EA001462B1

EA001462B1 - Способ профилактики или терапевтического лечения заболевания, связанного с повышенной концентрацией свободных окислительных радикалов в сыворотке крови

Info

Publication number: EA001462B1
Application number: EA199700101A
Authority: EA
Inventors: Витольд Кичка
Original assignee: Ника Хелт Продактс Лимитед
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-13
Publication date: 2001-04-23
Also published as: SV1996000001A; IL116737A0; HU223903B1; GB9714354D0; EP1086703A3; UA50728C2; AP628A; EE9700154A; OA10436A; HK1002060A1; AU709620B2; AP871A; MA23775A1; AP9701024A0; BA96074A; HUP9801689A2; FI972943A; KR100420377B1; JPH10511974A; EA199700101A1

Abstract

Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим димер лизоцима предпочтительно высокой чистоты, т.е. с содержанием примерно 10 вес.% или менее нежелательных побочных продуктов, и новым способам его применения. Такие способы применения включают местное, пероральное или парентеральное введение указанных композиций для неспецифической иммуностимуляции в качестве меры профилактики и/или терапевтического лечения заболеваний человека, включая рак и нарушения роста волос. Неспецифическая стимуляция иммунной системы вызывается с помощью однократного или повторного применения димера лизоцима предпочтительно при концентрациях от 0,005 до 0,5 мг на 1 кг веса тела.

Description

Область техники

Данное изобретение относится к новому применению димера лизоцима и к композициям, содержащим такой димер. Новое применение основано на общем принципе неспецифичной стимуляции иммунной системы и особенно полезно для предотвращения и/или лечения симптомов заболевания в связи с нарушенной функцией природных защитной и регенеративной систем человеческого организма и организма животных.

Предпосылки создания изобретения

В конце восьмидесятых было обнаружено, что димерные формы некоторых ферментов, при сохранении в основном полезных свойств соответствующих мономеров, становятся гораздо менее токсичными, чем мономеры, и в некоторых случаях даже совсем не проявляют отрицательных побочных эффектов, когда используются в терапевтических дозах. Противовирусные и антибактериальные композиции, содержащие в качестве активного ингредиента димер лизоцима или другие димерные ферменты были описаны в \νϋ 89/11294. В нем сообщается, что лизоцимный димер способен к подавлению пролиферации ряда штаммов бактерий, культивированных из образцов, взятых от больных, при применении в концентрациях, равных 1,25-20 мг/мл культуры. Также сообщается, что димер эффективен при лечении парвовирусных инфекций собак (ПВС), при пероральном введении дважды в сутки в дозе 1 2 мг/кПговзедснаетеелбаы. ли обнаружены дополнительные привлекательные свойства димеров лизоцима и были разработаны дополнительные способы терапевтического применения этого лекарственного препарата, в частности, для лечения бактериальных и вирусных инфекций, что раскрыто, например, в νθ 94/01127.

В νθ 94/01127 представлена модель теории, которая может помочь понять различные эффекты, наблюдаемые для димера лизоцима. Хотя собственный механизм действия димера лизоцима еще полностью не ясен, по-видимому, существуют дополнительные лечебные свойства, которые нельзя объяснить бактериолитическим действием соответствующего мономера. Авторы наблюдали определенные иммуностимулирующие воздействия димеризованного лизоцима, особенно в отношении модуляции уровней цитокинов. Кроме того, на основании своих экспериментов они заключили, что димер лизоцима, по-видимому, предупреждает проникновение вирусов в бактериальную клетку, преимущественно путем блокирования некоторых областей наружной поверхности клеток и, возможно, включающих белки вирусных рецепторов.

В уровне техники раскрываются дополнительные результаты, полученные ίη νίίτο для димера лизоцима. В частности, Ваг11ю1суп5 апб 2епеЬетдй (Еигор. 1. Сапсег, Υοΐ. 15, 1979, 85-91) испытывали димеризованный лизоцим на цитостатическую активность в отношении клеток рака печени (КРП) ίη νίίτο. Они наблюдали подавление 73±15% размножения клеток рака в клеточной культуре (1Ь1б., с. 89, табл. 2).

Удивительно, что до сих пор, за исключением νθ 94/01127, не сообщалось об экспериментах ίη νΐνο с димером лизоцима. Очень странно и удивительно и до сих пор не находит объяснения, почему ни Ваг11ю1еуп5 и ДепеЬегд. ни кто-то из других исследователей не вернулись к этому вопросу, чтобы активизировать дальнейшую разработку перспективной находки для борьбы с раком. Сравнительная демонстрация (фиг. 1) чистоты димера лизоцима, получаемого по методу δοπΐηίίηο еί а1., Еиг. 1. Βίοсйеш. 124, 183-189 (1982) и димера лизоцима, предпочтительно используемого в данном изобретении выявила, по крайней мере, одну возможную причину: в препарате, получаемом по δοπΐηίίηο еί а1., обнаружены высокие концентрации побочных продуктов, таких как мономер лизоцима, тример и тетрамер лизоцима, тогда как продукт, предпочтительно используемый в данном изобретении, является высоко очищенным, т. е. содержит желаемый димер лизоцима в количествах до 90 вес.% от общей фракции лизоцима в препарате. Способ получения такого высоко очищенного димера лизоцима был описан в νθ 91/10731.

Это служит весомым подтверждением предположения о том, что чистота описанного в уровне техники димера лизоцима была недостаточно хороша для экспериментов и применения ίη νΐνο, так как было известно уже 15 лет назад, что мономерная форма лизоцима, несмотря на благоприятную антибактериальную активность, довольно токсична и может вызвать воспаление и тяжелые аллергические реакции и даже симптомы токсического шока.

В свете таких обстоятельств кажется более понятным, почему ни один компетентный исследователь, включая ВагбюКутъ и ΖеηеЬе¾ хотя и рекомендующих димер лизоцима в качестве обещающего кандидата для дальнейших исследований, не провели дальнейших экспериментов в течение последних десяти-пятнадцати лет с целью разработки применения димера лизоцима ίη νΐνο.

Несмотря на такое отсутствие исследовательских работ в научном мире, возможно связанное с предубеждением профессионалов в отношении использования димера лизоцима ίη νΐνο, авторы настоящего изобретения провели дальнейшие исследования и разработку по усовершенствованию способа получения и очистки димеризованного лизоцима и по поиску применения ίη νΐνο для людей и животных продукта, который приведет, например, к его антивирусному и антибактериальному применению, раскрываемых в νθ 94/01127.

Кроме того, основываясь на своем знании низкой токсичности димеризованного лизоцима по сравнению с мономером и на способности нового высоко очищенного препарата димера лизоцима, авторы предприняли попытку и начали испытания по противораковому действию препаратов димера лизоцима ίη νίνο, хотя предшествующий опыт не наводил на мысль о его применении для лечения других заболеваний, а не только бактериальных и вирусных инфекций. Одно из наибольших преимуществ данного изобретения состоит в обеспечении применения высокоочищенного димера лизоцима для производства фармацевтической композиции для дополнения или замены чрезвычайно токсичных противораковых лекарственных средств, обычно применяемых при общепринятой терапии.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает сравнительную чистоту препаратов димера лизоцима, полученных по двум разным известным из уровня техники методикам;

фиг. 2 - график, иллюстрирующий хемилюминесцентные исследования.

Сущность изобретения

Соответственно, данное изобретение относится к способу профилактики или лечения заболевания, связанного с повышенной концентрацией свободных окислительных радикалов в сыворотке крови, который состоит в том, что для ингибирования увеличения концентрации указанных радикалов и стимулирования неспецифических защитных реакций иммунной системы, индивидууму, подверженному риску или имеющему данное заболевание, вводят фармацевтическую композицию, включающую препарат высокоочищенного димера лизоцима, который предпочтительно содержит около 10 вес.% или менее нежелательных побочных продуктов и, по существу, свободен от мономерной формы лизоцима, однократно или повторными дозами в количестве от 0,005 до 0,5 мг димер лизоцима на 1 кг веса тела.

Заболевание, профилактика или лечение которого осуществляется, представляет собой лейкемию, в частности лимфатическую лейкемию, индуцированную вирусом.

Предпочтительно, чтобы фармацевтическую композицию согласно изобретению вводили в таком количестве, чтобы обеспечить содержание димера лизоцима от около 0,01 до 0,1 мг на кг веса тела, например, в количестве 0,02 мг димера лизоцима на кг веса тела.

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения, содержание димера лизоцима в композиции составляет 0,01-10 мг/мл.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть в виде геля, мази или жидкого препарата для местного перорального или парентерального введения, при этом она может дополнительно содержать физиологиче ски приемлемый растворитель, носитель и консервант.

Другое ценное применение высоко очищенного димера лизоцима было неожиданно обнаружено при клинических испытаниях, когда композиции димера лизоцима вводили больным с более или менее инфицированными послеоперационными ранами, например, после ампутации нижней конечности. Оказалось, что местное применение димера не только успешно устраняло раневую инфекцию, но также стимулировало рост волос и обновление волос в месте лечения. Это неожиданное открытие привело к дальнейшим исследованиям и, наконец, к производству фармацевтических композиций, применимых в случае нарушения роста волос, в частности, нарушения роста волос на основе нарушения функций иммунной системы или ее дисфункций, таких как, например, в случае очаговой алопеции.

Такие композиции могут, по крайней мере частично, удовлетворять требованию желаемого длительного действия композиции в качестве стимулятора роста. Принцип, лежащий в основе этого полностью неожиданного эффекта, как полагают, включает, среди прочего, стимуляцию и улучшение механизмов иммунной защиты, улучшение циркуляции крови в поверхностных слоях ткани и в коже, общее неспецифическое улучшение иммунных функций и, возможно, еще несколько еще не идентифицированных эффектов.

Как правило, иммуностимуляторы включают группу биологических и синтетических соединений, которые усиливают неспецифические клеточные и гуморальные механизмы защиты у животных и людей. Иммуностимуляторы, такие как бетаглюкан, хитозан, левамизол, следы минералов и комбинации минералов и различные продукты, происходящие из многих растительных и животных источников, эффективны при профилактике заболеваний.

Димер лизоцима, о котором говорится здесь, может или непосредственно применяться у больных, нуждающихся в этом, или может использоваться для производства фармацевтических композиций, чтобы применяться в виде обычных галеновых форм. Гели, мази или жидкие композиции содержат димер лизоцима предпочтительно в концентрации, равной примерно 0,01-10 мг/мл и часто в концентрации, равной примерно 0,1-1,0 мг/мл. Их обычно готовят в виде стерильных апирогенных композиций, и они необязательно дополнительно включают, по меньшей мере, один физиологически приемлемый растворитель, и/или носитель, и/или, по меньшей мере, один подходящий консервант.

Фармацевтические композиции, содержащие димер лизоцима, применимы и предназначены непосредственно для местного и/или парентерального применения, включая локальную инъекцию, например, вблизи плотной опухоли, или наружное применение на поверхности тела, включая подкожную инъекцию. Внутривенные инъекции могут заменять или дополнительно содействовать местному применению при курсе терапии. Однако было также доказано, что очень эффективно наносить композиции димера лизоцима на слизистые оболочки, предпочтительно путем ингаляции (слизистая носа, рта и глотки) жидких композиций или местного применения (например, слизистая влагалища, шейки матки) жидких или кремообразных композиций или тампонов, пропитанных материалом димера лизоцима.

В некоторых случаях предпочтительно принимать димер лизоцима перорально, предпочтительно в обычных галеновых формах, таких как, например, таблетки, капсулы или драже, или в форме пилюль, гранул, хлопьев или в виде порошка. Эти твердые композиции часто содержат активное лекарственное вещество в количестве примерно 0,01-10 мг, предпочтительно примерно 0,01-1,0 мг на г композиции в целом. Также предпочтительно, чтобы они дополнительно включали, по меньшей мере, один подходящий носитель, и/или консервант, и/или другие обычные добавки, такие как, например, вещество, улучшающее вкус и запах, и подкрашивающее вещество.

Композиция для перорального использования, однако, может быть также в виде осмотической системы. В некоторых случаях, таких как, например, в целях профилактики и/или лечения рака мочеполового тракта, может быть полезно и благоприятно местное применение антисептических повязок или тампонов, пропитанных эффективной дозой высокоочищенного димера лизоцима.

Различные типы вышеупомянутых композиций димера лизоцима предпочтительно вводятся в одноразовой или повторяющихся дозах, равной примерно от 0,005 до 0,5 мг/кг веса тела, в частности, в дозе, равной примерно от 0,01 до 0,1 мг/кг веса тела. Само собой разумеется, что необходимая концентрация активного димера лизоцима в конечной фармацевтической композиции зависит непосредственно от размеров больного человека и животного и вида терапевтического или профилактического лечения, намеченного для соответствующего больного. В большинстве случаев, однако, вышеупомянутые интервалы концентраций достаточны для соответствующего лечения. Тем не менее, может стать необходимым, особенно в ветеринарной практике, повысить действующие концентрации димера лизоцима в композиции до значения свыше 1 0 мг/мл и ниже растворимости продукта димера в соответственном растворителе, т.е. до примерно 20 мг/мл жидкости или мази. При этом объем композиции, который нужно ввести, может оставаться достаточно минимальным для легкости манипуляции.

Если возможно, метод совместного назначения вышеупомянутых композиций предпочтительнее монотерапии путем перорального, парентерального введения или местного применения.

Благодаря, по существу, нетоксичному характеру высокоочищенного димера лизоцима, композиции, содержащие такой димер, можно вводить в течение длительного срока, т. е. на протяжении месяцев и даже лет, без возникновения опасных побочных эффектов. Интервалы времени между введениями для профилактического или терапевтического применения этого лекарственного препарата могут обычно находиться в пределах от одного до более раз в сутки до еженедельного или ежемесячного введения доз препарата и могут также состоять из более длительных интервалов, в зависимости от соответствующего пациента и остроты необходимости лечения, а также от эффективности иммуностимуляции димером лизоцима.

Как показано выше, данное изобретение стало, по крайней мере частично, возможным благодаря наличию димера лизоцима высокого качества. Поразительное отличие качества продукта и, в частности, доля нежелательного мономера лизоцима, демонстрируется фиг. 1:

полоса 1 представляет предварительно окрашенные стандарты белков с низким молекулярным весом: фосфорилазы В 142000 дальтон, БСА 97000, овальбумина 50000, карбоангидразы 35100, ингибитора трипсина соевых бобов 29700, лизоцима 21900 (Вюгаб, И8А);

полосы 2 и 3 показывают очищенный димер лизоцима ЬУШЬМ КЬР^К 602 (КЬР^К 602), сер. 506449, лабораторный контроль; полоса 2 нагружена 6,6 мкг, а полоса 3 - 19,8 мкг;

полосы 4 и 5 показывают другую серию КЬР-602, полоса 4 нагружена 6,6 мкг, а полоса 5 - 1 9,8 мкг;

полосы 6 и 7 показывают препарат димера лизоцима (К1\У-607). произведенного по 8оггеийио е! а1., Еиг. 1. Вюей. 124, 183-189 (1982); полоса 6 нагружена 6,6 мкг, а полоса 7 - 19,8 мкг.

Очищенный препарат димера лизоцима КЬР-602 содержит в четыре раза больше димера, чем сравниваемый продукт КΓΨ-607, тогда как сравниваемый продукт К1\У-607 содержит в шесть раз больше мономера, чем КЬР-602.

Для того чтобы это изобретение, описанное здесь, можно было понять полнее, представлены следующие примеры. Должно быть понятно, что эти примеры представлены только с иллюстративными целями и не должны интерпретироваться как ограничивающие это изобретение в каком-либо отношении.

Пример 1. Димер лизоцима (КЬР-602) при лечении лимфолейкемии у мышей АКК.

Материалы и методы

В эксперименте использовали семимесячных мышей обоих полов лейкозной линии АКК, зараженных вирусом Огай!, из Центра инбри7 динговых животных Института иммунологии и экспериментальной терапии Польской академии наук, Вроцлав. У мышей АКК происходит раняя активация эндогенного лейкозного вируса, что приводит к клиническим проявлениям лимфолейкемии в возрасте семи-девяти месяцев. Мышей делили на три группы из 30 животных каждая:

Группа I (экспериментальная)

- животным подкожно вводили КЬР-602 один раз в дозе 20 мкг/кг в 0,3 см³ ФБР;

Группа II (экспериментальная)

- животные получали КЬР-602 дважды в той же дозе, что и выше;

Группа III (контрольная)

- животные получали 0,3 см³ ФБР дважды.

Мышей забивали путем обескровливания через три и шесть недель после последней инъекции КЬР-602 (10 мышей из каждой группы). Десять мышей из каждой группы оставляли живыми.

Выполняли следующие исследования:

1. Определение общего веса тела и массы внутренних органов, таких как печень, селезенка, тимус и наружные шейные лимфатические узлы, с определением отношения массы органа к весу тела. Степень терапевтического действия оценивали с использованием формулы Ь/К х 100%, где Ь является средним временем выживания мышей, которых лечили КЬР-602, и К является средним временем выживания контрольных животных.

2. Гистопатологические исследования биопсийного материала из печени, селезенки, тимуса и лимфатических узлов. Срезы окрашивали Г+Э (Н+Е) по методу Гомори (Сотой) для ретикулярных волокон.

3. Уровень свободных радикалов в сыворотке оценивали с использованием хемилюминесцентного (Хл) метода, который дает возможность определения очень слабой фотонной люминесценции сыворотки.

4. Фагоцитарное действие гранулоцитов (ГЦ) оценивали, используя тест с нитросиним тетразолием и хемилюминесцентное (Хл) исследование.

Результаты:

Однократное (группа I) и двукратное (группа II) подкожное введение КЬР-602 мышам высоколейкозной линии АКК в дозе 20 мкг/кг вызывало статистически значимое увеличение веса тела и снижение массы внутренних органов, таких как селезенка, тимус, лимфатические узлы и печень (последнее было статистически не значимым) по сравнению с контрольными животными (группа III) с определением через три недели от начала эксперимента (табл. 1 ).

Увеличение общего веса тела в обоих лечившихся группах, снижение массы селезенки, тимуса и лимфатических узлов в группе I и увеличение печени и тимуса в группе II по сравне нию с контрольными животными (группа III) происходило через шесть недель от начала исследования (табл. 1 ).

В табл. 2 показано отношение веса внутренних органов к общему весу тела. Через три недели увеличение массы тимуса наблюдалось в группе III (контрольная) по сравнению с обоими экспериментальными группами (I и II). Через шесть недель происходило увеличение массы селезенки, тимуса и лимфатических узлов в группах II и III, по сравнению с группой I.

Гистопатологические исследования, проводимые через три и шесть недель, выявили умеренную (в экспериментальных группах) и чрезмерную (в контрольной группе) колонизацию шейных лимфатических узлов, тимуса и селезенки лимфоидными клетками. Однако лейкозные инфильтраты в печени были обнаружены только в контроле. Лимфоидные клетки имели овальные или круглые гиперхроматические ядра с многочисленными ядрышками и атипичными фигурами митоза. Эти клетки сопровождались немногочисленными слабодифференцированными центробластными клетками, ретикулярными клетками и островками пролиферирующих мегакариоцитов в селезенке. Строма лимфатических органов, таких как селезенка, лимфатические, узлы и тимус, содержала недостаточное количество тонких ретикулярных волокон.

Хемилюминесцентные исследования:

Основным моментом определения свободных радикалов в образцах сыворотки является измерение ультра-слабой люминесценции, образуемой в процессе свободнорадикальных реакций. Значения срт (число отсчетов в минуту), полученные сцинтилляционными измерениями, относятся к I или I, соответственно, согласно следующей формуле:

I: = Ц · е^-1'¹ где νυΓ^ΐ/τ и к= 1 /I (отсюда следует угол наклона кривой линейной регрессии на графике, где уМпДУф) и χ=ΐ, и линейная регрессия представляет у=кх+б.

Каждое значение к, раскрытое в настоящей заявке, получено на основании ряда 7 сцинтилляционных измерений, проводимых с 5-минутными интервалами, начиная со времени =0 мин; т.е. ΐο=0, ΐ₁=5, ΐ₂=10, ΐ₃=15, 1₄=20. ΐ₅=25, Ц=30 мин, образца сыворотки экспериментальной мыши АКК. Каждая сцинтилляционная смесь содержит аликвоту образца сыворотки вместе с дополнительными ингредиентами, необходимыми для сцинтилляционного измерения, включающими, среди прочих, токоферол в качестве акцептора радикалов.

Если данные сцинтилляционных измерений, выполненных во время 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин, показывают увеличение показателя срт по сравнению с люминесцентной эмиссионной активностью Т_о, измеренной во время ΐ=0, то это является указанием наличия высокой активности радикалов.

Соответствующие значения к (рассчитанные в соответствии с приведенной выше формулой) будут отрицательными (для лучшего понимания см. прилагаемый чертеж).

Пониженная активность радикалов означает меньшее увеличение срт или даже снижение срт по сравнению с интенсивностью при 1=0. Значения к увеличиваются, например, от к = -0,02 (=20 х 10^-3), что означает очень высокую активность радикалов, до к = -0,01 и далее до положительных значений к = +0,01 или к = +0,02, что означает очень низкую активность радикалов.

Исходной основой для значений к является табл. 1 , которая включает шесть групп мышей в дополнение к контрольной.

Таблица 1 Уровень свободных радикалов в сыворотке крови мыши АКК (коэффициент к)

Группа	Эксперимент	Эксперимент	Эксперимент
мышей	1	2	3
Группа 1	-0,0015	-0,012	-0,015
Группа 2	-0,009	-0,002	-0,008
Контрольная	-0,012	-0,015	-0,016
Группа 3	-0,003	-0,005	-0,005
Группа 4	0,004	-0,004	0,001
Контрольная	-0,003	-0,004	-0,005
Группа 5	0,042	0,015	-0,004
Группа 6	0,023	0,009	-0,007
Контрольная	-0,009	0,009	-0,018

Результаты, приведенные в табл. 1, являются четким подтверждением заявленного изобретения. Из таблицы можно видеть, что активность свободных радикалов в сыворотке контрольных групп увеличилась во всех показателях, полученных в дни с 0 по 42, на что указывает понижение значений от -0,012 до 0,016; от -0,003 до -0,005; или от -0,009 до -0,018 соответственно. Заметное повышение фагоцитной активности ГЦ было отмечено в обоих экспериментальных группах по сравнению с контрольной группой через три недели и составляло: 4688 Хл (группа I), 3485 Хл (группа II) и только 2052 Хл для контрольной группы. Через шесть недель фагоцитарная активность в группе II была в равной степени высокой (3264 Хл) и была ниже в группе I (2477 Хл). Значительное увеличение фагоцитарной активности, определяемой по тесту с нитросиним тетразолием (ТНТ) отмечали через три недели в обеих лечившихся группах и составляло 0,27 и 0,26 в группах I и II, соответственно. Через шесть недель повышение фагоцитарной активности было ниже и происходило только в группе II. Фагоцитарная активность в контрольной группе составляла 0,22.

Индекс терапевтической эффективности КЬР-602 составил 128% и 150% в группах I и II, соответственно, являясь выше минимального 125%. Это демонстрирует заметные иммуностимулирующие свойства КЬР-602 и дает право на его дальнейшее изучение.

Лейкозные инфильтраты значительно меньше в обеих экспериментальных группах, чем в контрольной группе, и даже отсутствуют у некоторых мышей. Лейкозные инфильтраты присутствовали в тимусе, селезенке и в лимфатических узлах. Кроме того, они были обнаружены в печени контрольных животных. Результаты исследования показывают, что КЬР-602 может частично подавлять или задерживать развитие лейкемии у мышей АКК. И наоборот, быстрое увеличение лимфатических органов с морфологическими изменениями, типичными для хорошо дифференцированной лимфоидной лейкемии, происходило у животных, получавших плацебо.

Кроме того, КЬР-602 подавляет увеличение свободных радикалов в сыворотке мышей. Он подавляет процессы с участием свободных радикалов подобно действию антиоксидантов, таких как витамин Е, С или селен. Возможно, что подавление пролиферации лейкозных клеток у мышей АКК, лечившихся КЬР-602, зависит от подавления процессов, вызванных свободными радикалами. У контрольных мышей (без введения КЬР-602) уровень свободных радикалов был выше и коррелировал с тяжестью заболевания.

КЬР-602 также стимулирует фагоцитарную активность мононуклеарной фагоцитарной системы (МФС), определенную двумя независимыми, ТНТ и Хл, и таким образом стимулирует клеточно-опосредованный иммунитет. Он также может модулировать синтез ΤΝΕ (фактора некроза опухолевых клеток). Кроме того, присутствующие на поверхности лейкемических клеток антигены отторжения опухолей могут распознаваться Т-клетками, действующими совместно с макрофагально-фагоцитарной системой (МФС). Среди этих Т-клеток находятся опухолеинфильтрующие лимфоциты (ОИЛ), на 50-100% более эффективные, чем лимфокиноактивированные киллерные клетки (ЛАК). Они имеют фенотип СЭ₄ или СЭ₈ или смешанный и экспрессируют рецептор ГЬ-2 на своей поверхности. Пока еще неизвестно, почему они парализуются опухолевыми клетками.

Ретикулоэндотелиальная система вместе со стимуляцией клеток МФС является основным иммунологическим и противовирусным механизмом. Стимуляция этих клеток приводит к продукции интерферона и опосредованно активирует специфические и неспецифические иммунные процессы, зависимые от В-клеток, Тклеток или ИК-клеток.

Клетки МФС участвуют в иммунологических процессах посредством своих рецепторов, таких как Ес рецепторы, С₃ рецепторы или НЬА рецепторы класса II, а также лектиновых, трансферриновых, урокиназных, инсулиновых и пятидесяти других менее известных рецепторов. Любые изменения их экспрессии и сродства указывают на активацию этих клеток. Клетки

МФС могут фагоцитировать чувствительные к N0 клетки, так как они могут синтезировать это вещество. Активированные фагоциты называются макрофагами воспаления или кровожадными клетками. Клетки МФС могут разрушать вирусы посредством своих цитотоксических и цитолитических свойств, продукции дефектных вирионов и синтеза интерферона.

Обещающие результаты предварительного исследования на мышах АКК. показывают, что КЬР-602 может успешно использоваться при лечении лейкемии у мышей АКК.

Таблица 2 Общая масса тела (г) и масса внутренних органов (мг) у контрольных и экспериментальных мышей (х ± 8; верхние значения показывают 8, нижние значения показывают х)

	Три недели	Шесть недель
Группа	I	II	III	I	II	III
Общая	25.27	26.20	23.96	26.77	27.30	25.57
масса тела	2.22	1.67	1.23	1.10	2.34	1.68
Селезенка	0.07	0.08	0.09	0.07	0.23	0.22
0.00	0.02	0.01	0.00	0.01	0.00
Тимус	0.06	0.07	0.08	0.08	0.21	0.15
0.01	0.02	0.02	0.01	0.03	0.07
Лимфати-	0.04	0.04	0.05	0.04	0.07	0.08
ческие узлы	0.00	0.00	0.01	0.00	0.04	0.04
Печень	1.38	1.36	1.43	1.61	1.89	1.67
0.15	0.38	0.05	0.18	0.42	0.15

Таблица 3 Отношение масс внутренних органов к общей массе тела в контроле и у экспериментальных животных, %

	Три недели	Шесть недель
Группа	I	II	III	I	II	III
Селезенка	0.30	0.31	0.37	0.29	0.84	0.87
Тимус	0.23	0.26	0.33	0.33	1.06	0.61
Лимф. узлы	0.18	0.18	0.21	0.15	0.26	0.26
Печень	5.49	5.25	5.81	6.02	6.35	6.40

Пример 2. Эффект высокоочищенного препарата димера лизоцима (КЬР-602) на рост волос при очаговой алопеции.

Было проведено исследование для определения того, действует ли бальзам, содержащий КЬР-602, на рост волос при очаговой алопеции. Кроме того, устанавливали переносимость этого бальзама при нанесении на кожу.

Материалы и методы:

Изучение представляло собой сравнительное клиническое испытание с контролем. В исследование было включено двенадцать лиц (два больных мужчины и десять больных женщин) с очаговой алопецией в стадии телогена в хорошем состоянии здоровья. Они были в возрасте от 19 до 50 лет. Двенадцать лиц (три больных мужчины и девять больных женщин) с очаговой алопецией, лечившиеся миноксидилом , считались контрольной группой. Их возраст находился в интервале от 19 до 49 лет. Распределение субъектов по полу и возрасту в группах двух видов лечения было сходным для двух групп.

Критерии отбора больных:

Критерии включения:

1. Очаговая алопеция в стадии телогена;

2. Возраст 18-50 лет.

Критерии исключения:

1. Очаговая алопеция в стадии дистрофии;

2. Другой тип алопеции;

3. Любое другое кожное заболевание.

Сопутствующее медикаментозное лечение:

Сопутствующее медикаментозное лечение не разрешалось, тем не менее, оно было необходимо для лечения по общему состоянию здоровья.

Распределение по номерам для лечения:

Во время исследования лица, которые удовлетворяли критериям отбора, получали номера в испытуемых группах в следующем порядке. Исследователь помещал соответствующий номер в соответствующем месте на каждой форме истории болезни (ФИБ).

Медикаментозное лечение при испытании:

Бальзам для волос, произведенный ΝΙΚΑ по оригинальной прописи, был получен в 1 00 мл одинаковых пластиковых бутылочках с калиброванным небольшим наконечникомкапельницей. Лосьон КЬР-602, 0,05%-ный, наносили на волосистую часть головы три раза в день по инструкции присутствующего дерматолога. Лечение начиналось непосредственно после постановки диагноза очаговой алопеции дерматологом.

2%-ный раствор миноксидила^® наносили дважды в день на пораженные области кожи.

Продолжительность лечения составила 1 6 недель. После лечения больных наблюдали в течение 2-месячного периода наблюдения.

Оценка безопасности:

Субъектам обеих испытуемых групп проводили обследование путем полного анамнеза и медицинских исследований в начале и конце изучения. Образцы крови и мочи для обычных лабораторных исследований брали до и после лечения. Лабораторные исследования включали следующие анализы:

Гематология:

Гемоглобин, гематокрит, общий и дифференцированный подсчет белых кровяных клеток.

Биохимический анализ сыворотки:

АлАТ (ГПТ), АСТ (ГОТ), щелочная фосфатаза, билирубин.

Моча:

Анализ мочи с помощью погружаемого тест-стержня на белок, кровь и глюкозу.

Пациентов осматривали ежемесячно на протяжении 4 месяцев терапии и 2 месяцев периода наблюдения. При каждом посещении субъектов опрашивали о наличии общих и местных побочных проявлений, таких как раздражение, жжение, зуд; области лечения исследовали на эритему или другие местные побочные эффекты.

Оценка эффективности:

Параметры эффективности:

1. Первостепенным параметром эффективности был рост волос.

2. Вторым параметром эффективности было время излечивания измененной волосистой части головы.

3. При исследовании делалась фотодокументация в следующие моменты:

- перед нанесением бальзама для волос с КЬР-602

- во время роста волос

- в конце срока применения бальзама для волос с КЬР-602.

Производилась оценка с помощью микроскопа (трихограмма). Стандартизованные трихограммы на волосах, взятых с границы очага поражения алопеции, дают наиболее полезную информацию по течению и тяжести заболевания, а также эффективности терапевтических мероприятий.

При каждом визите волосистую часть головы оценивали на признаки роста волос, которые классифицировались как:

- никакого

- легкий - видимое восстановление роста (пеньки или несколько разбросанных одиночных концов волос)

- умеренный - неполный (частичный)

- полный косметически приемлемый рост волос определялся как достаточный для того, чтобы прикрыть волосистую часть головы и терминальные области остаточной потери волос.

Результаты:

Все субъекты, включенные в исследование (12 лечившихся 0,05% КЬР-602, и 12 из контрольной группы, лечившихся 2% раствором миноксидила) завершили 4-месячный срок терапии и 2-месячный период наблюдения.

Эффективность.

Наиболее применимой мерой эффективности была оценка исследователями в конце изучения. Кроме того, у восьми из двенадцати субъектов (66%) в группе КЬР-602 и шести из двенадцати субъектов (50%) в группе миноксидила показали усиленный рост волос во время исследования. Из этих больных у четырех субъектов в группе КЬР-602 (33%) и трех в группе миноксидила (25%) рост волос считали полным и косметически приемлемым. Частичный рост волос был видимым у трех из двенадцати оцениваемых субъектов в группе КЬР-602 (25%) и трех в группе миноксидила (25%), соответственно. У одного субъекта КЬР-602 (9%) наблюдался минимальный рост волос. Не было роста волос у четырех из двенадцати (33%) в группе КЬР-602 и у шести из двенадцати (50%) в группе миноксидила.

В группе КЬР-602 с алопецией в пределах менее 25% волосистой части головы рост волос был получен у восьми из восьми субъектов и у шести из семи в группе миноксидила, соответственно. Не наблюдалось возобновления роста у субъектов с алопецией в пределах более 25% волосистой части головы в обеих лечившихся группах.

Среднее время реакции роста волос в связи с продолжительностью лечения, изменявшейся в пределах от одного до трех месяцев в обеих группах. Три субъекта в группе КЬР-602 дали ответную реакцию после одного месяца лечения. У одной женщины рост волос после одного месяца был с концами волос, равными примерно 5 мм по длине и облысевшие области волосистой части головы были покрыты густым возобновившимся ростом волос.

При контрольном визите после второго месяца у этой женщины появилась тотальная алопеция (эмоциональный стресс - развод), и у нее не было ответа на дальнейшее лечение, и испытание завершилось с отрицательным результатом. У одного субъекта в группе миноксидила возобновление роста волос наблюдалось после одного месяца терапии. У четырех пациентов в группе КЬР-602 рост волос был получен после двух месяцев лечения. После трех месяцев изучения возобновление роста волос наблюдалось у двух субъектов в группе КЬР-602 и у трех из группы миноксидила, соответственно.

Безопасность.

Во время терапии и периода наблюдения не наблюдалось общих побочных эффектов. Не отмечено аномалий в лабораторных анализах крови и мочи на исходном уровне и в конце изучения в обеих лечившихся группах.

Во время исследования наблюдались местные побочные реакции: одна женщина в группе КЬР-602 жаловалась на жжение и зуд волосистой части головы на втором месяце лечения. Она связывала эти симптомы с ношением нового парика. Эти ощущения исчезли в течение двух недель без дополнительного лечения, она не прекратила терапию и закончила испытание с хорошим результатом. Один субъект, лечившийся 2% раствором миноксидила жаловался на сальность волос, и никаких значительных клинических признаков не наблюдалось при исследовании волосистой части головы. Пациент связывал это явление с испытанием, но он хотел продолжать лечение. Никаких существенных данных не было отмечено в связи с возобновлением роста волос и возрастом пациентов, локализацией областей облысения и продолжительностью текущего эпизода, который был коротким и сходным для обеих групп и оценивался в пределах от одной недели до одного года, максимум. Все не ответившие на лечение в обеих лечившихся группах имели в анамнезе очаговую алопецию, продолжительностью, по крайней мере, пять лет (5-15 лет).

Обсуждение.

Исследование произведено с целью оценки безопасности и эффективности местно применяе15 мого 0,05% лосьона КЬР-602 в отношении роста волос у больных с очаговой алопецией и для сравнения его с эффективностью 2% раствора миноксидила во время четырехмесячной терапии.

Бальзам для волос, содержащий КЬР-602, хорошо переносился больными. У 66% субъектов, лечившихся 0,05% лосьоном КЬР-602, показан усиленный рост волос во время исследования по сравнению с 50% субъектов в группе миноксидила.

Косметически приемлемый рост волос наблюдался у 33% пациентов в группе КЬР-602 и у 25% в группе миноксидила, соответственно. Лучшие результаты лечения наблюдали у больных со степенью алопеции ниже 25% измененной волосистой части головы. 0,05%-ый лосьон КЬР-602 легко использовать для местного применения, и он не вызывает каких-либо местных или общих побочных явлений. Учитывая короткий срок исследования (16 недель), полученные результаты очень обнадеживают.

Выводы.

1. Бальзам для волос, содержащий КЬР602, хорошо переносился и не вызывал какихлибо побочных эффектов.

2. Местное применение 0,05% КЬР-602 легко и безопасно.

3. Никаких местных и общих побочных эффектов и никаких последствий по лабораторным показателям не наблюдалось во время исследования.

4. Из-за короткого срока терапии (4 месяца) и 2-месячного наблюдения полная оценка результатов и завершение лечения было невозможно, хотя этот период был достаточно длительным, чтобы наблюдать обнадеживающую эффективность лечения.

5. Результаты, полученные при испытании, показали, что 0,05% лосьон КЬР-602 сравним с 2% раствором миноксидила и даже более эффективен при лечении очаговой алопеции.

6. Доклинические исследования и результаты, полученные при испытании, показывают, что КЬР-602, применяемый местно, индуцирует рост волос у больных, страдающих очаговой алопецией.

Резюме.

Было выполнено исследование с целью определения эффективности и переносимости бальзама для волос, содержащего КЬР-602, в отношении роста волос при очаговой алопеции. Применение 0,05% лосьона КЬР-602 три раза в день хорошо переносилось при 4-месячном периоде лечения. Не наблюдалось никаких местных или системных побочных эффектов. В группе КЬР-602 наблюдался лучший ответ по росту волос, чем в группе миноксидила. Ответ на лечение с возобновлением роста волос наблюдался у 66% субъектов при применении 0,05% лосьона КЬР-602. Процент пациентов, у которых наблюдался ответ на лечение с умеренным или густым ростом волос, был больше среди больных, у которых область облысения охватывала менее 25% волосистой части головы. 0,05% КЬР-602, по-видимому, является отличным средством для лечения очаговой алопеции.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ профилактики или терапевтического лечения заболевания, связанного с повышенной концентрацией свободных окислительных радикалов в сыворотке крови, заключающийся в том, что для ингибирования увеличения концентрации указанных радикалов и стимулирования неспецифических защитных реакций иммунной системы, индивидууму, подверженному риску или имеющему данное заболевание, вводят фармацевтическую композицию, включающую препарат высокоочищенного димера лизоцима, который предпочтительно содержит около 10 вес.% или менее нежелательных побочных продуктов и, по существу, свободен от мономерной формы лизоцима, однократно или повторными дозами, причем количество вводимого димера лизоцима составляет от 0,005 до 0,5 мг на 1 кг веса тела.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой лейкемию, в частности, лимфатическую лейкемию, индуцированную вирусом.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество вводимого димера лизоцима составляет от около 0,01 до 0,1 мг на кг веса тела, в частности, 0,02 мг на кг веса тела.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция представляет собой гель, мазь или жидкий препарат для местного, перорального или парентерального введения и при этом фармацевтическая композиция дополнительно содержит, по крайней мере, один компонент, выбранный из группы, включающей физиологически приемлемый растворитель, носитель и консервант.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция содержит димер лизоцима в концентрации от 0,01 до 10 мг/мл.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция представляет собой твердый препарат, предназначенный для перорального применения, и при этом фармацевтическая композиция дополнительно содержит, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый компонент, выбранный из группы, включающей носитель и консервант.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция содержит димер лизоцима в концентрации от 0,01 до 10 мг/мл.