SK94297A3

SK94297A3 - New applications of lysozyme dimer

Info

Publication number: SK94297A3
Application number: SK942-97A
Authority: SK
Inventors: Witold Kiczka
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-13
Publication date: 1998-01-14
Also published as: NO973203D0; IL116737A; EP0804227B1; MD970244A; NO973203L; AP9701024A0; EP1086703A3; EP1086703A2; TNSN96004A1; PL321546A1; GB2311724B; HK1002060A1; MY132437A; AU709620B2; MD1633B2; DE69621589D1; HU223903B1; BG62239B1; OA10436A; JPH10511974A

Description

Predkladaný vynález sa týka použitia lyzozýmového diméru a prípravkov s obsahom takéhoto diméru. Nové použitia sú založené na známom princípe nešpecifickej stimulácie imunitného systému a sú zvlášť vhodné pri prevencii a/alebo liečbe symptómov alebo ochorení, ktoré súvisia s porušenou funkciou prirodzených obranných a regeneračných systémov v tele človeka a zvieraťa.

Doterajší stav techniky

Koncom 80. rokov bolo zistené, že dimerizované formy určitých enzýmov, hoci si v podstate zachovávajú prospešné vlastnosti zodpovedajúcich monomérov, sú oveľa menej toxické ako monoméry a v niektorých prípadoch vôbec nevykazujú negatívne vedľajšie účinky, ak sa používajú v terapeutických dávkach. Protivírusové a antibakteriálne prípravky s obsahom aktívnej zložky lyzozýmového diméru alebo iných dimerizovaných enzýmov sú popísané vo VO 89/11294. Je o nich uvedené, že lyzozýmový dimér je schopný inhibovať proliferáciu mnohých bakteriálnych kmeňov kultivovaných vo vzorkách odobraných od pacientov, v prípade, že sa podávajú v koncentráciách od 1,25 do 20 mg/ml kultúry. Tiež sa uvádza, že dimér je účinný pri liečbe parvovírusových infekcií u psov (CPV), ak sa podáva perorálne 2 x denne v dávke 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti. Neskôr sa zistili ďalšie výhodné vlastnosti lyzozýmových dimérov a vyvinuli sa ďalšie terapeutické aplikácie tohto liečiva, najmä pri liečbe bakteriálnych a vírusových infekcií, ako bolo objavené v napr. vo VO 94/01127.

Vo VO 94/01127 sa prezentuje modelová teória, ktorá napomáha pochopeniu rozličných účinkov zaznamenaných u lyzozýmového diméru. Hoci spôsob účinku lyzozýmového diméru nie je ešte celkom známy, zdá sa, že má ďalšiu kuratívnu schopnosť, ktorú nemožno vysvetliť bakteriolytickou aktivitou zodpovedajúceho monoméru. Vynálezcovia zistili určité imunostimulačné účinky dimerizovaného lyzozýmu, najmä pokiaľ ide o moduláciu hladín cytokínu. Navyše, na základe svojich pokusov dospeli k záveru, že sa zdá, že lyzozýmový dimér zabraňuje prenikaniu vírusov do bakteriálnych buniek, pravdepodobne blokovaním určitých oblastí vonkajšieho povrchu buniek a tým, že asi obsahuje proteíny receptoru vírusov.

Prvotné poznatky tohto druhu týkajúce sa diméru lyzozýmu sa prejavili v podmienkach in vitro. Najmä Bartholeyns a Zenebergh (Eur. J. Cancer, 15, 1979, 85-91) testovali dimerizovaný lyzozým na cytostatické účinky pri rakovine pečeňových buniek (HCT) in vitro. Zistili 73 ± 15%-nú inhibíciu multiplikácie rakovinových buniek na bunkových kultúrach (tamtiež, strana 89, tabuľka 2).

Je prekvapujúce, že okrem VO 94/01127, doteraz neboli opísané žiadne pokusy s dimérom lyzozýmu in vivo. Je zvláštne a prekvapujúce a doteraz nevysvetlené, prečo ani Bartholeyns a Zenebergh, ani iný výskumný pracovník nesledovali túto látku z hľadiska možného objavenia protirakovinového účinku. Porovnávaním (obr. 1) čistoty lyzozýmového diméru vyrobeného podľa spôsobu uvedeného Sorrentinom et al., Eur. J. Biochem, 124, 183-189 (1982) a lyzozýmového diméru výhodne použitého v predkladanom vynáleze sa zistila aspoň jedna z možných príčin: vysoké koncentrácie vedľajších produktov, ako je lyzozýmový monomér, trimér a tetramér boli v prostriedku podľa Sorrentina et al. zistené, zatiaľčo látka výhodne použitá v predkladanom vynáleze má vysokú čistotu, t.j. obsahuje požadovaný lyzozýmový dimér až množstve 90 % hmotn. vzhľadom na celkovú lyzozýmovú frakciu v prostriedku. Spôsob výroby takto vysoko purifikovaného lyzozýmového diméru bol opísaný vo VO 91/10731.

Toto silne podporuje názor, že čistota predchádzajúceho lyzozýmového diméru bola jednoducho nedostatočná pre experimenty in vivo a podávanie, pretože už 15 rokov je odborníkom známe, že monomérna forma lyzozýmu je napriek svojej dobrej antibakteriálnej účinnosti pomerne toxická a môže zapríčiňo3 vať zápaly a ťažké alergie a dokonca prejavy toxického šoku.

Vo svetle takýchto okolností sa zdá byť viac pochopiteľným, prečo žiadny kompetentný výskumník, vrátane Bartholeynsa a Zenebergha, napriek odporučeniu lyzozýmového diméru ako sľubného kandidáta pre ďalšie sledovania, neuskutočnil ďalšie pokusy počas posledných 10 až 15 rokov z hľadiska použitia diméru lyzozýmu v podmienkach in vivo.

Napriek takémuto nedostatku výskumných aktivít vo vedeckom svete, možno z dôvodov prevládania negatívneho postoja k použitiu diméru lyzozýmu in vivo, predkladatelia tohto vynálezu uskutočnili ďalší výskum a sledovanie, aby zlepšili spôsob výroby a purifikácie dimerizovaného lyzozýmu a aby našli použitie pre túto látku v podmienkach in vivo u ľudí a zvierat, čo viedlo napríklad k jeho použitu ako protivírusovej a antibakteriálenj látky, objavenej vo VO 94/01127.

Okrem toho, na základe poznatkov o nízkej toxicite dimerizovaného lyzozýmu v porovnaní s monomérnou formou a na základe dostupnosti nového, vysoko purifikovaného prostriedku lyzozýmového diméru, predkladatelia vynálezu iniciovali a zahájili skúšky s takýmito prostriedkami na báze lyzozýmového diméru z hľadiska ich protirakovinového účinku in vivo, hoci predchádzajúce skúsenosti nenaznačovali ich iné použitie, než pri liečbe bakteriálnych alebo vírusových infekcií. Jednou z najväčších výhod predkladaného vynálezu je poskytnutie vysoko purifikovaného lyzozýmového diméru na použitie na výrobu farmaceutického prostriedku na doplnenie alebo nahradenie extrémne toxických protirakovinových liečiv používaných v bežnej chemoterapii.

Podstata vynálezu

Vysoko purifikovaný lyzozýmový dimér spadajúci pod predkladaný vynález možno použiť na výrobu farmaceutických prostriedkov s priamym použitím pri liečbe zvierat a ľudí z dôvodov, že obsahuje malé množstvo toxického monoméru.

Ako už bolo naznačené, takto purifikovaný dimér lyzozýmu obsahuje asi 10 % hmotn. alebo menej nežiadúcich sprie4 vodných látok a možno ho získať dimerizáciou lyzozýmových monomérov akéhokoľvek pôvodu, napríklad monomérov lyzozýmu odvodených od ľudí, zvierat, z vajec, rastlín, mikroorganizmov, pričom monoméry sú alebo prirodzene izolované v natívnej forme, alebo sú vyrobené chemicky alebo génovým inžinierstvom a sú rovnakej alebo v zásade rovnakej chemickej a biologickej povahy ako prirodzene sa vyskytujúce monoméry.

V in vitro testoch na bunkových kultúrach a na modeloch in vivo, výhodne na modeloch myší a potkanov, mohli predkladatelia vynálezu úspešne demonštrovať, že použité prípravky lyzozýmových dimérov preukazujú významnú účinnosť pri inhibícii alebo úplnej ochrane bunky pred proliferáciou rakovinového tkaniva in vitro a in vivo. Takýto liečebný účinok bolo možné potvrdiť u rôznych typov rakoviny, vrátane ale bez obmedzenia na tie, ktoré sú odborníkom známe tým, že sú indukované alebo ovplyvnené vírusmi. Tieto vírusy zahrňujú najmä ľudský papilloma vírus, vírus Epsteina a Barrovej, vírus hepatitídy B a retrovírusy, ako sú HTLV-I (vírus T-bunkovej leukémie u dospelých), HTLV-II (vírus lymfómu) a HIV-I (vírus imunodeficiencie u ľudí) vrátane subtypov.

Typy rakoviny indukované alebo ovplyvňované účinkom týchto vírusov zahrňujú napríklad karcinóm krčku maternice, karcinóm močových ciest, Kaposiho sarkóm, primárny hepatocelulárny karcinóm, leukémiu, T-bunkový lymfóm, AIDS alebo jeho subtypy. Je predmetom predkladaného vynálezu poskytnúť farmaceutický prostriedok a spôsob prevencie a/alebo liečby rakoviny u zvierat a ľudí.

Ďalšie prospešné použitie purifikovaného diméru lyzozýmu bolo prekvapujúco objavené v klinických skúškach, keď boli prípravky lyzozýmového diméru podávané pacientom s viac alebo menej infikovanými pooperačnými ranami, napr. po amputácii dolnej končatiny. Zistilo sa, že miestne podávanie diméru nielenže úspešne zabraňovalo infikovaniu rany, ale tiež stimulovalo rast vlasov a obnovu rastu vlasov v liečenej oblasti. Tento prekvapujúci objav viedol k ďalším sledovaniam a konečne k výrobe farmaceutických prostriedkov použiteľných v prípadoch porúch rastu vlasov, najmä takých, ktoré boli dôsledkom znížených imunitných funkcií alebo dysfunkcií, ako je to napríklad v prípade alopecia areata.

Takéto prostriedky prinajmenšom čiastočne spínajú požiadavky na existenciu dlho požadovaného prípravku, ktorý pôsobí ako stimulátor vlasového rastu. Celkom nečakaný účinok tohto prostriedku sa pripisuje medzi iným stimulácii a zlepšeniu imunitných obranných mechanizmov, zlepšeniu cirkulácie krvi v superficiálnych tkanivových vrstvách a v koži, celkovému nešpecifickému zlepšeniu imunologických funkcií a pravdepodobne niektorým ďalším doteraz neidentifikovaným účinkom.

Ďalším prekvapujúcim a komerčne veľmi zaujímavým použitím farmaceutického prostriedku s obsahom lyzozýmového diméru je jeho použitie pri chove rýb a pestovaní včiel, kde v skríningovom experimente boli bežné antibiotiká nahradené rôznymi nešpecifickými imunostimulanciami, vrátane lyzozýmového diméru.

Použitie imunostimulátorov v kultúrach rýb na prevenciu a/alebo liečbu ochorení u rýb predstavuje sľubnú perspektívu (Siwicki a Anderson, 1990; Siwicki et al., 1994). V súčasnosti látky na liečbu ochorení rýb zahrňujú antibiotiká, liečivá a chemické látky na sterilizáciu nádrží pre chov rýb (Stoskopf, 1993). Z hľadiska terapie je každý prístup aspoň čiastočne účinný u určitých ochorení, dochádza však k problémom súvisiacim s nahromadením týchto látok v životnom prostredí a v rybacom mäse, ako aj k nebezpečenstvu zvýšenia počtu patogénnych kmeňov rezistentných na antibiotiká.

Pokiaľ ide o včely, je zaužívané usmrtiť kolónie včiel v prípade, že sa u nich zistia mikrobiálne, napríklad bakteriálne a/alebo vírusové infekcie. Takto sa zabráni rozšíreniu infekcií do iných kolónií a tým sa minimalizujú straty. Je preto potrebné poskytnúť alternatívny a spoľahlivý spôsob profylaktickej a/alebo terapeutickej liečby u medonosných včiel, ktorý kombinuje výhodu antibiotika, ktoré posilňuje imunitný systém včiel a antibiotika, ktoré nemá za následok rozšírenie mikrobiálnych kmeňov rezistentných na antibiotiká. Predkladaný vynález poskytuje spôsob, ktorý týmto požia davkám vyhovuje. Navyše, dokonca prítomnosť diméru lyzozýmu v konečnom medovom výrobku v detegovateľných koncentráciách, by bola považovaná skôr za zlepšenie kvality výrobku než za zhoršenie výrobku, z dôvodov prospešnosti nešpecifikého imunostimulačného účinku lyzozýmového diméru.

Vo všeobecnosti imunostimulanciá zahrňujú skupinu biologických a syntetických zlúčenín, ktoré zvyšujú nešpecifické obranné mechanizmy celulárnej a humorálnej imunity u zvierat a ľudí. Imunostimulanciá, ako betaglukán, chitosan, levamizol, kombinácie minerálov a stopových prvkov a rôzne produkty odvodené z množstva rastlinných a živočíšnych zdrojov sú z hľadiska prevencie ochorení účinné. Zvlášť sľubné z hľadiska stimulácie celulárnej a humorálnej imunitnej odpovede u rýb sa ukazujú byť niektoré typy betaglukánov.

Nešpecifické obranné mechanizmy, ktoré zahrňujú fagocytózu a tvorbu oxidačných radikálov sa rýchlo aktivujú pôsobením imunostimulancií a sú tiež rýchlo pripravené ochraňovať ryby pred patogénnymi mikroorganizmami, ako sú napr. vírusy, baktérie, mykoplazmy a huby a/alebo pred parazitmi alebo inými patogénnymi pôvodcami. Preto sú tieto mechanizmy predchodcami špecifickej imunitnej odpovede, ktorá vyžaduje dlhší časový úsek pre rozvinutie špecificky prispôsobenej imunitnej odpovede vrátane tvorby protilátok a špecifickej bunkovej aktivácie.

Veľmi povzbudzujúce výsledky dosiahnuté v prvých skúškach in vivo, naznačujúcich významné zlepšenie imunologických obranných mechanizmov, viedli k zahájeniu podrobného výskumného programu týkajúceho sa účinku lyzozýmového diméru na špecifické a nešpecifické bunkové a humorálne obranné mechanizmy u rýb, najmä u pstruhov a lososov a medonosných včiel.

Preto je predmetom predkladaného vynálezu poskytnúť nové použitia lyzozýmového diméru zahrňujúc jeho použitie na výrobu farmaceutických prostriedkov na stimuláciu nešpecifickej celulárnej a humorálnej bunkovej odpovede u rýb a medonosných včiel.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnúť spôsob použitia farmaceutických prostriedkov obsahujúcich uvedený lyzozýmový dimér na navodenie nešpecifickej stimulácie imunitného systému jednou alebo viacerými podaniami prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu prirodzene sa vyskytujúcich ochorení rýb a včiel.

Experimenty in vivo v niektorých prípadoch, napríklad kde včely boli poškodené nejakými chemikáliami alebo nežiadúcimi bioaktívnymi látkami, ako sú veľajšie produkty podávaných liečiv, ukázali, že by bolo vhodné liečiť ryby vysoko purifikovaným lyzozýmovým dimérom opísaným vo VO91/10731, ktorý obsahuje asi 10 % hmotn. alebo menej monomérnej formy lyzozýmu. Aby sa znížili náklady v chove rýb a/alebo pestovaní včiel by však bolo tiež prijateľné podávať prípravok obsahujúci lyzozýmový dimér s nižšou čistotou, pokiaľ sa podáva v dávke, ktorá nemá vedľajšie účinky vzhľadom na prítomnosť toxických sprievodných látok, najmä lyzozýmového monoméru.

Tu spomínaný lyzozýmový dimér možno podávať pacientom v prípade indikácie priamo, alebo ho možno použiť na výrobu farmaceutických prostriedkov použiteľných v bežnej galenickej forme. Gély, masti alebo tekuté prípravky obsahujú lyzozýmový dimér výhodne v koncentrácii asi 0,01 až 10 mg/ml a často v koncentrácii asi 0,1 až 1,0 mg/ml. Zvyčajne sa pripravujú ako sterilné a apyrogénne prípravky a voliteľne obsahujú aspoň jedno fyziologicky prijateľné rozpúšťadlo a/alebo nosič a/alebo aspoň jednu vhodnú konzervačnú látku.

Farmaceutické prostriedky s obsahom lyzozýmového diméru sú vhodné a určené v prvom rade na povrchové a/alebo parenterálne použitie, zahrňujúce miestne injekčné podávanie, napríklad v blízkosti solidného tumoru, alebo externé podávania na povrch tela vrátane podkožnej injekcie. Intravenózne injekcie môžu nahradiť alebo doplňujúco podporiť povrchové podávania v priebehu liečby. Ukázalo sa však ako veľmi účinné podávať prípravky s obsahom lyzozýmového diméru na mukózne membrány, výhodne inhalačné (nazálne, do úst, na mukózu faryngu) vo forme tekutých prípravkov, alebo povrchovou aplikáciou (t-j- na vaginálnu, cervikálnu mukózu) alebo aplikovaním tekutých alebo krémových prípravkov alebo tampónov impregnovaných lyzozýmovým dimérom. V niektorých prípadoch sa považuje za vhodné podávať lyzozýmový dimér perorálne, výhodne vo zvyčajných galenických formách, ako sú napríklad tablety, kapsle alebo dražé alebo vo forme peliet, granúl, vločiek alebo ako prášok. Tieto tuhé prípravky často obsahujú účinné liečivo v množstve od asi 0,01 do 10 mg, výhodne asi od 0,01 do 1,0 mg /g celkového prípravku. Tiež je výhodné, aby tieto prípravky obsahovali aj najmenej jeden vhodný nosič a/alebo konzervačnú látku a/alebo bežné aditíva, ako sú napr. ochucovadlá alebo farbivá. V prípade liečby rýb možno tuhé prípravky pridať k potrave. Alternatívne alebo doplnkovo možno lyzozýmový dimér rozpustiť vo vode nádrže, kde sú ryby, pretože sa uvažuje, že účinné liečivo môže byť tiež rezorbované žiabrami rýb. V prípade chovov včiel možno lyzozýmový dimér podávať rozpustením tuhých prípravkov v pitnej vode, čaji, cukrových roztokoch alebo iných bežných tekutinách pripravených pre včely, napr. ako náhrady potravy. Možno ho však tiež pripraviť ako vhodne koncentrovaný vodný roztok a zmiešať s medom, aby sa zabezpečil príjem liečiva u včiel.

Prípravok pre perorálne použitie môže byť aj vo forme osmotického systému. V určitých prípadoch, napríklad pri prevencii a/alebo liečbe rakoviny močových ciest môže byť vhodnou a prospešnou aj aplikácia antiseptických drenáži alebo tampónov impregnovaných účinnou dávkou vysoko purifikovaného lyzozýmového diméru.

Rôzne typy vyššie spomenutých prípravkov s obsahom lyzozýmového diméru sa výhodne podávajú v jednej alebo opakovanej dávke od asi 0,005 do 0,5 mg/kg telesnej hmotnosti, najmä v dávke od asi 0,01 do 0,1 mg/kg telesnej hmotnosti. Bez ďalšieho komentára platí, že požadovaná koncentrácia aktívneho lyzozýmového diméru vo farmaceutickom prípravku závisí v prvom rade od hmotnosti pacienta alebo zvieraťa a od druhu liečby alebo profylaxie navrhnutej pre konkrétny prípad. Vo väčšine prípadov sú však vyššie spomenuté škály kon centrácií pre správnu liečbu dostatočné. Mohlo by však byť nevyhnutné, najmä vo veterinárnej medicíne, zvýšiť koncentrácie prípravku s obsahom diméru v zodpovedajúcom rozpúšťadle, t.j. až na asi 20 mg/ml tekutiny alebo masti. Aby sa toto dosiahlo, možno objem prípravku, ktorý má byť podávaný, udržiavať na minimu z dôvodov ľahkého zaobchádzania.

Ak je to možné, je výhodnejšie použiť kombinovaný postup podávania v porovnaní s jednorazovou liečbou, či už perorálnou, parenterálnou alebo povrchvou aplikáciou.

Vzhľadom na v zásade netoxickú povahu vysoko purifikovaných prípravkov s obsahom lyzozýmového diméru možno tieto prípravky podávať dlhú dobu, t.j. mesiace alebo roky, bez toho, aby zapríčiňovali škodlivé vedľajšie účinky. Časový rozvrh profylaktického alebo terapeutického podávania liečiva môže byť bežne v rozmedzí od podávania viackrát denne až po dávkovanie v týždňových a mesačných dávkach a tieto intervaly môžu byť dokonca dlhšie, v závislosti od konkrétneho pacienta a naliehavosti liečby, ako aj od účinnosti imunostimulácie lyzozýmovým dimérom.

Ako bolo naznačené vyššie, predkladaný vynález vyplýva aspoň čiastočne z dostupnosti vysoko purifikovaného lyzozýmového diméru. Prekvapujúci rozdiel v kvalite prípravku a najmä v podiele nežadúceho monoméru lyzozýmu demonštruje obr. 1:

pruh 1 predstavuje LMV škvrny bielkovinových štandardov: fosforyláza B 142 000 daltonov, BSA 97 000, ovalbumín 50

000, uhlíková anhydráza 35 100, sójový trypsínový inhibítor

700, lyzozým 21 900 (Biorad, USA);

pruhy 2 a 3 predstavujú purifikovaný lyzozýmový dimér LYDIUM KLP^602 (KLP-602), podiel 506449, laboratórna kontrola; pruh 2 nanesený 6,6 pg a pruh 3 19,8 pg;

pruhy 4a 5 predstavujú inú sériu KLP-602, pruh 4 nanesený 6,6 pg a pruh 5 19,8 pg;

pruhy 6a 7 predstavujú prípravok s obsahom lyzozýmového diméru (KIV-607) vyrobeného podľa Sorrentina et al., Eur. J. Bioch. 124, 183-189 (1982); pruh 6 nanesený 6,6 mg a pruh 7 19,8 pg.

Prípravok purifikovaného lyzozýmového diméru obsahuje 4 x viac diméru v porovnaní s výrobkom ΚΙV-607, kým porovnaný výrobok ΚΙV-607 obsahuje 6 x viac monoméru ako KLP-602.

Prehľad obrázkov na výkrese

Obr. 1 znázorňuje porovnanie čistoty prostriedkov lyzozýmového diméru vyrobených podľa dvoch predchádzajúcich technológií.

Kvôli lepšiemu porozumeniu slúžia nasledovné príklady. Samozrejme, tieto príklady slúžia na ilustráciu a nemožno ich považovať za limitujúce z hľadiska vynálezu v žiadnom zmysle.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Lyzozýmový dimér (KLP-602) v liečbe lymfatickej leukémie u AKR myší.

Materiál a metódy

Pri sledovaní boli použité sedemmesačné myši obidvoch pohlaví leukemického kmeňa AKR naočkované Graffi vírusom z Centra pre chov zvierat, Ústav imunológie a experimentálnej terapie, Poľská akdémia vied, Vroclaw. U AKR myší sa vyskytuje skorá aktivácia endogénneho leukemického vírusu, ktorá vedie ku klinických manifestáciám lymfatickej leukémie vo veku sedem až deväť mesiacov. Myši boli rozdelené do troch skupín, po 30 zvierat v každej skupine:

Skupina I (experimentálna) zvieratám bola podaná jedna dávka KLP-602 20 Q gg/kg v 0,3 cm PBS subkutánne;

Skupina II (experimentálna) zvieratá dostali KLP-602 dvakrát, v tej istej dávke ako skupina 1;

Skupina III (kontrola)

O

- zvieratá dostali 0,3 cnr PBS dvakrát.

Myši boli usmrtené vykrvácaním 3 a 6 týždňov po poslednej injekcii KLP-602 (10 myší z každej skupiny). 10 myší z každej skupiny sa ponechalo nažive.

Uskutočnili sa nasledovné hodnotenia:

1. Meranie celkovej telesnej hmotnosti a hmotnosti vnútorných orgánov, ako sú pečeň, slezina, týmus a externé cervikálne lymfatické uzliny, so stanovením pomeru hmotnosti orgánu k celkovej telesnej hmotnosti. Pomer terapeutickej aktivity sa hodnotil za použitia vzorca L/K x 100 %, kde L je priemerná doba prežívania myší liečených KLP-602 a K je priemerná doba prežívania kontrol.

2. Histopatologické hodnotenia biopsií pečene, sleziny, týmusu a lymfatických uzlín. Rezy boli farbené H+E metódou pre retikulárne vlákna podlá Gomoriho.

3. Hladina volných radikálov v sére bola stanovená chemiluminiscenčnou metódou /Chl), ktorá umožňuje detegovať veľmi slabú fotoluminiscenciu séra.

4. Fagocytárna aktivita polymorfonukleárov (PMN) bola stanovená za použitia NBT a chemiluminiscencie (Chl).

Výsledky:

Jednodávkové (skupina I) a dvojnásobné (skupina II) subkutánne podávanie KLP-602 vysoko leukemickému AKR kmeňu myší v dávke 20gg/kg zapríčinilo významný nárast telesnej hmotnosti a zníženie hmotnosti vnútorných orgánov, ako sú: slezina, týmus, lymfatické uzliny a pečeň (posledne menovaný orgán bol štatisticky nevýznamný) v porovnaní s kontrolnou skupinou zvierat (skupina III), meranou 3 týždne po štúdii (tabuľka 1).

Zvýšenie celkovej telesnej hmotnosti liečených skupín, zníženie hmotnosti sleziny, týmusu a lymfatických uzlín v skupine I a zvýšenie hmotnosti pečene a týmusu v skupine II, pri porovnávaní 6 týždňov po štúdii (tabuľka 1).

Tabuľka 2 vyjadruje pomer hmotnosti vnútorných orgánov k celkovej hmotnosti. Po 3 týždňoch sa v skupine 2 (kontrola) zaznamenalo zýšenie hmotnosti týmusu v porovnaní s obidvoma experimentálnymi skupinami (I a II). Po 6 týždňoch sa prejavilo zvýšenie hmotnosti sleziny, týmusu a lymfatických uzlín v skupinách II a III v porovnaní so skupinou I.

Histopatologické hodnotenia uskutočnené po 3 a 6 týždňoch preukázali miernu (u experimentálnych skupín) a výraznú (v skupine kontrol) kolonizáciu cervikálnych lymfatických uzlín, týmusu a sleziny lymfoidnými bunkami. Avšak, leukemické infiltráty v pečeni sa zistili iba u kontrol. Lymfoidné bunky mali oválne alebo okrúhle jadrá s množstvom nukleolov a atypických mitotických znakov. Tieto bunky boli v malom množstve sprevádzané málo diferencovanými centroblastickými bunkami, retikulárnymi bunkami a ostrovčekmi proliferujúcich megakaryocytov v slezine. Stromy lymfatických orgánov, ako sú slezina, lymfatické uzliny a týmus obsahovali malé množstvo tenkých retikulárnych vlákien.

Chemiluminiscenčné hodnotenia:

Aktivita voľných radikálov v sére kontrolných myší bola a

K = 18 x 10 po troch týždňoch štúdie. V skupine II bola aktivita voľných radikálov nižšia (K =10 x 10“ ³). Po 6 týždňoch bola hladina voľných radikálov u kontrolnej skupiny K = 10 x 10^-3, nižšia bola v skupine II (K = 16 x 10^-3), n

a mierne zvýšená v skupine I (K = 1,5 x 10 ) . Významné zvýšenie fagocytárnej aktivity PMN sa zaznamenalo v obidvoch experimentálnych skupinách v porovnaní s kontrolnou skupinou po 3 týždňoch a bolo: 4688 Chl (skupina I), 3486 Chl (skupina II) a iba 2052 Chl pre kontrolnú skupinu. Po 6 týždňoch bola fagocytárna aktivita v skupine II rovnako vysoká (3264 Chl) a bola nižšia v skupine I (2477 Chl). Významné zvýšenie fagocytárnej aktivity namerané NBT testom bolo zaznamenané po 3 týždňoch v obidvoch liečených skupinách a bolo 0,27 a 0,26 v skupinách I a II. Po 6 týždňoch bolo zvýšenie fago cytárnej aktivity nižšie a vyskytovalo sa iba u skupiny II. Fagocytárna aktivita v kontrolnej skupine bola 0,22.

Index terapeutickej účinnosti KLP-602 bol 128% a 150% v skupinách la II, čo je nad minimom 125%. Toto naznačuje výrazné imunostimulačné vlastnosti KLP-602 a oprávňuje túto látku na ďalšie sledovania.

Leukemické infiltráty boli výzmane menšie v obidvoch experimentálnych skupinách v porovnaní s kontrolnou skupinou a u niektorých myší sa dokonca nevyskytli. Leukemické infiltráty boli prítomné v týmuse, slezine a v lymfatických uzlinách. Okrem toho sa našli v pečeni kontrolných zvierat. Výsledky sledovania naznačujú, že KLP-602 môže čiastočne inhibovať alebo odďaľovať progresiu leukémie u AKR myší, naopak, rýchle rozšírenie lymfatických orgánov s morfologickými zmenami typickými pre diferencovanú lymfoidnú leukémiu sa vyskytli u zvierat liečených placebom.

Navyše, KLP-602 inhibuje zvyšovanie voľných radikálovv sére myší. Inhibuje procesy vo voľných radikáloch podobným spôsobom ako antioxidanty typu vitamínu E, C a selénu. Je možné, že inhibícia proliferácie leukemickej bunky u AKR myší liečených KLP-602 závisí od inhibície procesov vyvolaných voľnými radikálmi. U kontrolných myší (bez KLP-602) bola hladina voľných radikálov vyššia a v korelácii s intenzitou ochorenia.

KLP-602 tiež stimuluje fagocytárnu aktivitu systému mononukleárnych fagocytov (MPS), ktorá bola meraná 2 nezávislými spôsobmi, NBT a Chl, a teda dochádza k stimulácii bunkovej imunity. Môže tiež modulovať syntézu TNF. Navyše, tumor rejekčné antigény prítomné na povrchu leukemickej bunky možno rozoznať pomocou T-buniek spolupracujúcich s MPS. Medzi takéto T-bunky patria tumor antiinfiltrujúce lymfocyty (TIL), o 50 až 100 % účinnejšie ako lymfokínom aktivované zabíjače (LAK). Majú CD₄ alebo CDg alebo zmiešaný fenotyp a exprimujú IL-2 receptor na svojom povrchu. Doposiaľ nie je známe, prečo sú paralyzované neoplastickými bunkami.

Retikuloendoteliálny systém s MPS bunkovou stimuláciou je základným imunologickým a antivírusovým mechanizmom. Sti mulácia týchto buniek vyúsťuje do tvorby interferonu a nepriamo aktivuje špecifické a nešpecifické imunologické procesy, závislé od B-buniek, T-buniek alebo NK buniek.

MPS bunky sa zúčastňujú na imunologických procesoch prostredníctvom svojich receptorov, ako sú Fc receptory, C-j receptory alebo receptory triedy II HLA a tiež lektíny, transferíny, urikináza, inzulín a štyridsať ďalších menej známych receptorov. Akékoľvek zmeny ich expresie a afinity naznačujú aktiváciu buniek. MPS bunky môžu fagocytizovať NO-senzitívne bunky, pretože môžu syntetizovať túto látku. Aktivované fagocyty sa nazývajú nahnevané makrofágy alebo krvilačné bunky. MPS bunky môžu rozrušovať vírusy prostredníctvom svojich cytotoxických a cytolytických vlastností, nedostatočnou tvorbou viriónov a syntézou interferonu.

Sľubné výsledky predbežnej štúdie na AKR myšiach naznačujú, že KLP-602 možno úspešne použiť pri liečbe leukémie u AKR myší.

Tabuľka 1

Celková telesná hmotnosť (g) a hmotnosť vnútorných orgánov (mg) u kontrol a experimentálnych myší (x±S; horné hodnoty predstavujú S, spodné x)

	tri týždne	6 týždňov
skupina	I	II	III	I	II	III
celková tel.	25,27	26,20	23,96	26,77	27,30	25,57
hmotnosť	2,22	1,67	1,23	1,10	2,34	1,68
slezina	0,07	0,08	0,09	0,07	0,23	0,22
	0,00	0,02	0,01	0,00	0,01	0,00
týmus	0,06	0,07	0,08	0,08	0,21	0,15
	0,01	0,02	0,02	0,01	0,03	0,07
lýmf. uzl.	0,04	0,04	0,05	0,04	0,07	0,08
	0,00	0,00	0,01	0,00	0,04	0,04
pečeň	1,38	1,36	1,43	1,61	1,89	1,67
	0,15	0,38	0,05	0,18	0,42	0,15

Tabuľka 2

Pomer hmotnosti vnútorných orgánov k celkovej telesnej hmotnosti u kontrol a u experimentálnych myší (%)

	tri týždne	6 týždňov
skupina	I	II	III	I	II	III
slezina	0,30	0,31	0,37	0,29	0,84	0,87
týmus	0,23	0,26	0,33	0,33	1,06	0,61
lýmf. uzl.	0,18	0,18	0,21	0,15	0,26	0,26
pečeň	5,49	5,25	5,81	6,02	6,35	6,40

Príklad 2: Účinok prípravku vysoko purifikovaného lyzozýmového diméru (KLP-602) na rast vlasov pri lopécii areata.

Sledovanie sa uskutočnilo so zámerom zistiť, či balzam s obsahom KLP-602 pôsobí na rast vlasov pri alopécii areata. Okrem toho sa stanovila znášanlivosť tohto balzamu pri aplikácii na kožu.

Materiál a metódy:

Sledovanie predstavovala kontrolovaná, komparatívna klinická štúdia. Do štúdie bolo zahrnutých 12 osôb (dvaja muži a desať žien) s lopéciou areata v telogen štádiu u inak zdravých ľudí. Boli vo veku od 19 do 50 rokov. Dvanásť osôb (traja muži a deväť žien) s alopéciou areata lieD čených Minoxidilom slúžilo ako kontrolná skupina. Boli vo veku od 19 do 49 rokov. Rozdelenie osôb podľa pohlavia a veku bolo v obidvoch skupinách podobné.

Kritériá výberu pacientov: kritériá pre zahrnutie do štúdie:

1. Alopécia areata v telogen štádiu;

2. Vek 18 až 50 rokov.

Kritériá pre vylúčenie zo štúdie:

1. Alopécia areata v štádiu dystrofie;

2. Iný druh alopécie;

3. Akékoľvek kožné ochorenia.

Súčasné užívanie liekov:

Súčasné užívanie liekov nebolo dovolené, okrem potreby liečby pre zachovania zdravia.

Číselné označenie účastníkov štúdie:

Počas štúdie boli osoby, ktoré splnili kritériá výberu, označené číslami v sledovaných skupinách, v postupnom poradí. Riešiteľ štúdie použil potom zodpovedajúce číslo na vyznačenom mieste v každom formulári pre správu o štúdii.

Podávanie liečby počas klinického skúšania:

Vlasový balzam vyrobený firmou NIKA podľa pôvodného predpisu bol poskytnutý v 100 ml rovnakých plastových fľašiach s malým kalibrovaným kvapátkom.

0,05 %-ný KLP-602 loción bol aplikovaný na plešinu 3 x denne podľa inštrukcií zúčastneného dermatológa.

n

2%-ný roztok MINOXIDIL u bol aplikovaný 2 x denne na poškodené miesto na koži.

Liečba trvala 16 zýždňov. Po jej skončení boli pacienti sledovaní ďalšie 2 mesiace.

Hodnotenie bezpečnosti

Pacienti obidvoch skupín prešli kompletnou lekárskou prehliadkou pred začiatkom a po skončení liečby. Pred liečbou a po nej sa u nich rutinnými laboratórnymi testami hodnotili vzorky moču a krvi. Laboratórne sledovania zahrňovali nasledovné testy: Hematológia: hemoglobín, hematokrit, celkový a diferenciálny počet bielych krviniek.

Sérová biochémia:

ALT (GPT), AST (GOT), alkalická fosfatáza, bilirubín

Moč: indikátorová analýza moču na bielkovinu, krv a glukózu.

Pacienti boli v priebehu terapie prehliadnutí každý mesiac počas 4 mesiacov liečby a počas nasledujúcich 2 mesiacov. Pri každej návšteve informovali pacienti o prítomnosti celkových alebo lokálnych vedľajších účinkov, ako sú svrbenie, pálenie, pichanie; liečené oblasti boli hodnotené na erytém alebo iné miestne vedľajšie účinky.

Hodnotenie účinnosti liečby:

Parametre účinnosti:

1. Primárnym ukazovateľom liečby bol rast vlasov.

2. Sekundárnym parametrom bola doba hojenia zmenenej pokožky na temene hlavy.

3. Fotografická dokumentácia bola urobená v nasledovných úsekoch štúdie:

pred aplikáciou vlasového balzamu s KLP-602 v čase rastu vlasov pri ukončení aplikácie vlasového balzamu s KLP-602

Uskutočnilo sa mikroskopické hodnotenie (trichogram).

Štandardizované trichogramy vlasov odobrané z miesta ohraničenia lézií alopécie areata predstavujú najužitočnejšiu informáciu o priebehu a závažnosti ochorenia a tiež o účinnosti liečby.

Pri každej návšteve bol skalp hodnotený na rast vlasov, čo bolo kategorizované nasledovne:

- žiadny

- slabý- viditeľná obnova rastu (pramienok alebo málo jednotlivých vlasových korienkov)

- mierny -nekompletný (čiastočný)

- kompletný kozmeticky akceptovateľný rast vlasov bol definovaný ako dostatočné pokrytie pokožky vo vlasovej časti hlavy a prekrytie oblastí, ktoré zostali bez vlasov.

Výsledky:

Všetci jedinci zahrnutí do štúdie (12 liečených 0,05% KLP-602 a 12 z kontrolnej skupiny liečených 2% roztokom Minoxidilu) absolvovali sledovanie počas obdobia 4-mesačnej liečby a 2 mesiace po jej ukončení.

Účinnosť

Stanovenie účinnosti liečby riešiteľom štúdie na konci skúšania bolo z hľadiska účinnosti najdôležitejšie. Celkovo sa u 8 z 12 osôb zahrnutých do štúdie (66%) v KLP-602 skupine a u 6 z 12 osôb (50%) v skupine, kde sa podával Minoxidil, zistil zvýšený rast vlasov v priebehu štúdie. Z týchto v KLP-602 skupine u 4 (33%) a v Minoxidilovej skupine u 3 (25%) sa tento rast považoval za úplný, kozmeticky akceptovateľný. Čiastočný rast vlasov sa pozoroval u 3 z 12 jedincov v KLP-602 skupine (25%) a u 3 v Minoxidilovej skupine (25%). U jedného jedinca v skupine KLP-602 (9%) sa zistil minimálny rast vlasov. U 4 z 12 (33%) v skupine KLP-602 sa nepozoroval žiadny rast vlasov a v skupine Minoxidilu to bolo u 6 osôb z 12 (50%).

V KLP-602 skupine s alopéciou v rozsahu menej ako 25% skalpu sa rast vlasov obnovil u 8 z 8 osôb , v skupine s Minoxidilom to bolo u 6 zo 7. U viac ako 25% osôb v obidvoch skupinách sa rast vlasov s rozsahom alopécie viac ako 25% neobnovil.

Priemerná doba pre začiatok rastu vlasov v korelácii s trvaním liečby bola v obidvoch skupinách v rozmedzí 1 až 3 mesiacov. U jednej ženy predstavovala dĺžka vlasov po 1 mesiaci 5 mm a plešina sa pokryla hustým vyrastaním vlasov.

Pri kontrolnej návšteve po 2. mesiaci sa u tejto ženy objavila alopécia totalis (výsledok emocionálneho stresu - rozvod) a na ďalšiu liečbu nereagovala, ukončila svoje zaradenie do štúdie s negatívnym výsledkom. U jedného pacienta z Minoxidilovej skupiny sa obnova rastu vlasov zistila po 1 mesiaci terapie. U 4 pacientov v KLP-602 skupine došlo k obnove rastu vlasov po 2 mesiacoch liečby. Po 3 mesiacoch štúdie sa obnova rastu vlasov zistila u dvoch osôb v KLP-602 skupine a u troch zo skupiny Minoxidilu.

Bezpečnosť

Počas liečby a nasledujúceho obdobia sa nezistili žiadne celkové vedľajšie účinky. Ani na začiatku, ani na konci štúdie neboli v obidvoch skupinách zistené žiadne abnormality krvných alebo močových hodnôt.

Miestne vedľajšie účinky zistené počas štúdie: Jedna zo žien v KLP-602 skupine si sťažovala na pálenie a pichanie na pokožke hlavy v období 2. mesiaca liečby. Tieto príznaky pripisovala noseniu novej parochne. Táto precitlivelosť zmizla v priebehu 2 týždňov, liečba sa neprerušila a pacientka dokončila štúdiu s dobrým výsledkom. Jeden z pacientov si sťažoval na mastenie vlasov počas liečby Minoxidilom, pri hodnotení pokožky hlavy neboli zistené žiadne výzanmné klinické príznaky. Pacient svoje ťažkosti dával do súvisu s liečbou, ale chcel v nej pokračovať.

Neboli zaznamenané žiadne zistenia korelácie medzi obnovením rastu vlasov a vekom pacientov, lokalizáciou plešiny a trvaním alopécie, ktorá bola krátka a podobná v obidvoch skupinách a trvala od 1 týždňa do maximálne 1 roka. Všetci jedinci, ktorí nereagovali na liečbu, mali alopéciu v anamnéze najmenej 5 rokov (5 až 15 rokov).

Diskusia

Hodnotila sa bezpečnosť a účinnosť povrchovo aplikovaného 0,05 % KLP-602 na rast vlasov u pacientov s alopéciou areata a táto bola porovnávaná s účinnosťou 2 % Minoxidilu počas 4-measačnej liečby.

Vlasový balzam s obsahom KLP-602 bol u pacientov dobre znášaný. U 66 % pacientov liečených 0,05 % KLP-602 lociónom došlo počas štúdie k zvýšeniu rastu vlasov v porovnaní s 50% úspešnosťou v skupine Minoxidilu.

Kozmeticky akceptovateľný rast vlasov sa zistil u 33 % pacientov v KLP-602 skupine a u 25 % v skupine Minoxidilu. Lepšie výsledky sa zaznamenali u pacientov s rozsahom alopécie menším ako 25 % zmeneného povrchu hlavy. 0,05 % KLP-602 loción bol jednoducho povrchovo aplikovateľný a nespôsoboval žiadne miestne ani celkové vedľajšie účinky. Berúc do úvahy krátkodobosť štúdie (16 týždňov) sú výsledky veľmi povzbudivé .

Závery

1. Vlasový balzam s obsahom KLP-602 bol dobre znášaný a nespôsoboval žiadne vedľajšie účinky.

2. Povrchová aplikácia 0,05 % KLP-602 bola jednoduchá a bezpečná.

3. Počas štúdie neboli zistené žiadne miestne alebo celkové vedľajšie účinky, ani odchýlky v laboratórnych hodnotách.

4. Z dôvodov krátkej doby podávania (4 mesiace) a 2 mesiacov ďalšieho sledovania nebolo možné kompletné vyhodnotenie výsledkov, hoci táto doba bola dostatočne dlhá na zistenie účinnosti liečby, ktorá je sľubná.

5. Výsledky získané v skúšaní ukázali, že 0,005 % KLP-602 loción je porovnateľný s 2 % roztokom Minoxidilu a je dokonca účinnejší pri alopécii areata.

6. Preklinické skúšky a výsledky získané v štúdii ukazujú, že KLP-602 pri povrchovej aplikácii indukuje rast vlasov u pacientov s alopéciou areata.

Súhrn

Štúdia sa uskutočnila z dôvodov stanovenia účinnosti a znášanlivosti vlasového balzamu s obsahom KLP-602 na rast vlasov pri alopécii areata. Aplikácie 0,05 % KLP-602 lociónu 3 x denne boli všeobecne dobre znášané počas 4-mesačnej doby liečenia. Nezistili sa žiadne miestne ani celkové vedľajšie účinky. U skupiny liečenej KLP-602 bol zistený lepší rast vlasov ako v skupine liečenej Minoxidilom. Obnovenie rastu vlasov sa zistilo u 66 % jedincov liečených 0,005 % KLP-602. Percento pacientov, ktorí reagovali na liečbu miernym alebo hustým obnoveným rastom, bolo vyššie u pacientov, u ktorých plešina zahrňovala menej ako 25 % povrchu hlavy. Zdá sa, že 0,05 % KLP-602 je významným prostriedkom pre liečbu alopécie areata.

Príklad 3: Profylaktická aplikácia lyzozýmového diméru na navodenie nešpecifickej stimulácie imunitného systému rýb.

Návrh testu

Do pokusu bolo zahrnutých 300 zdravých rýb druhu dúhový pstruh (Oncorhyncus mykiss, čeľaď salmonidae) s hmotnosťou 90 až 100 g každý. Lyzozýmový dimér vyrobený podľa V091/10731 (tu označený ako KLP-602) s obsahom asi 10 % hmotn. alebo menej sprievodných vedľaších produktov, v zásade bez monomérnej formy lyzozýmu, bol rozpustený v PBS na prípravu inj. roztokov pre podávanie 10 a 100 mg lyzozýmového diméru/kg hmotnosti, vhodných pre intraperitoneálne injekcie rybám. Liečivo bolo podané 1 x denne. V liečebnom protokole boli rôzne skupiny rýb, ktorým sa liečivo aplikovalo alebo iba 1 deň, v 1. a 3. deň, alebo v 1., 3. a 5. deň. Ryby v kontrolnej skupine lyzozýmový dimér nedostávali.

Po 1, 2, 3 a 4 týždňoch po podaní poslednej injekcie sa z každej liečenej skupiny, vrátane kontrol, vybralo 10 jedincov. Ryby boli znehybnené a z kaudálnej vény im bolo pomocou heparinizovanej vakuety (Greiner) odobraných asi 2 ml krvi. Stanovila sa fagocytárna schopnosť PMN a MN buniek, respiračná absorpčná aktivita pre kyslík a potenciálna smrtiaca aktivita PMN a MN buniek, MPO aktivita v PMn fagocytoch a tiež hladiny lyzozýmu a gamaglobulínu v sére.

Okrem toho bolo 20 jedincov z každej skupiny podrobených testu vystavenia sa ochoreniu (furunkulóza). Ryby dostali jednu intraperitoneálnu injekciu bakteriálnej suspenzie Aeromonas salmonicida, narastenej na nutričnom bujóne za 48 hod. Stanovila sa mortalita (úmrtnosť) zvierat a jej súvis s bakteriálnou injekciou bol potvrdený izoláciou patogénov z obličiek mŕtvych zvierat.

Výsledky

V skupinách liečených KLP-602 boli všetky vyššie spomenuté imunologické parametre významne zvýšené (P < 0,05) vzhľadom na zodpovedajúce parametre u kontrolnej skupiny.

Tento prekvapujúci výsledok bol zistený vo všetkých skupinách, t.j. po jednej, dvoch alebo troch aplikáciách KLP-602 a pretrvával počas celého obdobia sledovania až do 4 týždňov po poslednej injekcii.

Mortalita rýb v skupinách liečených KLP-602 bola tiež významne nižšia ako v kontrolnej skupine. Respiračná absorpčná aktivita bola dokonca výrazne vyššia ako boli fagocytárne indexy a hladiny neutrofilmyeloperoxidázy (MPO) u skupín liečených dvoj- a trojnásobným podaním KLP-602.

Známa citlivosť dúhového pstruha voči vystaveniu virulentnej baktérii A. salmonicida a výsledky zaznamenané u skupín profylaktický liečených prípravkom lyzozýmového diméru naznačujú, liečivo bolo v skutočnosti schopné indukovať krátkodobú ochranu pred mikrobiálnou nákazou. Ďalej sa ukázalo, že ochrana bola vyššia u skupín, ktoré dostávali dve alebo tri dávky KLP-602 v porovnaní so skupinami, ktoré dostali iba jednu dávku.

Záver:

Podávanie vysoko purifikovaného lyzozýmového diméru rybám zvyšuje nešpecifické obranné mechanizmy a významne zlepšuje ochranu pred mikrobiálnou nákazou, napríklad spôsobenou A. salmonicida (spôsobujúcou furunkulózu).

Toto zistenie má velký význam pre profylaktickú a terapeutickú liečbu rýb v chovoch rýb, z dôvodov zníženia strát zapríčinených často sa vyskytujúcimi ochoreniami u rýb, najmä v jarnom období.

Príklad 4: Terapeutické podávanie lyzozýmového diméru na navodenie nešpecifickej stimulácie imunitného systému u rýb

Návrh testu

Do tejto komparatívnej štúdie nešpecifických obranných mechanizmov v priebehu prirodzene sa vysyktujúcej infekcie IPNV (vírus infekčnej pankreatickej nekrózy) bolo zahrnutých 200 dúhových pstruhov pri podávaní prípravku obsahujúceho dimerizovaný lyzozým (KLP-602). Po identifikácii IPNV infekcie bola časť rýb liečená KLP-602, kým kontrolná skupina ostala bez liečby. Pomocou imunologických a serologických metód sa analyzovali hlavne ukazovatele charakterizujúce nešpecifické bunkové a humorálne obranné mechanizmy. Tieto metódy zahrňovali týždenné stanovenie celkového počtu leukocytov, relatívny počet leukocytov, fagocytárnej schopnosti PMN a MN buniek, respiračnej absorpčnej aktivity a potenciálnej usmrcovacej aktivity, MPO v neutrofiloch, aktivity lyzozýmu a ceruloplazmínu v plazme, celkových hladín bielkovín a gamaglobulínu, počas 2-mesačnej doby doby sledovania.

Replikované skupiny dúhového pstruha boli kŕmené stravou s obsahom nešpecifikého imunostimulátora KLP-602 v dávke 20 pg/kg telesnej hmotnosti. Lyofilizované vzorky KLP-602 boli podávané spolu s potravou alebo perorálne v tuhej forme (vločky, pelety) alebo rozpustené vo vode nádrží pre chov, t.j. vo vodnom roztoku, počas 7 dní. Predpokladá sa, že liečivo by mohlo byť rezorbované aj prostredníctvom žiabrov rýb.

Ďalej boli pstruhy testované z hľadiska zmien v nešpecifických bunkových a humorálnych obranných mechanizmoch v týždňových intervaloch. V každom čase sa náhodne vybralo na imunologické testovanie a identifikáciu IPNV 10 rýb. Okrem toho sa všetky ryby denne sledovali na nezvyčajné správanie, morfologické zmeny a mortalitu.

Výsledky

U rýb, ktoré boli infikované IPNV bolo možné zistiť imunosupresívny účinok. Počas celého sledovaného obdobia boli ukazovatele nešpecifických bunkových a humorálnych obranných mechanizmov významne znížené, pričom po 1 týždni pridávania lyzozýmového diméru do potravy sa v porovnaní s kontrolnou skupinou významne zvýšili niektoré ukazovatele, napr. hladina ceruloplazmínu, respiračná absorpčná aktivita pre kyslík, hladina imunoglobulínu a aktivita lyzozýmu. Po podaní KLP-602 sa jednoznačne identifikovali imunostimulačné účinky na nešpecifické obranné mechanizmy. Kumulatívna mor24 talita bola tiež najnižšia v skupinách, ktoré dostávali potravu s obsahom KLP-602.

Záver:

Ryby liečené pridaním lyzozýmového diméru (KLP-602) do potravy vykazovali pozotívne zmeny nešpecifických imunologických obranných mechanizmov. Tieto zmeny súviseli so zníženou mortalitou, t. j. naznačovali ochranu pred prirodzene sa vyskytujúcou infekciou IPNV, čo vedie k odporúčaniu ďalšieho vývoja a optimalizácie stratégie prevencie a/alebo liečby ochorení u rýb podávaním lyzozýmového diméru, ako tu bolo uvedené.

Claims

1. Použitie lyzozýmového diméru na výrobu farmaceutického prípravku na stimuláciu obranných mechanizmov nešpecifickej bunkovej a humorálnej imunity človeka alebo zvieraťa, pričom uvedená stimulácia zahrňuje zvýšenie fagocytárnej aktivity a zvýšenie aspoň jedného ukazovateľa vybraného zo • skupiny tvorenej hladinou ceruloplazmínu, aktivitou respiračnej prietrže, hladinou imunoglobulínu a aktivitou lyzozý- • mu a/alebo táto stimulácia zahrňuje reguláciu sérových hladín voľných radikálov.

2. Použitie podľa nároku 1, na prevenciu alebo liečbu ochorení vybraných zo skupiny pozostávajúcej z leukémie, porúch rastu vlasov, ochorení rýb a včiel.

3. Použitie podľa nároku 1, na prevenciu alebo liečbu imunosupresívneho účinku.

4. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že lyzozýmový dimér obsahuje asi 10 % hmotn. alebo menej nežiadúcich vedľajších produktov a je v zásade bez monomérnej formy lyzozýmu.

5. Použitie podľa nároku 2, vyznačujúce sa t ý m, že ochorením je leukémia indukovaná účinkom vírusu.

k

6. Použitie podľa nároku 5, vyznačujúce sa tým, že vírusom je retrovírus.

7. Použitie podľa nároku 2, vyznačujúce sa tým, že poruchou rastu vlasov je alopecia areata.

8. Použitie podľa nároku 2, vyznačujúce sa tým, že ochorenie u rýb patrí do skupiny furunkulózy alebo IPNV infekcie.

9. Použitie podľa nároku 8, vyznačujúce sa tým, že ochorenie rýb sa vyskytuje u rýb čeľade salmonidae.

10. Použitie podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že imunosupresívny účinok je vyvolaný mikrobiálnou infekciou.

11. Použitie podľa nároku 1, na výrobu farmaceutického prípravku na podávanie jednej alebo opakovaných dávok od asi 0,005 do 0,5 mg/kg telesnej hmotnosti človeku alebo zvieraťu.

12. Použitie podľa nároku 11, vyznačujúce sa tým, že dávka sa pohybuje v rozmedzí od asi 0,01 do 0,1 mg/kg telesnej hmotnosti.

13. Použitie podľa nároku 1, na výrobu farmaceutického prípravku vo forme gélu, masti alebo tekutého prípravku, na povrchové, perorálne alebo parenterálne podávanie, pričom tento prípravok zahrňuje najmenej jedno aditívum zo skupiny fyziologicky akceptovateľného rozpúšťadla, nosiča a vhodnej konzervačnej látky.

14. Použitie podľa nároku 13, na výrobu farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje uvedený lyzozýmový dimér v množstve od 0,01 do 10 mg/ml.

15. Použitie podľa nároku 13, kde uvedený farmaceutický prípravok obsahuje uvedený lyzozýmový dimér v množstve od asi 0,01 do 1 mg/ml.

16. Použitie podľa nároku 1, na výrobu farmaceutického prípravku v tuhej forme, ktorý je vhodný na perorálne podávanie a tento prípravok obsahuje najmenej jedno farmaceutický akceptovateľné aditívum vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nosiča a konzervačnej látky.

17. Použitie podľa nároku 16, kde uvedený farmaceutický prípravok obsahuje lyzozýmový dimér v množstve od 0,01 do 10 mg/g.

18. Použitie podľa nároku 10, na podávanie najmenej jednej dávky uvedeného prípravku jedincovi pred vypuknutím mikrobiálnej infekcie.

19. Použitie podľa nároku 10, na podávanie najmenej jednej dávky uvedeného prípravku jedincovi po zistení mikrobiálnej infekcie.

20. Použitie podľa nároku 10, na podávanie najmenej troch dávok uvedeného prípravku v podstate v rovnakých intervaloch jedincovi pred vypuknutím mikrobiálnej infekcie.