KR20010042619A - 수정능력 개선 조성물과 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 손상된 동물 또는 사람 수정능력의 개선을 위한 이량체형 라이소자임의 용도에 관한다. 또한, 동물 또는 사람에서 생식질환의 예방 또는 치료 및 이런 용도에 적합한 제약학적 조성물의 제조를 위한 라이소자임 이량체에 관하고, 사람 또는 동물세포, 특히, 생식세포의 보존 및 진핵세포 생명연장을 위한 개선된 방법에 관한다.

Description

수정능력 개선 조성물과 이의 용도{FERTILITY IMPROVING COMPOSITION AND APPLICATION THEREOF}

공지된 단량체형의 긍정적인 성질을 보유하면서도, 치료분량으로 사용되는 경우 부정적인 부작용을 보이지 않는 이량체 형태의 분리된 효소가 발견된 80년대 이후, 라이소자임과 다른 치료요법적 활성효소의 실제적인 용도의 한계는 극복되었다. 라이소자임 이량체 또는 다른 이량체형 효소를 활성성분으로 하는 항바이러스성 조성물과 항박테리아성 조성물은 WO 89/11294에서 제시하였는데, 이의 내용은 여기에 참고문헌으로 한다.

이후, 라이소자임 이량체의 더욱 매력적인 성질이 발견되었고, 다른 치료약물, 특히, WO 94/01127에서 밝힌 박테리아와 바이러스 감염의 치료를 위한 약물이 개발되었다. 본 발명자는 in vivo와 in vitro 실험으로, 특히, 사이토킨 수준의 조절과 관련된 이량체형 라이소자임의 면역조절 효과를 발견하였다. 라이소자임 이량체는 무엇보다도, TNFα, IL-2, IL-6, INFα의 합성을 조절하고, 식세포작용과 이와 관련된 면역학적 기작을 활성화시킬 수 있다. 라이소자임 이량체는 과도한 수준의 TNFα와 관련된 질환의 치료와 예방에 특히, 유용하다.

라이소자임 이량체 조성물은 in vivo에서, 특히, 바이러스가 림프구성 백혈병을 야기한 경우에, 백혈병세포 증식의 저해 또는 완전한 예방에 상당한 능력을 보이는 것으로 밝혀졌다. 추가연구에서, 활성성분으로 라이소자임을 함유한 제약학적 조성물이 만들어졌는데, 상기 조성물은 머리카락 성장질환, 특히, 면역학적 기능부전 또는 기능장애에 따른 머리카락 성장질환 또는 억압된 면역계와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 라이소자임 이량체의 이런 주목할 만한 효과는 WO 96/21463에서 제시하고 있는데, 이의 전체 내용은 여기에 참고문헌으로 한다.

본 발명의 요약

추가조사에서, 라이소자임 이량체가 보존, 특히, 동물 정액의 동결-보존에 긍정적인 영향을 줄 수 있다는 놀라운 사실이 밝혀졌다. 또한, 상업적 이익측면에서, 정자(정액 세포)의 유동성과 수정능력을 유지하기 위하여 동물과 사람 정액 샘플을 적절히 보존하고, 형태변형된(즉, 병리학적으로 변형된) 정액 세포의 수를 가능한한 적게 하는 것은 상당히 중요하다.

다양한 첨가제와 어쥬번트를 정자와 혼합하여, 냉동-보존을 용이하게 하고, 해동동안 세포를 보호하는 것은 당분야에 잘 공지된 것이다. 가령, 러시아 특허 출원 SU-604556-A에서 가축의 정자를 희석하고, 동결하기 위한 합성 수용성 배지의 제조를 제시하고 있는데, 상기 배지는 아라비아고무, 글리세롤, 락토오스, 중량의 10 내지 20% 계란 노른자로 구성된다.

라이소자임 이량체의 어쥬번트 효과 및 다양한 온도-대부분의 경우 한번이상의 심한-냉동단계가 필요-에서 동물 또는 사람 세포(예, 조직세포, 혈액세포, 정액세포)의 보존 향상에 대한 이의 기여는 심하게 냉동된 샘플의 해동 후, 보존 저장된 생물학적 물질의 가장 유관한 생물학적 활성 또는 생존변수를 분석 평가하여 입증한다. 동물 또는 사람 정액세포의 경우, 정상적인 유동성, 정자 형태, 생화학적활성, 생물학적 활성을 보유한 정자의 퍼센트 향상은 해동후 측정한다.

저장 온도(예, 영하 또는 영상)에 상관없이, 저장이전 동물 또는 사람세포 현탁액을 라이소자임 이량체로 처리하고, 세포와 라이소자임 이량체를 동시 저장하는 것이 특히 바람직하다. 라이소자임의 이량체-매우 낮은 온도에서, 정자와 다른 진핵세포의 세포막에 고착되어 이들을 안정화된다-의 어쥬번트 효과이외에, 아마도 항생제 활성과 바이러스 침투의 저해 또한, 지질저장동안 전반적인 보존 향상 효능에 기여하는 것으로 보인다. 영하에서 저장하는 경우, 라이소자임 이량체는 냉동단계이전에 세포현탁액에 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명은 난모세포의 수정능력 개선, 특히, 난모세포의 성숙향상 및 수정된 난세포와 초기 배아 발달의 개선에 관한다. 소 생식세포에 대한 in vitro 실험에서, 수정이 일어나는 성숙배지에 라이소자임이 존재하면, 소 난모세포의 수정률 및 생성된 배아의 기질은 긍정적인 영향을 받았다. 또한, 라이소자임 이량체와 유사분열물질(예, LPS, PHA 또는 ConA)의 혼합물의 존재하에 배양한 다형핵세포(PMN)의 세포배양물의 상층액 일부를 난모세포의 성숙배지에 첨가하면, 수정률과 배아발달에 유사한 긍정적인 효과가 있었다.

본 발명의 다른 목적은 in vivo에서 동물 또는 사람 정자 기질을 개선하고, 임의의 공지된 수정 또는 생식질환, 특히, 면역, 호르몬 또는 대사기원의 남성 생식질환 병인을 예방 또는 치료하는 것이다. 가장 적절한 구체예에서, 본 발명은 이런 질환을 회피 또는 완화하기 위하여, 이런 생식질환에 걸릴 위험이 있는 사람 또는 동물개체에 라이소자임 이량체의 효과량을 투여하여, 동물 또는 사람의 희정액증(oligospermia)을 예방 또는 치료하는 것에 관한다.

희정액증은 정자 농도의 병리학적 감소와 비정상적으로 높은 퍼센트의 형태변화된 정자로 특징지어진다. 이것은 무엇보다도, 정자형성, 즉, 정자의 생산과 성숙에 영향을 주는 호르몬, 면역 또는 대사이상에 기인한다. 활성성분으로 라이소자임 이량체를 함유한 제야학적 조성물을 다양한 수컷 가축의 근육내에 주사한 후, 정액 기질이 상당히 향상되었는데, 이의 예로 정액세포 농도의 급격한 증가와 형태변형된 정자 양의 상당한 감소를 들 수 있지만, 이들에 한정하지 않는다. 라이소자임 이량체의 광범위한 면역조절작용은 관찰된 긍정적인 효과의 중요원인중의 하나인 것으로 여겨진다.

이 글에서, 동물 또는 사람 면역계에 대한 라이소자임 이량체의 작용 측면에서, "조절하는"과 "조절"은 이런 작용의 이중기능성 면역계균형 성질을 표현한 것이다. 면역성 질환, 화학요법, 스트레스, 오염원등에 의해 야기된 개체의 면역학적 억압상태의 경우, 라이소자임 이량체는 면역계를 강화시키고, 일반적으로 면역학적 방어능력의 생리학적 수준을 정상으로 복구하거나, 또는 특정 사이토킨(인터페론과 일부 인터루킨 포함)의 혈액 또는 혈청 수준 증폭 및/또는 면역계의 다양한 식세포(예, 단핵구, 다핵구(PMN), 대식세포)의 식작용활성의 강화를 통해 이런 복구에 기여하게 된다. 한편, 면역계가 독소 또는 다른 해로운 약물에 의해 위협을 받거나 또는 면역계 자체가 병리적으로 과장된 면역반응을 일으키는 경우, 라이소자임 이량체를 투여하면, 극히 높은 종양괴사인자(TNF)수준을 감소시키고, 고열을 정상적인 체온으로 감소시키고 및/또는 생물계에 생성되는 다양한 공지된 형태의 자유 산화 라디컬(예, 산소, 하이드록시, 질소산화 라디컬)의 혈액 또는 혈장수준을 감소시키는 작용을 통하여 지나친 면역반응을 진정시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 가령, 자궁 내막의 산후 염증에 의해 야기된 임신불량에 걸린 암컷 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 자궁내막염은 가축, 특히, 암소에서 빈번하게 나타난다. 라이소자임 이량체 조성물을 자궁내에 주사하면, 내인성 프로스타글란딘의 활성을 감소시킨다는 사실이 in vivo 연구에서 밝혀졌다. 또한, 처리하지 않은 기준그룹과 비교할 때, 난포의 조기성숙, 조기 황체화, 증가하는 에스트라디올 수준에서 P-4 프로게스테론 수준의 조기감소가 라이소자임 이량체 처리한 암소에서 관찰되었다. 프로스타글란딘 F₂생산의 급속한 붕괴와 함께, 이런 동태변화는 라이소자임 이량체 처리한 암소가 11 ±3일 일찍 발정주기를 재개할 수 있다는 사실에서 알 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 목적에 사용할 수 있는 제약학적 조성물의 제조에 사용되는 라이소자임 이량체에 관한다. 라이소자임 이량체는 0.005 내지 5 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 1 mg/체중 kg(각각, 사람 개체의 혈액 ㎖당 0.07 내지 70 또는 0.14 내지 14㎍ 라이소자임 이량체에 해당, 5ℓ혈액을 가진 70kg 남자에 기초하여 계산)의 단일 또는 반복 투여량으로, 사람 또는 동물에 투여하는 것이 바람직하다. 용이하게, 약물은 0.01 내지 10mg/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mg/㎖ 용액농도로 라이소자임 용액을 함유한 주사용액으로 투여한다.

가급적, 투여된 라이소자임 이량체는 라이소자임 단량체를 교차연결하는 단백질에 의해 수득된 이량체 산물인데, 이는 중량당 10%이하의 불필요한 부산물, 특히, 단량체와 저량체 라이소자임을 함유한다. 라이소자임 단량체는 가급적, 계란에서 유래하지만, 사람, 동물, 식물, 미생물과 같은 다른 자연자원에서 수득하거나, 또는 화학적 합성 또는 유전공학방법으로 제조할 수 있다.

이 글에서 사용되는 리디움-KLP는 액체 조성물, 바람직하게는 주사용액을 의미하는데, 이것은 적당한 용매, 적당한 보존제, 라이소자임 이량체(활성성분)로 구성되고, 상기 이량체는 0.01 내지 10mg/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 0.5mg/㎖ 용액농도로 난의 흰자 라이소자임을 화학적으로 교차결합시켜 수득한다.

본 발명은 동물 또는 사람 생식세포, 예를 들면, 난모세포와 정모세포의 수정능력 향상을 위한 이량체형 라이소자임의 용도에 관한다. 본 발명은 또한, 동물 또는 사람에서 수정 또는 생식 질환의 예방 또는 치료에 관한다. 본 발명은 또한, 이런 목적에 적합한 제약학적 조성물의 제조를 위한 라이소자임 이량체의 용도 및 사람 또는 동물 세포 보존 향상과 세포 생존기간 연장을 위한 방법에 관한다.

도1은 상이한 농도의 라이소자임 이량체(하기 실시예 6)의 존재하에서, 수정된 난모세포의 발달을 보여주는 그래프다.

여기에 제시한 발명을 좀더 완벽하게 이해하기 위하여, 다음의 실시예를 제시한다. 상기 실시예는 단지 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

실시예 1: 정액 보존에 대한 라이소자임 이량체 효과

저온에서 보관한 수퇘지 정액에 대한 라이소자임 이량체 효과를 조사하였다. 실험은 임상적 조건하에서, 다른 계통의 6마리 수퇘지: "듀록" 1마리, "햄프셔" 3마리, "피에트레인" 1마리, "WBP" 1마리에서 실시하였다. 일주일에 한번씩 동물에 정액을 인공적으로 주입하였다.

정액 1㎖당 1, 2, 4㎍ 분량으로 수거한 직후, 새로운 정액은 라이소자임 이량체로 처리하였다. 모든 실험 단계, 즉, 정액에 라이소자임 이량체 첨가 전후, 정액의 동결전, 해동후, 사정액(ejaculate)을 철저하게 검사하였다. 다음의 요소: 정자 농도, 정상적인 유동성을 보유한 정자의 퍼센트, 정자 형태(선단체 포함), 다양한 희석도와 온도에서 생존율을 분석하였다. 생화학적 분석: GOT(글라타메이트-옥살로아세티이트-트랜스아미나제), 아크로신, 히알루로니다제, 산 포스파타제, 알칼린 포스파타제가 포함되었다. 다음의 동결 보존방법: a) 구체(ball)법, b) 5㎖ 플라스틱 원형 튜브에서 동결하고, 7㎖ 편평 튜브에서 동결한다. 예비 결과는 표 1, 2, 3에 제시한다.

표1에서, 4㎍ 라이소자임 이량체를 1㎖ 신규한 정액에 첨가하는 경우, 기준그룹과는 달리, 정상적인 유동성을 보유한 정자의 퍼센트가 5℃에서 평형후, 평균 10% 상승하고, 정액의 해동후 평균 15% 상승한다는 것을 알 수 있다.

표 2는 보존과정동안 손상된 선단체를 갖는 정자의 퍼센트에 대한 라이소자임 이량체(1㎖ 정액당 4㎍)의 효과를 보여준다. 실험샘플에서, 정자의 손상된 선단체 퍼센트는 기준샘플(라이소자임 무첨가)보다 훨씬 낮다.

표3은 개별 실험단계에서 GOT 활성분석의 결과를 보여준다. 라이소자임 이량체는 해동후, 정자로부터 효소의 방출을 감소시키는데(평균 10⁹정자당 429 U), 이것은 정자 세포 손상의 빈도가 훨씬 감소한다는 것을 암시한다.

전술한 조사의 결과에서, 라이소자임 이량체가 동물 또는 사람 정자의 보존에 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 동물 정자의 보존에 대한 라이소자임 이량체 효과

상이한 수컷 가축(6마리 수퇘지, 5마리 수캐, 5마리 숫양, 4마리 수사슴)에서 조사를 실시하였다. 라이소자임 이량체 조제품은 수거직후와 보존직전, 다음의 분량: 정액㎖당 1, 2, 4, 5, 10, 15, 20 ㎍으로 신규한 정액에 첨가한다. 모든 실험단계(라이소자임 이량체의 정액첨가 전후, 정액의 동결직전, 정액의 해동후)에서, 정자농도, 적절히 유동하는 정자의 퍼센트, 정자의 형태(선단체 포함), 다양한 희석도와 온도에서 생존율의 결정을 비롯한 상세한 정액 검사를 실시하였다. 생화학조사에는 GOT, 히알루로니다제, 산과 알칼린 포스파타제의 활성결정이 포함된다. 정액 동결은 다양한 동해(凍害)보호법, 예를 들면, 펠렛, 지푸라기(0.25 ㎖), 5㎖ 원형 튜브, 1.7㎖ 편평 튜브에서 동결을 이용하여 실시하였다. 1㎖ 신규한 정액에 4-10㎍ 라이소자임 이량체를 첨가하면, 해동후 유동성이 향상되는 정자수의 실제적인 증가, 손상된 선단체 수의 감소, 모든 동물의 보존 정자로부터 GOT 방출감소가 이루어진다. 이런 결과에서, 라이소자임 이량체를 상이한 수컷 동물의 신규한 정액에 첨가하여 저온 보존할 정자의 세포막을 안정시킬 수 있다는 것을 알 수 있다. 실시예 3: 수퇘지의 희정액증 치료에서 라이소자임 이량체의 효능

희정액증 증상이 1.5개월동안 지속되고, 우측 고환의 기능퇴화에 의해 형태변형된 정자의 퍼센트가 높은 6년생 수퇘지에서 실험을 실시하였다. 수퇘지의 근육에, 활성성분으로 2㎎라이소자임 이량체를 함유한 10㎖ 리디움-KLP를 투여하였는데, 이것은 동물 체중 kg당 대략 0.020 mg 분량에 해당한다.

처리전, 사정액 단위부피당 정자 농도는 ㎣당 145,000에서 65,000으로 점진적으로 감소하였고, 정자의 형태변화는 25% 내지 50%(평균 40%)이었다. 리디움-KLP 주사 51일후, 정자농도는 ㎣당 100,000에서 150,000으로 증가하였고, 정자의 형태변화는 18 내지 21%(평균 19.5%)이었다. 이로부터, 리디움-KLP가 동물 또는 사람의 희정액증 치료에 효과적인 약물이라는 결론에 도달할 수 있다.

실시예 4: 정자 세포의 생존에 대한 라이소자임 이량체 효과

이 실시예는 수퇘지와 황소 정자의 생존과 생리학적 활성에 대한 라이소자임 이량체의 효과를 설명한다. 본 연구에서, 다음을 결정하였다.

- 지속적으로 보존되지 않는 경우, 수퇘지와 황소의 신규한 정액에 대한 라이소자임 이량체 첨가의 영향;

- 이들 수컷의 정액 동해보호과정에 대한 라이소자임 이량체의 영향;

- 정액 기질이 나쁜 황소와 수퇘지의 수정능력에 대한 제약학적 라이소자임 이량체 조성물(리디움-KLP) 투여의 영향.

이들 연구는 75마리 수퇘지, 65마리 황소, 이들의 사정액에서 실시하였다.

a) in vitro 연구

조사과정동안, 신규한 정액에 첨가된 라이소자임 이량체의 가장 효과적인 분량은 1㎖ 정액당 5㎍인 것으로 밝혀졌다. 이보다 적은 분량, 예를 들면, 정액 ㎖당 1과 3㎍은 생물학적 활성을 보유하지 않는다. 유사하게, 5㎍/㎖ 정액이상의 분량은 일관되고 반복적인 생리효과를 주지 못한다. 따라서, 본 연구에서는 정액 1㎖당 5㎍ 라이소자임 이량체를 첨가하였다.

라이소자임 이량체를 신규한 정액(연속 동결처리안됨)에 첨가하면, 기준그룹에 비하여 수퇘지 정자의 생존기간은 평균 6.8 ±1.5시간 연장되고, 황소의 생존기간은 평균 3 ±1.2시간 연장된다.

유사하게, 연속 동해보존하고, 액체 질소(-196℃)에 30일동안 저장하고, 이후, 해동한 정액에 5㎍ 라이소자임 이량체를 첨가하면, 정자 세포의 생존기간 연장에 긍정적인 영향이 이루어지는데, 이때, 실험한 사정액에서 정자세포의 생존기간은 비슷한 기준샘플과 비교해 볼 때, 6 내지 14시간으로 변동되었다.

또한, 라이소자임 이량체 처리한 사정액에서, 특히, 수퇘지의 정액에서, 정상 유동성을 보유한 정자의 퍼센트는 처리하지 않은 기준보다 10-15% 더 높은 것으로 관찰되었다. 게다가, 근본적인 결함을 보유한 정자의 수는 라이소자임 이량체가 첨가안된 유사체와 비교해 볼 때, 20-25% 더 낮았다.

또한, 라이소자임 이량체 처리된 그룹에서, 선단체가 손상된 정자의 낮은 농도는 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 밝혀졌다(P 〈 0.01). 이런 효과는 수퇘지의 정액에서 특히 두드려진다: 기준샘플에서, 선단체 손상된 정자의 퍼센트는 35 내지 60%인 반면, 실험샘플에서 퍼센트는 28%를 초과하지 않는다.

또한, 연속 동해보존하고, 해동한 정액에 라이소자임 이량체를 첨가하면, 정자 세포 파괴는 통계학적으로 유의성(P 〈 0.05)있는 수준으로 감소된다(이탈된 트랜스아미나제(AspAT)로 측정). 기준샘플과 비교할 때, 수퇘지 정액에서 65 ±8%정도의 손상된 세포의 감소 및 황소 정액에서 48 ±11% 정도의 손상된 세포의 감소가 관찰되었다.

b) in vivo 연구:

기질이 나쁜(사정액에서 정자의 낮은 농도, 근본적인 결합과 손상된 선단체를 갖는 정자의 높은 퍼센트, 정상적인 유동성을 보유한 정자의 낮은 퍼센트)정액을 보유하여, 생식능력이 현저하게 떨어진 20마리 수퇘지와 15마리 황소를 라이소자임 이량체 처리하였다:

제약학적 라이소자임 이량체 조성물(리디움-KLP)은 동물 근육내에, 체중 kg당 0.02mg 라이소자임 이량체 분량으로 투여하였다. 조제물은 10일 간격으로, 세 번 투여하였다. 사정액은 첫 투여부터 마지막투여후 95일까지 일주일에 한번 검사하였다. 수퇘지 정액의 현미경모습에서, 리디움-KLP 첫 투여후 평균적으로 40 ±5일후(수퇘지)와 50 ±4일후(황소 정액) 긍정적인 변화가 관찰되었고, 최대 48 ±6일(수퇘지)과 최대 65 ±7일간 지속되었다. 이런 변화는 0시에서 초기 농도와 비교할 때, 25-40%의 정자 농도 증가로 확연히 알 수 있다.

근본적인 결함을 갖는 정자의 수에서도, 분명한 변화가 관찰되었다. 실험그룹에서, 이들 수는 기준그룹과 비교할 때, 20 내지 30%정도 감소하였다.

c) 수정능력 검사:

실험기간동안, 라이소자임 이량체로 보호하거나 또는 리디움-KLP 처리한 수컷에서 수득한 수퇘지와 황소 정액의 생리평가는 국소적 실험형태로 이루어졌다. 80마리 암소와 100 암퇘지에서 조사를 실시하였다. 라이소자임 이량체를 첨가하여 보호한 정액을 주입한 암소에서, 비-반복 요소(NR)는 87.5 ±8%인 것으로 밝혀졌다. 기준 암소개체군에서 이 수치는 70 ±9%이었다. 라이소자임 이량체를 첨가하여 보호한 정액을 주입한 암퇘지에서 이 수치는 86 ±5%이었고, 기준 암퇘지 개체군에서 이 수치는 74 ±6%이었다.

특히, 전술한 바와 같이, 리디움-KLP 처리한 수퇘지의 정액을 암퇘지에 주입한 후, 긍정적인 생리효과를 얻었다. 이런 면역자극 이전에, 수퇘지 사정액의 암퇘지 주입효능은 결코, 35-40%를 초과하지 않았다; 전술한 라이소자이 이량체 요법에 의한 수퇘지의 면역자극후, 정액주입효능은 실험기간동안 78-85% 증가하였다.

실시예 5: 동물의 손상된 수정능력 치료에 사용되는 라이소자임 이량체

본 실시예는 암소에서 자궁내막에 대한 라이소자임 이량체의 활성 및 관련된 작용모드를 입증하고, 밝히기 위한 실험을 설명한다.

출산후 자궁내막염에 걸린 120마리의 암소에서 조사를 실시하였다. 실험그룹은 임의로 선택된 60마리의 암소로 구성되었다. 기준그룹은 동일수의 암소로 구성되었다. 실험그룹의 암소는 카테테르를 이용하여, 40-50㎖의 5% 글루코스 용액에 녹인 2㎎ 라이소자임 이량체를 자궁내로 흡수하였다. 기준그룹의 암소는 항생제(Amoksiklav) 혼합물을 섭취하였다. 산부인과 검사를 고려하였다: 자궁과 자궁 경부의 상태, 갱년기 과정, 폐경시점, 자궁 강의 충전물-양, 특성, 방출 냄새, 난소활동의 평가. 각 그룹(∑= 40마리 암컷)으로부터 20마리 암소에서 실험실 조사를 실시하였다: 세포 면역 요인의 결정(LF-7의 영향하에 블라스틱 전환 검사이용), Wright에 따른 식세포작용 검사, 니트로테트라졸리움 블루(NBT)의 감소, 에스테라제 블루, 체액 면역의 면역요인-전체 단백질과 이의 분취물의 결정, 백혈구 패턴, 난소주기의 호르몬-프로게스테론(P-4)과 에스트라디올 수준결정, PGF2 알파(PGFM) 대사물질의 활성. 부가된 치료과정의 효능은 조사된 면역학적 요인, PGF2 알파의 동적변화, 난소주기의 프로게스테론 수준, 그리고 출산에서 초열 기간의 길이, 정액주입 지수, 임신기간의 길이와 같은 계산된 수정능력 지수에 기초하여 평가하였다.

실험실 조사에서, 세포면역의 분석된 요소의 수치에 대한 정맥투여된 리디움-KLP의 긍정적인 면역조절효과가 밝혀졌다. 실험그룹의 암소에서, 리디움-KLP 주입후 3일째와 5일째사이에, 식세포작용 지수의 15 내지 21% 증가, 식세포활성과 전화능력의 평균 10 내지 18% 상승, 감마글로불린 단편의 확실한 증가가 관찰되었다.

항생제를 섭취한 기준 암소그룹에서 면역활성 변화가 감지되었는데, 조사한 요소의 수치는 다른 조사중인 암소에서도 관찰되는 출산후 면역 니치(niche)의 양상을 암시한다.

리디움-KLP를 자궁내에 주입하면, 내인성 프로스타글란딘의 활성이 감소하였다(PGFM으로 측정). 특히, 이 변수의 분명한 동태변화는 라이소자임 이량체 투여후 2시간 내지 5시간사이에 관찰되었다. 이의 활성은 리디움-KLP 주입전에 관찰된 수치와 비교할 때, 대략 70-85% 감소하였다.

정맥으로 리디움-KLP를 섭취한 암소에서, 난포의 조기성숙, 조기 황체화, 기준 암소그룹에서와 유사한 변화에 비해 더 빠른 P-4 수준 감소가 관찰되었다. P-4 수준 변화와 동시에, 혈액에서 에스트라디올의 동태변화가 관찰되었다. 이런 증가는 P-4의 소멸동태와 상관하였다. 실험 암소그룹에서 이들 변화와 이의 빠른 속도는 이 그룹의 암소가 기준그룹의 암소보다 11 ±3일 일찍 발정주기에 들어간다는 점에서 알 수 있다.

프로스타글란딘 F2 생산의 동태변화 및 특히 이의 급속한 분해는 암소 자궁내막 치료에서 리디움-KLP의 효과활성의 주요결과라고 할 수 있다. 혈액에서 프로게스테론과 에스트라디올 수준의 동태변화는 이런 주장을 뒷받침한다.

실시예 6: 소 난세포(난모세포)성숙과 in vitro 수정에 대한 라이소자임 이량체(KLP-602) 효과

다음의 실험을 실시한다:

A. 소 난세포(난모세포)의 성숙과 in vitro 수정에 대한 상이한 라이소자임 이량체 농도의 효과 측정.

B. 다핵세포(PMN)와 백혈구사이의 상관관계, 난모세포 성숙, 조기 배아발달에 대한 라이소자임 이량체의 영향평가.

C. 난모세포의 in vitro 수정동안 존재하는 상이한 농도의 라이소자임 이량체의 배아 부(剖)발달에 대한 효과 측정.

결과:

Ad A.: 실험결과에서, 세포 또는 조직배양현탁액 ㎖당 0.1 내지 100㎍ 농도의 라이소자임 이량체는 난구 확장(점액화)을 손상시키는 반면, 더 높은 농도에서는, 즉, ㎖당 10㎍ 라이소자임 이량체 농도에서는, 난모세포 성숙율의 감소만이 관찰된다는 것을 알 수 있었다. 최대 10㎍/㎖의 라이소자임 이량체 농도는 난구 점액화에 대한 손상효과에도 불구하고, 난모 성숙에 긍정적인 영향을 주었다. in vitro 수정과 상이한 라이소자임 이량체 농도하에 성숙된 난모세포 배아발달의 결과로, 수정율과 난모 세포수의 최대상승이 나타나는데, 10㎍/㎖농도의 라이소자임 이량체를 사용하는 경우, 상기 난모세포는 배양 36시간후 중기 II 단계에 도달하였다. 또한, 0.1 내지 10㎍ 라이소자임 이량체/㎖의 존재하에 수정이 발생하는 경우, 특히 상실배(morula)와 배포단계에 도달하는 수정난모세포의 퍼센트가 증가하였다(도1).

Ad. B.: PMN은 RPMI에서, 다시 말하면, LPS와 라이소자임 이량체 첨가된 또는 이들 물질이 첨가되지 않은 1640 배지에서 3시간동안 배양하였다. 배양후, 배양배지(상층액)는 수거하고, 사용할 때까지 -80℃로 동결하였다. 다른 실험에서, 림프구에 Con A, PHA, 라이소자임 이량체를 첨가하여, 24시간동안 배양하고, 이후, 배양배지는 수거하고, 전술한 바와 같이 저장하였다. 다양한 실험을 실시하여, 다음을 평가하였다:

B.I. 난모세포 성숙에 대한 PMN 배양물에서 얻은 상이한 농도의 상층액 효과. 결과에서, 라이소자임 이량체 존재하에 배양된 LPS-자극 PMN에서 얻은 상층액은 난모세포 성숙율을 상당히 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.

B.II. 라이소자임 이량체 존재하에 10⁵LPS-자극한 또는 자극하지 않은 PMN 공동배양물의 난모세포 성숙에 대한 영향. 실험결과에서, LPS 활성화된 PMN에 라이소자임 이량체를 첨가하면, 정해진 실험조건하에서 암소 난모세포의 in vitro 성숙은 부정적인 영향을 받게된다는 것을 알 수 있었다. 이런 효과는 난모세포 성숙에 영향을 주는 PMN 세포에 의한 일부 요소의 생산증가를 암시한다.

B.III. B.I에서 제시한 것과 유사한 PMN 배양물의 상청액의 난모세포 성숙, 수정, 이후 in vitro 배아 발달에 대한 영향. 라이소자임 이량체 존재하에 성장한 LPS-자극한 PMN 세포배양물의 상층액을 2.5% v/v 농도로 성숙배지에 첨가하면, 난모세포 수정과 배아발달은 긍정적인 영향을 받게 된다는 것이 밝혀졌다.

B.IV. Con A, PHA, 라이소자임 이량체 존재하에 성장한 림프구 배양물에서 유래된 상층액의 난모세포 성숙, 수정, 이후 배아 발달에 대한 효과. 결과에서, 성숙배지상의 10% v/v 농도의 상층액은 난모세포 수정과 이후 배아발달에 긍정적인 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 이런 효과는 라이소자임 이량체를 첨가한 Con A 또는 PHA로 자극한 림프구의 경우, 훨씬 낮았다.

Ad.C.: 난모세포 수정이 일어난 배지에서, 10㎍/㎖ 농도의 라이소자임 이량체는 in vitro에서 수득된 배아의 기질에 긍정적인 영향을 주었다. 이런 효과가 수정과정에 있는 난모세포 또는 정자에 대한 상기 물질의 영향에 기인한 것인지는 추가로 확인해야 한다.

일반적으로, 상이한 실험 프로토콜에 따라 저농도로 사용된 라이소자임 이량체는 in vitro 암소 난모세포 성숙, 이들의 수정, 이후 배아 발달에 긍정적인 영향을 주는 것으로 밝혀졌다.

실시예 7: 진핵 세포 생존에 대한 라이소자임 이량체(KLP-602) 효과

일차 암탉 배아 섬유아세포와 연속 세포계 CC81(이종성 고양이 세포계, TBTR(암소 기관세포), MDBK(암소 신장세포)에서 조사를 실시하였다. 이의 주목적은 라이소자임 이량체 첨가된 또는 첨가되지 않은 혈청-무 Parker 배지에서, 세포계의 생존시간을 비교하기 위한 것이다.

일차 암탉 배아 섬유아세포와 연속 세포계는 바이러스학에 일상적으로 사용되는 방법으로 증식시켰다. 간단히 말하면:

a) 일차 암탉 배아 섬유아세포: 9-10일된 배아는 작은 조각으로 자르고, pH 7.5의 식염수에 녹인 희석된 트립신(0.25%)으로 처리하여, 단일세포 현탁액으로 분리하였다. 이들의 첫 번째 추출물은 버리고, 다음 추출물은 수거하였다. 세포는 원심분리하여 제거하고, 세척하였다. 이후, 이들은 혈구계 체임버에서 계수하고, 성장배지(하기 참고)에서 2.5 ×10⁵세포/㎖ 농도로 희석하였다. 이후, 세포 현탁액은 적당한 배양용기(Roux 플라스크 및/또는 실험 튜브)로 분배하고, 37℃로 유지시켰다. 일반적으로 단층 배양물이 수득되는 24시간후, 성장배지는 버리고, 단일층에 디스템퍼 바이러스를 접종하고, 세척하고, 라이소자임 이량체를 함유한 유지배지(하기 조성물 참고)로 덮었다.

b) 연속 세포계: 병안에 있는 단일층 배양물은 트립신(트립신 Difco 0.5%, 베르센 나트륨 0.02%)처리하여 계대배양하고, 세포는 성장배지에서 현탁하였다. 단일층 배양물을 수득한 직후, 성장 배지는 유지배지로 대체하였다. 세포현탁액은 유리용기로 분배하기 이전에, 바이러스를 접종하였다.

성장 배지: 중탄산염(Sigma)없는 Hank 염과 L-글루타민; 4-8%wt.(사용한 세포배양물에 따라) 태아 소 혈청(Sigma; 30분동안 58℃로 불활화시킴); 항생제(100 단위/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 디하이드로스트렙토마이신 황산염, 2.5 ㎍/㎖ 암포테리신 B; 100x 티로신)로 보충한 이이글 최소 필수 배지.

유지배지: Parker 199 배지(Biofactory of Sera and Vaccines, Lubin, Poland); 항생제(성장 배지와 동일).

약물의 독성: 라이소자임 이량체(KLP 602)와 펜톡시필린의 독성은 박테리아 실험튜브(각 약물 용액당 6개 튜브)와 플라스틱 평판(각 용액당 8개 웰)상의 세포 배양물에서 평가하였다. 배양물 평판은 이산화탄소로 채운 습한 체임버에서 37℃로 보관하였다. 세포에 대한 상기 약물의 효과는 광 현미경하(단순 또는 역 현미경)에서 조사하였다.

세포 생존율의 평가: 융합된 단일층은 트립신처리하여 분리하고, 원심분리하고, 세포 현탁액은 중성 레드로 염색하였다. 세포 수는 Burker 체임버에서 계수하였다.

바이러스 1. 개 파르보바이러스의 약독화된 BMD 균주(Lublin, Poland)

2. 디스템프 바이러스의 BP1과 BP2 균주(Pulawy, Poland)

혈구응집반응은 Sorensen 버퍼에서 0.1% 소 알부민(pH 5.8)으로 현탁된 돼지 적혈구로 실시하였다. 이번 연구에서, 라이소자임 이량체는 1 내지 1000 ㎍/㎖(표4, 4a, 4b, 4c)범위의 다양한 농도로 투여하였다.

실험 결과에서, 세포 배양 현탁액 ㎖당 1 내지 25㎍ 농도로 사용된 라이소자임 이량체는 세포에 비-독성일 뿐만 아니라, 눈에 띄게 세포의 생존기간을 연장시키는 것으로 밝혀졌다: 세포는 처리하지 않은 기준물질보다 2 내지 8일 더 불변된 단일층을 유지하였다(표4). 더 높은 농도로 투여하는 경우, 라이소자임 이량체는 진핵세포에 약간의 독성을 나타내지만(죽은 세포수의 증가와 처리된 세포의 형태변화로 추정), 그럼에도 불구하고, 라이소자임 이량체의 전체 실험 농도(즉, 세포배양 현탁액 ㎖당 1 내지 1000㎍)에서 세포-생명 연장 활성을 계속 지속하였다(표 4a, 표 4b).

진핵세포 생명연장 효과는 또한, 고정된 농도의 펜톡시필린과 다양한 농도의 라이소자임 이량체의 혼합물에 노출된 바이러스-감염 동물 세포에서도 관찰되었다(표 4c). 흥미로운 점은 이 세포 배양실험동안 라이소자임 이량체의 최고 분량(즉, 세포 배양물 ㎖당 1000㎍)에서, 매우 강력한 효과가 닭 배아 섬유아세포에서 관찰되었다는 점이다. 적어도 1.3 비율(= 기준에 비하여 세포 생존기간의 30% 연장), 최대 1.67(= 기준에 비하여 세포 생존기간의 67% 연장) 비율의 세포 생명 연장이 본 실험에서 정기적으로 달성되었다.

디스템프 바이러스와 개 바이러스로 감염시켰다; 기준물질의 바이러스 적정농도(CCID50/㎖)는 10^3.35(디스템프 바이러스)/10^5.0(개 파르보바이러스)이었다.

비교가능한 조건하에 다른 세포, 특히, 라이디히 세포와 유사한 대식세포로 실시한 조사에서, 전술한 결과가 입증되었다. 또한, 라이소자임 이량체로 처리한 후 세포의 DNA 함량과 단백질 합성이 증가하였다. 하지만, 라이소자임 이량체가 진핵세포, 특히, 아팝토시스(즉, 사전 결정된 "예정된" 세포 사멸)를 방해하기 위한 포유동물 면역콤피텐트 세포와 상호작용하는 방법은 아직 완벽하게 이해되지는 못하고 있다. 그렇지만, 지금까지 얻은 실험 결과는 진핵세포에 대한 라이소자임 이량체의 항-노화 효과의 측면에서 매우 흥미로운데, 이의 실제적인 용도는 아직 예상할 수 없다.

Claims (20)

1. 동물 또는 사람 수정능력 손상의 예방 또는 치료목적의 제약학적 조성물 제조를 위한 라이소자임 이량체의 용도.
2. 제 1 항에 있어서, 예방 또는 치료는 다음의 수정능력 변수: 정액 기질, 난세포 성숙, 배아 발달중 적어도 하나를 향상시키는 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
3. 제 1 항 또는 2항에 있어서, 예방 또는 치료는 다음의 정자 기질 요인: 정자세포 생존기간, 정자세포 유동성, 정자세포막 안정성, 선단체 보호, 정상형태 정자세포의 농도, 사정액상의 전체 정자 세포수중 적어도 하나를 향상시키는 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
4. 제 1 항에 있어서, 손상은 다음의 질환: 면역질환, 호르몬 질환, 대사질환중 적어도 하나에 의해 영향을 받거나 또는 야기되고, 여기서 상기 면역질환은 자궁 염증인 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
5. 제 1항에 있어서, 수정능력 손상은 희정액증에 기인하는 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
6. 제 1항에 있어서, 예방 또는 치료는 다음의 변수: 세포 면역, 식세포활성, 사이토킨 수준, 호르몬 수준중 적어도 하나를 조절하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 이량체의 용도.
7. 제 1항 내지 6항중 어느 한 항에 있어서, 제약학적 조성물은 체중kg당 0.005 내지 5, 바람직하게는 0.01 내지 1 mg 라이소자임 이량체, 또는 혈액 ㎖당 0.07 내지 70, 바람직하게는 0.14 내지 14㎍ 라이소자임 이량체의 단일 또는 반복분량으로 사람 또는 동물 개체에 투여하는데 적합한 양의 라이소자임 이량체를 함유하는 것을 특징으로 라이소자임 이량체의 용도.
8. 제 1항 내지 7항중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 0.01 내지 10, 바람직하게는 0.1 내지 0.5mg/㎖ 용액농도로, 라이소자임을 함유한 액체용액형태를 취하는 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
9. 제 1항 또는 2항에 있어서, 라이소자임 이량체는 세포 성숙 및 배아 발달의 개선에 사용되고, 여기서, 예방 또는 치료는 효과량의 라이소자임 이량체, 바람직하게는 성숙배지 ㎖당 1 내지 10㎍ 라이소자임 이량체로 난세포 성숙배지를 보충하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
10. 진핵세포, 특히, 동물 또는 사람 생식세포의 개선된 보존 및 진핵세포 생명연장을 위한 라이소자임 이량체의 용도에 있어서, 라이소자임 이량체의 존재하에서, 특히, 상기 세포를 함유한 현탁액 ㎖당 0.1 내지 50㎍ 라이소자임 이량체의 존재하에 진핵세포를 배양 또는 저장하는 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
11. 제 10항에 있어서, 한가지 요인으로 세포 생존을 1.3배이상, 바람직하게는 최대 1.67배 연장하기 위한 라이소자임 이량체의 용도.
12. 선행한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 라이소자임 이량체는 라이소자임 단량체가 교차연결된 이량체 산물이고, 원하지 않는 부산물, 특히, 라이소자임 단량체와 저량체를 중량당 10%미만으로 함유하는 것을 특징으로 하는 라이소자임 이량체의 용도.
13. 진핵세포, 특히, 포유동물 또는 사람 생식세포의 보존을 개선하고, 진핵세포 의 생명을 연장하기 위한 방법에 있어서, 라이소자임 이량체의 존재하에서, 바람직하게는 상기 세포를 함유한 현탁액 ㎖당 0.1 내지 50㎍ 라이소자임 이량체의 존재하에 세포를 저장 또는 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 진핵세포는 동결단계를 거쳐 보존하는데, 여기서, 세포를 동결하기 전, 상기 세포를 함유한 현탁액 1㎖당 0.1 내지 20㎍, 바람직하게는 1 내지 4㎍ 분량의 라이소자임 이량체를 세포에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 난세포 성숙 및 배아발달을 개선하기 위한 방법에 있어서, 난세포 성숙배지에 효과량의 라이소좀 이량체, 바람직하게는 성숙배지 ㎖당 1 내지 10㎍ 라이소자임 이량체를 보충하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 13항 내지 15항중 어느 한 항에 있어서, 라이소자임 이량체는 라이소자임 단량체의 교차연결된 이량체산물이고, 원하지 않는 부산물, 특히, 라이소자임 단량체와 저량체를 중량당 10%미만으로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 동물 또는 사람 수정능력 손상의 치료 또는 예방에 사용하는 조성물에 있어서, 체중 kg당 0.005 내지 5mg 라이소자임 이량체, 또는 혈액 ㎖당 0.07 내지 70㎍ 라이소자임 이량체 분량으로 사람 또는 동물 개체에 투여하는데 적합한 양의 라이소자임 이량체를 함유하는 것을 특징으로 조성물.
18. 제 17항에 있어서, 0.01 내지 10, 바람직하게는 0.1 내지 0.5mg/㎖ 용액농도로 라이소자임을 함유한 액체 용액형태를 취하는 것을 특징으로 하는 조성물
19. 진핵세포, 특히, 동물 또는 사람 생식세포의 보존을 향상하고, 진핵세포의 생명을 연장하기 위한 조성물에 있어서, 상기 세포를 함유한 현탁액 1㎖당 0.1 내지 50㎍ 라이소자임 이량체의 존재하에서 세포를 저장 또는 배양하는데 충분한 양의 라이소자임 이량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 17항 내지 19항중 어느 한 항에 있어서, 라이소자임 이량체는 라이소자임 이량체의 이량체화 산물이고, 원하지 않는 부산물, 특히, 라이소자임 단량체와 이량체를 중량당 10%미만으로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.