CZ220297A3

CZ220297A3 - Použití lysozymového dimeru pro výrobu farmaceutického prostředku

Info

Publication number: CZ220297A3
Application number: CZ972202A
Authority: CZ
Inventors: Witold Kiczka
Original assignee: Nika Health Products Limited
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-13
Publication date: 1998-02-18
Also published as: UA50728C2; SV1996000001A; AU709620B2; TNSN96004A1; HUP9801689A3; NO973203L; MD970244A; EP0804227A2; ES2109208T1; DE804227T1; EA199700101A1; CZ293353B6; HUP9801689A2; HU223903B1; GB2311724B; BG101709A; EP1086703A3; GEP20012571B; KR100420377B1; NO973203D0

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových aplikací lysozymového dimeru a prostředku, které tento dimer obsahují. Tyto nové aplikace jsou založeny na společném principu nespecifické stimulace imunitního systému a jsou obzvláště užitečné při prevenci a/nebo léčení symptomů chorob spojených se zhoršenou funkcí přirozených obranných a regeneračních systémů lidského a zvířecího těla.

Dosavadní stav techniky

Koncem 80. let bylo zjištěno, že dimerizované formy určitých enzymů si zachovávají prospěšné vlatnosti odpovídajících monomerů, ale zároveň jsou mnohem méně toxické než tyto monomery a v některých případech nemají při použití v terapeutických dávkách vůbec žádné negativní vedlejší účinky. Antivirální a antibakteriální prostředky obsahující jako účinnou přísadu lysozymový dimer nebo jiné dimerizované enzymy byly popsány v mezinárodní přihlášce WO 89/11294.

V této přihlášce se uvádí, že dimer lysozymu je schopen inhibovat proliferaci řady bakteriálních kmenů získaných kultivací ze vzorků odebraných pacientům, když se aplikují v koncentraci 1,25 až 20 mg, vztaženo na 1 ml kultury. Také se zde uvádí, že je tento dimer účinný při léčení infekcí vyvolaných psím parvovirem (CPV), když se podává orálně dvakrát denně v dávce 1 až 2 mg/kg tělesné hmotnosti.

Později byly zjištěny další atraktivní vlastnosti dimerů lysozymu a byly vyvinuty další terapeutické aplikace tohoto • · · » léčiva, zejména ve vztahu k léčení bakteriálních a virových infekcí (viz například mezinárodní přihlášku WO 94/01127.

V přihlášce WO 94/01127 je uvedená modelová teorie, která může napomoci porozumění různým účinkům pozorovaným u lysozymového dimeru. Přestože celý mechanismu účinku lysozymového dimeru není dosud úplně prozkoumán, zdá se, že zde existuje přídavná léčivá schopnost, kterou nelze vysvětlit bakteriolytickou aktivitou odpovídajícího monomeru. Vědci pozorovali určité imunostimulační účinky dimerizovaného lysozymu, které se týkají zejména modulace hladiny cytokinů. Na základě experimentů učinili závěr, že lysozymový dimer pravděpodobně zabraňuje průniku virů do bakteriálních buněk. Předpokládá se, že přitom dochází k blokování určitých oblastí vnějšího povrchu buněk, které pravděpodobně obsahují receptorové proteiny pro virus.

V dosavadním stavu techniky jsou uvedeny další výsledky získané in vitro s lysozymovým dimerem. Tak například zejména Bartholeyns a Zenebergh (Europ. J. Cancer, sv. 15, 1979, 85-91) zjišťovali, zda dimerovaný lysozym nevykazuje cytostatickou účinnost proti jaterním rakovinným buňkám (HCT) in vitro. Pozorovali 73 ± 15% inhibici multiplikace rakovinných buněk v buněčné kultuře (výše uvedená citace, str. 89, tabulka 2).

Překvapující je, že kromě přihlášky WO 94/01127 neexistují žádné publikace, v nichž by byly popsány in vivo experimenty s lysozymovým dimerem. Je velmi zvláštní a překvapující skutečností, která čeká na vysvětlení, proč ani Barholeyns a Zenebergh ani žádný jiný vědec nepokračoval v dalším vývoji tohoto slibného objevu využitelného při boji s rakovinou. Srovnávací studie (viz obr. 1) čistoty lysozymového dimeru produkovaného způsobem popsaným v Sorrentino et al., Eur. J. Biochem., 124, 183 až 189 (1982) a lysozymo• · · · • ·

vého dimeru přednostně používaného podle našeho vynálezu ukazují na alespoň jeden možný důvod: v přípravku získaném způsobem, který popsali Sorrentino a další, jsou obsaženy ve vysoké koncentraci vedlejší produkty, jako je monomer, trimer a tetramer lysozymu. Produkt, kterého se přednostně používá podle našeho vynálezu, je vysoce purifikovaný, tj . obsahuje požadovaný dimer lysozymu v množství až do 90 % hmotnostních, vztaženo na celkovou lysozymovou frakci přípravku. Způsob výroby takového vysoce purifikováného lysozymového dimeru byl popsán v přihlášce WO 91/10731. Toto zjištění silně podporuje předpoklad, že to jednoduše byla nedostatečná čistota lysozymového dimeru podle dosavadního stavu techniky, která bránila provádět in vivo experimenty a aplikace, poněvadž již před 15 lety bylo známo v tomto oboru, že monomemí forma lysozymu je přes svou prospěšnou antibakteriální účinnost poněkud toxická a může vyvolávat záněty a prudké alergie, a dokonce vyvolávat symptomy toxického šoku.

Ve světle těchto okolností se zdá být srozumitelnějším, proč se žádný kompetentní vědec včetně Bartholeyna a Zenebergha, přestože doporučili lysozymový dimer jako slibného kandidáta pro další zkoumání, neprovedl v průběhu minulých 10 až 15 let žádné další experimenty zaměřené na vývoj in vivo aplikací lysozymového dimeru.

Přestože v tomto ohledu nebyl ve vědeckém světě dostatek aktivity, zřejmě v důsledku předpojatosti proti použití lysozymového dimeru in vivo, původci předkládaného vynálezu provedli další výzkumné a vývojové práce zaměřené na zlepšení způsobu produkce a purifikace dimerizovaného lysozymu a nalezení in vivo aplikací tohoto produktu u člověka a jiných živočichů. Výsledkem těchto prací bylo vyvinutí protivirových a antibakteriálních aplikací popsaných v mezinárodní přihlášce WO 94/01127.

Podstata vynálezu

Na základě své znalosti, že dimerizovaný lysozym vykazuje nízkou toxicitu ve srovnání s monomerem a díky dostupnosti přípravku obsahujícího nový vysoce purifikovaný lysozymový dimer původci tohoto vynálezu zahájili pokusy s in vivo aplikací přípravku na bázi lysozymového dimeru proti rakovině, přestože dosavadní stav techniky nenavrhoval žádné jiné použití této látky kromě léčení bakteriálních nebo virových infekcí. Jednou z největších výhod tohoto vynálezu je, že umožňuje používat vysoce purifikovaného lysozymového dimeru pro výrobu farmaceutických prostředků doplňujících nebo nahrazujících extrémně toxická protirakovinová léčiva, kterých se obvykle používá při konvenční chemoterapii.

Přehled obr, na výkrese

Na obr. je uvedeno porovnání čistoty přípravků na bázi lysozymového dimeru vyrobených dvěma různými technologiemi známými z dosavadního stavu techniky.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Vysoce purifikovaného lysozymového dimeru podle vynálezu se může používat při výrobě farmaceutických prostředků, které jsou přímo aplikovatelné při léčení zvířat a lidí, poněvadž obsahují nízké množství toxického monomeru.

Jak již bylo uvedeno výše, tento purifikovaný lysozymový dimer obsahuje přibližně 10 % hmotnostních nebo menší množství nežádoucích vedlejších produktů a je možno ho získat dimerizací lysozymových monomerů jakéhokoliv původu, například lysozymových monomerů získaných z člověka, zvířat, vajec, rostlin a mikroorganismů. Monomery mohou být budí

získány bud v nativní formě izolací z přírodních zdrojů, nebo mohou být vyrobeny chemickými metodami nebo metodami genového inženýrství. Posledně uvedenými způsoby se získají lysozymové monomery stejného nebo v podstatě stejného chemického a biologického druhu, jako jsou monomery vyskytující se v přírodě.

Zkouškami na buněčných kulturách (in vitro) a na modelových zvířatech (in vivo), přednostně myších a krysách, původci tohoto vynálezu úspěšně demonstrovali, že použité prostředky na bázi lysozymového dimeru vykazují pozoruhodnou účinnost při inhibici nebo i úplné prevenci proliferace buněk rakovinných tkání in vitro a in vivo. Takový kurativní účinek bylo možno potvrdit u různých typů rakoviny včetně, ale nikoliv jen těch typů, o nichž je v tomto oboru známo, že jsou vyvolány nebo ovlivněny viry. Z těchto virů je možno uvést zejména lidský papilloma virus, virus EpsteinBarrové, virus hepatitis B a retroviry, jako je HTLV-I (virus leukémie dospělých T-buněk), HTLV-II (virus lymfomu) a HIV-I (virus humánní imunodeficience), včetně jejich podtypů.

Z typů rakovin, které mohou být indukovány nebo ovlivněny působením těchto virů, je možno uvést karcinom čípku, karcinom urogenitálního traktu, Kaposiho sarkom, primární karcinom jaterních buněk, leukémii, lymfom T-buněk, AIDS a jakýkoliv podtyp těchto rakovin. Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek a způsob prevence a/nebo léčení rakoviny u zvířat a člověka.

Další užitečnou aplikaci vysoce purifikovaného lysozymového dimeru objevili původci tohoto vynálezu překvapujícím způsobem při klinických zkouškách, když byly prostředky na bázi lysozymového dimeru podávány pacientům s více nebo méně infikovanými pooperačními ranami, například * · • · · ·

po amputaci dolní končetiny. Ukázalo se, že při lokální aplikaci tohoto dimeru došlo nejen k úspěšnému potlačení infekce v ráně, nýbrž i ke stimulaci růstu chlupů a obnovení ochlupení v ošetřené oblasti. Tento překvapující objev vedl k dalším výzkumům a nakonec k výrobě farmaceutických prostředků, jež lze aplikovat v případech poruch růstu vlasů, zejména takových poruch růstu vlasů, které jsou založeny na imunologických malfunkcích nebo dysfunkcích, jako je tomu například v případě alopecia areata.

Prostředky tohoto typu mohou alespoň zčásti splňovat funkci dlouho žádaného prostředku, který by působil jako stimulátor růstu vlasů. Princip, o který se opírá tento úplně neočekávaný účinek, je zřejmě založen mj. na stimulaci a zlepšení imunitních obranných mechanismů, zlepšení krevního oběhu ve vrstvách povrchové tkáně a kůže, obecném nespecifickém zlepšení imunologických funkcí a pravděpodobně ještě dalších neidentifikovaných účincích.

Ještě další překvapující a obchodně velmi zajímavá aplikace farmaceutického prostředku obsahujícího lysozymový dimer byla nalezena při chovu ryb a medonosných včel, když byly prováděny pokusy nahradit konvenční antibiotika různými nespecifickými imunostimulátory, mj. také dimerem lysozymu.

Použití imunostimulátorů v rybí kultuře pro prevenci a/nebo léčení chorob ryb představuje slibný směr (Siwicki a Anderson, 1990; Siwicky et al., 1994). V současné době se pro léčení chorob ryb používá antibiotik a dále se používá různých léčiv a chemikálií pro sterilizaci chovných rybníků (Stoskofp, 1993). Každá z těchto terapií je přinejmenším zčásti účinná při léčení určité konkrétní choroby, ale vznikají problémy s akumulací použitých látek v životním prostředí a mase ryb, jakož i s výskytem patogen• · • · · · • · · · · * nich kmenů organismů, které jsou resistentní vůči různým antibiotikům.

V případě chovu včel je rozšířena praxe usmrtit včelstva, je-li k dispozici důkaz, že jsou včely postiženy mikrobiálními, například bakteriálními a/nebo virovými infekcemi. Taková praxe zabraňuje rozšíření infekce na další včelstva a tím minimalizuje ztráty. Existuje proto potřeba vyvinout alternativní a spolehlivou metodu profylaktického a/nebo léčebného ošetření medonosných včel, v němž by byly spojeny výhody vyplývající z použití antibiotik s posílením imunitního systému včel a antibiotik zabraňujících vzniku mikrobiálních kmenů resistentních vůči antibiotikům. Předložený vynález poskytuje metodu pro splnění této potřeby. Kromě toho, i kdyby byl lysozymový dimer přítomen v detegovatelných koncentracích konečném produktu, tj. medu, bylo by to pravděpodobně považováno spíše za zlepšení kvality medu, než za změnu k horšímu, s ohledem na užitečné nespecifické imunostimulační účinky lysozymového dimeru.

Imunostimulátory obecně tvoří skupinu biologických a syntetických sloučenin, které posilují nespecifické buněčné a humorální obranné mechanismy zvířat a člověka. Imunostimulátory, jako je β-glukan, chitosan, levamisol, stopové minerály a jejich kombinace a různé produkty pocházející z rostlinných a živočišných zdrojů, jsou účinné při prevenci chorob. Několik typů β-glukanů se zdá být zejména slibných při stimulaci buněčné a humorální nespecifické imunitní odpovědi ryb.

Nespecifické obranné mechanismy, které zahrnují fagocytózu a produkci oxidačních radikálů, jsou rychle aktivovány imunostimulanty a jsou pohotově připraveny pro ochranu ryb proti patogenním mikroorganismům, jako jsou například viry, bakterie, mykoplasmata a houby a/nebo proti parazitům nebo jiným patogenním činidlům. Tyto mechanismy jsou tedy lepší než specifická imunitní odpověď, která vyžaduje dlouhé období vývoje a specificky přizpůsobenou imunitní odpověď, včetně nashromáždění protilátkek a specifické buněčné aktivace.

Tyto velice povzbuzující výsledky získané při prvních in vivo pokusech, které ukazují na možnost významného zlepšení imunologických obranných mechanismů odstartovaly rozsáhlý výzkumný program zaměřený na zjištění účinku lysozymového dimeru na specifické a nespecifické buněčné a humorální obranné mechanismy ryb, zejména pstruha a lososa, a medonosných včel.

Předmětem tohoto vynálezu jsou tedy také nové aplikace lysozymového dimeru zahrnující použití při výrobě farmaceutických prostředků určených ke stimulaci nespecifické buněčné a humorální imunitní odpovědi u ryb a medonosných včel. Dalším úkolem tohoto vynálezu je způsob použití farmaceutických prostředků obsahujících lysozymový dimer pro indukci nespecifické stimulace imunitního systému jediným nebo opakovaným podáním tohoto prostředku za účelem prevence a/nebo léčení chorob ryb a včel, které se vyskytují v přírodě.

Experimenty in vivo ukázaly, že v některých případech, například když byly ryby poškozeny určitými chemikáliemi nebo nežádoucími bioaktivními látkami, jako například vedlejšími produkty farmaceutických činidel, která jim byla podávána, může se dávat přednost léčení ryb vysoce purifikovaným lysozymovým dimerem popsaným v přihlášce WO 91/10731, který obsahuje asi 10 % hmotnostních nebo méně nežádoucích vedlejších produktů a který v podstatě neobsahuje monomerní podobu lysozymu. Pro snížení nákladů na chov ryb a/nebo včel by však bylo také přijatelné podávání pří• · · · • it · pravku na bázi lysozymového dimeru o nižší čistotě, pokud by se takový přípravek podával v dávce, jež nevyvolává nepříznivé účinky v důsledku přítomnosti toxických vedlejších produktů, zejména lysozymového monomeru.

Lysozymový dimer se může buď přímo podávat pacientům, kteří takové léčení potřebují, nebo se ho může používat pro výrobu farmaceutických prostředků, které jsou určeny pro aplikaci v podobě obvyklých galenických forem. Gely, masti nebo kapalné prostředky obsahují lysozymový dimer přednostně v koncentraci od asi 0,01 do asi 10 mg/ml a často v koncentraci od asi 0,1 do 1,0 mg/ml. Obvykle se připravují v podobě sterilních a apyrogenních směsí a popřípadě dále obsahují alespoň jedno fyziologicky vhodné rozpouštědlo a/nebo nosič a/nebo alespoň jednu vhodnou konzervační látku.

Farmaceutické prostředky obsahující lysozymový dimer jsou vhodné především pro topickou a/nebo parenterální aplikaci zahrnující lokální injekce, například do blízkosti tuhého nádoru nebo externí aplikace na povrchu těla, včetně subkutánních injekcí. Topickou aplikaci je možno v průběhu léčení nahradit nebo doplnit podáváním ve formě intravenosních injekcí. Jako účinné se však také projevilo podávání prostředků obsahujících lysozymový dimer na mukosální membrány, přednostně inhalací (v případě sliznice nosu, úst a hrtanu). Kapalné prostředky je možno topicky aplikovat například na vaginální nebo cervikální sliznici za použití tamponů napuštěných lysozymovým dimerem.

V některých případech se dává přednost orální aplikaci lysozymového dimeru, přednostně v podobě obvyklých galenických forem, jako například tablet, kapslí nebo dražé nebo ve formě pelet, granulí nebo prášků. Takové pevné prostředky často obsahují účinné léčivo v množství od asi

- 10 0,01 do 10 mg, přednostně od asi 0,01 do 1,0 mg, vztaženo na 1 g celkového prostředku. Prostředky tohoto typu přednostně dále obsahují také alespoň jeden vhodný nosič a/nebo konzervační činidlo a/nebo jinou obvyklou přísadu, jako je například příchuů nebo barvicí činidlo. V případě léčení ryb se mohou pevné prostředky přidávat ke krmivům. Alternativně nebo přídavně se může lysozymový dimer rozpustit ve vodě v chovném rybníce, poněvadž se předpokládá, že účinné léčivo může být také resorbováno žábrami ryb. V případě chovu medonosných včel se mohou přípravky obsahující lysozymový dimer aplikovat tak, že se pevné prostředky rozpustí v pitné vodě, čaji, cukerném roztoku nebo jiných obvylých kapalinách připravovaných pro včely, například jako náhradní potrava. Také je však možno je připravovat jako vodné (přednostně koncentrované) roztoky, které se mísí s medem, aby se zajistilo přijímání léčiva včelami.

Prostředek pro orální použití může být však také podobu osmotického systému. V některých případech, jako například v případě prevence a/nebo léčení rakoviny urogenitálního traktu, může být užitečná a prospěšná místní aplikace antiseptických vložek nebo tamponů napuštěných účinnou dávkou vysoce purifikovaného lysozymového dimeru.

Různé typy výše uvedených prostředků obsahujících dimerní lysozym se přednostně podávají ve formě jediné nebo opakované dávky 0,005 až 0,5 mg/kg tělesné hmotnosti, zejména dávky v rozmezí od 0,01 do 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti. Není zapotřebí uvádět, že požadovaná koncentrace účinného lysozymového dimeru ve výsledném farmaceutickém prostředku závisí především na velikosti lidského nebo zvířecího pacienta a na druhu léčení nebo profylaktického ošetření, které je pro pacienta navrhováno. Ve většině případů jsou však výše uvedená koncentrační rozmezí postačující pro zajištění vhodné léčby. Nicméně může být nutné, zejména ve veterinárním lékařství zvýšit skutečné koncentrace lysozymového dimeru v prostředcích na hodnoty vyšší než 10 mg/ml, až do hranice rozpustnosti dimerního produktu ve zvoleném rozpouštědle, tj. do asi 20 mg/ml kapaliny nebo masti. V posledně uvedeném případě je možno objem podávaného prostředku udržet na rozumné minimální úrovni, což usnadňuje manipulaci.

Je-li to možné, dává se přednost kombinovanému protokolu podávání výše uvedených prostředků před jednoduchou terapií spočívající v orální, parenterální nebo topické aplikaci.

S ohledem na v podstatě netoxickou povahu vysoce purifikovaného lysozymového dimeru se mohou prostředky, které tento dimer obsahují, podávat dlouhodobě, t j . po dobu více měsíců nebo dokonce let, aniž by to vyvolávalo škodlivé vedlejší účinky. Intervaly profylaktického nebo terapeutického podávání tohoto léčiva mohou typicky ležet v rozmezí od 1 nebo několika podávání za den až do aplikace jednou týdně nebo měsíčně. Intervaly mohou být i delší v závislosti na konkrétním pacientovi a naléhavosti léčení, jakož i na účinnosti imunostimulace lysozymovým dimerem.

Jak již bylo uvedeno výše, vynález byl přinejmenším zčásti umožněn dostupností lysozymového dimeru ve vysoké čistotě. Překvapující rozdíl v kvalitě produktu a zejména v nežádoucím podílu lysozymového monomeru, je znázorněn na obr. 1:

Dráha 1 představuje předem obarvené proteinové standardy o nízké molekulové hmotnosti: fosforylasu B, 142 000 Da; BSA, 97 000 Da; vaječný albumin, 50 000 Da; karbonovou anhydrasu (carbonic anhydrase), 35 100 Da;

• · · *

inhibitor sojového trypsinu, 29 700; lysozym, 21 900 Da (BioRad, USA);

dráhy 2 a 3 obsahují purifikovaný lysozymový dimer LYDIUM KLp(^R)602 (KLP-602), várka 5060449, laboratorní kontrola v nanesením množství 6,6 gg (dráha 2) a 19,8 gg (dráha 3);

dráhy 4 a 5 ukazují jinou dávku KLP-602, nanesenou v množství 6,6 gg (dráha 4) a 19,8 gg (dráha 5);

dráhy 6 a 7 ukazují lysozymový dimerní přípravek (KIW-607), výrobený způsobem popsaným v publikaci Sorrentino et al., Eur. J. Bioch. 124, 183 až 189 (1982), přičemž na dráhu 6 bylo naneseno 6,6 gg této látky a na dráhu 7 19,8 gg této látky.

Přípravek KLP-602 na bázi purifikovaného lysozymového dimeru obsahuje čtyřnásobné množství dimeru než srovnávací produkt KIW-607. Naproti tomu srovnávací produkt KIW-607 obsahuje šestinásobné množství monomeru ve srovnání s produktem KLP-602.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Lysozymový dimer (KLP-602) při léčbě lymfatické leukémie u myší AKR

Materiály a metody

Pro studii se použije sedmiměsíčních samců a samic myši leukemického kmene AKR inokulovaných Graffiho virem, které pocházejí z Centra inbredních zvířat Ústavu imunologie a experimentální medicíny Polské akademie věd ve Wroclavi. U myší AKR nastane časná aktivace endogenního leukemického viru, což ve věku 7 až 9 měsíců vede ke klinické manifestaci lymfatické leukémie. Myši se rozdělí do tří skupin po 30 zvířatech:

Skupina I (experimentální)

- zvířatům se subkutánně v jedné dávce podá 20 M-g/kg KLP-602 v 0,3 cm³ PBS;

Skupina II (experimentální)

- zvířatům se podá dvakrát KLP-602 ve stejné dávce jako u skupiny I;

Skupina III (kontrolní)

- zvířatům se podá dvakrát 0,3 cm³ PBS.

Deset myší z každé skupiny se 3 až 6 týdnů po poslední injekci KLP-602 usmrtí vykrvácením. Deset myší z každé skupiny se nechá naživu.

Provedou se následující zkoušky:

1. Stanoví se celková tělesná hmotnost a hmotnost vnitřních orgánů, jako jater, sleziny, brzlíku a vnějších krčních lymfatických uzlin a vypočte se poměr hmotnosti orgánů k celkové tělesné hmotnosti. Poměr terapeutické účinnosti v procentech se vypočte podle vzorce L/K x 100, kde L představuje střední dobu přežití myší ošetřených

KLP-602 a K představuje střední dobu přežití kontrolních myší.

2. Provedou se histopatologické zkoušky pomocí biopsie jater, sleziny a lymfatických uzlin. Řezy se barví H+E za použití Gomoriho metody pro retikulární vlákna.

3. Hladina volných radikálů v séru se stanoví pomocí chemiluminiscence (Chl), která umožňuje detekci i při velmi slabé fotoluminiscenci séra.

4. Fagocytická polymorfonukleární aktivita (PMN) se stanoví za použití zkoušek NBT a chemiluminiscence (Chl).

Výsledky:

Jedno subkutánní podání látky KLP-602 (skupina I) a dvě taková podání (skupina II) v dávce 20 ůg/kg myším vysoce leukemického kmene AKR vyvolá po třech týdnech studie statisticky nevýznamné zvýšení tělesné hmotnosti a snížení hmotnosti vnitřních orgánů, jako sleziny, brzlíku, lymfatických uzlin a jater (posledně uvedené snížení je statisticky nevýznamné), na rozdíl od kontrolních zvířat (skupina III) (viz tabulka 1).

Po šesti týdnech studie dojce ke zvýšení tělesné hmotnosti u obou léčených skupin, poklesu hmotnosti sleziny, brzlíku a lymfatických uzlin ve skupině I a ke zvýšení hmotnosti jater a brzlíku ve skupině II ve srovnání s kontrolní skupinou (skupinou III) (viz tabulka 1).

V tabulce 2 je uveden poměr hmotnosti vnitřních orgánů k celkové tělesné hmotnosti. Po třech týdnech bylo u skupiny III (kontrolní) pozorováno zvýšení hmotnosti brzlíku, ve srovnání s oběma experimentálními skupinami • · · * » « · « (I a II). Po šesti týdnech dojde ke zvýšení hmotnosti sleziny, brzlíku a lymfatických uzlin ve skupinách II a III, ve srovnání se skupinou I.

Histopatologickými zkouškami prováděnými po třech až šesti týdnech se zjistí mírná (u experimentálních skupin) a nadměrná (u kontrolní skupiny) kolonizace krčních lymfatických uzlin, brzlíku a sleziny lymfoidními buňkami. Leukemické infiltráty v játrech se však zjistí pouze u kontrolní skupiny. Lymfoidní buňky mají oválné nebo cirkulární hyperchromatické jádro s četnými jadérky a atypickými mitotickými čísly. Tyto buňky jsou doprovázeny malým počtem málo diferencovaných centroblastických buněk, retikulárních buněk a ostrůvky proliferujících megakaryocytů ve slezině. Stroma lymfatických orgánů, jako sleziny, lymfatických uzlin a brzlíku, obsahuje malý počet tenkých vláken retikula.

Chemiluminiscenční stanovení

Po třech týdnech studie činí aktivita volných radikálů v séru kontrolních myší K = 18 x 10^-3. Ve skupině II je aktivita volných radikálů nižší (K = 10 x 10^-3). Po šesti týdnech činí hladina volných radikálů u kontrolních zvířat K = 10 x 10³, u skupiny II je nižší (K = 16 x 10”³) a u skupiny I je o trochu vyšší (K = 1,5 x 10~³). U obou experimentálních skupin bylo zaznamenáno po třech týdnech výrazné zvýšení fatocytické aktivity PMN ve srovnání s kontrolní skupinou: 4 688 Chl (skupina I), 3 485 Chl (skupina II) a pouze 2 052 Chl (kontrolní skupina). Po šesti týdnech byla fagocytická aktivita ve skupině II stejně vysoká (3 264 Chl) a ve skupině I byla nižší (2 477 Chl). Při měření zkouškou NBT bylo po třech týdnech u obou léčených skupin zjištěno pozoruhodné zvýšení fagocytické aktivity, a to 0,27 (skupina I) a 0,26 (skupina II). Po • · · r » * ·· ··· ·· · šesti týdnech bylo zvýšení fagocytické aktivity nižší a bylo zaznamenáno jen u skupiny II. Fagocytická aktivita u kontrolní skupiny byla 0,22.

Index terapeutické účinnosti látky KLP-602 je u skupiny I 128 % a u skupiny II 150 %, což je v obou případech vyšší než minimální hodnota 125 %. To ukazuje, že látka KLP-602 vykazuje významné imunostimulační vlastnosti a kvalifikuje ji to pro další studie.

U obou experimenálních skupin jsou ve srovnání s kontrolní skupinou pozorovány podstatně menší leukemické infiltráty a u některých myší z experimentálních skupin tyto infiltráty vůbec chybějí. Leukemické infiltráty jsou přítomny v brzlíku, slezině a lymfatických uzlinách. Kromě toho byly také zjištěny v játrech kontrolních zvířat. Výsledky této studie ukazují, že látka KLP-602 může zčásti inhibovat nebo pozdržet postup leukémie u myší AKR. Naopak, u zvířat léčených placebem došlo k rychlému zvětšení lymfatických orgánů a k morfologickým změnám, které jsou typické pro dobře diferencovanou lymfoidní leukémii.

Látka KLP-602 kromě toho inhibuje zvýšení hladiny volných radikálů v myším séru. Tato látka inhibuje volně radikálové procesy podobně jako to činí antioxidanty, jako je vitamin E, vitamin C nebo selen. Je možné, že inhibice proliferace leukemických buněk u myší AKR léčených KLP-602 závisí na inhibici procesů indukovaných volnými radikály. U kontrolních myší (kterým nebyla podávána látka KLP-602) je hladina volných radikálů vyšší a koreluje s intenzitou této choroby.

KLP-602 také stimuluje fagocytickou aktivitu mononukleárního fagocytického systému (MPS) měřenou dvěma nezávislými metodami (NBT a Chl) a tím stimuluje imunitu zpro- 17 středkovanou buňkami. Tato látka také může modulovat syntézu TNF. Kromě toho, mohou být T-buňkami kooperujícími s MPS rozpoznány antigeny odmítajícími nádor (tumor rejection antigens), které jsou přítomny na povrchu leukemických buněk. Mezi těmito T-buňkami jsou nádorové anti-infiltrující lymfocyty (TIL), jejichž účinnost je o 50 až 100 % vyšší než účinnost lymfokinem aktivovaných zabíječů (LAK). Tyto buňky mohou mít fenotyp CD₄ nebo CDg nebo mohou mít směsný fenotyp a exprimují na svém povrchu receptor 11-2. Dosud není známo, proč jsou tyto buňky paralyzovány neoplastickými buňkami.

Retikulo-endotheliální systém se stimulací buněk MPS představuje hlavní imunologický a protivirový mechanismus. Stimulace těchto buněk má za následek produkci interferonu a nepřímou aktivaci specifických a nespecifických imunologických procesů závislých na B-buňkách, T-buňkách nebo buňkách NK.

Buňky MPS se podílejí na imunologických procesech prostřednictvím svých receptorů, jako jsou receptory Fc, receptory C₃ nebo receptory HLA z třídy II a také receptory lektinu, transferinu, urokinasy, inzulínu, jakož i padesáti jiných, méně známých receptorů. Jakákoliv změna jejich exprese a afinity ukazuje na aktivaci těchto buněk. Buňky MPS mohou fagocytizovat NO-sensitivní buňky, poněvadž mohou syntetizovat tuto látku. Tyto aktivované fagocyty jsou také označovány názvy rozzlobené makrofágy (angry macrophages) nebo krvežíznivé buňky (blood thirsty cells). Buňky MPS mohou ničit viry prostřednictvím svých cytotoxických a cytolytických vlastností, produkce defektních virionů a syntézy interferonu.

Slibné výsledky předběžné studie na myších AKR ukazují, že se muže látky KLP-602 úspěšně používat při léčení leukémie u myší AKR.

Tabulka 1

Celková tělesná hmotnost (g) a hmotnost vnitřních orgánů (mg) u kontrolních a experimentálních myší (x ± S; vyšší hodnoty odpovídají S, nižší hodnoty odpovídají x)

	3 týdny	6	týdnů
skupina	I	II	III	I		II	III
celková	25,27	26,20	23.96	26,	77	27,30	25,57
tělesná , hmotnost	2,22	1,67	1 ,23	1,	10	2,34	1 ,68
slezina	0,07 0,00	0,08 0,02	0,09 0,01	0,07 0,00		0,23 0,01	0,22 0,00
brzlík	0,06 0,01	0,07 0,02	0,08 0,02	0,08 0,01		0,21 0,03	0,15 0,07
lymfatické	0,04	0,04	0,05	0,04		0,07	0,08
uzliny	0,00	0,00	0,01	0,00		0,04	0,04
játra	1 ,38 0,15	1 ,36 0,38	1 ,43 0,05	1 ,61 0,18		1 ,89 0,42	1 ,67 0,15

Tabulka 2

Poměr hmotnosti vnitřních orgánů k celkové tělesné hmotnosti u kontrolních a experimentálních myší (%)

	3 týdny	6 týdnů
skupina	I	II	III	I	II	III
slezina	0,30	0,31	0,37	0,29	0,84	0,87
brzlík	0,23	0,26	0,33	0,33	1 ,06	0,61
lymfat. uzliny	0,18	0,18	0,21	0,T5	0,26	0,26
játra	5,49	5,25	5,81	6,02	6,35	6,40

Příklad 2

Účinek vysoce purifikovaného lysozymového dimeru (přípravku KLP-602) na růst vlasů při alopecia areata

Tato studie byla provedena za účelem zjištění, zda balzám obsahující KLP-602 působí na růst vlasů při alopecia areata. Kromě toho byla při této studii sledována tolerovatelnost tohoto balsámu při aplikaci na kůži.

Materiály a metody

Studie byla provedena jako srovnávací klinická studie s kontrolním pokusem. Studii se podrobilo dvanáct pacientů (2 muži a 10 žen) postižených alopecií ve stadiu telogenu s dobrým celkovým zdravotním stavem. Věk pacientů byl v rozmezí od 19 do 50 let. Kontrolní skupinu tvořilo 12 pacientů (3 muži a 9 žen) postižených alopecia areata, kteří byly léčeni Minoxidilem^^R^. Věk těchto pacientů byl v rozmezí od 19 do 49 let. Rozdělení pacientů podle pohlaví a věku v obou skupinách podrobených léčení bylo stejné.

Kritéria uplatněná při výběru pacientů:

Inkluzivní kritéria:

1. alopecia areata ve stádiu telogenu;

2. věk 18 až 50 let

Exkluzivní kritéria:

1. alopecia areata ve stádiu dystrofie;

2. jiný typ alopecie;

3. jakákoliv jiná kožní choroba « · · ·

Souběžná léčba:

Souběžná léčba nebyla povolena, pokud jí nebylo zapotřebí s ohledem na celkový zdravotní stav.

Přidělení čísel léčení:

Během studie byly osoby, které splňovaly kritéria výběru očíslovány ve zkoušených skupinách. Výzkumný pracovník zapsal odpovídající číslo na příslušné místo každého formuláře vztahujícího se k jednotlivému případu (Čase Reported Form - CRF).

Pokusné léčení:

Bylo použito následujícího protokolu: Vlasový balzám vyrobený firmou Nika o původním složení se umístí do lOOml stejných lahviček z plastu s kalibrovaným kapátkem s kapilárním hrotem. Na skalp se třikrát denně podle instrukcí ošetřujícího dermatologa nanese 0,05% KLP-602. Léčení se zahájí ihned poté, co dermatolog rozpozná alopecia areata.

2% roztok Minoxidilu(^R) se aplikuje 2 x denně na postiženou oblast kůže.

Léčení trvá 16 týdnů. Po léčení jsou pacienti ještě 2 měsíce pozorováni.

Vyhodnocení bezpečnosti:

U pacientů v obou zkoušených skupinách se před zahájením studie zaznamená celková anamnéza a provede se vstupní lékařské vyšetření. Lékařské vyšetření se opakuje na konci studie. Před a po léčení se odeberou vzorky krve a moči pro rutinní laboratorní testy. Laboratorní studie zahrnují následující testy:

Hematologie:

Hemoglobin, hematokrit, celkový a diferenciální počet bílých krvinek

Biochemie séra:

ALT (GPT), AST (GOT), alkalická fosfatasa, bilirubin

Moč:

Analýza moči na protein, krev a glukosu za použití máčecích zkušebních systémů.

Pacienti se sledují jednou měsíčně po dobu 4 měsíců léčení a následně ještě 2 měsíce. Při každé návštěvě jsou pacienti dotazováni na výskyt všeobecných nebo místních nepříznivých jevů, jako je podráždění, pálení a svrbění; léčené oblasti se vyšetřují na erythém a jiné lokální vědlejší účinky.

Vyhodnocení účinnosti:

Parametry účinnosti:

1. hlavním parametrem účinnosti je růst vlasů

2. vedlejším parametrem účinnosti je doba hojení pozměněného skalpu

3. fotografická dokumentace se pořizuje v následujících dobách během studie:

- 22 před aplikací vlasového balzámu s KLP-602 v době růstu vlasů na konci aplikace vlasového balzámu s KLP-602

Provede se mikroskopické vyhodnocení (trichogram). Standardizované trichogramy vlasů měřené na okrajových částech lézí alopecia areata poskytují velmi užitečné informace o průběhu a prudkosti choroby a také účinnosti terapeutických opatření.

Při každé vizitě se skalp hodnotí, pokud se týče růstu vlasů, který se klasifikuje takto:

- žádný

- malý - viditelný nový růst (vellus nebo několik rozptýlených jednotlivých terminálních vlasů)

- střední - neúplný (částečný)

- úplný

Kosmeticky přijatelný růst vlasů je definován jako dostatečný růst pro zakrytí skalpu a skrytí reziduálních oblastí, kde vlasy nejsou.

Výsledky:

Všichni pacienti, kteří se zúčastnili této studie (12 pacientů léčených 0,05% KLP-602 a 12 pacientů z kontrolní skupiny léčených 2% roztokem Minoxidilu^^R^ dokončilo studii zahrnující čtyřměsíční léčení a dvouměsíční následné sledování .

Účinnost

Nejužitečnějším měřítkem účinnosti bylo zhodnocení, které provedl výzkumný pracovník na konci této studie. Celkem 8 z • · ·

pacientů (66 %) ve skupině léčené KLP-602 a 6 z 12 pacientů ve skupině léčené Minoxidilem^^R^ vykázalo zvýšený růst vlasů během této studie. Z těchto pacientů 4 pacienti (33 %) ve skupině léčení KLP-602 a 3 pacienti (25 %) ve skupině léčené Minoxidilem byli hodnoceni tak, že růst jejich vlasů je úplný a kosmeticky přijatelný. Částečný růst vlasů byl pozorován u tří z 12 pacientů ve skupině léčené KLP-602 (25 %) a u tří pacientů ve skupině léčené Minoxidilem (25 %). U jednoho pacienta ve skupině léčení KLP-602 (9 %) byl pozorován minimální růst vlasů. Žádný růst vlasů nebyl pozorován u čtyř pacientů ze skupiny léčené KLP-602 (33 %) a u 6 pacientů ze skupiny léčené Minoxidilem (50 %).

Ve skupině léčené KLP-602 byl v případě, že alopecia postihla méně než 25 % skalpu, růst vlasů pozorován u 8 z 8 pacientů, zatímco ve skupině léčené Minoxidilem byl za srovnatelných podmínek růst pozorován u 6 z ze 7 pacientů. Žádný obnovený růst nebyl pozorován u pacientů s alopecií zasahující více než 25 % skalpu u obou léčených skupin.

Střední doba odpovědi spočívající v růstu vlasů v korelaci s dobou léčení ležela v rozmezí od 1 do 3 měsíců u obou skupin. Tři pacienti ve skupině léčení KLP-602 respondovali po 1 měsíci léčení. U jedné ženy došlo po 1 měsíci k růstu terminálních vlasů o délce asi 5 mm a oblasti holého skalpu byly pokryty hustým vlasovým nárůstem.

Při kontrolní vizitě po druhém měsíci byla u této ženy zjištěna alopecia totalis (v důsledku emocionálního stresu vlivem rozvodu) a tato žena dále nerespondovala na další léčení, takže konečný výsledek studie byl u ní negativní. U jednoho pacienta ze skupiny léčené Minoxidilem byl obnovený růst vlasů pozorován po 1 měsíci léčení. U čtyř pacientů ze skupiny léčené KLP-602 byl obnovený růst vlasů « ·

pozorován po 2 měsících léčení. Po 3 měsících studie byl obnovený růst vlasů pozorován u dvou pacientů ze skupiny léčené KLP-602 a u tří pacientů ze skupiny léčené Minoxidilem.

Bezpečnost

Žádné obecné vedlejší účinky nebyly pozorovány během léčení a během období dodatečného sledování. U obou léčených skupin nebyly zjištěny žádné abnormality při laboratorním vyšetření krve a moči a naměřené hodnoty byly jak při úvodním, tak při závěrečném měření v normě.

Lokální nepříznivé účinky pozorované během studie:

Jedna žena ze skupiny léčené KLP-602 si stěžovala na pálení a svrbění skalpu během druhého měsíce léčení. Tyto symptomy spojovala s nošením nové paruky. Tyto pocity zmizely během dvou týdnů bez jakéhokoliv přídavného léčení. Pacientka nepřerušila léčbu a dokončila ji s dobrým výsledkem. Jeden pacient ve skupině léčené 2% roztokem Minoxidilu si stěžoval na maštění vlasů, při prohlídce skalpu však nebyly zjištěny žádné významné klinické známky. Pacient uváděl svůj stav do souvislosti se zkouškou, ale byl ochoten v léčení pokračovat.

Nebyla zjištěna žádná signifikantní korelace obnoveného růstu vlasů s věkem pacientů, umístěním lysých oblastí a dobou trvání probíhající epizody, která byla krátká a podobná u obou skupin a trvala od 1 týdne do 1 roku. Všichni nerespondující pacienti v obou léčených skupinách byli postiženi alopecia areata přinejmenším 5 let (5 až 15 let).

Diskuse

Účelem této studie bylo vyhodnotit bezpečnost a účinnost topicky aplikovaného 0,05% lotionu KLP-602, růst vlasů u pacientů s alopecia areata léčených tímto lotionem a porovnat jeho účinnost s účinností 2% roztoku Minoxidilu během čtyřměsíčního léčení.

Vlasový balzám obsahující KLP-602 byl dobře tolerován pacienty. 66 % pacientů léčených 0,05% lotionem KLP-602 vykázala zvýšený růst vlasů během studie, zatímco ve skupině léčené Minoxidilem činil tento podíl jen 50 %.

Kosmeticky přijatelný růst vlasů byl pozorován u 33 % pacientů ve skupině léčené KLP-602 a u 25 % pacientů ve skupině léčené Minoxidilem. Lepší výsledky léčení byly pozorovány u pacientů s rozsahem alopecie nižší než 25 % pozměněného skalpu. 0,05 % lotion KLP-602 bylo možno snadno topicky aplikovat a nevyvolával žádné lokální ani všeobecné nepříznivé účinky. S ohledem na krátkou dobu této studie (16 týdnů) jsou dosažené výsledky velmi povzbudivé.

Závěry:

1. Vlasový balzám obsahující KLP-602 je velmi dobře tolerován a nevyvolává žádné vedlejší účinky.

2. Topická aplikace 0,05% KLP-602 je snadná a bezpečná.

3. Během studie nebyly pozorovány žádné lokální ani všeobecné vedlejší účinky a žádné odchylky od laboratorních hodnot.

• · · ·

- 26 4. V důsledku krátké doby léčení (4 měsíce) a sledování (další 2 měsíce) není možno úplně zhodnotit výsledky a účinnost léčení, přestože byla tato doba dostatečně dlouhá na to, aby bylo možno zjistit, že výsledky léčení jsou povzbudivé.

5. Výsledky dosažené při zkoušení ukazují, že při léčení alopecia areata je 0,05% lotion KLP-602 srovnatelný s 2% roztokem Minoxidilu nebo ho dokonce předčí.

6. Předklinická vyšetření a výsledky dosažené při studii ukazují, že KLP-602 aplikovaný topicky indukuje vlasový růst u pacientů postižených alopecia areata.

Shrnutí:

Tato studie byla provedena za účelem zjištění účinnosti a tolerovatelnosti vlasového balzámu obsahujícího KLP-602 při indukci růstu vlasů u pacientů postižených alopecia areata. Aplikace 0,05% lotionu KLP-602 třikrát denně byla obecně dobře tolerována při čtyřměsíčním léčení. Nebyly pozorovány žádné lokální ani systemické vedlejší účinky. Pozorovaná odpověď spočívající v růstu vlasů byla lepší ve skupině léčené KLP-602 než ve skupině léčené Minoxidilem. Obnova růstu vlasů byla v případě aplikace 0,05% lotionu KLP-602 pozorována u 66 % pacientů.

Procentický podíl pacientů, kteří respondovali středním obnovením růstu nebo obnovením hustého vlasového porostu byl vyšší u pacientů, u nichž lysá oblast zahrnovala méně než 25 % skalpu. Zdá se, že 0,05% KLP-602 představuje pozoruhodné činidlo pro léčení alopecia areata.

• ·

Příklad 3

Profylaktická aplikace lysozymového dimeru za účelem nespecifické stimulace imunitního systému ryby

Uspořádání pokusu:

Na zkoušku se použije 300 zdravých pstruhů duhových (Oncorhynchus mykiss, čeleď lososovitých) o hmotnosti 90 až 100 g. Lysozymový dimer vyrobený způsobem popsaným v mezinárodní přihlášce W0 91/10731 (zde označovaný názvem KLP-602) obsahující přibližně 10 % hmotnostních nebo méně nežádoucích vedlejších produktů a v podstatě prostý monomerní formy lysozymu se rozpustí v PBS na injekční roztok. Tento roztok se intraperitoneální injekcí podává rybám v dávce 10 až 100 mg lysozymového dimeru na kg tělesné hmotnosti. Léčivo se podává jednou denně. Terapeutický protokol zahrnuje několik různých skupin ryb. V těchto skupinách se rybám léčivo podává buď pouze v den 1 nebo v den 1 a v den 3 nebo v den 1, 3 a 5. Rybám v kontrolní skupině se lysozymový dimer nepodává vůbec.

Po 1, 2, 3 a 4 týdnech od podání poslední injekce se náhodným způsobem vybere 10 ryb z každé skupiny, včetně kontrolní skupiny. Ryby se imobilizují a z kaudální vény se jim heparizinovanou vakuové injekční stříkačky (vacuette, Greiner). Stanoví se fagocytická schopnost buněk PMN a MN, účinnost na respirační rupturu a potenciální usmrcovací účinnost buněk PMN a MN, účinnost MPO ve fagocytech PMN a hladina lysozymu a gamma-globulinu v séru.

jedinců z každé skupiny se také podrobí provokaci chorobou, furunkulosou. Rybám se podá jedna intraperitoneální injekce bakteriální suspenze Aeromonas salmonicida nepěstované na živné půdě během 48 hodin. Stanovuje se mortalita zvířat a její vztah k indukované bakteriální infekci se potvrdí izolací patogenů z ledvin uhynulých zvířat.

Výsledky:

Všechny výše uvedené imunologické parametry jsou ve skupinách léčených KLP-602 významně lepší (P < 0,05) ve srovnání s odpovídajícími hodnotami kontrolní skupiny. Tento překvapující výsledek byl pozorován ve všech skupinách, tj. po jedné, dvou nebo třech aplikacích KLP-602 a trval po celou dobu sledování až do konce čtvrtého týdne po poslední injekci.

Také mortalita ryb byla ve skupinách léčených KLP-602 významně nižší než v kontrolní skupině. Stejně tak byla podstatně vyšší účinnost na respirační rupturu a také fagocytické indexy a hladina neutrofilové myeloperoxidasy (MPO) ve skupinách, v nichž byla látka KLP-602 aplikována dvakrát a třikrát byly silně zvýšené.

Susceptibilita pstruha duhového k virulentní bakteriální provokaci A. salmonicida je známa. Výsledky pozorované ve skupinách profylakticky ošetřených lysozymovým dimerem ukazují, že zkoušené léčivo je schopno indukovat krátkodobou ochranu proti takové mikrobiální napadení. Ochrana byla přitom vyšší ve skupinách, v nichž byly aplikovány dvě nebo tři dávky KLP-602, než ve skupinách, v nichž byla aplikována jen jedna dávka.

Závěry:

Aplikace vysoce purifikovaného lysozymového dimeru rybám zvyšuje jejich nespecifické obranné mechanismy a významně zlepšuje jejich ochranu proti mikrobiálnímu napadení, například A. salmonicida (což je patogen vyvolávající furunkulosu). Toto zjištění má velký význam pro profylaktické a terapeutické léčení ryb při chovu ryb za účelem minimalizace ztrát, k nimž dochází při často se opakujících rybích chorobách, zvláště v průběhu jarního období.

Příklad 4

Terapeutická aplikace lysozymového dimeru za účelem indukce nespecifické stimulace imunitního systému ryby

Uspořádání pokusu:

Na tuto komparativní studii nespecifických obranných mechanismů během přirozeně se vyskytnuvší infekce IPNV (infekční virus nekrosy slinivky břišní) se použije 200 pstruhů duhových, kterým se aplikuje prostředek obsahující dimerizovaný lysozym (KLP-602). Po rozpoznání infekce IPNV se část ryb léčí KLP-602, zatímco kontrolní skupina zůstává neléčena. Imunologickými a sérologickými metodami se analyzují hlavní parametry charakterizující nespecifické buněčné a humorální obranné mechanismy. Tyto metody zahrnují týdenní stanovení celkového leukocytového čísla, relativního počtu leukocytů, fagocytické schopnosti buněk PMN a MN, účinnosti na respirační rupturu a potenciální usmrcující účinnosti, účinnosti MPO v neutrofilech, účinnosti lysozymu a ceruloplasminu v plasmě a celkové hladiny proteinu a gamma-globulinu během pozorovacího období, které činí dva týdny.

Replikovaným skupinám pstruha duhového se podává strava obsahující nespecifický imunostimulátor KLP-602 v dávce 20 μg/kg tělesné hmotnosti. Lyofilizované vzorky KLP-602 se podávají spolu s živinami bud orálně v pevné formě (vločky, pelety) nebo ve formě roztoku ve vodě v • · · • · chovném rybníku po dobu 7 dnů. Předpokládá se, že se léčivo může také resorbovat prostřednictvím rybích žáber.

V týdeních intervalech se z každé skupiny odebírají vzorky ryb a stanovují se u nich změny nespecifických buněčných a humorálních obranných mechanismů. Pokaždé se také náhodným způsobem odebere 10 ryb pro imunologická stanovení a identifikaci IPNV. Kromě toho se všechny ryby každý den sledují, zda se u nich nevyskytne neobvyklé chování a zda u nich nedojde k morfologickým změnám. Rovněž se sleduje mortalita.

Výsledky:

U ryb přirozeně infikovaných IPNV je možno pozorovat imunosupresivní účinek. Během celé doby pozorování byly u ryb podstatně sníženy parametry reflektující nespecifické buněčné a humorální obranné mechanismy, přičemž jeden týden po podání potravy s lysozymovým dimerem došlo ke statisticky významnému zvýšení některých parametrů, například hladiny celuloplasminu, účinnosti na respirační rupturu, hladiny imunoglobulinu a účinnosti lysozymu (například k asi 31% zvýšení hladiny celuloplasminu, asi 40% zvýšení aktivity lysozymu a asi 33% zvýšení účinnosti na respirační rupturu) ve srovnání s kontrolní skupinou). Po aplikaci KLP-602 byly nepochybně identifikovány imunostimulační účinky a nespecifické obranné mechanismy. Také kumulativní mortalita byla ve skupinách, v nichž byly ryby krmeny potravou obsahující KLP-602, nejnižší.

Závěry:

Ryby léčené podáváním medikovaného krmivá obsahujícího lysozymový dimer (KLP-602) vykázaly výhodné změny nespecifických imunologických obranných mechanismů. Tyto změny • · · · · · korelovaly se sníženou mortalitou, což ukazuje, že došlo k ochraně proti přirozeně se vyskytující infekci IPNV. Toto zjištění představuje významný stimul pro další vývoj a optimalizaci strategie prevence a/nebo léčení rybích chorob podáváním lysozymového dimeru v souladu s poznatky uvedenými v tomto popisu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití lysozymového dimeru pro výrobu farmaceutického prostředku pro stimulaci nespecifických buněčných nebo humorálních obranných mechanismů imunitního systému člověka nebo zvířete, přičemž taková stimulace zahrnuje zvýšení fagocytické aktivity a zvýšení alespoň jednoho parametru zvoleného ze souboru zahrnujícího hladinu ceruloplasminu, aktivitu na respirační rupturu, hladinu imunoglobulinu a aktivitu lysozymu a/nebo zahrnuje regulaci hladiny volných kyslíkových radikálů v séru.
2. Použití podle nároku 1 pro prevenci nebo léčení choroby zvolené ze souboru zahrnujícího leukémii, poruchy růstu vlasů, choroby ryb a choroby včel.
3. Použití podle nároku 1 pro prevenci nebo léčení imunosupresivního účinku.
4. Použití podle nároku 1, kde lysozymový dimer obsahuje přibližně 10 % hmotnostních nebo méně nežádoucích vedlejších produktů a je v podstatě prostý monomerní formy lysozymu.
5. Použití podle nároku 2, kde chorobou je leukémie indukovaná účinkem virů.
6. Použití podle nároku 5, kde virem je retrovirus.
7. Použití podle nároku 2, kde poruchou růstu vlasů je alopecia areata.
8. Použití podle nároku 2, kde rybí choroba je zvolena ze souboru zahrnujícího furunkulosu a infekci IPNV.

• · · · • ·
9. Použití podle nároku 8, kde rybí choroba se vyskytuje u ryb z čeledi lososovitých.
10. Použití podle nároku 3, kde imunosupresivní účinek je vyvolán mikrobiální infekcí.
11. Použití podle nároku 1, pro výrobu farmaceutického prostředku pro podání jedné nebo opakované dávky asi 0,005 až 0,5 mg/kg tělesné hmotnosti člověku nebo zvířeti.
12. Použití podle nároku 11, kde dávka leží v rozmezí od asi 0,01 do 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti.
13. Použití podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku ve formě gelu, masti nebo kapalného prostředku pro topické, orální nebo parenterální podávání, přičemž takový prostředek obsahuje alespoň jednu přísadu zvolenou ze souboru zahrnujícího fyziologicky vhodné rozpouštědlo, nosič a vhodnou konzervační látku.
14. Použití podle nároku 13 pro výrobu farmaceutického prostředku, který obsahuje lysozymový dimer v množství od 0,01 do 10 mg/ml.
15. Použití podle nároku 13, kde farmaceutický prostředek obsahuje lysozymový dimer v množství od 0,01 do 1 mg/ml.
16. Použití podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku v pevné formě vhodného pro orální podávání, přičemž tento farmaceutický prostředek dále obsahuje alespoň jednu farmaceuticky vhodnou přísadu zvolenou ze souboru zahrnujícího nosič a konzervační činidlo.

* · · ·
17. Použití podle nároku 16, kde farmaceutický prostředek obsahuje lysozymový dimer v množství od 0,01 do 10 mg/g.
18. Použití podle nároku 10 pro podání alespoň jedné dávky tohoto prostředku jednotlivci před mikrobiální infekcí.
19. Použití podle nároku 10 pro podání alespoň jedné dávky tohoto prostředku jednotlivci po identifikaci mikrobiální infekce.
20. Použití podle nároku 10 pro podání alespoň tří dávek tohoto prostředku, v podstatě ve stejných intervalech, jednotlivci před mikrobiální infekcí.