KR0142172B1 - 리보뉴클레아제 이량체를 만드는 개량된 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단량체 리보뉴클레아제 슈버리미데이터 결합시약으로 이량체 형성과정을 실시하는 것으로 이온교환수지 크로마토그래피를 통하여 단량체와 다량체를 여과시키고 전기영동법으로 반응의 진행을 감지하여 순수한 이량체 리보뉴클레아제 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다량의 새성물의 저렴한 가격으로 생산할 수 있는 장점이 있고 본 발명의 리보뉴클레아제 이량체는 리보뉴클레아제 단량체에 통상적으로 관련된 세포독성 없이 효과없이 바리어스와 박테리아 감염성 질환에 효과적인 요법적 역할을 할 수 있다.

Description

리보뉴클레아제 이량체를 만드는 방법

제1도와 2도는 본 발명에 따르는 이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 용출 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 바이러스와 세균감염을 치료하는데 사용할 수 있는 리보뉴클레아제(ribonuclease) 이량체의 제조와 방법에 사용되는 일련의 방법에 관계한다.

공지된 항체에 저항성이 있는 박테이라와 바이러스 질환의 다수의박테리아와 바이러스는 동물과 사람을 치료할 수 있는 새로운 형태의 약물을 만드는데 필요하다. 현재 사용되는 약물과 치료방법중에 각종질환으로 고통을 받는 환자에게 유익한 것으로 단량체형의 효소를 주입하는 것이 공지되어 있다. 특정효소의 활성을 감소시킬 수 있는 질병의 경우에는 이러한 방법이 필수적이된다. 효소는 유기체내에 대부분의 생체기능을 수행하는 촉매역할을 한느 활성단백질이다. 따라서 단독으로 또는 복합적으로 작용하는 각종효소는 이들의 생리화학적, 생리적 또는 생물학적 효과에 따라 분리되어야 한다.

공지된 많은 효소가운데 특정질병의 활성을 감소시키고 치료요법적 효과가 있는 것이 리보뉴클레아제이다. 리보뉴클레아제는 많은 동물과 식물유기체에 공통적으로 볼 수 있는 핵산효소이다.

리보뉴클레아제의 특성연구와 이 효소의 분리방법연구가 Schmidt와 McDonald에 의해 1950년대 중반부터 시작되었다. 이 효소를 기초로한다. 각종 연구중에서 종양성 조직에서는 이러한 리보뉴클레아제의 활성이 상당히 격감되는 것으로 밝혀졌다. 예로써 백혈병이 걸린 쥐에서 산성 리보뉴클레아제 활성이 상당히 감소되어 있었는데 이러한 동물의 지라조직에서 수득한 미토콘트리아와 마이크로좀에서 특히 두드러지게 발견되었다. 이와 같은 연구에서 알수 있듯이 리보뉴클레아제의 주입이 바이러스 백혈병과 관계한 증상을 예방하거나 치료하는데 효과가 있음을 제시한다.

불행하게도 이러한 효소의 단량체는 심각한 세포득성 효과가 있기 때문에 리보뉴클레아제의 이용하야 유익한 결과를 얻기가 실제로 힘이든다. 예를 들면 배양된 섬유아세포에서 최소로 작은양의 리보뉴클레아제를 주사할 경우에도 세포독성 효과가 나타났다. 분명하듯이 이 효소의 단량체형과 관게한 해독한 세포독성 효과를 가능한 최소로하고 리보뉴클레아제의 유익한 효과를 최대로하는 방법을 개발하는 것이 당면과제이다.

최근에는 항-바이러스성 또는 항세균성 성분물을 세포독성의 효과를 나타내지 않는 리보뉴클레아제에서 만들었는데 이것은 이효소의 이량체형을 기초로한 성분물이 된다. 리보뉴클레아제이량체 성분물은 감염성 질환의 치료에 매우 효과가 있는 것으로 밝혀졌고 동시에 리보뉴클레아제 단량체와 관계한 세포독성 효과는 나타나지 않았다. 다양한 치료에서 리보뉴클레아제의 이용은 PCT 출원 US 88/01785에 상술되어 있다.

기존의 리보뉴클레아제 단량체형에서 이량체형으로 만드는 몇가지 방법이 있으나 이때 중요한 제조방법의 요소는 적은 비용으로 효과적인 이량체를 다량 만드는 것이다. 따라서 단량체, 다량체 또는 다른 이물질과 같은 불순물의 양을 최소화하고 순수한 리보뉴클레아제 이량체의 양을 최대로 만들 수 있는 시스템의 개발이 바람직하다.

본 발명에 따르면 순수 리보뉴클레아제 이량체를 다량 만들 수 있는 효과적인 방법은 다음의 단계로 구성된다.:

a) pH가 적어도 9가 되는 완충용액에 다량체형 리보뉴클레아제를 첨가하여 리보뉴클레아제 용액을 만들고;

b) 용액의 pH는 9 또는 9 이상으로 유지시키면서 리보뉴클레아제 용액에서 리보뉴클레아제 단량체를 이량체화시키기 위해 디메틸서버리미데이트와 같은 결합제를 첨가하고;

c) 이량체 형성반응을 종결시키기 위해 pH를 약 7로 낮추고;

d) 용액을 이온교환 수지를 통과시킨 제1차 여과단계를 거쳐 리보뉴클레아제 이량체 수득함으로써 이량체 리보뉴클레아제를 분리 하고;

e) 이온 교환수지를 통과한 제1차 여과단계에서 수득된 생성물을 2차 여과시키고;

f) 2차여과 단계에서 생성된 고순도의 이량체 리보뉴클레아제를 수득한다.

상기 방법을 이용하여 다량의 정제된 리보뉴클레아제 이량체 생성물을 만들 수 있고 이 생성물은 각종 바이러스와 박데리아성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따르는 리보뉴클레아제 이량체형을 만들기 위해 현재 이용가능한 리보뉴클레아제 단량체를 시발물질로 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용된 리보뉴클레아제 단량체는 Serva Feine Biochemica, GmbH, Heidelberg No. 28260에서 구입하였다. 사용된 단량체는 리보뉴클레아제A로 구성되어 있거나 또는 각종 리보뉴클레아제를 이용할 수 있다. 리보뉴클레아제 단량체 용액을 준비하기 위해 실온에서 인산용충용액에 리보뉴클레아제 단량체를 용해시킨다. 이용한 완충용액은 0.1M 디소디움 하이드로겔 인산 디하이드레이트 완충용액이 적절하고 적절한 완충용액은 1000ml 물에 70g 디소듐 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트를 용해시킴으로써 만들 수 있다. 본 발명에 이량화 반응에 사용된 완충액과 시약의 실제양은 다양할 수 있는데 본 발명의 이량화 반응에는 5미터 디소듐 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트 완충용액에 40 내지 60g의 리보뉴클레아제 단량체를 용해시킨 것을 이용하였다. 단량체 용액의 pH는 적어도 9, 적절하게는 10이 적당하다. pH 조절은 0.1N 수산화나트륨을 이용 한다.

이량체 반응은 리보뉴클레아제 단량체 용액의 pH를 적어도 9 이상 적절하게는 10(±0.2)을 유지하면서 리보뉴클레아제 단량체 용액에 비례하여 슈버리미데이트 결합시약을 첨가하여 실행된다. 본 발명에 사용된 디메틸 슈버리미데이트가 적절하지만 다른종류의 슈버리미데이트 결합시약을 이용할 수도 있다. 상기 준비된 용액에 4-6g 디메틸 슈버리데이트를 단량체 용액에 첨가하고 결합시약은 약1분동안에 용해된다. 자석 교반기 또는 다른 장치를 이용하여 지속적인 교반을 시키면서 이량체 반응은 실온(25℃±5)에서 약 30-60분 동안에 일어난다. 이때 생성된 혼합물은 탄젠셜 플로우시스템(하기에서 상술하기로함)을 이용하여 농축시킨다.

결합반응 시작 후 다양한 시간별로 용액에서 시험시료를 취하여 각각을 겔-전기영동분석 한다. 겔-전기영동분석에서 거의 모든 분석시료에서 효소의 단량체 형태가 분명하게 보이지만 리보뉴클레아제의 이량체에 해당하는 벤드도 반응시작후 약 10분뒤에 볼수 있다. 효고의 이량체형에 해당하는 밴드는 약 15분후에 분명히 볼수 있는데 이 밴드는 반응이 진행됨에 따라 뚜렷하게 보이게된다. 효소의 올리고머형태도 결합시약을 계속 첨가하면서 약 30분후에 볼수 있게 된다. 리보뉴클레아제의 단량체 형태는 분자량이 15,000인데 이량체는 이크기의 두배가 된다.

순수한 리보뉴클레아제 이량체가 생성물에 다량 포함되게 하려면 단량체 또는 다량체형의 리보뉴클레아제를 제거하고 리보뉴클레아제 이량체를 분리하기 위해서 적어도 두단계의 여과과정을 거치게 한다. 이량체가 형성안된 리보뉴클레아제 단량체는 수득하여 본 발명에 따라 효소의 이량체 생산에 최대효율을 나타내게 하기위해 다시 반복반응을 시킨다.

이량체 형성된 리보뉴클레아제 용액에서 올리고머를 분리하기 위해 이온교환수지를 통하여 용액을 여과시킨다. 바람직한 구체예에서 여과는 세파덱스 이온교환물질로 만든 컬럼을 이용한다. 높이가 20cm 직경이 약 25cm인 세파덱스 컬럼을 준비하여 pH가 8.6인 50mM 암모니움 하이드로겐 완충액 60 1로 세척한다. 카보네이트 완충액을 물 1 1에 4g 암모늄 하이드로겐 카보네이트를 용해시켜 만든다. 상기와 같이 준비된 리보뉴클레아제 용액을 컬럼으로 통과시켜 균등완충액으로 용출시킨다. LKB 2211 슈프렉과 같은 플렌션 콜렉터에 의해 용액의 일부를 수득하고 용액의 유속은 분당 80ml이 된다. 용출 프로파일은 분당 0.5mm 속도로 측정할 수 있는 LKB 2210 기록기로 기록한다. 흡광도는 LKB 2238 UVIOR SII에서 280nm에서 측정한다.

이와 같은 여과단계에서 나타난 용출 프로파일은 일반적으로 세종류의 피크가 나타난다. 첫째로는 리보뉴클레아제의 다량체를 나타내고 두번째로는 이량체를 나타내고 마너비 피크가 효소의 단량체를 나타낸다. 이때 겔-전기영동 분석을 이용하여 각각의 수득된 부분을 분석하는 것이 좋다. 이와 같은 분석은 Thomas et al PNAS 72:2626에 설명된 것과 같이 SDS-폴리아크릴 아미드겔-전기영동과정(SDS-PAGE)로 가능하다. 이와 같은 전기영동 연구에서 수득된 각 단편의 약 50μl를 피복완충액 50μl와 혼합하고 약 95℃에서 10분간 가열한다. 다음 혼합물 25μl를 겔포켓에 넣는다. 마지막으로 전기영동을 20-35mA에서 약 4시간동안 실시하여 리보뉴클레아제 효소의 각종형태대로 분리된다. 단백질 띠는 코마시블루 R250(Merck)로 착색하여 볼수 있다.

SDS-PAGE 전기영동과정을 이용하여 단량체, 이량체 또는 올리고형을 포함하는 리보뉴클레아제 단편을 확인하고 분류해낼 수 있다. 분류된 성분물을 확인한 후에 이량체형의 밴드부분을 분리해내어 수득한다. 수득된 이량체는 탄젠셜 플로우시스템(tangential flow system)에서 약 800ml로 농축시키는 것이 적절한다. 탄젠셀 플로우 시스템의 격막을 적절한 용매로 세척해내고 상당량의 이량체를 포함하게 된다. 이용액은 동결건조시키고 다음의 단계를 실시할때까지 약 4℃에서 저장하는 것이 적절하다. 이상적으로는 동결건조는 약 500ml 밀둥근 플라스크에 약 200ml 용액으로 실시하는 것이 적절하다. 플라스크를 밀봉하고 물질이 냉동건조될때까지 약 -30℃에서 30분동안 보관한다.

시발물질이 고가이기 때문에 이전단계의 여과과정에서 여과된 단량체들을 본 발명의 이량체형성 과정으로 되반복시키는 것이 적절하다. 이것은 단량체 뉴클레아제를 포함하는 부분을 확인하고 이 부분을 회수하여 탄젠셜 플로우 시스템을 이용하여 농축시키고 상기 결합시약을 첨가한다. 상기와 같은 결합반응이 일어나고 상기 설명한 여과과정을 실시한다. 재생된 리보뉴클레아제 냉동 동결후에 제1차 이량화 형성때 수득된 이량체 생성물과 새로이 형성된 이량체 생성물을 완전히 혼합한다. 이렇게 반복기술을 이용하면 이량체 생성물 수득량이 약 30%까지 증가된다.

상기 수득된 상기 이량제 용액을 제2단계 여과과정을 거쳐 단량체와 올리고머에서 이량체를 분리시켜 최종생성물의 순도를 높인다. 이경우에 상기 수득된 냉동동결된 효소 혼합물을 세파덱스 G 50 F컬럼과 같은 이온교환수지르 통하여 용출시킨다. 또한 이단계에서 이온 교환수지 컬럼은 0.2M 아세테이트 나트륨 완충액을 이용하여 pH 5의 아세테이트 나트륨 완충액은 1 1 물에 트리하이드레이트 아세테이트 나트륨 27g을 이용하여 만들 수 있다.

제1차 여과단계에서 측정된 2번째 피크에 상응하는 부분을 수득하여 세파텍스 컬럼에 얹는다. 제1여과 과정에서 설명한 조건과 물질을 제2차 단계에서 다시 이용하는 것이 적절하다. 용출 프로파일을 기록하고 제1단계 여과과정에 따라 수득된 부분을 분리하고 확인하는데 이용한다. 이 경우에는 용출 프로파일은 주요 피크에 거대 이량체를 포함하고 있다.

수득된 단편에서 얻은 리보뉴클레아제 효소의 SDS-PAGE 분석은 상기 설명한 것과 같이 실시하는 것이 적절하다. 이 연구에서 용출 프로파일의 주피크에는 매우 순도가 높은 리보뉴클레아제 이량체 생성물이 포함되어 있음을 알 수 있다. 이때 주피크를 수득하고 탄젠셜 플로우 시스템에 의해 농축시킨다. 이때 세파덱스 G 25 컬럼을 통과하여 염을 제거한다. 직경이 25cm, 높이가 65cm인 32리터 컬럼을 염제거 공정을 실행하기 위해 시간당 151의 유속으로 실행한다. 또한 50mM 암모니움 하이드로겐 카보네이트 완충액을 이용한다.

이때 생성된 물질은 고도의 정제된 리보뉴클레아제 이량체 성분물로 구성되어 있다. 그러나 제약학적으로 유용한 형태로 냉동건조된 리보뉴클레아제 이량체를 만들기 위해 이량체에 있는 앤도복신을 제거하는 과정이 필요하가. 따라서 상기 과정에 의해 생성된 정제된 이량체 생성물은 앤도복신의 결합능이 높은 데톡시겔(Detoxigel)과 같은 크로마토그래피를 통하여 용출시킨다. 데톡시겔은 약 2mg/ml의 엔도톡신의 결합능을 가진다. 단백질 이량체와 같은 다른 성분물들은 비-톡이적으로 결합하기 때문에 가능하면 이량체 생성물의 최대 수용시키는 생리적 pH범위인 완충액을 이용하여 수득할 수 있다. 이량체 수득률을 최대로 하기 위해 0.1-0.5M 염용액(예:염화나트륨)의 첨가한다. 일반적으로 1500 I.U/ml을 포함하는 용액을 독소제거 컬럼에 통과시킨 후에는 1.0 E.U/ml로 감소하게 된다.

엔도톡신을 리보뉴클레아제 이량체 용액에서 제거한 후에 용액을 수득하고 살균한 후 멸균된 밑둥근 플라스크에서 냉동동결시킨다. 최종용액에서 앤도톡신의 함량을 Munich, KebiVitrum firm의 Coatest(R)을 이용하여 적량한다. 이 시험에서는 앤도톡신의 LAL 활성을 기초로한다. 활성화된 LAL는 크로모제닉 기질(S-2423)에서 노란색 염료 p-니트로아닐린로 분리되는데 스펙트럼 포토메터를 이용하여 450nm에서 앤도톡신의 양을 정량한다. 앤도톡신의 함량이 0.1ng/ml일 경우 이량체 용액을 밑-둥근 플라스크에 넣고 냉동동결시킨다.

상기 과정을 최종 리보뉴클레아제 이량체 생성물의 소요량이 수득될때까지 반복된다. 정제과정후에 각각의 이량체는 배치(batch) 살균시키고 필요한 경우에 냉동공결시키고 PCT/US88/01785에 상술된 바이러스와 박테리아 질환에 처리된 것과 같은 유용한 리보뉴클레아제를 만들기 위해 균일한 하전을 띄는 리보뉴클레아제를 수득한다. 항박테리아와 항-바이러스 효과에 더하여 항-염중성 또는 항-히스타민제와 같은 용도의 리보뉴클레아제 이량체의 치료요법적인 이용은 효소의 단량체와 연관된 세포독성이 없을때 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 이량체 리보뉴클레아제 생성물 다량을 이용할때 효과적이다. 본 발명에 따라 수득된 특정 리보뉴클레아제 이량체 생성물은 스펙트럼 포토메터를 이용하여 모니터된 리보핵산용액에서의 이 효소의 활성을 검사할 수 있다. 본 방법을 이용하여 순도높은 이량체 효소를 만들고 이 효소의 활성을 검사할 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것이며 본 발명을 이에 한정하지는 않는다.

리보뉴클레아제 이량체 제조

50g 리보뉴클레아제 단량체를 0.1M 디소디움 하이드로젠 포스페이트 디하이드레이트 51에 용해시킨 후 0.1N 수산화나트륨으로 pH 10.0으로 조절한다. 디소디움 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트 완충액은 11 물에 70.98g 디소디움 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트를 용해시킴으로써 만들 수 있다. 그 다음 5g 결합제 디메틸 슈버리미데미트(Sigma Batch No 29 3687)를 25℃에서 첨가시킨 후 1분내에 용해시킨다. 용액의 pH는 0.1N 수산화나트륨을 이용하여 지속적으로 조절한다. 마그네틱 교반기를 이용하여 용액을 지속적으로 교반하고 약 25℃에서 45분간 반응시킨다. 반응은 0.1M 염산을 이용하여 pH를 7.0로 낮추면 끝나게 된다.

결합반응의 시작후 다양한 시간대에서 시료를 수득하여 겔-전기영동으로 분석하였다. 리보뉴클레아제 단량체, 이량체, 다량체를 SDS 겔에서 분리해낼 수 있다. 사용된 리보뉴클레아제 단량체는 분자량이 15,000이 되고 이량체는 이크기의 두배가 된다. 전기영동 분석에서 이량체밴드는 결합제를 첨가후 15분뒤에 분명하게 형성되고 반응이 진행될수록 밴드는 점차 굵어진다. 또한 리보뉴클레아제 올리고형은 30분후에 생성된다.

이량체 리보뉴클레아제 용액은 탄젠셜 플로우 시스템(밀리포어)에서 800ml로 농축시킨다. 밀리포어 시스템에는 Filtron Ausschluss 10,000d 필터와 7바 티어(bar tear) 저항성의 올레핀막, Verder 80W Type 20-30# 60079 펌프가 포함된다. 입력압력은 2바이고 출력압력은 0.2 이하로 최소화된다. 수행능은 시간당 11가 된다. 장치의 데드볼륨은 400ml이고 장치를 400ml로 최종용적 1200ml로 세척해낸다.

농축된 리보뉴클레아제 용액은 세파덱스 G 50 F(파르마샤)를 이용하여 여과시켜, 이량체 형성과정동안에 형성된 각종 올리고형을 분리한다. 여과시에 직경이 25.2cm 높이가 120cm 인 컬럼을 60리터 50mM 암모니움 하이드로겐 카보네이트(pH 8.6)로 세척해낸다. 50mM 암모니움 하이드로겐 카보네이트 완충용액은 3.95g 암모니움 하이드로겐 카보네이트를 1 1 물에 용해시켜 만들수 있다. 그다음 1200ml 전체 단백질 용액을 겔 배드에서 코팅시키고, 등가 완충액으로 용출시킨다. 약 1000ml의 용액부분을 fraction수득기(LKB 2211 Suprec)로 분당 80ml의 속도로 15분간 분리해낸다. 용출 프로파일을 분당 0.5mm 속도에서 LKB 2210 기록기로 기록한다음 흡수도를 LKB 2238 UVICOR SII를 이용하여 280nm에서 측정하였다. 도면1에 나타난 용출 프로파일에서 세개의 피크가 나타나 있는데 제1피크가 리보뉴클레아제의 다량체, 제2피크가 리보뉴클레아제의 이량체, 제3피크가 리보뉴클레아제의 단량체를 나타낸다. 도면1에서 두꺼운선은 리보뉴클레아제 용액의 흡수 프로파일을 나타내는 것이다.

각각의 부분에서 리보뉴클레아제 혼합물은 Thomes et al PNAS 72:2626(1975)에 따라 SDS-PAGE로 분석하였다. 이 과정에서 각 단면의 50μl 는 코딩 완충액 50μl과 혼합한 다음 혼합물은 95℃에서 10분간 가열한다. 그다음 이혼합물 25μl를 겔에 도말한다. 시험동안에 표준 IV(Merck) 단백질 혼합물을 겔에 도말하는데 분자량이 12,300; 30,000; 45,000; 66,200; 76,000이 된다.

사용된 피복온충액의 성분물은 다음과 같다.

0.72g 크리스 염산(0.06M)

0.13g EDTA(Ⅲ)(5mM)

0.18g 글리세린(10%)

5g SDS, pH 7.2(90ml 물첨가)

10ml 베타-멀캅토에탄올(10%)

겔 전기영동 과정에서 3.9% 콜렉팅 겔 위에 18% 분리겔을 만든다. 18% 아크릴아미드의 분리겔 용액은 다음과 같은 성분물을 가진다.

9g 아크릴아미드

0.045g 비스아클릴아미드

0.136g HCl pH 8.8(0.325M)

0.03g SDS

200μl 10% 암모니움 설페이트 용액

20μl TEMED

3.9% 아크릴아미드의 콜렉팅 겔 용액은 다음과 같은 구성으로 되어있다.

0.39g 아크릴아미드

10.4ml 비스아클릴아미드

0.125m 트리스 HCl pH 6.8

10mg SDS

100μl 10% 암모니움 퍼설페이트 용액

10μl TEMED.

SDS-폴리아크릴아미드겔은 두개의 20×20cm 글래스 플레이트로 에탄올 깨끗하게 세척하고 두 글라스판 사이 두께 1mm(길이 20cm 넓이 1cm에 겔을 넣는다. 스페이싱 스트립은 글라스 플레이트의 좌우 모서리에 넣고 밑면은 텍스타일 접착제로 복합한다음 세면을 클립으로 고정시킨다. 모서리는 1% 아가로스 용액으로 추가 봉합한다. 아가로스가 굳은후에 상기 설명한 분리겔을 글라스 플레이트 윗모서리의 약 3cm 아래이치에서 사이공간에 넣고 파스테르 피펫으로 물층을 만든다. 겔은 약 30분뒤에 증합반응 형성된다. 물층을 제거하고 겔의 모서리를 1회 세척한후 상기 설명한 콜렉팅 겔을 만든다.

그다음 콜렉팅 겔용액을 모서리에 채우고 테플론 시료용기콤을 넣어 분리겔츠으이 앞쪽 약 1cm 위치에 시료코켓을 만든다. 약 15분후에 콜렉팅겔이 중합반응된후에 콤을 제거한다. 그 다음 텍스타일 접착 스트립을 제거하고 겔은 전기영동 장치에 수직 위치로 장착한다. 완충액 용기통에 전기영동 완충액(6g트리스-베이스(0.05M); 28.5g 글리신(0.38M); 1g SDS(0.1% 11물)을 넣고, 겔포켓을 완충액으로 분사세척한다. 리보뉴클레아제 이량체 시료를 약 95℃에서 10분간 가열시킨 후 용기에 채우고 겔포켓에 시료를 넣는다.

전기영동은 약 4시간동안 20mA로 실시한다. 24시간 전기영동을 원할경우 하전은 6-8mA로 낮추면 된다. 전기영동이 실시됨을 확인하기 위해 코팅완충액에 0.02% 부로모페닐-블루로 혼합하면 된다. 전기영동은 블루다이가 겔의 아래쪽에 도달했을 때 종료한다. 분리겔을 떼어내어 약 30분간 고정액에서 착색시키고 400ml 메탄올, 140ml 아세트산, 21 물의 표백액에서 다시 표백시킨다. 고정액은 1g 코마시 블루(R250, Merck) 50ml물과 50ml 메탄올로 구성된 혼합하여 만든다. 단백질 밴드는 상기 설명한 것과 같이 염료액의 색으로 볼수 있다. 상기 SDS-PAGE를 이용하면 다량체를 포함하는 시료에 이량체 리보뉴클레아제의 양이 점차 증가하는 것을 볼수 있다.

주로 이량체인 시료를 수득하여 탄젠셜 플로우 시스템(Millipore)에서 800ml로 농축시킨다. 격막을 400ml 침투액으로 제척하고 이량체 용액 120ml을 남긴다. 그다음 이 용액을 동결건조시켜 다음단계 시작전까지 4℃에 저장시킨다. 냉동동결은 500ml 밑-둥근 플라스크에 200ml의 용액을 넣어 실시한다. 플라스크를 액화질소에 두고 회전식 증발기(Heidolph VV60)에서 동결시킨다. 플라스크는 봉합하고 -30℃에서 30분가 저장한다. 마지막으로 이물질은 표준과정에 따라 동결건조시킨다.

다음의 과정에 넘어가기전에 제1여과 과정에서 여과된 단량체 리보뉴클레아제를 이량체 과정에 반복시킨다. 이때 주로 단량체 리보뉴클레아제가 있는 부분을 수득하여 상기 탄젠셜 플로우 시스템을 이용하여 4리터로 농축시킨 다음 상기 나타낸 결합시약을 이용하야 이량화 반응을 시킨다. 재생된 단량체를 이용하여 결합단계에서 여과과정을 전술한 것과 같이 실시하고 재생된 단량체는 이량체형으로 수득할 수 있다. 제1이량체 형성과정에서 얻어진 냉동건조된 생성물은 단량체에서 회수하여 얻어진 냉동건조 생성물과 혼합한다.

복합된 냉동건조된 리보뉴클레아제 혼합물을 세파덱스 G 50 F에서 크로마토그래피하여 단량체와 올리고머형에서 이량체의 분류를 실시한다. 크로마토그래피 과정은 pH 5의 0.2M 아세테이트 나트륨에서 세파덱스 G 50 F(Pharmacia)를 이용하여 실시한다. 0.2M 사세테이트 나트륨 완충액은 물 1리터에 트리 하이드레이트 아세테이트 나트륨 27.22g을 용해시켜 만들 수 있다. 그로마토그래피는 제1여과 단계에서 확인된 장치와 조건하에서 실시한다.

이경우에 용출 프로파일은 도면에서 볼수 있고 도면에서 두꺼운선은 도면의 얇은 선보다 좀더 민감한 감지법을 이용하여 얻은 리보뉴클레아제 용액의 흡수도를 나타낸다. 좀더 감도가 나은 프로파일의 중간에 주피크는 이량체를 포함하는 것임을 알수 있다. 피크에서 얻은 효소의 SDS-PAGE분석에서 주피크에 이량체 함량을 제1여과단계에서의 응출 프로파일과 비교할 수 있다.

주피크 부분을 수득하고 상기 설명한 탄젠셜 플로우 시스템을 이용하여 농축한다. 세파덱스 G25 컬럼으로 수득한 물질을 통과시켜 염을 제거한다. 컬럼의 직경은 25.2cm 높이는 65cm이고 기존용적은 32리터이고, 우속은 시간당 15리터가 된다. 제2용출에서 주피크에서 수득한 리보뉴클레아제 용액은 최대 5리터가 되고 세파덱스 컬럼에 피복된다. 50mM 암모니움 하이드로겐 카보네이트 완충액을 이용하여 염을 제거한다. 염제거 과정은 수득된 용액이 5리터가 될때까지 약 90분간 지속한다. 용출 프로파일을 기록하고 5리터 Schott flask에 단일피크를 수득한다. 정제된 최종생성물 시료는 베타-멀캅토에탄올로 환원상태에서 플로팅시키고 SDS-PAGE에서 이량체 리보뉴클레아제만이 있음을 확인할 수 있다.

제약학적으로 유용한 냉동건조 단백질을 만들기 위해 앤도톡신을 리보뉴클레아제에서 제거할 필요가 있다. 이 목적을 위해 정제된 이량체를 Detoxigel 컬럼을 이용하여 크로마토그래피한다. 소요의 리보뉴클레아제 이량체를 최대로 얻기위해 염용액을 첨가하여 생리적 pH 범위의 완충액을 사용한다. 효소용액을 Detoxigel 컬럼에 피복시키고 약 1500 E.U/ml의 앤도톡신을 제거한다. 각 과정의 전후에 데톡시겔은 1% 데스옥시콜레이트로 재생시켜 물로 완전히 세척해내고 앤도톡신이 더이상 감지되지 않을때까지 세척한다. 컬럼의 용적은 750ml(직경 9.5cm, 높이 14cm)이고 컬럼은 0.1M 암모니움 바이카보네이트로 균등화시킨다. 앤도톡신이 없는 완충액을 살균수와 혼합한다. 2리터 리보뉴클레아제 용액을 겔에 코팅하고 겔에 흡수되도록한다. 단백질은 균등완충액으로 용출시키고 멸균비이커에 수득한다. 용액은 살균된 밑-둥근 플라스크에서 냉동건조시킨다.

앤도톡신 양은 Munich, Kabi-Vitrum firm Coatest(R)로 정량한다. 이 테스트는 앤도톡신에 의해 LAL 활성을 기초로 한것이다. 활성화된 LAL는 크로모젠 기질(S-2423)에서 노란색 염료 p-니트로아닐린을 분리한다. 색의 환원은 스펙트럼 포토메터로 405nm에서 앤도톡신의 양을 직정한다. 0.1mg/mg의 정데된 리보뉴클레아제 이량체 생성물을 밑-둥근 플라스크에 넣고 냉동 동결시킨다. 고도의 정제된 리보뉴클레아제 이량체 생성물은 사용할때까지 냉동동결 상태로 저장한다.

[실시예 2]

효소활성 검사

본 발명에 따라 만든 이량체 리보뉴클레아제의 효소활성은 Kunitz, J, Gen Physiol 24:15(1940)에 설명한 효소활성 검사를 이용하여 검사하였다. 이러한 검사는 헥산에 리보뉴클레아제가 작용할 경우 흡수 스펙트럼이 파장이 ㅉ랍은 쪽으로 이동하게 되는 것을 기초로 하는 것이다. 290-305nm에서 헥산농도는 리보뉴클레아제의 활성으로 인해 감소하게 된다. 초기 반응에서 이러한 감소는 지속적으로 계속되므로 효소활성의 측정에 이용할 수 있다. 이 실험에서 헥산량의 감소는 300nm에서 측정할 수 있다.

실험은 25℃에서 실시하고 온도 큐벳을 사용하여 모든 용액을 사용하기전에 약 25℃에서 5분간 처리한다. 스펙트럼 포토메터를 이용하여 300nm에서 측정한다. 반응용적은 3ml이고 반응은 두께가 1cm인 3ml 큐벡에서 실시한다.

반응혼합물은 헥산용액 1.5ml 리보뉴클레아제가 포함된 0.05-0.5ml 시험시료를 이용하고 최종용적이 10ml이 되도록 물을 첨가한다. 헥산용액은 80mg 헥산과 나트륨염(Boehringer)을 500ml 아세테이트 완충액에 용해시킨다. 아세테이트 완충액은 0.1M 아세테이트 완충액으로 pH가 5이고 0.57ml 글리셜 아세트산과 80ml 증류수를 혼합하여 만들 수 있고 1N 수산화나트륨으로 pH 5로 적정한 후 100ml로 증류수로 채운다. 리보뉴클레아제 이량체를 포함하는 시험시료는 5mg 리보뉴클레아제 이량체를 5ml 증류수에 용해시켜 만든다.

헥산과 시료용액을 큐벡에 혼합하고 헥산의 환원을 스펙트럼 포토메터 스페트론 1001(Beusch Lomd)로 약 20분간 체크한다. 흡수 프로파일을 기록하고 직선범위에서 8분간 관찰한다. 반응이 종료될때까지 25℃에서 지속하고, 약 3시간이 소요된다. 용액은 최종치를 정량하기 위해 2회 측정하여 평균치를 계산해낸다.

효소활성을 계산하기 위해 헥산의 상각은 반응시각(E_O)때 정량하고 반응의 최종 상각(Ee)은 직선부분에서 측정한다. 리보뉴클레아제 이량체 시험시료의 △E/분이 0.007이 넘지않도록 희석시킨다. 브랭크 값은 리보뉴클레아제와 물로 만든 반응에서 얻는다. 효소단위는 약 25℃에서 기질의 E-Ee값이 분당 100%가 되는 조건하에서 효소의 양을 나타낸다. 효소의 상각치 최대값은 300nm에서 Eo-Ee가 된다. 효소활성의 계산은 다음과 같다;

본 발명의 이량체 리보뉴클레아제 효소는 상당한 양의 활성을 가진다.

Claims (23)

1. 정제된 리보뉴크레아제 이량체 생성물을 만드는 과정에 있어서;

   a) 단량체 리보뉴클레아제를 pH가 9 또는 그 이상으로 완충액에 첨가하여 리보뉴클레아제 용액을 만들고;

   b) pH를 9 또는 그 이상으로 유지시키면서 리보뉴클레아제 용액에서 리보뉴클레아제 단량체를 이량체화시키기 위해 슈버리미데이트 결합시약을 첨가하고;

   c) pH를 7로 낮추어 이량체 형성반응을 종료시키고;

   d) 용액을 이온교환수지를 통하여 용출시켜 제1단계 여과단계를 실시함으로써 이량체 형성된 리보뉴클레아제 용액을 여과시키고 이때 이 용액에는 리보뉴클레아제 이량체형이 포함되어 있고;

   e) 제1여과단계에서 수득된 부분을 다시 이온교환수지를 통과시킴으로써 제2여과과정을 커지게 하고;

   f) 제2여과단계에서 생성된 고도의 정제된 이량체 리보뉴클레아제 생성물을 수득하는 단4계로 구성된 것을 특징으로 하는 정제된 리보뉴클레아제 이량체 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 단량체 리보뉴클레아제 용액을 pH 10으로 조정시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 단량체 리보뉴클레아제 용액을 수산화나트륨을 첨가하여 pH 10으로 조정시키는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 단량체 리보뉴클레아제 용액을 사용된 완충액이 디소디움 하이드로겐 포스페이트 디하이드로레이트 완충액인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 용액을 pH 10으로 유지시키면서 결합시약을 단량체 리보뉴클레아제 용액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 슈버리미데이트 결합시약이 디메틸 슈버리미데이트로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 이량체 형성 반응을 실온에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 이량체 형성반응을 용액을 지속적으로 교반시키면서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 이량체 형성반응은 염산을 첨가하여 종료시키는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 이량체 형성된 리보뉴클레아제 용액을 탄젠셜 플로우 시스템을 사용하여 여과시키기 전에 농축시키는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 제1차 여과과정은 교차결합된 덱스트란 이온 교환수지를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 리보뉴클레아제 단량체 용액에는 40-60g 리보뉴클레아제 단량체와 완충액 4-6리터로 구성되고 결합시약을 약 4-6g 정도 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 제1차 여과단계후에 수득된 부분을 겔전기영동으로 분석시키는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 1차 여과단계후에 수득된 단편을 냉동동결시키는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 1차 여과단계후에 수득된 단편을 리보뉴클레아제는 다시 이량체 과정으로 반복시키는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 2차 여과단계는 교차결합된 덱스트란 이온 교환수지를 이용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제1항에 있어서, 2차 여과단계는 5에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 2차 여과단계의 pH는 아세테이트 나트륨 완충액을 이용하여 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제1항에 있어서, 2차 여과과정에서 수득된 물질을 겔전기영동으로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제1항에 있어서, 2차 여과과정후에 탈염과정을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 세파덱스 G25 칼럼을 이용하여 탈염과정을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제1항에 있어서, 정제된 리보뉴클레아제 이량체에서 엔도톡신을 제거하는 단계가 추가되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 엔도톡신이 데톡시겔 칼럼을 이용하여 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.