HU212929B - Method of preraring ribonuclease dimers - Google Patents
Method of preraring ribonuclease dimers Download PDFInfo
- Publication number
- HU212929B HU212929B HU9202251A HU225192A HU212929B HU 212929 B HU212929 B HU 212929B HU 9202251 A HU9202251 A HU 9202251A HU 225192 A HU225192 A HU 225192A HU 212929 B HU212929 B HU 212929B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ribonuclease
- solution
- dimer
- liquid chromatography
- buffer
- Prior art date
Links
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 title claims description 82
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 title claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 239000000539 dimer Substances 0.000 title description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 29
- 108010015937 ribonuclease dimer Proteins 0.000 claims description 27
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 20
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 16
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 16
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 7
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 2
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 claims 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 10
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 7
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1,3-oxazole-4-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=CC(C=2OC=C(C=O)N=2)=C1 BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- AJDUTMFFZHIJEM-UHFFFAOYSA-N n-(9,10-dioxoanthracen-1-yl)-4-[4-[[4-[4-[(9,10-dioxoanthracen-1-yl)carbamoyl]phenyl]phenyl]diazenyl]phenyl]benzamide Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2NC(=O)C(C=C1)=CC=C1C(C=C1)=CC=C1N=NC(C=C1)=CC=C1C(C=C1)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC2=C1C(=O)C1=CC=CC=C1C2=O AJDUTMFFZHIJEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 229940087562 sodium acetate trihydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 239000001043 yellow dye Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004160 Ammonium persulphate Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019395 ammonium persulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007823 electrophoretic assay Methods 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013636 protein dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Jelen találmány tárgyát ribonukleáz dimerek előállítására szolgáló eljárás képezi.
Az eddig ismert antibiotikumokra rezisztens baktérium törzsek és vírusos megbetegedések egyre növekvő száma teszi szükségessé azt, hogy új gyógyszereket próbáljunk ki emberek és állatok kezelésében. A jelenleg alkalmazott számos kezelési mód és gyógyszer között ismertek olyanok, amelyben enzimek monomer formáját juttatják be különböző betegségekben szenvedő betegek kezelése során. Néhány esetben erre azért van szükség, mert bizonyos betegségek során bizonyos enzimek aktivitásában (működőképességében) csökkenés tapasztalható. Az enzimek katalitikusán aktív fehérjék, amelyek az élő szervezetekben szinte az összes fő életfolyamatban részt vesznek. így számos enzimet akár egyedileg, akár bizonyos kombinációkban különböztettek meg fizikokémiai, fiziológiai vagy biológiai hatásai által.
A ribonukleázok az egyik olyan enzimcsalád a különböző enzimek közül, amelyekről ismert, hogy terápiás hatással bírnak illetve különböző betegségek során aktivitásuk csökken. A ribonukleázok a nukleáris (sejtmagban található) enzimek egyik csoportja, amelyek számos állatban és növényi organizmusban általánosan megtalálhatók. A ribonukleázok izolálására szolgáló eljárások vizsgálatát Schmidt és McDonalds indította el az 1950-es évek közepén. Ezzel az enzimmel kapcsolatos számos felfedezés közül az egyik megállapítás az volt, hogy rákos szövetekben nagymértékben csökkent ezen ribonukleázok aktivitása. Egy esetben kimutatták, hogy leukémiás egerekben a savas ribonukleáz aktivitás jelentős csökkenést mutat, mely különösen ezen állatok lépszöveteiből nyert mitokondrium és mikroszóma frakciókban volt megfigyelhető. Ehhez hasonló tanulmányok azt jelezték, hogy ribonukleáz adagolással lehetséges a vírusos leukémiával együtt járó tünetek megelőzése vagy kezelése.
Sajnos a ribonukleáz alkalmazásával elérhető lehetséges előnyös hatásai nem valósíthatók meg elsősorban ezen enzim monomer formájának erősen toxikus tulajdonságának köszönhetően. Például tenyésztett fibroblasztokkal végzett vizsgálatokban citotoxikus hatás figyelhető meg monomer formában lévő ribonukleáz esetén még akkor is, ha igen alacsony dózisokat alkalmazunk. Nyilvánvaló, hogy olyan eljárás kifejlesztése szükséges, mely a ribonukleázzal elérhető lehetséges előnyös hatásokat maximalizálja, míg az enzim monomer formájával együttjáró káros citotoxikus hatásokat minimalizálja.
Újabban felfedezték, hogy ribonukleázból olyan antivirális és antibakteriális készítményeket lehet alkotni, melyek nem fejtenek ki citotoxikus hatásokat, ha az enzim dimer formáin alapuló készítményt állítunk elő. Dimer formában lévő ribonukleáz készítmények alkalmazása hatásosnak bizonyult számos fertőző betegség kezelésében, és ugyanakkor nem okoz a monomer formával általánosan együttjáró erősen citotoxikus hatásokat. Ribonukleáz dimerek különböző terápiás kezelésekben történő alkalmazását ismertetik a WO 89/11 294 számon közrebocsátott nemzetközi (PCT) bejelentésben.
A ribonukleáz dimerek előállítására több eljárás is ismert, melyeket az alábbiakban ismertetünk röviden.
Wang és társai [Biochemistry 15 (3), 660-665. oldalak, (1976)] a dimerek előállítása során többféle pHértéken dolgoztak, optimális intervallumnak a 7,58,0 pH-tartományt jelölték meg, és a maximális kitermelést 20% körül jelezték. A dimerizációs reakciót ammónium-acetát adagolásával állították le, azonban az el nem reagált ammónium-acetát a kapcsolószerrel reagál, azt további felhasználásra alkalmatlanná téve. A terméket egy lépésben tisztították oszlopkromatográfiásan.
Hartman és társai [Biochemistry 6, 2439-2448. oldalak, (1967)] 10,5-ös pH-értéken végezték a dimerizációt, kapcsolószerként dimetil-adipimátot alkalmazva.
Bartholeyns és társai a Wang-féle eljárás olyan változatát ismertették [Science 186, 444-445. oldalak, (1974)], melyben dimetil-parafaimidátot alkalmaznak kapcsolószerként. A dimerizáció elállítását és a tisztítást ugyanúgy hajtották végre, mint a Wang-féle módszernél.
A Koostra és társai által leírt módszer [Biochim. et Biophys. Acta 631 (3), 439-450 (1980)] lényeges elemeiben megegyezik a fent ismertetett Wang-féle módszerrel, és az apró változások nem hozhatók kapcsolatba a jelen találmány szerinti megoldással.
Bár a ribonukleáz dimerek monomer formájukból történő előállítására a fenti eljárások ismertek, változatlanul nagy fontossággal bír, hogy képesek legyünk a dimer forma nagy mennyiségének olcsó és hatékony úton való előállítására. így nagyon kívánatos egy olyan rendszer kidolgozása ribonukleáz dimerek előállítására, melynek segítségével szennyezőket - mint pl. monomereket, multimereket és más szennyező anyagokat - minimális mennyiségben tartalmazó terméket lehet előállítani.
A jelen találmány tárgya a fentiekkel összhangban egy hatékony eljárás tisztított ribonukleáz dimer előállítására, melynek során
a) ribonukleáz oldatot állítunk elő úgy, hogy ribonukleáz monomereket adagolunk egy legalább 9-es pH-értékű puffer oldathoz,
b) egy parafaimidát kapcsolóreagenst adagolunk a ribonukleáz oldathoz, és a ribonukleáz monomereket dimerizáljuk, miközben a reakcióelegy pH-értékét nem engedjük 9 alá csökkenni,
c) a dimerizációs reakciót egy adott ponton leállítjuk,
d) a kapott dimerizált ribonukleázt folyadékkromatográfiásán tisztítjuk, oly módon, hogy a c) lépésben a dimerizációs reakciót úgy állítjuk le, hogy sav adagolásával az oldat pH-értékét 7+0,2-re csökkentjük, a kapott oldatot töményítjük, majd a d) tisztítási lépésben két folyadékkromatográfiás tisztítási lépést alkalmazunk, ahol az első tisztítási lépésben kapott, fő tömegében ribonukleáz dimert tartalmazó frakciót töményítés után vezetjük a második tisztítási lépésbe; és kívánt esetben a kapott ribonukleáz dimert sómentesítjük a második kromatográfiás tisztítási lépés előtt vagy után, és
HU 212 929 Β kívánt esetben a kapott ribonukleáz dimerből eltávolítjuk az endotoxinokat, és kívánt esetben a tisztítás során kapott ribonukleáz monomereket tartalmazó frakciókat visszavezetjük a b) lépésbe.
A fenti eljárást alkalmazva nagy mennyiségű tisztított ribonukleáz dimer terméket állíthatunk elő, és e termék különösen alkalmas számos vírusos és bakteriális betegség kezelésében.
A jelen találmány tárgyát képező eljárás újdonsága és haladó jellege alapvetően azon a felismerésen alapszik, hogy a dimerizációs reakciót egyszerűen le lehet állítani a pH-érték 7-re történő csökkentésével, és így nincs szükség ammónium-acetáttal végzett lefojtásra, ezáltal lehetőség nyílik arra, hogy az el nem reagált monomereket tartalmazó oldatot visszavezessük egy újabb kapcsolási reakcióba, ami nyilvánvalóan jelentős megtakarítással jár, különös tekintettel az alkalmazott reagensek magas árára.
További előnye a találmány szerinti eljárásnak, hogy a két lépésben alkalmazott folyadékkromatográfiás tisztítás ipari méretű termelésre is kiválóan alkalmas.
Az 1. és 2. ábra a jelen találmánynak megfelelően végrehajtott ioncserélő kromatográfiával nyert elúciós kép grafikus megjelenítését mutatja.
A jelen találmány szerint ribonukleáz dimer formáinak előállításában bármely jelenleg hozzáférhető ribonukleáz monomert alkalmazhatunk kiindulási anyagként. Jelen találmányban olyan ribonukleáz monomereket alkalmazunk, amelyeket a Serva Feine BioChemica. GmbH. Heidelberg cégtől vásároltunk, katalógus szám: 28 260. Az alkalmazott monomerek tartalmazhatnak Ribonukleáz A-t vagy bármely más, a kereskedelemben hozzáférhető különböző ribonukleázt. A kapcsolási reakcióhoz a ribonukleáz monomereket úgy készítjük elő, hogy a ribonukleáz monomereket egy foszfát pufferben szobahőmérsékleten oldjuk fel egy ribonukleáz monomer oldat-készítése céljából. Az alkalmazott puffer előnyösen egy 0,1 mól/1 dinátrium-hidrogén-foszfát dihidrát puffer, és a monomert az oldat legalább kb. 2 órán keresztül történő folyamatos keverésével oldjuk fel. Egy megfelelő puffer oldatot kb. 70 g dinátrium-hidrogén-foszfát dihidrát kb. 1000 ml vízben való oldásával készítünk. Bár az alkalmazott reagensek és oldatok aktuális mennyisége a jelen találmányban változhat, a találmány szerinti dimerizációs reakciót kb. 40-60 g ribonukleáz monomernek egy kb. 5 liter dinátrium-hidrogén-foszfát dihidrát puffért tartalmazó főzőpohárban való feloldásával valósítjuk meg. Az is előnyös, hogy a monomer oldatot legalább 9 körüli, legelőnyösebben 10 körüli pH értékre állítsuk. A pH állítást 0,1 mól/1 NaOH-dal végezhetjük.
A dimerizációs reakciót a ribonukleáz monomer oldathoz egy parafaimidát kapcsoló reagens részletekben történő adagolásával engedjük végbemenni, mialatt a pH-t legalább 9 körüli értéken vagy e fölött tartjuk, előnyösen 10 körüli értéken (10=0,2) tartjuk. A jelen találmányban előnyös egy dimetil-parafaimidát kapcsoló reagens alkalmazása, de más ismert parafaimidát kapcsoló reagens is használható. A fent ismertetett módon készített monomer oldathoz előnyösen 46 g dimetil-parafaimidátot adunk, és a kapcsoló reagens kb. 1 percen belül oldódni fog. Mágneses keverőn vagy más eszközzel történő folyamatos keveréssel, a dimerizációs reakciót kb. 30-60 percig kb. 25 °C szobahőmérsékleten (25+5 °C) hagyjuk végbemenni. A reakciót pH 7 körüli (7+0,2) értékre való csökkentésével állítjuk le, és ez 1 mól/1 HC1 oldat adagolásával végezhető el. Ezen a ponton előnyös, ha a kapott keveréket bekoncentráljuk egy tangenciális áramlási rendszert alkalmazva, ahogy ezt alább részletesebben ismertetni fogjuk.
Hasznos, ha a kapcsolási reakció elindításától számított különböző időpontokban az oldatból vizsgálati mintákat veszünk és ezeket gélelektoroforézis analízis alá vetjük. A gélelektroforézis vizsgálatok azt mutatják, hogy bár az enzim monomer formája szinte az összes vizsgált frakcióban tisztán látható, a ribonukleáz dimer formájának megfelelő csík világosan látható kb. 15 perc után, és ez a csík a reakció előrehaladásával egyre kifejezettebbé válik. Az enzim oligomer formái szintén megfigyelhetők a kapcsoló reagens hozzáadását követően kb. 30 perc múlva. A ribonukleáz monomer formájának relatív molekulatömege kb. 15 000, és a dimer formája kb. kétszer ekkora méretű.
Annak érdekében, hogy nagy mennyiségű terméket állítsunk elő, mely elsősorban tisztított ribonukleáz diniért tartalmaz, előnyös, hogy a dimerizált ribonukleáz oldatot legalább két szűrési lépésen vezessük keresztül azért, hogy izoláljuk a ribonukleáz dimert és eltávolítsuk a monomer vagy multimer formában lévő ribonukleázt. Az eltávolított nem dimerizálódott ribonukleáz monomereket ily módon összegyűjtjük és a jelen találmány szerint előnyösen visszavezetjük, ezzel tovább maximalizáljuk az enzim dimer formájának előállításának hatékonyságát.
A dimerizált ribonukleáz oldatból az oligomerek elválasztásának céljából előnyös, ha az oldatot egy folyadékkromatográfiás oszlopon szűrjük át. Az előnyös megvalósítás szerint a szűrést egy Sephadex gélszűrő oszlop alkalmazásával végezzük. Egy 25 cm átmérőjű és kb. 120 cm hosszú Sephadex oszlopot készítünk, amit kb. 60 liter 50 mmól/1 ammónium-hidroaénkarbonát, kb. 8,6 körüli pH-jú oldattal mosunk. Ezt a karbonát puffért kb. 4 g ammónium-hidrogén-karbonát 1000 ml vízben való oldásával készítjük. A fent kapott ribonukleáz oldat teljes mennyiségét az oszlopra viszszük és egy egyensúlyi pufferrel eluáljuk. Egy frakciószedő, mint pl. LKB 2211 Suprec, felhasználásával frakció oldatokat gyűjtünk, és az oldat áramlási sebessége durván 80 ml percenként. Az elúciós képet egy regisztráló berendezés, mint pl. LKB 2210, segítségével kirajzoltatjuk 0,5 mm/perc sebességet használva, és az adszorbciót 280 nm hullámhosszon egy LKB 2238 UNICOR Síi fotométerrel mérjük.
Az így végzett szűrési lépéssel nyert elúciós kép általában három fehérjecsúcsot mutat: az első fehérjecsúcs a ribonukleáz multimereket jelzi, a második fehérjecsúcs a dimer formáknak felel meg, és az utolsó fehéijecsúcs az enzim monomer formában maradó
HU 212 929 Β mennyiségének felel meg. Ezen a ponton tanácsos az egyedileg gyűjtött frakciók vizsgálatát elvégezni gélelektroforézis analízist alkalmazva. Ilyen vizsgálat SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) segítségével végezhető amint ezt Thomas és munkatársai, PNAS 72,2626 (1975) cikkben közölték. Ezen elektroforetikus vizsgálat során mindegyik gyűjtött frakcióból előnyösen kb. 50 μΐ-t összekeverünk 50 μΐ fedő pufferrel és kb. 10 percig kb. 95 ’C-on forraljuk. Ezt követően ebből a keverékből 25 μΐ-t töltünk be a gélzsebbe. Végül, az elektroforézist kb. 4 órán keresztül 20-35 mA áramerősséggel hajtjuk végre azért, hogy a ribonukleáz enzimek különböző formáit egymástól elválasszuk. A fehérjecsíkokat festékkel, mint pl. Coomassie Blue R250 (Merck), történő festéssel tesszük láthatóvá.
A fenti SDS-PAGE elektroforézis rendszert alkalmazva a ribonukleáz monomer, dimer vagy oligomer formáit, vagy ezek keverékét tartalmazó frakciók azonosíthatók és egymástól elválaszthatók. A frakciók összetételének azonosítása után a főként dimer formát tartalmazó frakciókat izoláljuk és összegyűjtjük. Az összegyűjtött dimer frakciókat előnyösen 800 ml-re koncentráljuk be egy tangenciális áramlási rendszerben. A tangenciális áramlási rendszer membrán diafragmáját egy megfelelő oldattal újra mossuk úgy, hogy nagyobb mennyiségű dimert tartsunk vissza. Előnyösen ezt az oldatot liofilizáljuk és a további lépések elvégzéséig 4 °C-on tárolhatjuk. Ideális esetben a liofilizálást úgy végezzük, hogy az oldatot kb. 200 ml-es adagokra osztjuk szét 500 ml-es gömblombikba és folyékony nitrogén atmoszférában egy rotációs evaporátorba helyezzük. A gömblombikot tömítéssel szorosan lezárjuk és 30 percig -30 ’C-on tartjuk, ezáltal az anyag liofilizálódik.
Mivel a kiindulási anyagok gyakran drágák lehetnek, különösen előnyös, ha az előző szűrési lépésben kiszűrt monomereket -visszavezetjük a jelen találmány szerinti dimerizációs folyamatba. Ez úgy végezhető, hogy összegyűjtjük azokat a frakciókat, melyekben jelentős mennyiségű ribonukleáz monomereket azonosítottunk, ezeket egy tangenciális áramlási rendszert alkalmazva koncentráljuk, és a fenti kapcsoló reagenst adjuk hozzá. A kapcsolási reakció a fent ismertetett módon megy végbe, és előnyösen a fenti szűrési lépést is elvégezzük. A visszavezetett ribonukleáz liofilizálása után az újonnan kapott dimereket alaposan összekeverjük az első dimerizációs lépésben kapott dimerizált termékekkel. Ezzel a reciklizáló eljárással a dimer termék kitermelésének 30%-os növekedését érhetjük el.
A fent kapott elsődleges dimerizációs oldatot tovább tisztítjuk egy második szűrési lépést végezve abból a célból, hogy a dimereket még jobban elválasszuk a monomerektől és oligomerektől továbbá, hogy a végtermék tisztaságát tovább növeljük. Ebben az esetben előnyös, hogyha a fent kapott liofilizált enzimkeveréket egy gélszűrésre alkalmas anyagon, mint pl. Sephadex G 50 F oszlopon eluáljuk. Ebben a lépésben az is előnyös, ha az oszlopot 5 körüli pH értékre állítjuk, és ezt egy 0,2 mól/1 nátrium-acetát puffer alkalmazásával érhetjük el. A nátrium-acetát pH = 5 puffért kb. 27 g nátrium-acetát trihidrát 1000 ml vízben való oldásával készítjük.
A második fehérjecsúcsnak megfelelő összegyűjtött frakciókat, amint azt első szűrési lépésben végzett mérésekkel meghatároztunk, a Sephadex oszlopra viszszük. Előnyösen az első szűrési lépésben ismertetett körülményeket és anyagokat alkalmazhatjuk újra a frakciók második szűrési lépésénél is. Az elúciós képet ismét felvesszük és ezt használjuk a második szűrési lépést követően gyűjtött kívánt frakciók azonosításában és izolálásában. Ebben az esetben az elúciós kép egy nagymennyiségű dimert tartalmazó fő fehéijecsúcsot és csak két gyenge másodlagos fehérjecsúcsot mutat.
Újra előnyös, ha az összegyűjtött frakciókból elvégezzük a ribonukleáz enzimek SDS-PAGE analízisét, amint ezt fent jeleztük. E vizsgálatok szerint az elúciós kép fő fehérjecsúcsának megfelelő frakciók alaposan tisztított ribonukleáz dimer terméket tartalmaznak. Ezen a ponton a fő fehérjecsúcsának megfelelő frakciókat összegyűjtjük és előnyösen egy tangenciális áramlási rendszer segítségével koncentráljuk. Az is előnyös, ha ennél a pontnál egy sótalanítási lépést is végrehajtunk a frakciók Sephadex G25 oszlopon keresztül történő szűrésével. A sótalanítási lépést kivitelezhetjük egy 25 cm átmérőjű és 65 cm hosszú és 32 liter alaptérfogatú oszlopon 15 liter/óra áramlási sebességgel működtetve. Továbbá, egy 50 mmól/1 ammőnium-hidrogén-karbonát puffért használunk.
Ennél a pontnál lévő termék alaposan tisztított ribonukleáz dimer terméket fog tartalmazni. Ahhoz azonban, hogy a liofilizált, ribonukleáz dimereket tartalmazó termékből egy gyógyászatilag alkalmazható formát kapjunk, ajánlott, hogy a dimereket endotoxin eltávolítási folyamaton vezessük keresztül. Ezért előnyös, ha a fent kapott tisztított dimer terméket egy további kromatográfiás eljárásnak vetjük alá, mint pl. egy nagy endotoxin megkötő képességű Detoxigel oszlopon (Pierce Chemical Company, USA) keresztül eluáljuk. A detoxigel endotoxin megkötő képessége kb. 2 mg/ml. Mivel más komponensek, pl. fehéije dimerek, nemspecifikus kötődése is lehetséges, a dimerizált anyag maximális visszanyerése a pufferek fiziológiád pH tartományban való alkalmazásával érhető el. Egy maximális dimer kitermelés elérés érdekében 0,ΙΟ,5 mól/1 sóoldatot (pl. NaCl) adunk a szükséges pH tartományban. Általában 1500 endotoxin egység/ml (E. U./ml) endotoxin tartalmú oldatot detoxifikáló oszlopon való kromatográfiával 1,0 E. U./ml ének alá csökkenthető.
A ribonukleáz dimer oldat endotoxinoktól való megszabadítása után az oldatot összegyűjtjük, sterilre szűrjük, és Iiofilizáláshoz steril gömblombikokba osztjuk szét. A végtermék endotoxin tartalmát egy diagnosztizáló rendszer segítségével, mint pl. „Coatest (R)” (Kabi-Vitrum, München) határozhatjuk meg. Ez a vizsgálat a Limulus-AmoeboCyten-Lysat (LAL) endotoxinnal való aktiválásán alapszik. Az aktivált LAL p-nitroanalint. egy
HU 212 929 Β sárga színű festéket hasít le a kromogén szubsztrátból (S2423), melynek extinkcióját, mint az endotoxin tartalmat 405 nm-en spektrofotométeren mérjük. Ha az endotoxin tartalom 0,1 ng/mg alatti, a dimer oldatot gömblombikokba rakjuk és liofilizáljuk.
A fenti folyamatot annyiszor ismételjük, ahányszor szükséges a kívánt mennyiségű ribonukleáz dimer végtermék eléréséhez. Az egyedi dimer termékeket tisztítás után sterilizálhatjuk vagy szükség szerint tovább liofilizáljuk, és homogén ribonukleáz dimert fogunk kapni, amely igen hatékony számos virális és bakteriális betegség kezelésében, mint azt a WO 89/11 294 számon közrebocsátott nemzetközi (PCT) szabadalmi bejelentésben ismertetik. Az anti-virális és anti-bakteriális hatás mellett a ribonukleáz dimerek más terápiás előnyökkel is bírnak, pl. gyulladásgátlóként és antihisztamin reagensként is ismertek az enzim monomer formájánál tapasztalt lehetséges citotoxikus hatás jelentkezése nélkül. A jelen eljárás különösen hasznos tisztított ribonukleáz dimer termékek nagy mennyiségben történő hatékony előállítására. A jelen találmány szerinti eljárását alkalmazva a kapott ribonukleáz dimer termékek enzimaktivitását ribonukleinsav oldatokon vizsgálhatjuk és a ribonukleáz dimer hozzáadása után egy spektrofotométeren követhetjük. Ezt az eljárást alkalmazva lehetőség nyílik alaposan tisztított dimer formában lévő enzim előállítására és az aktivitásának vizsgálatára is.
A következő példákkal a jelen találmány tárgyának bemutatását kívánjuk szolgálni anélkül, hogy bármely értelemben ezekre korlátozódnánk.
1. példa
Ribonukleáz dimerek előállítása g ribonukleáz monomert egy 5 liter 0,1 mól/1 dinátrium-hidrogén-foszfát dihidrát oldatot tartalmazó edényben oldunk fel, és a pH-t 0,1 mól/1 NaOH oldattal 10-re állítjuk. A dinátrium-hidrogén-foszfát dihidrát puffért 70,98 g dinátrium-hidrogén-foszfát dihidrát 1000 ml vízben való oldásával készítjük. Ezután 5 g dimetil-parafaimidát (Sigma, No. 29F3687) kapcsoló reagenst adunk 25 °C-on (szobahőmérséklet), és a dimetil-parafaimidát 1 perc alatt feloldódik. Az oldat pHját folyamatosan ellenőrizzük és 10-re állítjuk 0,1 mól/1 NaOH-dal. Mágneses keverővei az oldatot folyamatosan keverjük és a reakciót 45 percig végezzük kb. 25 °C-on. A reakciót a pH 7 körüli értékre való csökkentésével állítjuk le 1 mól/1 HC1 hozzáadásával.
A kapcsolási reakció elindítását követően különböző időpontokban vizsgálati mintákat veszünk, melyeket gélelektroforézissel analizálunk. A ribonukleáz monomereket, dimereket és multimereket SDS gélen választjuk el. Az alkalmazott ribonukleáz monomer relatív molekulatömege 15 000, a dimer formáé ennek kb. kétszerese. Az elektroforézissel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a dimereknek megfelelő fehérjecsík tisztán látható 15 perccel a kapcsoló reagens hozzáadása után, és ez a fehérjecsík egyre kifejezettebbé válik a reakció előrehaladtával. Továbbá, a ribonukleáz oligomer formái 30 perc elteltével képződnek.
A dimerizált ribonukleáz oldatot 800 ml-re koncentráljuk be egy tangenciális áramlási rendszerben (Millipore). A Millipore rendszer egy Filtron Ausschluss 10 000 d szűrőt, egy 7 bar szakítószilárdságú olefin membránt és egy Verder 80W 20-30 # 60 079 típusú pumpát tartalmaz. A bemeneti nyomás 2 bar, a kimeneti nyomás minimálisan kisebb, mint 0,2 bar. A munkakapacitás kb. 1 liter óránként. A berendezés holttere kb. 400 ml, ezért a koncentrálási folyamat befejezésekor a berendezést 400 ml-re átöblítjük. így a végtérfogat 1200 ml lesz.
A koncentrált ribonukleáz oldatot ezután Sephadex G 50 F (Pharmacia) oszlopon való szűrési folyamatnak vetjük alá a dimerizációs folyamat alatt képződött különböző oligomer formák elválasztása érdekében. E szűréshez egy 25,2 cm átmérőjű és 120 cm hosszú oszlopot 60 liter 50 mmól/1 ammónium-hidrogén-karbonát pufferrel pH = 8,6 mossuk. Az 50 mmól/1 ammóniumhidrogén-karbonát puffért 3,95 g ammónium-hidrogénkarbonát 1000 ml vízben való oldásával készítjük. Ezt követően az 1200 ml térfogatú fehéqeoldat teljes mennyiségét a gélágyra visszük és egyensúlyi pufferrel eluáljuk. Kb. 1000 ml-es frakciókat gyűjtjük egy frakciószedő segítségével (LKB 2211) 15 percig, amely 80 ml/perc áramlási sebességnek felel meg. Az elúciós képet egy LKB 2210 regisztráló berendezéssel vesszük fel 0,5 mm/perc sebességet használva, és az abszorpciót 280 nm-en egy LKB 2238 UNICOR Síi fotométeren mérjük. Az 2. ábrán látható elúciós kép három fehérjecsúcsot mutat, az első fehérjecsúcs a ribonukleáz multimereket jelzi, a második fehérjecsúcs a dimer formáknak, és az utolsó fehérjecsúcs az enzim monomer formáinak felel meg. Az 1. ábrán a vastag vonal a ribonukleáz oldat adszorpciós profilját jelzi nagyobb érzékenységgel mérve, míg az alacsonyabban futó vékony vonal egy kisebb érzékenységgel való mérést jelenti.
Ezután a ribonukleáz keveréket az egyedileg gyűjtött frakciókban SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) analizáljuk Thomas és munkatársai, PNAS, 72,2626 (1975) cikkében közölt eljárásnak megfelelően. Ebben az eljárásban mindegyik frakcióból 50 μΙ-t 50 μΐ fedő pufferrel keverünk össze, és a keveréket 10 percig 95 °C-on forraljuk. Ezt követően a keverékből 25 μΙ-t a gélzsebekbe juttatunk. A vizsgálat során a standard IV (Merck) fehérjekeveréket alkalmazzuk referenciaként, mely 12, 300, 30 000, 45 000, 66 200 és 76 000 molekulatömegű tartományt fedi. Az alkalmazott fedő puffer az alábbi összetevőkből áll:
- 0,72 g Tris HC1 (0,06 mól/1),
- 0,136 g EDTA (III) (5 mmól/1),
- 0,18 g glicerin (10%),
- 5 g SDS, a pH-t 7,2-re állítjuk (90 ml vizet adunk),
- 10 ml beta-merkaptoetanol (10%).
A gélelektroforézishez 18%-os elválasztógélt készítünk, amelyre egy 3,9%-os gyűjtőgélt fektetünk. A 18% akrilamid tartalmú elválasztógél oldat az alábbi összetevőkből áll:
- 9 g akrilamid,
- 0,045 g bisz-akrilamid,
HU 212 929 Β
- 0,136 g Tris HCl pH = 8,8,
- 10 mg SDS,
- 100 μΐ 10%-os ammónium-perszulfát oldat, és
- 10 μΐ TEMED.
Az SDS-poliakrilamid gélt úgy készítjük, hogy két 20 cmx20 cm nagyságú üveglemezt alaposan megtisztítunk és etanollal leöblítünk, majd ezeket egymásra helyezzük. A két lemez közötti rést, ahová a gélt fogjuk önteni, két, 1 mm vastagságú (20 cm hosszú, 1 cm széles) távtartó csík biztosítja. A távtartó csíkokat az üveglemezek bal és jobb szélére helyezzük. Az alsó szélt egy textil tapadócsíkkal zárjuk le, és mind a három szélt csipeszekkel erősítjük meg. A széleket ezenkívül még 1%-os agaróz oldattal is lezárjuk. Az agaróz megszilárdulása után a fenti elválasztógél oldatot függőleges helyzetben a hézagba töltjük az üveglemez tetejétől kb. 3 cm-rel lejjebb, és egy Pasteur-pipetta segítségével vizet rétegzünk a tetejére. A gél kb. 30 perc után polimerizálódik. A fedő vízréteget leöntjük, és a gél szélét egyszer fentebb ismertetett gyűjtőgél oldattal öblítjük.
Ezután a gyűjtőgél oldatot a felső szél tetejéig töltjük, és egy Teflon mintagyűjtő fésűt helyezünk be úgy, hogy a minta zsebek alja kb 1 cm-rel magasabban legyenek az elválasztógél tetejétől. Kb. 15 perc múlva a gyűjtőgél polimerizálódik, és a fésű eltávolítható. Ezután a textil tapadócsíkot távolítjuk el és a gélt függőleges helyzetben az elektroforézis készülékbe helyezzük. A puffer tartályokat elektroforézis pufferrel töltjük fel [6 g Tris bázis, (0,05 mól/1); 28,5 g glicin (0,38 mól/1); 1 g SDS (0,1%); és 1000 ml H2O] és a gél zsebeket egyszer a pufferrel átmossuk. A ribonukleáz dimer mintákat fedőpufferben 10 percig 95 ’C-on forraljuk és gélzsebeknek megfelelő vizsgálati mintazsebek területébe töltjük.
Az elektroforézist kb. 40 mA-en kb. 4 órán át végezzük. Ha azonban egy éjszakán keresztül való futtatás kívánatos, az áramerősséget kb. 6-8 mA-re csökkentve végezzük. A fehérjefront mozgását láthatóvá tehetjük, ha a fedő pufferbe 0,02% brómfenol-kék festéket keverünk. Az elektroforézist akkor fejezzük be, amikor a folyamat alatt mozgó fehérjefront a gél alját eléri. Az elválasztógélt levágjuk, kb. 30 percig egy fixáló oldatban festjük, majd 2 órán át egy 400 ml metanolt, 140 ml ecetsavat és 2000 ml vizet tartalmazó színtelenítő oldatban színtelenítjük. A fixáló oldatot 500 ml színtelenítő oldat és 12 ml festék oldat keverékéből állítjuk elő, mely festék oldatot 1 g Coomassiekék (R250, Merck), 50 ml H2O és 50 ml metanol keverékéből készítjük. A fehérjecsíkok láthatóvá tehetők a festék oldattal való festéssel, amint ezt fent jeleztük. Az SDS-PAGE technikát alkalmazva az eredmények azt jelzik, hogy a mintákban a ribonukleáz dimerek mennyisége fokozatosan növekszik, és végül multimereket tartalmazó frakciók is megjelennek.
Az összes olyan frakciót, melyek nagyrészt dimer formát tartalmaznak, összegyűjtjük és 800 ml-re koncentráljuk egy tangenciális áramlási rendszerben (Millipore). A membrán diafragmát újra 400 ml szűrlettel öblítjük, így a dimereket tartalmazó oldat teljes térfogata 1200 ml lesz. Ezután ezt az oldatot liofilizáljuk és a következő lépésig 4 ’C-on tároljuk. A liofilizálást úgy végezzük, hogy az oldatot kb. 200 ml-es részletekben 500 ml-es gömblombikokba osztjuk. A gömblombikokat folyékony nitrogén atmoszférába helyezzük és egy rotációs evaporátorban (Heidolph VV60) megfagvasztjuk. A gömblombikokat tömítéssel szorosan lezáijuk és 30 percig -30 ’C-on tartjuk. Végül ezt az anyagot a standard eljárással liofilizáljuk.
A folyamat további lépése előtt az első szűrési lépésben kiszűrt ribonukleáz monomereket összegyűjtjük és a dimerizációs folyamatba vezetjük vissza. Ez esetben az első szűrési lépés azon frakcióit, melyek főleg ribonukleáz monomereket tartalmaznak, összegyűjtjük és 4 literre konvertáljuk be a fentiekben ismertetett tangenciális áramlási rendszert alkalmazva. Ezután a monomer frakciókat dimerizáljuk a fenti kapcsoló reagenst használva. A reciklizált monomereket felhasználó kapcsoló lépést követően a fent jelzett szűrési lépést végezzük el, és ezzel a reciklizált monomereket most dimer formában kapjuk meg. Az első dimerizációs eljárásból kapott liofilizátumokat a reciklizált monomerekből nyert dimer liofilizátummal összekeverjük.
A fenti lépésekből nyert liofilizátum keveréket újra Sephadex G50F oszlopon keresztül kromatografáljuk azért, hogy a dimerek a monomerektől és oligomerektől történő jobb elválasztását érjük el. A kromatográfiás eljárást egy Sephadex G50F (Pharmacia) oszlopon 0,2 mól/1 nátrium-acetát pH = 5 pufferben hajtjuk végre. A 0,2 mól/1 nátrium-acetát puffért 27,22 g nátrium-acetát trihidrát 1000 ml vízben való oldásával készítjük. A kromatográfiás eljárást az első szűrési lépésben ismertetett körülmények között és berendezésben végezzük.
Ez esetben újra egy elúciós képet kapunk, mely a 2. ábrán látható. Ezen az ábrán a vastag vonal a ribonukleáz oldatok abszorpciós profilját jelenti nagyobb érzékenységen detektálva, mint a vékony vonallal jelzett profil. A nagyobb érzékenységgel felvett elúciós profil közepén egy nagy dimertartalmú fő fehérjecsúcsot, és csak két gyenge másodlagos fehérjecsúcsot láthatunk. A fehérjecsúcsokból vett enzimminták SDS-PAGE analízise a dimerek nagyobb felhalmozódását mutatja a fő fehérjecsúcsban az első szűrési lépésből származó elúciós profilhoz képest.
A fő fehérjecsúcs frakciót összegyűjtjük és a fenti tangenciális áramlási rendszerrel bekoncentráljuk. A sótalanításhoz ezen összegyűjtött frakciókat egy Sephadex G25 oszlopon engedjük keresztül. Az oszlop 25,2 cm átmérőjű és 65 cm hosszú, az alaptérfogan 32 liter, és 15 liter/óra áramlási sebességgel működtetjük. A második elúciós profil fő fehérjecsúcsából származó összesen maximálisan 5 liter ribonukleáz oldatot a Sephadex oszlopra visszük. A sótalanítást 50 mmól/1 ammónium-hidrogén-karbonát pufferben végezzük. A sótalanítási lépés 90 percig tart, ami alatt 5 liter szűrletet gyűjtünk. A fennmaradó részt elöntjük. Felrajzoljuk az elúciós profilt és a kapott egyetlen fehérjecsúcsot egy 5 literes Schott-flaskába gyűjtjük. A tisztított vég6
HU 212 929 Β termékből vett mintákat beta-merkaptoetanollal redukálva és nem redukált körülmények között vizsgáljuk. A tisztított végtermék SDS-PAGE analízise azt mutatja, hogy csak ribonukleáz dimerek vannak jelen.
Annak érdekében, hogy a liofilizált fehérjét gyógyászatilag hatékony formává alakítsuk, a ribonukleáz dimereket meg kell szabadítani az endotoxinoktól. E célból a tisztított dimereket egy Detoxigel oszlopon kromatografáljuk. A kívánt ribonukleáz dimer termék maximális visszanyerése szempontjából szükséges, hogy az alkalmazott pufferek fiziológiai pH tartományban legyenek. Ez sóoldat hozzáadásával valósítható meg. Az enzim oldatot a Detoxigel oszlopra visszük fel, és az endotoxinok kb. 1500 E. U./ml mennyiségben távolítjuk el. E lépés előtt a Detoxigel oszlopot 1% dezoxikoláttal regeneráljuk, ezt követően vízzel alaposan addig mossuk, míg az elfolyóban endotoxint tudunk kimutatni. Az oszlop térfogata 750 ml (9,5 cm átmérőjű és 14 cm hosszú), az oszlopot 0,1 mól/1 ammónium-bikarbonáttal hozzuk egyensúlyba. Az endotoxin-mentes puffért steril vízzel keverjük. A ribonukleáz oldatot 2 liter térfogatban a gélágyra helyezzük és hagyjuk, hogy beszívódjon a gélbe. A fehérjét ezután az egyensúlyi pufferrel eluáljuk és egy steril főzőpohárba gyűjtjük. Az oldatot egy steril gömblombikba visszük át liofilizálás céljából.
A készítmény endotoxin tartalmát egy „Coatest (R)” (Kabi-Vitrum, München) diagnosztikai rendszer segítségével határozzuk meg. Ez a vizsgálat a Limulus-AmoeboCyten-Lysat (LAL) endotoxinnal való aktiválásán alapszik. Az aktivált LAL p-nitroanalint, egy sárga színű festéket hasít le a kromogén szubsztrátból (S-2423), és a színintezitás csökkenését, mint az endotoxin tartalmat 405 nm-en spektrofotométeren mérjük. A 0,1 ng/mg alatti endotoxi tartalmú tisztított ribonukleáz dimer terméket gömblombikokba rakjuk és liofilizáljuk. A kapott tennék (15 g, 30%-os kitermelés) egy liofilizált, alaposan tisztított ribonukleáz dimer oldat, mely további felhasználásig tárolható.
2. példa
Enzimaktivitás vizsgálat
A jelen találmány szerint előállított dimer ribonukleáz enzimaktivitását a Kunitz, J. Gén. Physiol., 24, 15 (1940) cikkben közölt aktivitás vizsgálattal lehet mérni. Ez a vizsgálat azon alapszik, hogy a ribonukleáz ribonukleinsavra való hatása következtében ennek abszorpciós spektruma az UV sávban a rövidebb hullámhosszúságú tartomány felé mozdul el. A 290-305 nm tartományban a nukleinsav koncentráció csökken a ribonukleázzal való emésztés eredményeképpen. A reakció kezdeti szakaszában a csökkenés lineáris és ez felhasználható az enzimaktivitás mérésére. Ebben a vizsgálatban a nukleinsav mennyiségének csökkenését 300 nm-en mérjük.
A vizsgálatot 25 °C-os állandó hőmérsékleten végezzük, és egy termosztálható küvettát használunk, így az összes oldat használat előtt 25 ’C-on 5 percig kezelhető. A méréseket 300 nm-en egy spektrofotométerben végezzük. A reakcióelegy térfogata 3 ml, a reakciót 3 ml-es küvettában végezzük, mely 1 cm vastagságú.
A reakciókeveréket 1,5 ml ribonukleinsav oldatból és 0,05-0,5 ml ribonukleáz frakciókat magukba foglaló vizsgálandó mintából készítjük, és vízzel 10 ml-re egészítjük ki. A ribonukleinsav oldatot 80 mg ribonukleinsav és nátrium-só (Boehringer) 50 ml acetát pufferben való oldásával készítjük. Az acetát puffer 0,1 mól/1 acetát puffer pH = 5, amit 0,57 ml ecetsav és kb. 80 ml desztillált víz keverésével készítünk, a pH-t 1 mól/1 NaOH-dal 5-re állítjuk, desztillált vízzel 100 ml-re egészítjük ki és sterilre szűrjük. A ribonukleáz dimer frakciókat is magukba foglaló vizsgálandó mintákat 5 mg ribonukleáz dimer 5 ml vízben való oldásával készítjük és úgy hígítjuk, hogy a mért érték a megfelelő tartományon belül legyen.
A ribonukleinsav és a vizsgálandó minta oldatokat egy küvettában összekeverjük és a ribonukleinsav csökkenést kb. 20 percig Spectronic 1001 (Bausch & Lomb) spektrofotométeren mérjük. Az abszorpciós profilt kirajzoljuk és a lineáris tartományt kb. 8 percig észleljük. A reakciót 25 ’C-on addig folytatjuk, míg teljesen végbe nem megy, ami kb. 3 óra múlva következik be. Az oldatokat újra mérjük a végső érték megállapítása miatt, és a méréseket kétszer ismételjük átlagérték meghatározásához.
Az enzimaktivitás számításához a nukleinsav extinkcióját meg kell határozni a reakció elején (Eo) és a ΔΕ/perc kezdeti lineáris szakaszon a reakció végén (Ee). A ribonukleáz dimer vizsgálandó minták hígítását úgy kell választani, hogy a ΔΕ/perc 0,007-nél ne legyen nagyobb. A reakcióhoz használt vak értékét, amelyet ribonukleázból és vízből készítünk, a mért értékekből ki kell vonni. Az enzim egységeként azt az enzim mennyiséget tekintjük, amely a vizsgálati körülmények között a szubsztrát E-Ee értékének percenként 100% csökkenését okozza 25 ’C-on. A 300 nm-en megfigyelhető extinkció legnagyobb lehetséges értéke Eo-Ee. Az enzim specifikus aktivitását a következő összefüggésből számítjuk:
(3xAE/perc) hígítási faktor (Eo-Ee)xminta oldat térfogata (ml)
A jelen találmány szerint dimer ribonukleáz enzimek a szakirodalomban ismertetett [lásd pl. Sorrentino és társai: Eur. J. Biochem, 124, 183-189 (1982)] enzimaktivitást mutatják.
Claims (17)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás ribonukleáz dimer előállítására, melynek sorána) ribonukleáz oldatot állítunk elő úgy, hogy ribonukleáz monomereket adagolunk egy legalább 9-es pH-értékű puffer oldathoz,b) egy parafaimidát kapcsolóreagenst adagolunk a ribonukleáz oldathoz, és a ribonukleáz monomereket dimerizáljuk, miközben a reakcióelegy pH-értékét nem engedjük 9 alá csökkenni,c) a dimerizációs reakciót egy adott ponton leállítjuk,d) a kapott dimerizált ribonukleázt folyadékkroma7HU 212 929 Β tográfiásan tisztítjuk, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben a dimerizáciős reakciót úgy állítjuk le, hogy sav adagolásával az oldat pH-értékét 7±0,2-re csökkentjük, a kapott oldatot töményítjük, majd a d) tisztítási lépésben két folyadékkromatográfiás tisztítási lépést alkalmazunk, ahol az első tisztítási lépésben kapott, fő tömegében ribonukleáz dimert tartalmazó frakciót töményítés után vezetjük a második tisztítási lépésbe; és kívánt esetben a kapott ribonukleáz dimert sómentesítjük és második kromatográfiás tisztítási lépés előtt vagy után, és kívánt esetben a kapott ribonukleáz dimerből eltávolítjuk az endotoxinokat, és kívánt esetben a tisztítás során kapott ribonukleáz monomereket tartalmazó frakciókat visszavezetjük a b) lépésbe.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monomer ribonukleáz oldat pH-értékét 10+0,2 értékre állítjuk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben nátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát oldatot alkalmazunk puffer oldatként.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapcsoló reagensek a monomer ribonukleáz oldathoz való adagolása közben az oldat pH-ját 10+0,2 értéken tartjuk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy parafaimidát kapcsoló reagensként dimetilparafaimidátot alkalmazunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) dimerizáciős lépést szobahőmérsékleten hajtjuk végre, előnyösen az oldat keverése mellett.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimerizáciős reakciót HC1 adagolásával állítjuk le.
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ribonukleáz dimert tartalmazó oldatot tangencionális áramlási rendszerben töményítjük az első folyadékkromatográfiás lépés előtt és/vagy után.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy folyadékkromatográfiás lépést egy olyan keresztkötött dextrán mátrix alkalmazásával végzünk, melynek peptidekre és globuláris fehérjékre vonatkozó molekulatömeg-frakciótartománya 150030 000.
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ribonukleáz monomer oldat 10 tömegrész ribonukleáz monomert tartalmaz 1000 tömegrész puffer oldatra vonatkoztatva, amelyhez 1 tömegrész mennyiségben adagoljuk a kapcsolószert.
- 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyadékkromatográfiás lépés után kapott frakciót liofilizáljuk.
- 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első szűrési lépés után kapott, fő tömegükben monomer ribonukleázt tartalmazó frakciókat visszavezetjük a b) dimerizáciős lépésbe.
- 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a legalább egy folyadékkromatográfiás lépést egy megfelelő ioncserélő gyanta alkalmazásával hajtjuk végre.
- 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második kromatográfiás lépést 5-ös pH-értéken hajtjuk végre, ahol a pH-értéket előnyösen nátrium-acetát pufferrel állítjuk be.
- 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első és/vagy második folyadékkromatográfiás lépések során összegyűjtött frakciókat gélelektroforézissel analizáljuk.
- 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második folyadékkromatográfiás lépést követően sómentesítési lépést hajtunk végre olyan keresztkötött dextrán mátrix alkalmazásával, melynek peptidekre és globuláris fehérjékre vonatkozó molekulatömeg-frakciótartománya 1500-30 000.
- 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az endotoxinokat gélkromatográfiás módszerrel távolítjuk el endotoxint megkötő mátrixot alkalmazva.
Priority Applications (24)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK90907615.0T DK0509989T3 (da) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Fremgangsmåde til fremstilling af ribonucleasedimere |
| DE69026275T DE69026275T2 (de) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Verfahren zur herstellung von ribonuklease-dimeren |
| AU56401/90A AU645252B2 (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of producing ribonuclease dimers |
| JP2507450A JP2732515B2 (ja) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | リボヌクレアーゼ二量体の製造方法 |
| BR909007970A BR9007970A (pt) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Processo para preparacao de dimeros de ribonuclease |
| HU9202251A HU212929B (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preraring ribonuclease dimers |
| SU905052835A RU2060274C1 (ru) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Способ получения очищенного димера рибонуклеазы |
| SG1996003125A SG47607A1 (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| ES90907615T ES2086403T3 (es) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Procedimiento para la elaboracion de dimeros de ribonucleasa. |
| SU905052819A RU2067617C1 (ru) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Способ получения димера лизоцима |
| RO92-0932A RO112641B1 (ro) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Procedeu de preparare a unui produs dimeric de ribonuclează |
| EP90907615A EP0509989B1 (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| AT90907615T ATE136056T1 (de) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Verfahren zur herstellung von ribonuklease- dimeren |
| PCT/US1990/000141 WO1991010730A1 (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| CA002073350A CA2073350C (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Ribonuclease dimers and method of preparing them |
| KR1019920701567A KR0142172B1 (ko) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | 리보뉴클레아제 이량체를 만드는 개량된 방법 |
| PL90288268A PL165863B1 (pl) | 1990-01-08 | 1990-12-14 | Sposób wytwarzania dimeru rybonukleazy PL PL |
| NO1992922625A NO922625D0 (no) | 1990-01-08 | 1992-07-03 | Fremgangsmaate til fremstilling av ribonuklease-dimerer |
| OA60243A OA09707A (en) | 1990-01-08 | 1992-07-07 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| FI923124A FI100724B (fi) | 1990-01-08 | 1992-07-07 | Ribonukleaasidimeerien valmistusmenetelmä |
| BG96579A BG60685B1 (bg) | 1990-01-08 | 1992-07-07 | Метод за получаване на рибонуклеазни димери |
| LVP-92-507A LV10118B (en) | 1990-01-08 | 1992-12-28 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| LTIP595A LT3424B (en) | 1990-01-08 | 1993-06-02 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| HK166796A HK166796A (en) | 1990-01-08 | 1996-09-05 | Method of preparing ribonuclease dimers |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU905052819A RU2067617C1 (ru) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Способ получения димера лизоцима |
| HU9202251A HU212929B (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preraring ribonuclease dimers |
| PCT/US1990/000141 WO1991010730A1 (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| SG1996003125A SG47607A1 (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preparing ribonuclease dimers |
| OA60243A OA09707A (en) | 1990-01-08 | 1992-07-07 | Method of preparing ribonuclease dimers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT65395A HUT65395A (en) | 1994-06-28 |
| HU212929B true HU212929B (en) | 1996-12-30 |
Family
ID=33136228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202251A HU212929B (en) | 1990-01-08 | 1990-01-08 | Method of preraring ribonuclease dimers |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0509989B1 (hu) |
| JP (1) | JP2732515B2 (hu) |
| KR (1) | KR0142172B1 (hu) |
| AT (1) | ATE136056T1 (hu) |
| AU (1) | AU645252B2 (hu) |
| BG (1) | BG60685B1 (hu) |
| BR (1) | BR9007970A (hu) |
| DE (1) | DE69026275T2 (hu) |
| DK (1) | DK0509989T3 (hu) |
| ES (1) | ES2086403T3 (hu) |
| FI (1) | FI100724B (hu) |
| HK (1) | HK166796A (hu) |
| HU (1) | HU212929B (hu) |
| LT (1) | LT3424B (hu) |
| LV (1) | LV10118B (hu) |
| NO (1) | NO922625D0 (hu) |
| OA (1) | OA09707A (hu) |
| PL (1) | PL165863B1 (hu) |
| RU (2) | RU2060274C1 (hu) |
| SG (1) | SG47607A1 (hu) |
| WO (1) | WO1991010730A1 (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DZ1964A1 (fr) * | 1995-01-13 | 2002-10-15 | Nika Health Products Ltd | Nouvelle applications d'un dimère de lysozyme. |
| FR3115037A1 (fr) * | 2020-10-12 | 2022-04-15 | Compagnie Laitiere Europeenne | Procédé de purification de fraction de protéines cationiques et fraction ainsi obtenue |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU624331B2 (en) * | 1988-05-26 | 1992-06-11 | Nika Health Products Ltd. | A composition having as its active ingredient lysozyme or ribonuclease dimer in a pharmaceutically acceptable carrier |
| US7850731B2 (en) | 2006-10-04 | 2010-12-14 | Seaspine, Inc. | Articulating spinal implant |
-
1990
- 1990-01-08 KR KR1019920701567A patent/KR0142172B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-01-08 WO PCT/US1990/000141 patent/WO1991010730A1/en active IP Right Grant
- 1990-01-08 HU HU9202251A patent/HU212929B/hu unknown
- 1990-01-08 DK DK90907615.0T patent/DK0509989T3/da active
- 1990-01-08 AT AT90907615T patent/ATE136056T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-08 ES ES90907615T patent/ES2086403T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-08 DE DE69026275T patent/DE69026275T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-08 AU AU56401/90A patent/AU645252B2/en not_active Ceased
- 1990-01-08 SG SG1996003125A patent/SG47607A1/en unknown
- 1990-01-08 BR BR909007970A patent/BR9007970A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-01-08 RU SU905052835A patent/RU2060274C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-01-08 EP EP90907615A patent/EP0509989B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-08 RU SU905052819A patent/RU2067617C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-01-08 JP JP2507450A patent/JP2732515B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-14 PL PL90288268A patent/PL165863B1/pl not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-03 NO NO1992922625A patent/NO922625D0/no unknown
- 1992-07-07 OA OA60243A patent/OA09707A/en unknown
- 1992-07-07 FI FI923124A patent/FI100724B/fi active
- 1992-07-07 BG BG96579A patent/BG60685B1/bg unknown
- 1992-12-28 LV LVP-92-507A patent/LV10118B/en unknown
-
1993
- 1993-06-02 LT LTIP595A patent/LT3424B/lt not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-09-05 HK HK166796A patent/HK166796A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL165863B1 (pl) | 1995-02-28 |
| BG60685B1 (bg) | 1995-12-29 |
| EP0509989B1 (en) | 1996-03-27 |
| FI923124A (fi) | 1992-07-07 |
| PL288268A1 (en) | 1991-09-09 |
| LT3424B (en) | 1995-09-25 |
| LTIP595A (en) | 1994-12-27 |
| HUT65395A (en) | 1994-06-28 |
| RU2060274C1 (ru) | 1996-05-20 |
| BR9007970A (pt) | 1992-11-17 |
| KR0142172B1 (ko) | 1998-07-01 |
| SG47607A1 (en) | 1998-04-17 |
| LV10118B (en) | 1995-02-20 |
| DK0509989T3 (da) | 1996-07-08 |
| AU5640190A (en) | 1991-08-05 |
| DE69026275D1 (de) | 1996-05-02 |
| HK166796A (en) | 1996-09-13 |
| DE69026275T2 (de) | 1996-10-02 |
| EP0509989A1 (en) | 1992-10-28 |
| JPH05505094A (ja) | 1993-08-05 |
| FI100724B (fi) | 1998-02-13 |
| OA09707A (en) | 1993-08-30 |
| FI923124A0 (fi) | 1992-07-07 |
| LV10118A (lv) | 1994-05-10 |
| BG96579A (bg) | 1993-12-24 |
| WO1991010730A1 (en) | 1991-07-25 |
| ES2086403T3 (es) | 1996-07-01 |
| KR920703802A (ko) | 1992-12-18 |
| RU2067617C1 (ru) | 1996-10-10 |
| JP2732515B2 (ja) | 1998-03-30 |
| AU645252B2 (en) | 1994-01-13 |
| ATE136056T1 (de) | 1996-04-15 |
| NO922625D0 (no) | 1992-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Banda et al. | Alpha 1-proteinase inhibitor is a neutrophil chemoattractant after proteolytic inactivation by macrophage elastase. | |
| De Renzo et al. | Preparation and certain properties of highly purified streptokinase | |
| JPH02504468A (ja) | 繊維芽細胞成長因子のアナログ | |
| DE69032025T2 (de) | Menschlicher elastase-inhibitor | |
| Mahieu | Biochemical structure of glomerular basement membrane in chronic glomerulonephritis. I. Lobular and membrano-proliferative glomerulonephritis | |
| HU212929B (en) | Method of preraring ribonuclease dimers | |
| HU214509B (hu) | Eljárás tisztított lizozim dimerek előállítására | |
| Shiozawa et al. | Isolation and Characterization of the Polypeptide Components from Light‐Harvesting Pigment‐Protein Complex B800–850 of Rhodopseudomonas capsulata | |
| US5314816A (en) | Method of preparing lysozyme dimers | |
| EP0616642B1 (de) | Neue thrombininhibitorische proteine aus landblutegeln | |
| CA2073350C (en) | Ribonuclease dimers and method of preparing them | |
| US6316236B1 (en) | Lysozyme dimer | |
| Rhodes et al. | The elastinolytic proteinase of Aspergillus flavus is not glycosylated | |
| JPH01261332A (ja) | プレカリクレイン賦活物質の不活化のためのキモトリプシンの用途 | |
| JP2729484B2 (ja) | アンチトロンビン−▲ｉｉｉ▼の精製方法 | |
| JPH03287600A (ja) | ヒト炎症局所由来ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 | |
| JPH06511383A (ja) | ウイルス不活性化法およびそのための医薬組成物 | |
| JPS6169730A (ja) | 可溶性蛋白質ｆｂｐ及びその製造方法 | |
| JPH02100696A (ja) | ヒト由来分化誘導物質 | |
| JPH0196197A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド、その製造法およびその用途 |