бронхиальных труб. Они могут быть введены единственно или с фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами, и может находиться в твердой или жидкой формах, таких, как таблетки, капсулы, порошки, растворы, суспензии или эмульсии.

Формы дозировок твердого вида могут быть традиционного типа. Твердая форма может быть капсулой, такой как обычного желатинового типа, содержащей биологический агент, такой как антитело или их связывающие порции, настоящего изобретения и носитель, например, увлажнители и инертные наполнители, такие как лактоза, сахароза или кукурузный крахмал. В другом воплощении, эти соединения таблетируют с подходящей основой для таблетирования, такой как лактоза, сахароза или кукурузный крахмал, или желатин, дезинтегрирующие агенты, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или алгиниковая кислота, и увлажнитель, такой как стеариновая кислота или стеарат магния.

Биологический агент настоящего изобретения может также быть введен в инъекционной дозировке в растворе или суспензии этих материалов в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем. Такие носители включают стерильные жидкости, такие как вода или масла, с или без добавления сурфактанта и другого фармацевтически и физиологически приемлемого носителя, включая адьюванты, наполнители или стабилизаторы. Ил люстративными маслами являются нефтяные, животные, растительные или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло или минеральное масло. В основном, предпочтительными жидкими носителями, особенно для инъекционных растворов, являются вода, раствор хлорида натрия, водная Όглюкоза и соответствующий раствор сахара, и гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Для использования в качестве аэрозолей биологический агент настоящего изобретения в растворе или суспензии может быть упакован в аэрозольный контейнер под давлением совместно с подходящими пропеллентами, например, гидроуглеродными пропеллентами, такими, как пропан, бутан или изобутан с подходящими адьювантами. Материалы настоящего изобретения также могут быть введены в форме без давления, такой, как распылитель или аэрозольный ингалятор.

Биологические агенты могут быть использованы для обнаружения онкологических тканей (особенно, в эндотелиальных клетках их сосудов) и нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты ίη νίνο. Это достигается путем пометки биологического агента, введения меченого биологического агента млекопитающему и дополнительно визуализацией млекопитающего.

Примерами меток, полезных для диагностической визуализации в соответствии с настоящим изобретением являются радиометки, как ¹³¹Ι, ¹¹¹Ιη, ¹²³1, ⁹⁹тТс, ³²Р, ¹²⁵1, ³Н, ¹⁴С и ¹⁸⁸ВЙ, флюоресцентные метки, как флуоресцеин и родамин, активные метки для ядерного магнитного резонанса, изотопы позитронной эмиссии, определяемые сканером позитрон-эмиссионной томографии (РЕТ), хемолюминесцеры, как люциферин, и ферментативные маркеры, как пероксидаза или фосфатаза. Также могут быть радиоизотопные близкодействующие источники излучения, такие, как изотопы, определяемые короткодистанционными детекторными зондами, такими, как трансректальный зонд. Эти изотопы и трансректальные детекторные зонды, будучи использованными в комбинации, являются особенно полезными для определения возвратов простатической ямки и заболеваний узлов таза. Биологический агент может быть помечен такими реагентами с использованием методов, известных в области. Например, см. \Уепке1 апб Меагек, К.абю1ттипо1тадшд апб РаФо1ттипо1йсгару. Е1кеν^е^, Ыете Уогк (1983), что внесено здесь в ссылки, на предмет методик, относящихся к радиомечению антител. Смотрите также Э.Со1с11ег е! а1., Ике о£ Мопос1опа1 Ап1|ЬоФек ак РаФорйагтасеи11са1к £от 111е Босайха11о п оГ Нитап Сатсшота Хеподгайк ш АШутю М1се, Ме1й. Епхутой 121: 802-816 (1986), что внесено здесь в ссылки.

Радиомеченый биологический агент этого изобретения может быть использован для диагностических тестов ίη νίίτο. Специфическая активность меченого биологического агента, такого как меченое антитело, его связывающая часть, зонд или лиганд, зависит от полужизни, изотопной чистоты радиоактивной метки и того, каким образом метку вносят в биологический агент. В табл. 2 перечислены некоторые широко используемые изотопы, их специфические активности и полужизни. В иммунологических тестах, чем выше специфическая активность, обычно, тем лучше чувствительность.

Таблица 2

Изотоп	Удельная активность чистого изотопа (Ки/моль)	Период полураспада
14С	6.25 х 101	5720 лет
3Н	2.01 х 104	12.5 лет
358	1.50х 106	87 дней
125ι	2.18 х 106	60 дней
32р	3.16 х 106	14.3 дня
131Ι	1.62 х 107	8.1 дня

Процедуры пометки биологических агентов радиоактивными изотопами, перечисленными в табл. 2, являются широко известными в области. Процедуры пометки тритием описаны в патенте США № 4,302,438, что внесено здесь в ссылки. Процедуры йодирования, пометки тритием и пометки Ά. специально адаптированные для мышиных моноклональных антител, описаны у Ообтд, 1.А. (кирга, рр 124-126), и ссылка, процитированная там, что внесено здесь в ссылки. Другие процедуры йодирования биологических агентов, таких, как антитела, их связывающие части, зонды или лиганды, описаны у Нип1ет апб Сгееиетооб, №11иге 144:945 (1962), Эат1б е1 а1., Вюсйетщйу 13:1014-1021 (1974) и в Патентах США Νοκ. 3,867,517 и 4,376,110, что внесено здесь в ссылки. Элементы для радиоактивного мечения, которые полезны для визуализации, включают ¹²³Ι, ¹³¹Ι, 'ίη и ^99тТс, например. Процедуры йодирования биологических агентов описаны у Стееиетооб, Р. е1 а1., Вюсйет. 1. 89:114-123 (1963); Матсйа1ошк, 1. ВюсйетЭ. 113:299-305 (1969); и Моткоп, М. е1 а1., 1ттипосйетМгу. 289-297 (1971), что внесено здесь в ссылки. Процедуры ^99тТс-мечения описаны у Рйобек, В. е1 а1. ίη ВитсЫе1, 8. е1 а1. (ебк), Титог 1тадтд: Тйе Кабю1ттипосйет1са1 Эе1ес1юп о£ Сапсег. №\ν Уогк: Маккоп 111-123 (1982) и ссылки, процитированные там, что внесено здесь в ссылки. Процедуры, подходящие для ^1П1п-мечения биологических агентов, описаны у Нпа1отасй, Ό.Ι. е1 а1., 1. 1тти1. МеШобк. 65:147157 (1983), Нпа1о^1сй, Ό. е1 а1., 1. АррБеб Ваб1айоп. 35:554-557 (1984) и Виск1еу, КС. е1 а1., Р.Е.В.8. 166:202-204 (1984), что внесено здесь в ссылки.

В случае, если биологический агент является радиомеченым, биологический агент вводят пациенту с локализацией в опухоли, несущей антиген, с которым биологический агент реагирует, и определяют или визуализируют 1п νίνΌ, используя известные методы, такие, как радиоядерное сканирование с использованием, например, гамма-камеры или эмиссионной томографии. См., например, А.Р.Вгаб\\'е11 е1 а1., Оете1ортеп1 т АпбЬобу 1тадшд, Мопос1опа1 АпбЬоб1ек £ог Сапсег Эе1ес1юп апб Тйетару.

В.\У.Ва1б\ут е1 а1., (ебк.), рр.65-85 (Асабетю Ргекк 1985), что внесено здесь в ссылки. Альтернативно, может быть использован позитронный эмиссионный трансаксиальный томографический сканнер, как таковой, созданный Ре1 VI, находящийся в Вгоокйатеп №11юпа1 ЬаЬога1огу, если используют радиометку, высвобождающую позитроны (например, С, Р, О и Ν).

Биологические агенты, меченые флуорофорами или хромофорами, могут быть получены из стандартных долей, известных в области. Поскольку антитела и другие белки адсорбируют свет, имеющий длину волны до, примерно, 310 нм, флуоресцентные доли должны быть выбраны так, чтобы они имели основную адсорбцию при длинах волн выше 319 нм и, предпочтительно, выше 400 нм. Разнообразие подходящих флуоресцентных и хромофорных веществ описано у 8йует, 8с1епсе. 162:526 (1968) и Вгапб, Ь. е1 а1., Аппиа1 Рет1е\\· о£ Вюсйетщйу. 41:843-868 (1972), что внесено здесь в ссылки. Биологические агенты могут быть помечены группами флуоресцентных хромофоров традиционными методами, такими, как раскрытые в патентах США №№. 3,940,475, 4,289,747 и 4,376,110, что внесено здесь в ссылки.

Одной из групп флюоресцентных веществ, имеющих набор желаемых свойств, описанных выше, являются ксантиновые красители, которые включают флуоресцеины, полученные из 3,6-дигидрокси-9-фенилксантгидрола, и резамины и родамины, полученные из 3,6-диамино-9фенилксантгидрола и лиззаним родамина В. Родаминовые и флуоресцеиновые производные 9-о-карбоксифенилксантгидрола имеют 9-окарбоксифенильную группу. Флуоресцеиновые соединения, имеющие реактивные спаренные группы, такие как аминогруппы, и изотиоцианатные группы, такие как флуоресцеин изотиоцианаты и флюорескамины, широко доступны. Другой группой флуоресцентных соединений являются нафтиламины, имеющие амино группу в позициях α или β.

Биологические агенты могут быть помечены флуорохромами или хромофорами процедурами, описанными у бобшд, 1. (кирга, рр 208249). Биологические агенты могут быть помечены индикаторными группами, содержащими ЯМР-активный атом ¹⁹Р или множеством таких атомов, так как (ί) практически все природно богатые флуорином атомы являются изотопами ¹⁹Р и, таким образом, практически все флуоринсодержащие соединения являются ЯМРактивными; (ίί) многие химически активные полифлуоринированные соединения, такие, как трифторуксусный ангидрид, являются коммерчески доступными по относительно низкой стоимости, и (ίίί) было обнаружено, что многие флуоринированные соединения являются с медицинской точки зрения приемлемыми для использования у человека, такие, как перфлуоринированные полиэфиры, используемые для переноса кислорода в качестве заменителя гемоглобина. После прошествия определенного времени для инкубации проводят ЯМР определение всего организма, используя прибор, такой, как один из описанных у РуксИ. Бшепййс Атепсап. 246:78-88 (1982), что внесено здесь в ссылки, для локализации и визуализации злокачественных тканей (особенно, эндотелиальных клеток сосудов внутри них) и эпителиальных клеток простаты.

В случаях, когда важно отделить районы, содержащие живые и мертвые эпителиальные клетки простаты, или разделить живые и мертвые эпителиальные клетки простаты, могут быть одновременно введены антитела настоящего изобретения (или другие биологические агенты настоящего изобретения), меченые как описано выше, совместно с антителом или другим биологическим агентом, которые распознают только живые или только мертвые эпителиальные клетки простаты, меченые меткой, которая может быть отделена от метки, использованной для пометки нужного антитела. Путем анализа концентрации двух меток в различных местах или во времени могут быть оценены вариации пространственной и временной концентраций живых и мертвых нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты. В особенности, этот способ может быть осуществлен, используя меченые антитела настоящего изобретения, которые распознают и живые, и мертвые эпителиальные клетки простаты, и меченые 7Е11 антитела, которые распознают только мертвые эпителиальные клетки простаты.

Биологические агенты могут также быть использованы для умерщвления или удаления онкологических клеток и нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты ίη νίνο. Это включает использование биологических агентов единственно или с цитотоксическим лекарством, с которым связаны биологические агенты настоящего изобретения (например, биологические агенты, распознающие нормальные, доброкачественные гиперпластические и злокачественные эпителиальные клетки простаты). Это включает введение биологических агентов, связанных с цитотоксическим лекарством, млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении. В случае нормальных, доброкачественных гиперпластических и злокачественных эпителиальных клеток простаты, любые из этих клеток, с которыми биологические агенты связаны, уничтожаются, т.к. биологические агенты распознают эпителиальные клетки простаты. Несмотря на то, что такое введение может разрушить нормальные эпителиальные клетки простаты, это не является проблемой, так как простата не является необходимостью для жизни или выживания. Хотя простата напрямую не относится к фертильности, это не является практическим соображением для пациентов, получающим лечение по настоящему изобретению. В случае онкологических тканей, поскольку биологические агенты распознают эндотелиальные клетки сосудов, которые находятся рядом с онкологическими клетками, связывание комплекса биологический агент/цитотоксическое лекарство с этими эндотелиальными клетками сосудов разрушает их, таким образом устраняя приток крови к соседним онкологическим клеткам и, таким образом, убивая или удаляя эти онкологические клетки. Альтернативно, биологические агенты, вследствие их связывания с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся рядом с онкологическими клетками, локализованы рядом с онкологическими клетками. Таким образом, путем использования подходящих биологических агентов (включая таковые, содержащие вещества, эффективные для умерщвления клеток, не беспорядочно, но только на коротком расстоянии), клетки в онкологических тканях (включая злокачественные клетки) могут быть селективно убиты или удалены.

Биологические агенты настоящего изобретения могут быть использованы для доставки разнообразных цитотоксических лекарств, включая терапевтические лекарства, соединения, испускающие излучение, молекулы растительного, грибкового или бактериального происхождения, биологические белки и их смеси. Цитотоксические лекарства могут быть внутриклеточно действующими цитотоксическими лекарствами, такими, как радиоизотопные близкодействующие источники излучения, включая, например, α-излучатели высокой энергии.

Ферментативно активные токсины и их фрагменты проиллюстрированы А фрагментом дифтерийного токсина, несвязывающими активными фрагментами дифтерийного токсина, экзотоксином А (из Р8еиботопа8 аегидшоза), А цепью рицина, А цепью абрина, А цепью модеццина, α-сакрином, определенными белками А1еигйе8 Γοτάίί, определенными белками Ц1апΙΐιίη, белками Рйу1о1асса атепсапа (РАР, РАР11 и РАР-8), ингибитором МогоФса сйагапйа, курцином, кротином, ингибитором 8аропапа ойгста118, гелонином, митогиллином, рестриктоцином, феномицином и эномицином, например. Процедуры для получения ферментативно активных полипептидов иммунотоксинов описаны в XV О 84/03508 и νθ 85/03508, что внесено здесь в ссылки. Некоторые цитотоксические доли произведены из адриамицина, хлорамбуцила, дау номицина, метотрексата, неокарциостатина и платины, например.

Процедуры для конъюгирования биологических агентов с цитотоксическими агентами были описаны ранее. Процедуры для конъюгирования хлорамбуцила с антителами описаны у Иескпег, I., Еигореап 1оигпа1 о£ Сапсег. 9:741-745 (1973); Скоке, Т. е! а1., ВпОкк Меб1са1 1оигпа1. 3:495-499 (1972); и З/екегке, М., е! а1., Ыеор1акта. 19:211-215 (1972), что внесено здесь в ссылки. Процедуры для конъюгирования дауномицина и адриамицина с антителами описаны у ΗιιπνίΙζ. Е. е! а1., Сапсег Векеагск, 35:11751181 (1975) и Агпоп, К. е! а1., Сапсег Зигуеук. 1:429-449 (1982), что внесено здесь в ссылки. Процедуры получения конъюгатов антителорицин описаны в Патенте США Ыо.4,414,148 и у Оката, Т., е! а1., Сапсег Зигуеук, 1:373-388 (1982) и в ссылках, процитированных там, что внесено здесь в ссылки. Процедуры связывания также описаны в ЕР 86309516.2, что внесено здесь в ссылки.

В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения, которое особенно хорошо подходит для умерщвления или удаления нормальных, доброкачественных гиперпластических и онкологических эпителиальных клеток простаты, первый биологический агент конъюгируют с пролекарством, которое активируется только в непосредственной близи с активатором пролекарства. Активатор пролекарства конъюгируют со вторым биологическим агентом в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, таким, который связывается с неконкурентным сайтом на молекуле простатспецифического мембранного антигена. Связываются ли два биологических агента с конкурентным или неконкурентным сайтами связывания может быть определено традиционными пробами связывания. Например, моноклональные антитела 1591, 1533 и Е99 связываются с конкурентными сайтами связывания на молекуле простат-специфического мембранного антигена. Моноклональное антитело 1415, с другой стороны, связывается с сайтом связывания, который является неконкурентным относительно сайта, с которым 1591, 1533 и Е99 связываются. Так, например, первый биологический агент может быть одним из 1591, 1533 и Е99, и второй биологический агент может быть 1415. Альтернативно, первый биологический агент может быть 1415 и второй биологический агент может быть одним из 1591, 1533 и Е99. Пары лекарство-пролекарство, подходящие для использования в практике настоящего изобретения, описаны у В1аке1у е! а1., ΖΌ2767, ап 1тргоуеб Зук!ет £ог Ап11Ьобу-б1гес!еб Епζуте Ргобгид Ткегару Тка! Кекикк ш Титог Ведгеккюпк т Со1огес!а1 Титог Хеподгайк, Сапсег Кекеагск, 56:32873292 (1996), что внесено здесь в ссылки.

Альтернативно, биологический агент может быть связан с высокоэнергичными излу чающими эмиттерами, например, радиоизотопами, как ¹³¹1, γ-эмиттер, которые, будучи локализованы в месте опухоли, приводят к умерщвлению в диаметре в несколько клеток. См., например, З.Е.Огбег, Апа1ук1к, Кеки1!к, апб Еи!иге Ргокресйуе о£ !ке Ткегареийс Ике о£ Вабю1аЬе1еб АпйЬобу 1п Сапсег Ткегару, Мопос1опа1 АпкЬоб1ек £ог Сапсег Пе!есйоп апб Ткегару, К.XV. Ва1б\\'к1 е! а1. (ебк.), рр 303-316 (Асабетю Ргекк 1985), что внесено здесь в ссылки. Другие подходящие радиоизотопы включают α-эмиттеры, такие, как В1, В1 и А!, и β-эмиттеры, такие, как ¹⁸⁶Ке и ⁹⁰Υ. Ожидается, что радиотерапия будет особенно эффективной, поскольку эпителиальные клетки простаты и эндотелиальные клетки сосудов внутри опухолей являются относительно радиочувствительными.

Если биологические агенты используются единственно для умерщвления или удаления онкологических клеток или эпителиальных клеток простаты, такое умерщвление или удаление может быть выполнено путем инициации эндогенных иммунных функций хозяина, как опосредованная комплементом или антителозависимая клеточная цитотоксичность.

Биологический агент настоящего изобретения может быть использован и продаваться вместе с оборудованием, таким, как набор для определения определенной метки.

Биологические агенты настоящего изобретения могут быть использованы вместе с другими типами терапевтического лечения. Такие другие типы лечения включают хирургию, излучение, криохирургию, термотерапию, гормональную терапию, химиотерапию, вакцины и другие иимунотерапии.

Также настоящее изобретение охватывает способ умерщвления или удаления, который включает использование биологических агентов для профилактики. Например, эти материалы могут быть использованы для предотвращения или задержки развития или прогрессирования рака простаты или других типов рака.

Использование терапевтических способов настоящего изобретения для лечения рака простаты или других типов рака имеет набор преимуществ. Поскольку биологические агенты, в соответствии с настоящим изобретением, имеют в качестве мишени только онкологические клетки (такие, как клетки злокачественных тканей, содержащие эндотелиальные клетки сосудов) и эпителиальные клетки сосудов, другая ткань остается нетронутой. В результате, лечение такими биологическими агентами является более безопасным, особенно для пожилых пациентов. Ожидается, что лечение в соответствии с настоящим изобретением будет особенно эффективным, поскольку оно направляет высокие уровни биологических агентов, таких, как антитела или их связывающие части, зонды или лиганды, к костному мозгу и лимфатическим со судам, где преимущественно доминируют метастазы рака простаты и метастазы многих других типов рака. Более того, способы настоящего изобретения являются особенно хорошо подходящими для лечения рака простаты, размер опухоли при раке простаты имеет тенденцию к небольшому размеру и, поэтому легко разрушается цитотоксическими агентами. Лечение в соответствии с настоящим изобретением может быть эффективно прослежено по клиническим параметрам, таким, как, в случае рака простаты, сывороточный простат-специфичный антиген и/или по патологическим характеристикам рака пациента, включая стадию, шкалу Глисона (С1еакои), экстракапсулярную, семянную, везикулярную или периневральную инвазии, положительные края, вовлеченные лимфатические узлы, и т.д. Альтернативно, эти параметры могут быть использованы для определения, когда такое лечение должно быть использовано.

Поскольку биологические агенты настоящего изобретения связываются с живыми клетками простаты, терапевтические способы лечения рака простаты с использованием этих биологических агентов являются гораздо более эффективными, чем те, которые нацелены на лизированные клетки простаты. По этим же причинам способы диагностики и визуализации, которые определяют локализацию живых нормальных, доброкачественных гиперпластических или злокачественных эпителиальных клеток простаты (как и эндотелиальных клеток сосудов внутри опухолей) являются гораздо более продвинутыми из-за использования биологических агентов настоящего изобретения. В дополнение, способность разделять между живыми и мертвыми клетками простаты может быть преимущественной, особенно, для мониторинга эффективности определенного протокола лечения.

Гибридомы Е99, 6415. 1533 и 1591 были депонированы, соответствуя и удовлетворяя требованиям Будапештского договора по Международному Соответствию Депонирования Микроорганизмов для целей процедуры патентования Американской Коллекции Клеточных Культур (А.Т.С.С.) по адресу 12301, Рагк1а^и Блуе, КоскуШе, Магу1аиб 20852. Гибридома Е99 была депонирована 2 мая 1996 года и получила указательный номер А.Т.С.С. НВ-12101. Гибридома 1415 была депонирована 30 мая 1996 года и получила указательный номер А.Т.С.С. НВ-12109. Гибридомы 1533 и 1591 были депонированы 6 июня 1996 года и получили указательные номера А.Т.С.С. НВ-12127 и НВ-12126, соответственно.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Ткани человека.

Свежие образцы доброкачественных и злокачественных тканей были получены из от деления патологии Медицинского Центра Корнельского Университета Нью-Йорка (Ыете Уогк НокрИа1 Соте11 ишуегкбу Меб1са1 Сеи1ег (ΝΥΗ-СиМС).

Пример 2. Культура ткани.

Культуральные линии клеток рака человека были получены из Лаборатории урологической онкологии ΝΎΗ-СИМС. Линии клеток рака простаты РС-3 (М1скеу, Б.Б. е! а1., Скагас(ел/абои о! А Нитап Ргок1а!е Абеиосагсшота Се11 Ьше (Би145) Ак А Моио1ауег СиНиге Аиб Ак А 8о11б Титог 1и А1йут1с М1се, Ргод. СИи. Бю1. Кек.. 37:67-84 (1980), что внесено здесь в ссылки, Би-145 (М1скеу, Б.Б., е! а1., С.’11агас1елхабои о! А Нитаи Ргок1а!е Абеиосагсшота Се11 Ьше (Όυ145) Ак А Моио1ауег СиНиге Аиб Ак А 8о11б Титог 1и А1йут1с М1се, Ргод. С1ш. Бю1. Кек.. 37:67-84 (1980), что внесено здесь в ссылки, и ЕЖ'.’аР (Ногокхетасх, 1.8., е! а1., 'ЪЖ.’аР Мобе1 Θί Нитаи Ргок!абс Сагсшота, Саисег Кек.. 43:1809-1818 (1983), что внесено здесь в ссылки) были получены из Атепсаи Туре Си 11 иге СоИесбои (КоскуШе, МБ.). Сначала гибридомы клонировали в среде КРМ1-1640, с добавками 10% ЕС8, 0,1 мМ неосновных аминокислот, 2 мМ Ь-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 ид/мл стрептомицина и среды НАТ (С1ВСО, Сгаиб 1к1аиб, ΝΥ). Субклоны культивировали в той же среде без аминоптерина.

Пример 3. Получение мышиных моноклональных антител.

Мыши ВАЕВ/с женского пола были иммунизированы внутриперитонеально ^NСаР (6 х 10⁶ клеток) три раза с интервалами в 2 недели. Последняя внутрибрюшинная повторная иммунизация была осуществлена с использованием свежих эпителиальных клеток простаты, которые были выращены ш У11го. Три дня спустя клетки селезенки сливали с мышиными клетками миеломы 8Р-2, используя стандартные методики (иеба, К. е! а1., Се11 8шГасе Аибдеик О! Нитаи Кеиа1 Саисег Бейиеб Ву Мойке Моиос1оиа1 АШ1Ьоб1ек: Шеибйсабои О! Т1ккие-8ресШс К1биеу С1усорго!ешк, Ргос. №Ш. Асаб. 8с1. и8А. 78: 5122-5126 (1981), что внесено здесь в ссылки). Супернатанты полученных клонов были проанализированы методом розеток и пробами цитотоксичности комплемента против живых ^NСаР. Клоны, которые были позитивны по этим анализам, были проанализированы иммунохимически против нормальных почек, толстой кишки и простаты. Клоны, которые были ^NСар⁺/Nт1К^б^-/толстая кишка^-простата⁺ селектировали и переклонировали 3 раза ограниченным разведением. Класс гемоглобина культурированного супернатанта из каждого клона определяли иммунодиффузией, используя специфичную кроличью антисыворотку (Са1Ыосйет, 8аи Б1едо, СА). тАЬк очищали, используя набор МАР8-11 (В1о-Каб, Шсйтоиб, СА).

Пример 4. Биотинилирование тАЬк.

Очищенные тАЬк диализовали в 0,1М ЫаНСОз в течение 2 ч. Один мл тАЬ в концентрации 1 мг/мл смешивали с 0,1 мл биотинамидокапроат Ν-гидроксисукцинамидного эфира (81дта) в диметилсульфоксиде (1 мг/мл) и перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Несвязанный биотин удаляли диализом против физиологического раствора, забуференного фосфатом (РВ8).

Пример 5. Иммуногистохимическое окрашивание тканей простаты.

Замороженные срезы тканей простаты помещали внутрь колец крышек плат Ра1соп 3034 (Вес!оп-Э1скеп8оп, Ыпсо1п Рагк, N1), предварительно покрытых 0,45% раствором желатина, как описано у МагиысЬ, М.Р., А Вар|б Ме!1об Рог Ргосекктд Уегу Багде МипЬегк ОГ Т1ккие Зесбопк Рог 1ттипоЫ51осНет1са1 НуЬпбота 8сгеешпд, 1. 1ттипо1. Ме!1обк. 111:143-145 (1988), что внесено здесь в ссылки. Платы хранили при -80°С. Замороженные срезы фиксировали 2% параформальдегидом в РВ8 в течение 10 минут при комнатной температуре и, после промывания с РВ8, блокировали активность эндогенной пероксидазы обработкой 0,3% перекисью водорода в РВ8 в течение 10 мин при комнатной температуре. После инкубирования срезов с 2% В8А в РВ8 в течение 20 мин добавляли тАЬк на 60 мин при комнатной температуре. Препараты интенсивно промывали РВ8 и инкубировали с кроличьим анти-мышиным 1д, конъюгированным с пероксидазой (ΌΛΚΟ Согр., 8ап1а ВагЬага, СА), разведенным в пропорции 1:100 в 10% нормальной человеческой сыворотке в РВ8, в течение 60 мин при комнатной температуре. После реакции с диаминобензидином проводили контрастирующее окрашивание срезов с гематоксилином.

Пример 6. Серологический анализ.

Гемоадсорбционный анализ в смеси с анти-мышиным иммуноглобулином проводили, как указано у Иеба, В., е! а1., Се11 8игГасе Ап!1депк ОГ Нитап Вепа1 Сапсег ЭеПпеб Ву Мойке Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: 1бепбПса1юп ОГ Т1ккие8рес|Пс К1бпеу С1усорго!етк, Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А. 78:5122-5126 (1981), что внесено здесь в ссылки. Для получения клеток-индикаторов анти-мышиный 1д (ПАКО Согр.) конъюгировали с человеческим ВВС типа 0, используя 0,01% хлорид хрома. Серологические исследования проводили на клетках, предварительно культивированных на планшетах Терасаки (Мтс, Эептагк). Антитела инкубировали с клеткамимишенями при комнатной температуре в течение 1 ч. Клетки-мишени затем промывали и добавляли клетки-индикаторы на 1 ч.

Пример 7. Иммунопреципитация.

Клетки ^NСаР (2 х 10⁷) биотинилировали с биотином-ΝΗδδ (в конечной концентрации 5 мМ) в течение 30 мин на льду. После промывания биотинилированные клетки снова суспендировали в 1 мл лизирующего буфера (20 мМ трис/НС1 рН 8.0, 1 мМ БЭТА, 1 мМ РМ8Р, 1% тритон Х-100) в течение 30 мин на льду. Суспензию центрифугировали при 1500 д х 100 мин при 4°С, и супернатант центрифугировали при 12,000 грт х 15 мин при 4°С. Полученный лизат предварительно абсорбировали с пансорбином, покрытым кроличьим или козлиным антимышиным 1дС, в течение 1 ч при 4°С. Предварительно адсорбированный лизат инкубировали с тАЬ в течение ночи при 4°С. На 2 ч при 4°С добавляли агарозные шарики, покрытые кроличьим или козлиным анти-мышиным 1дС, и затем промывали. Шарики снова суспендировали в трис-основании/№С1, добавляли к буферу для проб с 2-меркаптоэтанолом и кипятили в течение 5 мин. После центрифугирования супернатант наносили на 12% гель для δΌδ-РАСЕ (ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле). Гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую блокировали и окрашивали со стрептавидин-пероксидазой. Мембрану проявляли с диаминобензидином (ПАВ).

Следующая иммунопреципитация была сходной, за исключением того, что лизат сначала предварительно очищали с одними тАЬ в течение ночи при 4°С. Дополнительно использовали вторые тАЬ для иммунопреципитации предварительно очищенного лизата.

Анализировали приблизительно 2000 клонов, из которых были отобраны четыре клона, как описано в примере 3, выше. После субклонирования были проанализированы супернатанты из 4 гибридом, Е99, 6415, 1533 и 1591 путем иммунофлуоресценции против живых (т.е., нефиксированных) БЖ'.'аР, иммунопреципитации и последующей иммунопреципитации для подтверждения реактивности к Р8МА.

Иммунофлуоресцентное исследование с использованием Б-Ν СаР клеток-мишеней (впервые описанных у Ного8/е^1с/, что внесено здесь в ссылки, для получения антител 7Е11 и прототипной линии клеток для экспрессии Р8МА) показывает, что антитела Е99 связываются и оставляют живые клетки Б-ΝСаР иммунофлуоресцентными. Это отличается от антител 7Е11, которые, как впервые отмечено у Ного8/е^1с/, что внесено здесь в ссылки, обеспечивают только слабое или не обеспечивают связывания с живыми клетками БЖ'.'аР, но проявляют сильное связывание так только клетки фиксируют (убивают).

Реактивности четырех тАЬк с нормальными человеческими тканями исследовали иммуногистохимически; эти результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Реактивность тАЬ§ с нормальными человеческими тканями по непрямому окрашиванию иммуноперок-

сидазой
Ткани	Е99	3415	Ί533	Д591
	(Уз)	(Υι)	(У.)	(Г.)
Простата ·	•	•	•	•
Почки
клубочек			0
прокс.каналец
Мочеточник	0	о	0	0
Мочевой пузырь			°	°
Яичко	0	0	0	0
Матка
Пищевод	О	О	0	О
Тонкая кишка	О	О	О	О
Желудок	°	о	°	о
Толстая кишка	0	о	0	о
Селезенка			°	о
Щитовидная железа	0		0	о
Легкие	0	°	0	' о
Поджелудочная железа	о	о	°
Печень	°	о	0	°
♦ВРН	0-3’	0-3’	0-4’	0-4’
* рак простаты	0-3’	0-3’	0-4’	0-4’
* ЫЧСаР (50ίά	3’	3’	4’	4’
* ЬиСаР (5С16)	0-2’	0-2’	0-3’	0-3’

·- позитивная; - слабая, гетерогенная; негативная

Вышеописанное последовательное изучение иммунопреципитации показало, что 7Е11, Е99, 1415, 1533 и 1591 связываются с одной и той же молекулой, т.е. Р8МА.

Пример 8. - Исследование Жейеги Βίοι.

Для подтверждения того, что антитела Е99, 1415, 1533 и 1591 осаждают одинаковую полосу с антителом 7Е11 (т.е., Р8МА), проводили анализ Жейеги Βίοι. Семенную плазму (400 цг/лунку) или лизат ЬЫСаР наносили в лунки 12% 8В8-РАСЕ геля. После электрофореза гель переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны блокировали 5% сухим молоком/ Трис-забуференным физиологическим раствором-1\\ссп 20 (ΙΒ8Τ) на 60 мин при комнатной температуре. После повторной промывки мембраны инкубировали с первичными тАЬ в течение 60 мин при комнатной температуре. После повторной промывки мембраны инкубировали с комплексом овечий анти-мышиный-1дпероксидаза 1/5000 в 5% сухом молоке/ТВ8Т в течение 60 мин при комнатной температуре. После повторной промывки мембраны проявляли, используя хемилюминесцентную метку под названием ЕСЬ (Ашегейат Ь1Ее δοίοηοοδ. 1и1етайоиа1, АгПпдЮп НсщйЕ. ΙΙΙίηοίδ) в соответствии с указаниями производителя. Результаты эксперимента Жейеги Βίοι представлены в табл. 4.

Таблица 4

Данные жеасегп Ъ1о1

Проба	7Е11	Е99	1415	Ί533	Ί591
Простатическая (семенная) жидкость	юо κϋ полоса	100 КО полоса	100 КО полоса	100 Κϋ полоса	100 Κϋ полоса
ЫЧСаР	100 Κϋ &	100 Κϋ&	100 Κϋ&	100 Κϋ&	100Κϋ&
клеточный лизат	200 Κϋ ПОЛОСЫ	200 Κϋ полосы	200 Κϋ полосы	200 Κϋ полосы	200 Κϋ полосы

Пример 9. Реактивность тАЬ к внеклеточному домену Р8МА.

Для подтверждения экспрессии на поверхности клеток (внеклеточной) определяемого Р8МА тестировали свежие, живые клетки ЬА/СаР. без фиксации, ίη νίΐτο, путем иммунофлуоресценции. Клетки ЬЫСаР промывали и инкубировали с тАЬ в течение 1 ч при комнатной температуре и затем с кроличьим антимышиным 1д-флуоресцеином (БАКО Согр., 8ап1а ВагЬага, СА). Информацию с лунок считывали при помощи флуоресцентного микроскопа. Негативный контроль состоял из соответствующих изотипу чужеродных тАЬ, в то время, как анти-класс I МНС тАЬ служили в качестве позитивного контроля.

Результаты иммунофлуоресценции и анализа розеток представлены в табл. 5.

Таблица 5

Сравнение 7Е11 с новыми тАЪ§

ЬМСаР живые клетки	7Е11	Е99	Д415	Д533	Д591
Иммунофлуоресценция	иег	3+	3+	4+	4+
Анализ КоззеИе	нег	+	+	+	+
ЬИСаР	+++	++++	+++	++	+++

фикс.

Пример 10. Исследования конкуренции.

Исследования конкуренции проводили для определения, обнаруживают ли 1591, 1533, Е99 и 1415 одинаковые или различные антигенные сайты (эпитопы) молекул простат-специфичного мембранного антигена, используя следующую процедуру.

Платы покрывали лизатом клеточной линии ЬЕ/СаР в качестве источника простатспецифичного мембранного антигена и промывали для удаления несвязанного материала. Холодные (немеченые) моноклональные антитела инкубировали на плате в течение 1 ч при комнатной температуре для осуществления связывания с их антигенным сайтом. Дополнительно, добавляли вторые моноклональные антитела, меченые либо биотином, либо ¹²⁵1, на еще один час. Платы промывали для удаления несвязанного материала. Количество вторых моноклональных антител, связанных платой, покрытой простат-специфичным мембранным антигеном, определяли либо при помощи комплекса авидин-щелочная фосфатаза в иммуноферментном анализе (в случае вторых моноклональных антител, меченых биотином), либо физическим подсчетом лунок в гамма-счетчике (в случае вторых моноклональных антител, меченых ¹²⁵1). Контроля состояли из использования тех же моноклональных антител, и немеченых, и меченых, для определения 100% конкуренции, или из использования моноклональных антител к совершенно отличной молекуле (например, моноклонального антитела 1-56, кото рое определяет ингибин, имеющий отношение к простате белок, отличный от простатспецифичного мембранного антигена) для определения 0% конкуренции.

Результаты показывают, что каждый из 1591, 1533 и Е99 служит помехой, конкурирует или блокирует связывание друг друга, но не блокирует связывание 1415, и наоборот. 7Ε11/ СУТ356, о котором известно, что он связывается с Р8МЛ в другом (внутриклеточном) сайте, не блокировал ни один из 1591, 1533, Е99 или 1415.

Наличие пар моноклональных антител, которые связываются с неконкурентными сайтами, позволяет создать метод анализа сэндвича (комплекса) антител для определения растворимых антигенов, таких, как растворимый простат-специфичный мембранный антиген или его фрагмент в, например, жидкостях организма. Например, антиген (например, простатспецифичный мембранный антиген или его фрагмент) может быть захвачен из жидкости организма при помощи 1591 и, на другом этапе, определен при помощи меченого 1415.

В другом воплощении, т.е. лечении, можно увеличить связывание антител путем использования комбинации неконкурентных моноклональных антител. Например, предполагая, что каждый из неконкурентных сайтов один раз представлен на молекуле простат-специфичного мембранного антигена, добавление комбинации 1591 плюс 1415 могло бы связывать в два раза больше молекул моноклональных антител, нежели любое из моноклональных антител по отдельности. Связывание двух неконкурентных антигенных сайтов связывания также может приводить к большему перекрестному связыванию антигена и, возможно, повышенной интернализации. Дополнительно, поскольку две определяемых сайта физически локализованы на одной молекуле простат-специфичного мембранного антигена, связывание двух молекул моноклональных антител с этой единственной молекулой простат-специфичного мембранного антигена ставит две молекулы моноклональных антител в непосредственную близость одной к другой, ситуация, которая обеспечивает оптимальное взаимодействие лекарство - пролекарство. Например, моноклональное антитело 1591 может быть конъюгировано с активатором пролекарства. Поскольку пролекарство и активатор могут быть связаны в непосредственной близи только в месте клеток, экспрессирующих простат-специфичный мембранный антиген (т.е., клеток рака простаты) активация пролекарства в активную форму может происходить только в этих местах.

Пример 11. Микроскопия.

Софокусная микроскопия и иммуноэлектронная микроскопия продемонстрировали, что Е99, 1591, 1533 и 1415 связываются с клеточной мембраной в ямках, покрытых клатри ном, и затем быстро интернализуются в эндосомы (цитоплазматические везикулы). Фиг. 1-4 являются иммуно-электронными микрофотографиями, которые прослеживают взаимодействие моноклонального антитела 1591, меченого золотом, с клеточной поверхностью как функцию времени. На этих фигурах местонахождение моноклонального антитела показано черными точками.

Живые клетки ΕΝΟαΡ инкубировали с 1591 в течение одного часа при 4°С. Клетки промывали и затем содержали при 37°С в течение 0, 5, 10 или 15 мин, после чего их фиксировали и подвергали иммуно-электронной микроскопии. Фиг. 1 показывает клетки перед инкубации при 37°С. Можно видеть 1591, связанным с клеткой вдоль наружной стороны клеточной мембраны. На этой фигуре М обозначает митохондрию клетки, и Ν обозначает ее ядро. Фиг. 2 показывает клетку после инкубации при 37°С в течение 5 мин. Стрелка показывает формирование ямки, покрытой клатрином. На фиг. 3, которая показывает клетку после 10 мин инкубации при 37°С, можно видеть захват или эндоцитоз покрытой клатрином ямки, как показано стрелкой. Фиг. 4 показывает, что после инкубации при 37°С в течение 15 мин моноклональное антитело 1591 содержится в эндоцитозных везикулах внутри клетки, как показано стрелками. Как можно видеть на фиг. 5, после инкубации при 37°С в течение 15 мин. моноклональное антитело 1591 также содержится внутри эндосом, как показано стрелками.

Пример 12. Секвенирование вариабельного района моноклонального антитела 1591.

Общую РНК получали из 10⁷ клеток мышиной гибридомы 1591. Пробу культуральной среды этих клеток тестировали на связывание со специфическим антигеном 1591 на клетках простаты. Культуральная среда была позитивна и по твердофазному иммуно-ферментному анализу, и по ХУсЧсгп Βίοι на связывание с антигеном.

кДНК νΗ и νΚ получали, используя обратную транскриптазу и мышиный к постоянный район, и праймеры постоянного района мышиного 1дС. кДНК первой цепи были амплифицированы ПЦР, используя разнообразные праймеры мышиных сигнальных последовательностей (6 для νΗ и 7 для νΚ). Амплифицированные ДНК очищали на геле и клонировали в вектор рТ7В 1ие.

Полученные клоны νΗ и νΚ анализировали на правильную встройку путем ПЦР и определяли последовательность ДНК отобранных клонов методом дидеокситерминации цепи.

Исключая район праймера (поскольку эта последовательность зависит от последовательности использованного праймера), все полученные клоны νΗ имели идентичную последовательность. Эта последовательность была получена из клонов, полученных с тремя различными 5' праймерами. Один клон имел изменение одной пары оснований внутри сигнальной последовательности, и один клон содержал измененный продукт ПЦР. Используя стратегию секвенирования, показанную на фиг. 6, получали нуклеотидную последовательность тяжелой цепи. Она обозначена 8Εζ). ГО. Νο. 1 и показана на фиг. 7 вместе с нуклеотидной последовательностью соответствующей обратной, некодирующей цепи (обозначенной 8Εζ). ГО. Νο. 2). Эти последовательности включают часть сигнальной последовательности и часть постоянного района антитела. Соответствующие вычисленные аминокислотные последовательности 1591 УН, обозначенные 8ЕЦ. ГО. Νο. 3, 8ЕЦ. ГО. Νο. 4 и 8ЕЦ. ГО. Νο. 5, также показаны на фиг.

7. Кодирующая цепь вариабельного района тяжелой цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района) имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8ЕЦ. ГО. Νο. 6):

С-АС-С-ТССАССТССААСАСТСТЗЗАССТСААСТССТСААС-ССТСССАСТТСАЕТЗАСЗ АТАТССТССААСАСТТСТСОАТАСАСАТТСАСТСААТАТАССАТАСАСТЗазТСААС САСАСССАТССАААСАСССТТСАСТООАТТССАААСАТСААТССТААСААТСОТССТ АССАССТАСААТСАСААСТТССАСвАСААЭЗССАСАТТСАСТСТАСАСААСТССТСС А<ЗТАСАС-ССТАСАТСС-АаСТСС©СА<ЗССТААСАТСТСАССАТТСТ(ЗСАС-ТСТАТТАТ ТСТССАС-СТаСТТС-СААСТТГаАСТАСТСОСаССААС-ОСАССАСТСТСАСАС-ТСТСС ТСА

Обратная, некодирующая цепь вариабельного района тяжелой цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района) имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8ЕС>. ГО. Νο. 7):

ТСАС-САСАСТ(ЗТС-А<ЗАаТС©Т<ЗССТТСаССССА<ЗТА(ЗТСАААСТТССААССАССТСС АСААТААТАСАСТССАСААТССТСАОАТаТТАаССТССОСАССТССАТаТАОССТаТ АСТССАССАСТТСТСТАСАОТСААТСТ&ЗССТТаТССТССААСТТСТСАТТСТАССТ С<ЗТАССАССАТТСТТАООАТТОАТ(ЗТТТССААТССАСТСААС<ЗСТСТТТССАТ<ЗОСТ СТ(ЗСТТСАСССАСТСТАТС©ТАТАТТСАСТаААТ(ЗТСТАТССАОАА(ЗТСТТССАаСА ТАТССТСАСТСААСТСССАОаСТТСАССАаТТСАОаТССАСАСТСТТаСАССТССАС СТС

Белковая последовательность, соответствующая вариабельному району тяжелой цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района) имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8ЕЦ. ГО. Νο. 8):

ЕУ0Ь005<ЗРЕЬ7КРСТгта13СКТЗаТТЕТЕ¥Т1НИУК05Н<ЗК5ЬЕИ1ОК1№ЫЫ<Ю ТТУМОКЕЕРУАТ'ЬТУРКЯЯЯТАУМЕЬКЗЬ'ТЗЕРЗАУГУСААСИПЕ'РУНОООТТЬТУ’З 3

1591 УН содержится в подгруппе III мышиных тяжелых цепей (КаЬа! с1 а1., 8сс|испссз о£ Рпйешз о£ 1ттипо1од1са1 1и1егез1. и.8. ОераПшеи1 о£ НсаН11 апб Ншпап 8еплсез (1991) (КаЬа1), что внесено здесь в ссылки).

Последовательность 1591 УН сравнивается со смысловой последовательностью для этой подгруппы на фиг. 8.

В отличие от УН, было получено более одной последовательности УК. Из исследованных 15 клонов УК четыре имели последовательность измененного мышиного 1дк из пары слияния (Саго1 с1 а1., Мо1еси1аг 1шшипо1о§у. 25:991-995 (1988), что внесено здесь в ссылки). Эти клоны происходили из двух специфичных 5' праймеров. Дальнейшей работы с этими клонами не проводили. Из оставшихся клонов десять имели одинаковые нуклеотидные последовательности, и один клон, УК17, имел альтернативную УК последовательность. Десять идентичных клонов происходили из трех 5' праймеров (отличных от двух, которые имели измененные последовательности), один из которых также продуцировал УК17. Стратегия секвенирования, которая была использована, показана на фиг. 9.

Нуклеотидная последовательность 1591 УК, соответствующая десяти идентичным клонам (обозначенная 8ЕЦ. ГО. Νο. 9) представлена на фиг. 10 вместе с нуклеотидной последовательностью соответствующей обратной, некодирующей цепи (обозначенной 8ЕЦ. ГО. Νο. 10) и вычисленными аминокислотными последовательностями, которые обозначены 8ЕЦ. ГО. Νο. 11, 8Εζ). ГО. Νο. 12 и 8Εζ). ГО. Νο. 13. Эти последовательности включают часть сигнальной последовательности и часть постоянного района антитела. Кодирующая цепь вариабельного района легкой (каппа) цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района), соответствующая десяти идентичным клонам, имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8ЕС>. ГО. Νο. 14): ААСАТТСТААТЗАСССААТСТСССАЛАТССАТОТССАТЕТСАЗТАОСАСАС-АОССТС АССТТСАССТаСААССССАСТОАОААТСТОСТГАСТТАТСТТТССТОСТАТСААСАЗ АЛЛССАОАОСАСТСТССТАААСТЕСТОАТАТАСОСаОСАТССААССОаТАСАСТССС СТСССССАТСНСТТСАСАаЕСАЕТеСАТСТЕСААСАОАТТГСАСТСТОАССАТСАСС АСТЗТЕСАЕаСТаЛАСАССТТССАЕАТТАТСАСТСТЗСАСАССатТАСАЕСТАТССС ТАСАССТТСаОАОС-аСССАССААОСТСвАААТАААА

Обратная, некодирующая цепь вариабельного района легкой (каппа) цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района), соответствующая десяти идентичным клонам, имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8ЕС>. ГО. Νο. 15):

ТТТТАТТТССАЕСТТЗЗТССССССТССЗААСЕТСТАСгЗАТАССТСТААСССТОТСС АСАЗТС-АТААТСТЗСААСгТСТТСАСССТС-САСАСТЗСТЗАТСС-ТСАОАСТСАААТС тсттасАаАтссАстссстатаААОссАтсосоаАссссАатстАССсзс-ттааАтас ССССТАТАТСАССАСТТТАССАСАСТССТСТОСТТТСТСТТСАТАССАОСАААСАТА АСТААССАСАТТСТСАСТССССТТОСАвЗТСААОСТОАСССТСТСТССТАСТбАСАТ ссАСАГОСАТТтаоаАаАТтааатсАттАСААТСТТ

Белковая последовательность, соответствующая вариабельному району легкой (каппа) цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района), соответствующая десяти идентичным клонам, имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8Εζ). Ш. Νο. 16): ΝΐνΜΤ0δ?Κ5Μ3Μ3ν(3ΕΗν^7ΟΚΑ3ΕΝννΤΥν3ΜΥΰςΚ?Ξ05ΡΚ^ΙΥαΑ5ΝΗΥΤ(3 νΡϋΗΡΤα5Ο3ΑΤϋΓΓΒΤΙ33ν0ΑΕϋΙΛηΥΗθαςαΥ8ΥΡΥΊΤΟ(32ΤΚΣ;ΕΙΚ

Кодирующая цепь вариабельного района легкой (каппа) цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района), соответствующая клону УК17, имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8Εζ). Ш. Νο. 17):

САСАТТСзТСАТОАСССАСТСТСАСАААТТСАТСТССАСАТСАСТАССАСЗАСАОООТС АОСАТСАТСТЗТААСбССАОТСААОАТСТСОСТАСТССТОТАОАСТСаТАТСААСАСз АААССАаОАСААТСТССТАААСТАСТОАТТТАТТОЭЗСАТССАСТСОаСАСАСТОСА СТСССТСАТС<ЗСТТСАСА®5САСТОаАТСТСЗ<ЗаАСАСАСТГСАСТСТСАССАТТАСТ ААТ(ЗТТСА<ЗТСТаААСАСТТОССАСАТТАТТТСТаТСА<ЗСААТАТААСАаСТАТССТ СТСАСС-ТТСССТССТСССАССАТССТСС-АССТЗААА

Обратная, некодирующая цепь вариабельного района легкой (каппа) цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района), соответствующая клону УК17, имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8Εζ). ГО. Νο. 18): ТТТСАСС-ТССАССАТОЗТСССАССАССС-ААСаТСАаАСС'АТАССТСТТАТАТТССТС АСАОАДАТА^ТСТаССААСТСТТСАОАСТСААСАТТАСТААТСаТСАСАСТСААС-ТС Т<ЗТСССА<ЗАТССАСТСССТС-Т(ЗААССОАТСАбОСАСТССАСТЭТаСССАСТ(ЗОАТСС ССААТАААТСАаТАС-ТТТАОСАСАТТаТССТССТТТСТСТТС’АТАССАСТСТАСАбС А-СТАСССАСАТСТТС-АСТССССТТАСАСАТаАТаСТСАСССТСТСТССТАСТСАТСТ СЗАСАТСААТТТаТС-АСАСТОССТСАТСАСААТСТС

Белковая последовательность, соответствующая вариабельному району легкой (каппа) цепи 1591 (исключая сигнальную последовательность и компоненты постоянного района), соответствующая клону УК17, имеет следующую нуклеотидную последовательность (обозначенную 8Εζ). ГО. Νο.19): ΒΐνΜΤ03ΗΚΓΜ5Τ3νΕΟΚν3ΙΙ€:<Λ30ΒναΤΑνθΗΥ00ΚΡαζ23ΡΚΙ,Ι.ΙΥ’ΛΛ3ΤΚΉΤα 7?0РГТа303аТЭГТЬТ1ТМ723ЕПЬАЕ^,/Б’ССЮтаЗУРЕТЕСАСТМЬП1₁:<

1591 УК относится к Подгруппе V мышиных каппа цепей (КаЬа1, что внесено здесь в ссылки). Последовательность 1591 УК, соответствующая десяти идентичным клонам, сравнивается со смысловой последовательностью для подгруппы на фиг. 11.

Предпочтительными 1591 являются таковые, которые имеют кодирующие последовательности цепи ДНК вариабельного района, соответствующие 8Εζ). ГО. Νο. 6 и последовательностям некодирующих цепей (обратных), соответствующих 8Εζ). ГО. Νο. 7. Вариабельный район тяжелой цепи 1591, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 8Εζ). ГО. Νο. 8. Вариабельный район легкой цепи 1591, предпочтительно, имеет последовательность кодирующей цепи ДНК, соответствующую 8Εζ). ГО. Νο. 17, последовательность некодирующей (обратной) цепи ДНК, соответствующую 8Εζ). ГО. Νο. 18, и аминокислотную последовательность, соответствующую 8Εζ). ГО. Νο. 19.

Пример 13. Иммуногистохимическое окрашивание нормальных и злокачественных тканей.

Онкологические ткани из 23 карцином предварительно охлаждали в жидком азоте, быстро замораживая в соединении ОСТ (Мйек, ЕБкИатТ, I пека па) на сухом льду, и хранили при -80°С. Замороженные срезы тканей (5цм) фиксировали в холодном ацетоне (4°С) в течение 10 мин. птАЬк (5 μτ/мл или супернатанты гибридом) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Связывание антител определяли, используя кроличий анти-мышиный комплекс 1д-пероксидаза (ϋΑΚΟ, СарпгИспа. СаПГопиа) в качестве вторых антител и ϋΑΒ (8щша.

81.Ьош5, Μίδδοηπ) в качестве хромогена. Сходные по изотипу чужеродные антитела использовали как негативный контроль.

шАЬк 1591, 1533, 1415 и Е99 сильно реагировали с клеточным эндотелием во всех 23 исследованных карциномах, включая 9/9 почечных, 5/5 уротелия, 6/6 толстой кишки, 1/1 легких и 1/1 карцином молочной железы, и 1/1 метастатической аденокарциномы печени. Фиг. 2А-2Е, соответственно, показывают иммуногистохимическую реактивность тАЬ 1591 к вновь образованным сосудам карциномы почек, уротелия, толстой кишки, легких и молочной железы, и метастатической аденокарциномы печени.

Несмотря на то, что изобретение было детально описано в целях иллюстрации, очевидно, что эти детали перечислены только по этой причине, и профессионалами в области могут быть сделаны варианты без отхода от идеи и рамок изобретения, которые определены следующей формулой изобретения.

Перечисленние последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(ί) ЗАЯВИТЕЛЬ: Соте11 КезеагсЬ Гоипдайоп, 1пс.

(Н) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: ЛЕЧЕНИЕ И ДИАГНОСТИКА РАК (ίίί) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 19 (ίν) АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:

(A) АДРЕС: Νϊχοη, Наг^гауе, Леуап5&Лоу1е ЬЬР (B) УЛИЦА: СНпсоп Зциаге, Р.О. Вох 1051 (C) ГОРОД: К.осНе51ег (Л) ШТАТ: Νεν Уогк (Е) СТРАНА: США (Г) ΖΙΡ: 14603-1051 (ν) ФОРМА ПРОЧТЕНИЯ НА КОМПЬЮТЕРЕ:

(A) ТИП НОСИТЕЛЯ: дискета (B) КОМПЬЮТЕР: совместимый с ΙΒΜ (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РС-ЛО5/М8-ЛО8

Л) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Ра1еп1Ве1еа5е#1.0,Уегаоп#1.30 (νΐ) ДАННЫЕ ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ:

(B) ДАТА ЗАПОЛНЕНИЯ:

(C) КЛАССИФИКАЦИЯ:

(νίί) ДАННЫЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: Ш 06/022,125 (B) ДАТА ЗАПОЛНЕНИЯ: 18 июля 1996 года (νίί) ДАННЫЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: Ш 08/838,632 (B) ДАТА ЗАПОЛНЕНИЯ: 9 апреля 1997 года (νίϋ) ИНФОРМАЦИЯ ОБ ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ:

(A) ИМЯ: ОоШтап, М1сИае1 Ь.

(B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 30, 727 (C) РЕФЕРАТИВНЫЙ/РЕЕСТРОВЫЙ НОМЕР: 19603/1174 (ίχ) ИНФОРМАЦИЯ О ТЕЛЕКОММУНИКАЦИИ;

(A) ТЕЛЕФОН: (716) 263-1304 (B) ТЕЛЕФАКС: (716) 263-1600 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Ες IЛ ΝΟ: 1:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(А) ДЛИНА: 391 пара оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (Л) ТОПОЛОГИЯ: линейная (Н) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е<2 1Л N0:1:

ТСТССТЗТСА ООААСТЗСАб ОТЭТССТСТС ТЗАббТССАб СТбСААСАСТ СТббАССТЗА60

АСТЗЗТОААб ССТббСАСТТ САОТОАООАТ АТССТбСААб АСТТСТЗЗАТ АСАСАТТСАС 120 ТСААТАТАСС АТАСАСТббб ТСААССАОАЗ ССАТССАААС АбССТТбАОТ СОАТТбОААА180

САТСААТССТ ААСААТббТб СТАССАССТА СААТСАСААЗ ТТСЗАССАСА АбСССАСАТТ240

ОАСТЗТАСАС ААбТССТССА СТАСАбССТА САТббАбСТС СЗСАбССТАА САТСТЗАбСА3 00

ТТСТбСАбТС ТАТТАТТОТЗ САбСТСбТТб ЗААСТТТбАС ТАСТЗЗЗЗСС ААббСАССАС 360

ТСТСАСАЗТС ТССТСАбССА АААС6АСАСС

ЗЭ1 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е<2 ГО N0:2:

(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 391 пара оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Е<2 ГО N0:6:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 345 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 ГО N0:2:

етототсзтт ТТббСТбАбб АСАСТСТСАС АбТбСТСССТ ТОСССССАбТ ΑβΤςΑΑΑατΤ60

ССААССАбСТ 6САСААТААТ АСАСТбСАбА АТССТСАОАТ вТТАббСТСС 66А5СТССАТ12 0 бТАббСТвТА СТОбАббАСТ ТСТСТАСАСТ СААТОТбвСС ТТОТССТСОА АСТТСТОАТТ180

ОТАббТббТА ССАССАТТ6Т ТА60АТТ6АТ СТГТССААТС САСТСААббС ТСТТТССАТв240

ОСТСТбСТТС АСССАСТОТА ТббТАТАТТС АОТбААТбТб ТАТССАОААб ТСТТССАббА300

ТАТССТСАСТ вААвТСССАб ССТТСАССАб ТТСАббТССА 6АСТСТТССА бСТСОАССТС360

АбАбАббАСА ССТССАбТТС СТАбСАОвАб А3 31 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е<2 ГО N0:3:

(χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ГО N0:6:

6АССТССАОС ТбСААСАбТС ТООАССТСАА СТОбТСААОС СКЗббАСТТС АбТОАССАТА

ТССТбСААОА СТТСТббАТА САСАТТСАСТ 5ААТАТАССА ТАСАСТббОТ СААССАОАбС

САТббАААбА СС дат:

Т6А2Т6 6АТТЗЗАААС АТСААТССТА АСААТС

ТАССАСС!

«ЗААвТ ТСС-АббАСАА ббССАСАТТб АСТСТАЗАСА АСТССТССАС

АТбЗАССТСС бСАОССТААС АТСТОАббАТ ТСТ'

120

ТАСАС ’4 3 «Г7СТ АТТАТТЗТбС АбСТббТТч

ААСТТТСАСТ АСТббббССА АббСАССАСТ СТСАСАб'

ССТСА

ЗСС

345 (О ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 123 аминокислоты (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(Г>) ТОПОЛОГИЯ: линейная (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е(} ГО N0:7:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 345 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χϊ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е<2 ГО N0:3:

Зет

Рхо

ν*ι

Ахд

Аз Г.

суз

Агд

Суз

Рго

Ьеи

01у

Рго

АХа

АХа

ТЬг

ν&ι

1

5

10

15

Тгр

ТЬг

ТЬт

С1у

С1и

АХа

Тгр

Азр

РЬе

Зег

С1и

Азр

Не

Ьеи

СХп

Азр

20

25

30

рне

Тгр

Не

Н1з

Не

ΗΪ3

Не

Туг

Нхз

ТЬх

Ьеи

б1у

С1и

АХа

СХи

Рго

35

40

45

Тгр

Ьуз

01и

Рго

V»!

Азр

Тгр

Ьуз

Н1з

<5Хп

Зег

01л

Тгр

Тгр

Туг

ΗΪ3

50

55

60

Ьеи

С1п

Зет

С1и

ν»ι

Ата

С1у

С1п

С1у

Нхз

Не

Азр

Суз

Агд

С1п

Уа1

б 5

70

75

80

Ьеи

С1п

Тут

Зег

Ьеи

Н13

С1у

А1а

Рго

С1п

Рго

Азп

Не

С1у

РЬе

Суз

85

90

95

Зег

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Суз

Зег

тгр

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьеи

Ьеи

О1у

РГО

Агд

Нхз

100

105

110

Ηίβ

Зет

Н1з

Зег

Ьеи

Ьеи

Зег

С1п

Азп

Азр

ТЬг

115 120 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 ГО N0:7:

ТСА6СА5АСТ СТСАСАбТСО ТбССТТСОСС ССАбТАбТСА ААбТТССААС САССТССАСА60

АТААТАСАСТ ССАОААТССТ САОАТбТТАб бСТОСббАбС ТССАТбТАбб СТбТАСТбЗА120

ССАСТТЗТСТ АСАСТСААТС ТООССТТОТС СТСОААСТТС ТОАТТбТАСС ТбСТАССАСС190

АТТбТТАСбА ТТСАТСТТТС СААТССАСТС ААббСТСТТТ ССАТСЗСТСТ ССТТСАСССА240

СТСТАТСОТА ТАТТСАСТОА АТОТбТАТСС АСААСТСТТС САООАТАТСС ТСАСТбААбТ300

СССАббСТГС АССАОТТСАС ОТССАбАСТб ТТССАССТОС АССТС345 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е<2 ГО N0:8:

(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 115 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Е(2 ГО N0:4:

(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 130 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (Н) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Εζ) ГО N0:4:

Ьеи

Ьеи

Зех

С1у

ТЬг

АХа

С1у

Уа1

Ьеи

Зех

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

С1п СХп

1

5

10

15

Зех

СХу

Рго

С1и

Ьеи

V»!

Ьуз

Рхо

С1у

ТЬх

Зег

Уа1

Ахд

Не

Зех Суз

20

25

30

ьуз

ТЬх

Зех

С1у

тух

ТЬх

РЬе

ТЬх

<31и

Туг

ТЬг

Не

Нхз

Тхр

V»! Ьуз

35

40

45

СХп

Зех

Нхз

С1у

Ьуз

Зех

Ьеи

С1и

Тхр

Х1е

С1у

Азп

Не

Азп

Рхо Азп

50

55

60

Азп

С1у

С1у

ТЬг

ТЬг

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

С1и

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг Ьеи

65

70

75

80

ТЬх

Уа1

Азр

Ьуз

Зех

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

МеС

СХи

Ьеи

Ахд

Зег Ьеи

85

90

95

ТЬх

Зех

СХи

Азр

Зех

АХа

Уа1

Тух

Тух

Суз

А1а

А1а

С1у

Тхр

Азп РЬе

100

105

но

Азо Туг Тхэ <31у С1п С1у ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Ьуз ТЬг 115 120 125

ТНг Рхо

130 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е0 ГО N0:5:

(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 125 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная (Н) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е<2 ГО N0:8:

С1и

ν·ι

С1п

Ьеи

С1п

С1п

Зех

С1у

Рго

С1и

Ьеи

V»!

Ьуз Рго

С1у

ТЬх

1

5

10

15

Зех

νδΐ

Агд

Не

вех

Суз

Ьуз

ТЬх

Зех

С1у

Тут

ТЬг

РЬе ТЬх

С1и

тух

20

25

30

ТЬг

Не

Нхз

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Зех

ΗΪ3

С1у

Ьуз

Зех

Ьеи С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у

Азп

Не

Азп

Рго

Азп

Азп

вХу

С1у

ТЬг

ТЬх

Тух

Азп С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

СХи

Азо

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Азо

Ьуз

Зех

Зег

Зег ТНг

А1а

Τ’

ί3

70

75

30

Мес

С1и

Ьеи

Агд

Зех

Ьеи

ТЬх

Зех

С1и

Азр

Зех

А1а

ν»1 Тух

Тут

Суз

85

90

95

А1а

АХа

С1у

Тхр

Азп

РЬе

Азр

Тух

Тхо

С1у

С1п

С1/

ТЬх ТНг

Ьеи

ТЬх

100

105

но

ν’αΐ Зет Зет

115 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Е<2 ГО N0:9:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 363 пары оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е0 ГО N0:9:

ТТАТАТЗСАб СТОАТСббАА САТТОТААТб АСССААТСТС ССАААТССАТ СТССАТбТСА 60 СТАОбАбАбА бббТСАССТТ ОАССТОСААб ОССАОТЗАбА АТбТОСТГАС ТТАТбТТТСС 12 0 ТббТАТСААС АОАААССАбА ССАСТСТССТ АААСТЗСТ5А ТАТАСббббС АТССААССбб 190 ТАСАСТЗЗСб ТССССЗАТСС СТТСАСАббС АбТСОАТСТб СААСАСАПТ САСТСТОАСС 240 АТСАбСАбТб ТбСАСОСТОА АОАССТТбСА 6АТТАТСАСТ ОТбОАСАбОб ТТАСА6СТАТ 300 ССбТАСАСОТ ТСббАббббб ОАССААбСТб ОАААТААААС 66ССТСАТ6С ТССАССААСТ 360 ОТА 363 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ; 8Е(2 ГО N0:5:

Ьеи

Зех

Суз

С1п

С1и

Ьеи

СХп

Уа1

Зег

Зех

Ьеи

Ахд

Зех

Зег

Суз

Азп

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Азр

Ьеи

Азп

Тгр

Зех

Ьеи

С1у

Ьеи

С1п

С1у

Тух

Рго

А1а

Ахд

20

25

30

Ьеи

Ьеи

Азр

ТЬх

Ηίδ

Зех

Ьеи

Азп

Не

Рхо

Тух

ТЬх

С1у

Зег

Ахд

А1а

35

40

45

Мес

С1и

Ахд

АХа

Ьеи

Зех

С1у

Ьеи

С1и

ТЬх

Зех

Не

Ьеи

ТЬх

Мес

ν»ι

50

55

60

ν31

Рхо

Рхо

ТЬх

Не

Ахд

Зех

Зег

Агд

ТЬх

Ахд

Рго

Н±з

Ьеи

ТЬх

Зех

65

70

75

80

Рго

Рго

Уа1

01п

Рго

ТЬг

Тгр

Зег

Зег

А1а

А1а

Н1з

Ьеи

Ахд

Не

Ьеи

85

90

95

С1п

Зех

Не

Не

Уа1

С1п

Ьеи

ν*ι

61у

ТЬг

Ьеи

ТНг

ТЬг

С1у

А1а

Ьуз

100

105

но

А1а

Рго

Ьеи

Зег

С1п

Рго

Зех

С1п

Рго

Ьуз

Агд

Н13

Рго

115

120

125

(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Е<2 ГО ΝΟ: 10:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 363 пары оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (п) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е<2 ГО N0:10:

ТАСАОТТОбТ 6СА6САТСА6 СССбГТТТАТ ТТССАбСТТб 6ТССССССТС ССААСОТЗТА60

СббАТАбСТб ТААСССТСТС САСАОТбАТА АТСТССААСС ТСТТСАСССТ 6САСАСТ6СТ120

6АТЗОТСАОА ОТСАААТСТО ТТЗСАОАТСС АСТбССТОТС ААбСбАТСбб ОСАССССАСТ180

ЗТАССЗЗТТЗ САТССССССТ АТАТСАЗСАС- ТТТАЗЗАЗАС ТССЮТС-ОТТ ТСТЗТТЗАТА 240

ССАЗЗАААСА ТАДСТААССА САТГСТСАСТ ССССТТЗСАЗ ЗТСААВЗТЗА С22ТСТСТСС ЗСО

ТАСТЗАСАТЗ ЗАСАТЗСАТТ ТЗЗЗАЗАТТЗ ЗЗТСАТТАСА АТСТТСССАТ САССТССАТА ЗсЭ тал зга (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е<3 ГО ΝΟ: 11:

(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 121 аминокислота (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (Х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Ер ГО ΝΟ: ί I:

Беи

Туг

СХу

АХа

Азр

СХу

Азп

Не

Уа1

Мей

ТЬг

СХп

Зет

Рго

Буз

Зет

1

5

10

15

Мей

Зег

Мей

Зег

Уа1

С1у

СХи

Агд

Уа1

ТЬг

Беи

ТЬг

суз

Χν3

АХ а

зет

20

25

30

СХи

Азп

УаХ

Уа1

ТЬг

Тут

Уа1

Зег

Тгр

Тут

СХп

СХп

Буз

₽то

61и

СХп

35

40

45

Зег

Рго

Буз

Беи

Беи

Не

Тут

СХу

А1а

Зет

Азп

Агд

Тут

ТЬг

СХу

УаХ

50

55

60

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

сху

Зет

61у

Зет

АХа

ТЬт

Азр

РЬе

ТЫ

Беи

ТЫ

65

70

75

80

116

Зег

Зег

УаХ

СХп

АХа

61и

Азр

Беи

АХа

Азр

Тут

ΗΪ3

Суз

С1у

С Ха.

85

90

95

С-1у

Туг

Зег

Туг

Рго

Туг

ТЫ

РЬе

<31у

С1у

СХу

ТЬг

Еуз

Беи

СХи

XX а

100

105

110

Буе

Агд

АХа

Азр

А1а

А1а

Рго

ТЬг

УаХ

11з

120

(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Е<2 ГО ΝΟ: 12:

(О ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 114 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е(2 ГО N0:12:

Туг Мей 61и Беи Мей СХу ТЫ Беи Рго Азп Беи Рго Азп Рго Суз Рго

Ю 15

Суз

СХп СХи

Агд

СХу

Зег

Рго

Рго

АХа

Агд

Рго

УаХ

Агд

Мей

тгр

Беи

20

25

30

Баи

Не: РЬе

Рго

С1у

Не

Азп

Агд

Азп

СХп

Зег

Зег

Беи

Беи

Азп

Суз

35

40

45

Тут

ТЫ СХу

нХз

Рго

ТЬг

СХу

ТЬг

Беи

СХу

Зег

Рго

Не

А1а

Зет

СХп

50

55

60

АХа

УаХ Азр

Беи

СХп

СХп

Не

Зет

Беи

Рго

Зег

АХ а

УаХ

Суз

Агд

Беи

65

70

75

8 0

Буз

ТЫ Беи

С1п

Не

Не

ТЬг

УаХ

Азр

Агд

УаХ

ТЬг

АХа

1Хе

Агд

ТЬг

85

90

95

Агд

Зет СХи

СХу СХу

Рго

Зет

Тгр

Буз

АЗП

СХу

Беи

Мес

Беи

Ηίβ

СХп

100 105 110

Беи Туг (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Е<} Ю N0:13:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 116 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (И) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 ГО N0:13:

ХХе

Не

Тгр

Зет

Тгр

СХи

Ηίβ

Суз

Азп.

Азр

Рго

1Хе

Зег

СХп

11е Ηίβ

1

5

10

15

УаХ

ΗΪ3

УаХ

Зет

Агд

Агд

СХи

С1у

Ηίβ

Беи

Азр

Беи

СХп

С1у

СХп СХи

20

25

30

Суз

СХу

Тут

Беи

Суз

РЬе

Беи

УаХ

Зет

ТЫ

СХи

ТЬг

Агд

АХа

УаХ Зег

35

40

43

ТЬг

А1а

Азр

1Хе

Агд

СХу

ХХе

СХп

Рго

Уа1

ΗΪ3

Тгр

СХу

Рго

Агд Зег

50

55

60

Беи

Ηίβ

Агд

СХп

Ττρ

Не

Суз

Азп

Агд

РЬе

Ηίβ

Зег

Азр

НХЗ

СХп СХп

63

70

75

80

Суз

АХа

СХу

Агд

РГО

Суз

Агд

Беи

Зет

Беи

Тгр

ТЬг

СХу

Беи

СХп Беи

85

90

95

зет

УаХ

Ηίβ

Уа1

Агд

Агд

61у

Азр

СХп

АХа

СХу

Азп

Буз

ТЫ

СХу Суз

100 105 110

Суз ТЬг Азп Суз

115 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Е<2 Ю N0:14:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 321 пара оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е(2 ГО ΝΟ: 14:

ААСАТТЗТАА ТЗАСССААТС ТСССАААТСС АТЗТССАТСТ САЗТАССАЗА ЗАЗЗЗТСАСС €0 ТТОАССТЗСА АЗЗССАЗТЗА ЗААТЗТССТТ АСТТАТЗТТТ ССТЗСТАТСА АСАСАААССА 120 ЗАССАЗТСТС СТАААСТССТ ЗАТАТАСЗСС ССАТССААСС ЗЗТАСАСТЗС ОСТСССССАТ 130 СЗСТТСАСАЗ ЗСАЗТСЗАТС ТЗСААСАОАТ ТТСАСТСТЗА ССАТСАЗСАЗ ТЗТЗСАЗЗСТ 240 ЗААЗАССТТЗ САЗАТТАТСА СТЗТЗЗАСАЗ ОЗТТАСАЗСТ АТСССТАСАС СТТССЗАСЗС 300 ЗЗЗАССААЗС Τ33ΆΑΑΤΆΑΑ А 321 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Ε<2 ГО ΝΟ: 15:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 321 пара оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная (Н) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (Х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е(5 ГО N0:15:

ТТТТАТТТСС АССТТЗЗТСС ССССТСС5АА СЗТЗТАСЗЗА ТАССТЗТААС ССТЗТССАСА 60 ЗТЗАТААТСТ ССААЗСТСТТ САЗССТЗСАС АСТЗСТЗАТЗ СТСАЗАСТСА ААТСТСТТСС 120 АЗАТССАСТЗ ССГЗТЗААСС ОАТСЗССЗАС СССАЗТЗТАС СССТТЗЗАТЗ ССССЗТАТАТ 180 САЗСАЗТТТА ЗЗАЗАСТЗСГ СТЗЗТТТСТЗ ТТЗАТАССАС ЗАААСАТААЗ ТААССАСАТТ 240 СТСАСТОЗСС ТГЗСАЗЗТСА АЗЗТЗАСССТ СТСТССТАСТ ЗАСАТСЗАСА ТЗЗАТТТЗЗЗ 300 АСАТТЗСЗТС АТТАСААТЗТ Т 321 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5Е<2 ГО N0:16:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 107 аминокислот (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е0 ГО N0:16:

Азп Не

УаХ

Мей

ТЬг 3

СХп

Зег

Рго

Буе

Зег 10

Мей

£ег

Мао

Зег

УаХ 15

С1у

СХи Агд

УаХ

ТЬг 20

Хеи

ТЬг

Суз

Буз

АХа 23

Зег

СХи

Азп

УаХ

УаХ 30

ТЬг

Туг

УаХ Зег

Тгп 35*

Туг

СХп

СХп

Буз

Рго 40

СХи

СХп

Зег

Рго

Б’/з 45

Беи

Беи

1Хе

Туг СХу 50*

АХа

5ет

Азп

Агд

Туг 55

ТЬг

СХу

УаХ

Рго

Азп 60*

Агд

РЬе

ТЫ

СХу

Зег СХу 65

Зег

АХа

ТЫ

Аза 70*

РЬе

ты

Беи

ТЬг

Не 75

Зег

Зег

Уа1

СХп

АХа 80

СХи Азр

Беи

АХа

Авр 85

Туг

Ηίβ

Суз

СХу

СХп 90

СХу

Туг

Зег

Туг

Рго 95

Туг

ТЫ РЬе

СХу

СХу 100

СХу

ТЬг

Буз

Беи

СХи 105

Не

Буз

(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 5ЕЦГО N0:17:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 321 пара оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Ες ГО N0:17:

ЗАСАТТСТЗА ТЗАСССАСТС ТСАСАААТТС АТЗТССАСАТ САЗТАЗЗАЗА САСЗЗТСАЗС60

АТСАТСТЗТА АЗЗССАЗТСА АЗАТЗТЗЗЗТ АСТЗСТСТАЗ АСТЗЗТАТСА АСАСАААССА120

ЗСАСААТСТС СТАААСТАСТ ЗАТТТАТГЗЗ ССАТССАСТС ЗЗСАСАСТЗЗ АСТСССТЗАТ180

СЗСТТСАСАС ЗСАЗТССАТС ТЗВЗАСАЗАС ТТСАСТСТСА ССАТТАСТАА ТЗТТСАЗТСТ240

СААСАСТТСС САСАТТАТТТ СТСТСАССАА ТАТААСАССТ АТССТСТСАС СТТСССТССТ 300 ЗЗЗАССАТСС ТЗЗАССТЗАА А321 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8Ер ГО ΝΟ: 18:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 321 пара оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ: одноцепочечная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 ГО N0:18:

ТТТСАЗЗТСС АЗСАГСЗТСС САЗСАССС-АА СЗТЗАЗАСЗА ТАССТЗТТАТ АТТЗСТЗАСА 6 0

САААСААТСТ СССААЗТСТТ САЗАСТЗААС АТТАЗТААТЗ СТЗАЗАЗТЗА АЗТСГС-ТССС 12С АЗАТССАСТЗ ССТЗТЗААЗС САТСАЗЗЗАС ТССАЗТЗТЗС СЗАЗТЗЗАТЗ СССААТАААТ 180 САЗТАСТТТА ЗЗАЗАТТЗТС СТЗЗТТТСТЗ ТТЗАТАССАС ТСТАСАССАС ТАСССАСАСС 240 ТТЗАСТОЗСС ТТАСАЗАТЗА ТЗСТЗАСССТ ЗТСТССТАСТ ЗАТЗТЗЗАСА ТЗААТТТЗТЗ 300 АЗАСТЗЗЗТС АТСАСААТЗТ С 321 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО 8ЕО ΙΌ N0:19:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

(A) ДЛИНА: 107 пара оснований (B) ТИП: аминокислотная (C) ЦЕПОЧЕЧНОСТЬ:

(О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е(2 Ю N0:19:

(χί) ЗЕОиЕМСЕ ЕЕЗСН1?ТЮЫ: ЗЕ<2 10 N0:19:

Азр

Не

ν*1

МеС

ТЬг

αΐη

Зег

К1з

Ьуз

РЬе

Мес

Зег

ТЬг

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

13

Азр

Агд

V»!

Зег

11а

118

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1п

Азр

Уа1

С1у

ТЬг

А1а

20

25

30

Уа1

Азр

Тгэ

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

ьеи

Не

35

40

45

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТЬг

Агд

Н13

ТЬг

<31у

ν«ι

Рго

Азо

Агд

РЬе

ТЬг

<31у

50

55

60*

Зег

<31у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

ТЬг

Азп

V»!

<31п

Зег

65

70

75

80

С1и

Азр

Беи

А1а

Азо

Туг

РЬе

Суз

С1п

01а

Туг

Азп

Зег

Туг

Рго

Ьеи

85*

90

95

ТЬг

РЬе

□1у

А1а

<31у

ТЬГ

Мее

Ьеи

Азр

Ьеи

Ьуз

100 105

Claims (85)

1. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязываюгций участок, которые связываются с внеклеточным доменом простат-специфического мембранного антигена (Р8МА), где антитело или его антигенсвязываюгций участок связываются с живыми клетками.

2. Изолированное поликлональное антитело или его антигенсвязываюгций участок, которые связываются с внеклеточным доменом простат-специфического мембранного антигена (Р8МА), где антитело или его антигенсвязываюгций участок связываются с живыми клетками.

3. Антитело или его антигенсвязываюгций участок по п.1 или 2, которые позволяют использовать агенты, активные в клетке.

4. Изолированное антитело или его антигенсвязываюгций участок по пп.1-3, где антитело или его антигенсвязываюгций участок представляют собой 1дС.

5. Изолированное антитело или его антигенсвязываюгций участок по пп.1-4, выбранные из группы, состоящей из ЕаЬ-фрагмента, Е(аЬ')₂фрагмента и Εν-фрагмента.

6. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пи. 1-5, которые конкурируют за связывание Р8МА с антителом, выбранным из группы, состоящей из моноклональных антител Е99,1533 и 1891.

7. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по и.6, которые конкурируют за связывание Р8МА с моноклональным антителом 1591.

8. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пи. 1-5, которые связываются с внеклеточным эпитопом Р8МА, который также распознается антителом, выбранным из группы, состоящей из моноклональных антител Е99,1533 и 1591.

9. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.8, которые связываются с внеклеточным эпитопом Р8МА, который также распознается моноклональным антителом 1591.

10. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пи. 1-5, которые конкурируют за связывание Р8МА с моноклональным антителом 1415.

11. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по и. 10, которые связываются с внеклеточным эпитопом Р8МА, который также распознается моноклональным антителом 1415.

12. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пи. 1 или 3-5, где антитело выбрано из группы, состоящей из моноклональных антител Е99,1533,1415 и 1591.

13. Изолированное антитело по пп.1 или 34, продуцируемое гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС, выбранный из группы, состоящей из НВ-12101, НВ-12109, НВ12127 и НВ-12126.

14. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пи. 1-5, которые содержат антигенсвязываюгций участок аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 8Εζ) Ю N0:8 и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 8ΕρΐϋΝΟ:19.

15. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по и. 14, которые содержат антигенсвязываюгций участок из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 8Εζ) Ю N0:8 и антигенсвязывающий участок из аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 8Εζ) ГО N0:19.

16. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пи. 1-5, которые содержат антигенсвязываюгций участок аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 8Εζ) ГО N0:6 и нуклеотидной последовательности вариабельного участка легкой цепи 8ΕρΐϋΝΟ:17.

17. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по и. 16, которые содержат антигенсвязываюгций участок аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью вариабельного участка тяжелой цепи 8Εζ) ГО N0:6, и антигенсвязывающий участок аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью вариабельного участка легкой цепи 8Εζ) ГО N0:17.

18. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пи. 1-17, где анти тело или его антигенсвязывающий участок связаны с цитотоксическим лекарством.

19. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.18, где цитотоксическое лекарство выбрано из группы, состоящей из терапевтического лекарства, вещества, испускающего излучение, молекул растительного, грибного или бактериального происхождения, белков и их смесей.

20. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.19, где цитотоксическое лекарство представляет собой вещество, испускающее излучение.

21. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.20, где вещество, испускающее излучение, представляет собой αизлучатель, β-излучатель или γ-излучатель.

22. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.21, где вещество, испускающее излучение, выбрано из группы, состоящей из ²¹²Βί, ²¹³Βί, ²¹¹Л1, 'Π/υ.'Υ и ¹³¹Ι.

23. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по пп.1-22, где антитело или его антигенсвязывающий участок связаны с меткой.

24. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.23, где метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биологически активной ферментной метки, радиоактивной метки, метки, активной в отношении ядерного магнитного резонанса, люминесцентной метки и хромофорной метки.

25. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.24, где радиоактивная метка выбрана из группы, состоящей из ³²Р, ¹²⁵Ι, ³Н, ¹⁴С, ¹⁸⁸Кй, ¹³¹Ι, ⁹⁹тТс и ^1ΠΙη.

26. Композиция, содержащая изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-25 и физиологически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор, смешанные с изолированным антителом или его антигенсвязывающим участком.

27. Композиция, содержащая изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-25 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор, смешанные с изолированным антителом или его антигенсвязывающим участком.

28. Набор для определения Р8МЛэкспрессирующих клеток, содержащий изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.23-25 и средство для обнаружения метки.

29. Набор по п.28, где клетки представляют собой злокачественные клетки.

30. Набор для определения Р8МЛэкспрессирующих клеток, содержащий изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-22, метку, средство для присоединения метки к антителу или его антигенсвязывающему участку и средство для обнаружения метки.

31. Набор по п.30, где клетки представляют собой злокачественные клетки.

32. Набор по пп.28-31, дополнительно содержащий физиологически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор.

33. Набор по пп.28-31, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор.

34. Набор по пп.28-31, где метка выбрана из группы, состоящей из флюоресцентной метки, биологически активной ферментной метки, радиоактивной метки, метки, активной в отношении ядерного магнитного резонанса, люминесцентной метки и хромофорной метки.

35. Набор по п.34, где радиоактивная метка выбрана из группы, состоящей из ³²Р, ¹²⁵Ι, ³Н, ¹⁴С, ¹⁸⁸КД ¹³¹Ι, ⁹⁹тТс и ^Π1Ιη.

36. Набор по пп.30-35, где рак представляет собой рак простаты.

37. Набор по пп.30-35, где рак выбран из группы, состоящей из рака почек, рака уротелия, рака толстой кишки, рака легких, рака молочной железы и метастазирующей в печень аденокарциномы.

38. Клеточная линия гибридомы, имеющая регистрационный номер АТСС НВ-12101, которая продуцирует моноклональное антитело Е99.

39. Клеточная линия гибридомы, имеющая регистрационный номер АТСС НВ-12109, которая продуцирует моноклональное антитело 1415.

40. Клеточная линия гибридомы, имеющая регистрационный номер АТСС НВ-12127, которая продуцирует моноклональное антитело 1533.

41. Клеточная линия гибридомы, имеющая регистрационный номер АТСС НВ-12126, которая продуцирует моноклональное антитело 1591.

42. Способ лечения, предупреждения возникновения или замедления развития рака у субъекта, включающий получение антитела или его антигенсвязывающего участка по пп.1-25, и введение антитела или его антигенсвязывающего участка субъекту при условиях, эффективных для лечения, предупреждения возникновения или замедления развития рака.

43. Способ по п.42, где рак представляет собой рак простаты.

44. Способ по п.43, где рак простаты является метастазирующим.

45. Способ по п.44, где метастазирующий рак простаты включает метастазы в костный мозг или лимфатические узлы.

46. Способ по пп.43-45, где введение антитела или его антигенсвязывающего участка осуществляют после простатэктомии.

47. Способ по п.42, где рак представляет собой непростатический рак.

48. Способ по п.47, где непростатический рак выбран из группы, состоящей из рака почек, рака уротелия, рака толстой кишки, рака легких, рака молочной железы и метастазирующей в печень аденокарциномы.

49. Способ по п.47, где антитело или его антигенсвязывающий участок связываются с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся рядом с непростатическими злокачественными клетками или внутри непростатической злокачественной опухоли.

50. Способ по пп.42-49, где введение осуществляют путем парентеральной, внутривенной, внутримышечной, ректальной или внутриполостной инсталляции.

51. Способ по пп.42-50, где антитело или его антигенсвязывающий участок интернализуются с Р8МА.

52. Способ по пп.42-51, где введение антитела комбинируют с дополнительной терапией.

53. Способ по п.52, где дополнительная терапия выбрана из группы, состоящей из хирургической операции, радиоактивного облучения, химиотерапии, иммунотерапии и гормонального замещения.

54. Способ по п.53, где гормональное замещение включает обработку эстрогеном или антиандрогенным агентом.

55. Способ по п.54, где антиандрогенный агент представляет собой агент, который блокирует или ингибирует действие тестостерона.

56. Способ по пп.42-44, где антитело или его антигенсвязывающий участок эффективны для индукции эндогенной иммунной функции хозяина.

57. Способ по п.56, где эндогенная иммунная функция хозяина представляет собой комплемент-зависимую цитотоксичность или антитело-зависимую цитотоксичность.

58. Способ лечения, предупреждения возникновения или замедления развития рака у субъекта, включающий получение первого антитела или его антигенсвязывающего участка по пп.1-25, получение второго антитела или его антигенсвязывающего участка, которые связываются с внеклеточным доменом простатспецифического мембранного антигена, и введение и первого антитела или его антигенсвязывающего участка, и второго антитела или его антигенсвязывающего участка субъекту, нуждающемуся в лечении, при условиях, эффективных для лечения, предупреждения возникновения или замедления развития рака.

59. Способ по п.58, где рак представляет собой рак простаты.

60. Способ по п.59, где рак простаты является метастазирующим.

61. Способ по п.60, где метастазирующий рак простаты включает метастазы в костный мозг или лимфатические узлы.

62. Способ по пп.58-61, где введение осуществляют путем парентеральной, внутривен ной, внутримышечной, ректальной или внутриполостной инсталляции.

63. Способ по пп.58-62, где введение антитела или его антигенсвязывающего участка осуществляют после простатэктомии.

64. Способ по п.58, где рак представляет собой непростатический рак.

65. Способ по п.64, где введение осуществляют путем парентеральной, внутривенной, внутримышечной, ректальной или внутриполостной инсталляции.

66. Способ определения Р8МАэкспрессирующих клеток, включающий получение антитела или его антигенсвязывающего участка по пп.23-25, где антитело или его антигенсвязывающий участок связаны с меткой, обеспечение взаимодействия Р8МАэкспрессирующих клеток с антителом или его антигенсвязывающим участком при условиях, эффективных для связывания, и определение Р8МА-экспрессирующих клеток путем обнаружения метки.

67. Способ по п.66, где клетки представляют собой нормальные, доброкачественные гиперпластические или злокачественные клетки простаты.

68. Способ по п.66, где клетки представляют собой непростатические злокачественные клетки.

69. Способ по пп.66-68, где взаимодействие обеспечивают ш νίΙΐΌ.

70. Способ по п.69, где взаимодействие обеспечивают в образце сыворотки или мочи.

71. Способ по п.69, где взаимодействие обеспечивают в биопсийном образце ткани.

72. Способ по п.70 или 71, где образец взят от человека.

73. Способ по п.66, где взаимодействие обеспечивают в живом млекопитающем, включающий введение антитела или его антигенсвязывающего участка млекопитающему при условиях, эффективных для связывания антитела или его антигенсвязывающего участка с Р8МАэкспрессирующими клетками, присутствующими у млекопитающего.

74. Способ по п.67, где взаимодействие обеспечивают в живом млекопитающем, включающий введение антитела или его антигенсвязывающего участка млекопитающему при условиях, эффективных для связывания антитела или его антигенсвязывающего участка с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся рядом или внутри нормальной, доброкачественной гиперпластической или злокачественной ткани простаты, присутствующей у млекопитающего.

75. Способ по п.68, где взаимодействие обеспечивают в живом млекопитающем, включающий введение антитела или его антигенсвязывающего участка млекопитающему при условиях, эффективных для связывания антитела или его антигенсвязывающего участка с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся ря49 дом или внутри непростатической злокачественной ткани, присутствующей у млекопитающего.

76. Способ по п.75, где непростатическая злокачественная ткань представляет собой злокачественную ткань почек, злокачественную ткань уротелия, злокачественную ткань толстой кишки, злокачественную ткань легких, злокачественную ткань молочной железы, злокачественную ткань метастазирующей в печень аденокарциномы, злокачественную ткань лимфатических узлов или злокачественную ткань метастазов в костный мозг.

77. Способ по пп. 75-76, где антитело или его антигенсвязывающий участок связываются с эндотелиальными клетками сосудов, находящихся рядом или внутри непростатической злокачественной ткани.

78. Способ по пп.75-77, где обнаружение метки определяет местоположение непростатической злокачественной ткани в теле субъекта.

79. Способ по п.74, где обнаружение метки определяет местоположение нормальной, доб рокачественной гиперпластической или злокачественной ткани простаты в теле субъекта.

80. Способ по п.73, где обнаружение метки определяет местоположение Р8МАэкспрессирующих клеток в теле субъекта.

81. Способ по пп.73-79, где субъектом является человек.

82. Способ по пп.73-81, где метку обнаруживают с помощью устройства для визуализации изображения.

83. Способ по пп.73-82, где метку обнаруживают с помощью трансректального зонда.

84. Способ по пп.42-80, где изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок находятся в составе композиции, дополнительно включающей физиологически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор.

85. Способ по пп.42-80, где изолированное антитело или его антигенсвязывающий участок находятся в составе композиции, дополнительно включающей фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор.