CN111372654A

CN111372654A - 用于改善精子质量的方法和产品

Info

Publication number: CN111372654A
Application number: CN201880075368.0A
Authority: CN
Inventors: R·L·罗布克; M·贝穆德斯冈萨雷斯
Original assignee: University of Adelaide
Current assignee: University of Adelaide
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2020-07-03
Also published as: BR112020005732A2; EP3684469A1; AU2018337761A1; EP3684469A4; JP7384414B2; WO2019056070A1; JP2020534348A; US20210145815A1; JP2024016146A

Abstract

本发明涉及用于改善精子质量的方法和产品，用于治疗个体以改善精子质量或改善生育力的方法，以及具有改善的质量的精子在辅助生殖技术中的用途，包括将精子暴露于BGP‑15和/或其衍生物，例如BGP‑15、普萘洛尔、氯吡哌醇、阿莫氯醇、NG‑94、iroxanadine和/或其药学上可接受的衍生物、前药、溶剂化物、盐、互变异构体、立体异构体和/或外消旋体。

Description

用于改善精子质量的方法和产品

优先权要求

本申请要求2017年9月22日提交的澳大利亚临时专利申请2017903857的优先权，其内容通过引用并入本文。

领域

本公开涉及用于改善精子质量的方法和产品，用于治疗个体以改善精子质量或改善生育力的方法，以及具有改善的质量的精子在辅助生殖技术中的用途。

背景

尽管生殖医学有许多进展，但由于男性生育力降低，很大比例的夫妇不能受孕。尽管存在许多导致男性生育力降低的原因，但在一些情况下精子具有降低的精子质量。精子质量降低的许多原因仍然未知。

例如，多项研究已经表明精子功能随着年龄的增加而降低。考虑到父系年龄有增加的趋势，显然与年龄相关的精子质量的降低是值得关注的。

此外，育龄男性中男性肥胖的比率在过去的几十年中显著增加，并且与世界范围内男性不育的增加一致。有新出现的证据表明超重或肥胖对男性生殖潜力有负面影响，包括降低精子质量。最近的研究表明，精子质量的降低不仅仅是由于产生的精子的量或运动性的降低。

先前的研究还表明，吸烟的男性的生育力更差。虽然研究报道香烟烟雾可能负面影响精子参数、精浆和多种其它生育力因素，但是吸烟对男性生育力的实际影响仍不清楚。

可用于改善精子质量的药理学干预是有限的。一些补充剂可用于帮助改善男性生育力，其通常依赖于维生素和抗氧化剂来改善妊娠率。辅助生育技术也允许干预以治疗生育力差，并且在一些情况下可以用于辅助实现妊娠，其中低生育力的原因之一是由于精子质量降低。然而，尽管在辅助生殖领域取得了许多进展，但是辅助生殖技术的成功率仍然通常较低。辅助生殖技术例如体外受精(IVF)、精子卵浆内注射(ICSI)和(IUI)的较低成功率可能部分是由于使用了低质量的精子。

辅助生殖技术也广泛用于动物，特别是具有高遗传价值的动物。改善精子质量可以在改善动物繁殖率和/或生育动物的质量方面具有优势，这提供了经济优势。

在野生物种中，迫切需要辅助生殖技术来改善捕获和/或濒危物种的生育力以便维持生物多样性。

因此，由于多种原因，需要新的方法和产品来改善精子质量。

概述

本公开涉及用于改善精子质量的方法和产品，用于治疗个体以改善精子质量或治疗生育力降低的方法，以及具有改善的质量的精子在辅助生殖技术中的用途。

本公开的某些实施方案提供了改善精子质量的方法，所述方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，从而改善精子的质量。

本公开的某些实施方案提供了通过如本文所述的将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物而产生的分离的精子。

本公开的某些实施方案提供了治疗个体以改善精子质量的方法，该方法包括给个体施用有效量的BGP-15和/或其衍生物，从而改善个体的精子质量。

本公开的某些实施方案提供了治疗个体精子质量降低的方法，该方法包括给个体施用有效量的BGP-15和/或其衍生物，从而治疗个体。

本公开的某些实施方案提供了BGP-15和/或其衍生物在用于改善精子质量的组合物中的用途。

本公开的某些实施方案提供了用于改善精子质量的药物组合物，所述组合物包含有效量的BGP-15和/或其衍生物。

本公开的某些实施方案提供了治疗个体以改善精子质量的方法，所述方法包括给个体施用如本文所述的药物组合物。

本公开的某些实施方案提供了改善通过对卵母细胞受精产生的胚胎的发育能力的方法，所述方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，从而改善胚胎的发育能力。

本公开的某些实施方案提供了使用精子辅助生殖的方法，该方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，并且将暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子用于辅助生殖的方法中。

本公开的某些实施方案提供了使用如本文所述的辅助生殖方法生育的动物。

本公开的某些实施方案提供了体外受精方法，所述方法包括：

将精子体外暴露于BGP-15和/或其衍生物；以及

用暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子使卵母细胞受精。

本公开的某些实施方案提供了用于改善精子质量的试剂盒或产品，所述试剂盒或产品包括用于暴露于精子的BGP-15和/或其衍生物。

本公开的某些实施方案提供了用于辅助生殖技术的试剂盒或产品，所述试剂盒或产品包括用于暴露于精子的BGP-15和/或其衍生物。

本发明的某些实施方案提供了用于使卵母细胞与精子受精的体外受精介质，所述介质包含BGP-15和/或其衍生物。

本发明的某些实施方案提供了用于精子的体外受精介质，所述介质包含BGP-15和/或其衍生物。

本公开的某些实施方案提供了精子制备介质，该介质包含BGP-15和/或其衍生物。

本公开的某些实施方案提供了冷冻精子的方法，所述方法包括在冷冻精子之前、期间和/或之后的一个或多个时间将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物。

本公开的某些实施方案提供了精子冷冻介质，所述介质包含BGP-15和/或其衍生物。

本公开的某些实施方案提供了筛选改善精子质量的活性剂的方法，该方法包括确定BGP-15衍生物改善精子质量的能力，并且将该衍生物鉴定为改善精子质量的活性剂。

本文公开了其它某些实施方案。

附图简述

某些实施方案由以下附图示出。应当理解，以下描述仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本描述。

图1是体外用BGP-15处理对恢复精子功能的作用。从“年轻”(～6周龄)或“年老”(～1岁)的雄性小鼠的附睾和输精管收集精子，并且在对照培养基(未处理)或含有10μMBGP-15的培养基中体外获能(成熟)1小时，随后用精子对来自年轻雌性小鼠的卵母细胞进行体外受精，并且评价假定合子的发育。A)IVF后24小时完成裂解的假定合子的百分数。B)到第5天完成胚泡发育的2细胞胚胎的百分数。C)开始孵化的胚泡的百分数。在使用来自年老小鼠的精子受孕的胚胎中，每个发育阶段都是受损的，然而每个发育参数通过在体外用BGP-15处理“年老”精子1小时而得到改善。N＝6-12只小鼠/处理组。分析是配对t-检验，比较每个年龄组内未处理的和BGP-15处理的，以及未配对t-检验，比较年轻的和年老的。

图2显示BGP-15体内处理对恢复精子功能的作用。“年轻”(～6周龄)或“年老”(～1岁)的雄性小鼠是“未处理的”或用BGP-15(15mg/kg)每日一次腹膜内处理4天。最后一次注射后约12小时，从附睾和输精管收集精子并且用于体外受精来自年轻雌性小鼠的卵母细胞，并且评估假定合子的发育。A)IVF后24小时完成裂解的假定合子的百分数。B)到第5天完成胚泡发育的2细胞胚胎的百分数。C)开始孵化的胚泡的百分数。在使用来自年老小鼠的精子受孕的胚胎中，每个发育阶段都是受损的，然而通过用BGP-15处理“年老”小鼠，每个发育参数都得到了改善。N＝1只小鼠/处理组。

图3显示年老雄性妊娠较少。(A)当与年轻(6-8周龄)雌性配对时，观察到年轻和年老雄性小鼠具有相似的交配率(交配数)。(B)然而，与年轻雄性相比，年老雄性在性交后第18.5天观察到妊娠数显著减少。数据显示为平均值。统计学分析是Fisher精确检验(P＝0.004；95％CI：1.75，19.14；N＝25(年轻)，33(年老)雄性。

图4显示了年老雄性生育更小更不健康的后代。(A)在胚胎发育的第18.5天，发现产生妊娠的年老雄性小鼠比年轻雄性生育的胎儿更轻。(B)来自年老雄性的胎儿也具有更小的胎盘。(C)年老雄性生育的新生幼仔在出生后第1天比年轻雄性生育的新生幼仔更轻。(D)与来自相比，由年老雄性生育的后代比年轻雄性生育的后代经历更高的新生仔死亡率(即在出生后第21天断奶之前死亡)。数据显示为平均值±SEM。统计分析是线性混合模型(A、B、C)或未配对的Student’s T检验(D)。

图5显示了体外BGP-15处理精子。试验设计图示。获得证实生育力的种外雄性小鼠，并且老化至至少12个月大；然后将它们与“年轻对照”比较。通过与自然循环的年轻雌性交配来评估生育力。选择产生妊娠(即可育)的年轻雄性和没有产生妊娠(即低生育力)的年老雄性作为体外受精(IVF)和胚胎产生的精子供体。在体外受精(IVF)当天，收集精子，并且在精子获能期间用BGP-15处理一半精子1小时。在IVF之前即刻，将等分试样用于精液分析和精子质量测定，即：精子计数、存活、形态、运动性(包括前进运动性)、线粒体活性和透明带结合能力。

图6显示BGP-15增加了年老雄性的精子运动性。获能后精液溶液的分析显示，年老的雄性呈现更低的精子计数(A)，但正常的存活率(B)和形态正常的精子率(C)。总运动性(D)和前进运动性(E)也降低。BGP-15处理对精子计数、存活或形态没有影响，但增加了年老雄性精子的总运动性(D)和前进运动性(E)。数据显示为平均值±SEM。统计分析是配对(年轻的未处理的和年轻的处理的，年老的未处理的和年老的处理的)或不配对(年轻的和年老的)Student’s T-检验。

图7显示BGP-15处理增加了年老雄性的精子线粒体膜电位(MMP)。(A)JC-1染色精子的低MMP(上图)或高MMP(下图)的代表性图像。(B)JC-1染色精子的流式细胞术分析。在年老雄性中，BGP-15增加了显示高MMP(C)的活精子的百分数。数据显示为平均值±SEM。统计分析是配对(年轻的未处理的和年轻的处理的，年老的未处理的和年老的处理的)或不配对(年轻的和年老的)Student’s T-检验。

图8显示BGP-15改善了年老雄性的透明带结合能力。用二苯甲酰胺DNA染色评估精子的透明带结合能力显示(A)年老雄性的较少精子与MII卵母细胞的透明带结合，但通过BGP-15处理增加(B)。数据显示为平均值±SEM。统计分析是配对(年轻的未处理的和年轻的处理的，年老的未处理的和年老的处理的)或不配对(年轻的和年老的)Student’s T-检验。

图9显示年老雄性具有破坏的植入前胚胎发育。IVF后植入前胚胎的时差成像的形态动力学分析显示，与年轻雄性相比，年老雄性具有更长的至2-细胞的时间(A)和更高的胚泡破坏频率(B)。数据显示为平均值±SEM。统计学分析是不配对的Student’s T检验。

图10显示在用BGP-15体外处理精子后，来自年老雄性的植入前胚胎呈现改善的发育。(A)与年轻的(未处理和处理的)雄性相比，年老雄性在IVF后(hCG注射后46小时)第2天达到第一次裂解(2-细胞)的假定合子的百分数降低；但是当用BGP-15处理年老精子时，2-细胞率改善。(B)年老雄性还显示IVF后第5天(hCG注射后112小时)达到胚泡期的2-细胞胚胎的百分数降低，这通过BGP-15处理精子而得到改善。(C)IVF后第5天的孵化胚泡率在来自年老雄性的胚泡中降低，但通过用BGP-15处理精子得到了改善。数据显示为平均值±SEM。统计分析是配对(年轻的未处理的和年轻的处理的，年老的未处理的和年老的处理的)或不配对(年轻的和年老的)Student’s T-检验。

图11显示了用BGP-15体内处理雄性小鼠。试验设计图示。获得证实能育的种外雄性小鼠，并且老化至至少12个月大；然后与“年轻对照”比较。通过与自然循环的年轻雌性交配来评估生育力。选择产生妊娠(即可育)的年轻雄性和没有产生妊娠(即低生育力)的年老雄性作为体外受精(IVF)和胚胎产生的精子供体。在IVF前4天每天通过腹膜内注射(IP)给予一半雄性BGP-15(15mg/kg)。在评估雄性生育力的同时，一组年轻雌性被激素刺激排卵，并且收集它们的卵丘-卵母细胞复合物。这些COC用所有处理组的精子授精。在受精培养基中温育4小时后，评估假定合子的原核存在情况，并且在体外进一步培养5天。在IVF后第2天和第5天分别对2-细胞和胚泡期的发育进行评价。

图12显示BGP-15改善了年老雄性精子的精子形态和线粒体膜电位(MMP)。用BGP-15体内处理对年老雄性的精子计数(A)、存活(B)或运动性(D，E)没有显著影响，但令人惊奇的是，它增加了形态正常精子(C)以及具有高MMP的精子群的比例(F)。数据显示为平均值±SEM。统计学分析是不配对的Student’s T检验。

图13显示用BGP-15体内处理年老雄性后，植入前胚胎发育的改善。(A)与未处理的年轻雄性相比，未处理的年老雄性在IVF后(hCG注射后46小时)第2天达到第一次裂解(2-细胞)的假定合子的百分数降低，但是在用BGP-15处理的年老雄性中2-细胞率改善。(B)未处理的年老雄性还显示出IVF后(hCG注射后112小时)第5天达到胚泡期的2-细胞胚胎的百分数降低，这在接受BGP-15处理的那些中也有所改善。(C)IVF后第5天的孵化率在所有组中都相似。数据显示为平均值±SEM。统计学分析是不配对的Student’s T检验。

图14显示BGP-15增加了人精子的运动性。(A)BGP-15处理30分钟对纯精液样品(含精浆)的精子运动性没有影响，但它提高了来自相同供体的洗涤样品(除去精浆)的精子运动性。BGP-15处理对在24(B)或48(C)小时时的洗涤样品的精子运动性没有影响。BGP-15处理30分钟后，BGP-15处理精子对来自纯样品的精子的活力(或膜不渗透性)没有影响，但来自相同供体的洗涤样品的精子活力降低(D)。BGP-15处理对在24(E)或48(F)小时时的洗涤样品的精子活力没有影响。数据显示为平均值±SEM。统计分析是配对的Student’s T检验。

图15显示BGP-15减轻了人精子中的DNA损伤。(A)在未处理和处理的样品中对DNA氧化损伤标记物8-氧代-2’-脱氧鸟苷(8OHdG)进行定量分析表明，洗涤提高了精子8OHdG水平，但是在BGP-15处理30分钟后，在来自相同供体的纯和洗涤样品的精子中，该水平降低。(B)用DAPI DNA染色通过HALO分析法进行的DNA片段化定量分析表明，洗涤增加了精子DNA片段化，而BGP-15处理减少了精子DNA片段化。(C)染色质结构损伤标记物色霉素A3(CMA3)的定量分析表明，当洗涤提高精子CMA3的水平时，BGP-15没有作用。在24和48小时时的DNA损伤分析显示BGP-15处理分别对精子DNA 8OhdG(D、G)、片段化(E、H)或CMA3(F、I)水平没有影响。数据显示为平均值±SEM。统计分析是配对的Student’s T检验。

图16显示通过洗涤进行的精子选择降低了年老男性的精子活力。通过洗涤除去精液样品中的精浆后的精液分析显示年轻(＜40岁)和年老(＞40岁)男性之间相似的精子计数(A)和运动性(B)，但在年老男性中存活(膜不渗透性)显著降低(C)。比较纯样品和洗涤样品中的精子活力，表明洗涤对年轻男性没有影响(D)，但在年老男性中精子活力降低(E)。数据显示为平均值±SEM。统计分析是配对的Student’s T检验。

图17显示BGP-15改善了年老男性的精子运动性。(A)洗涤和BGP-15处理都不影响年轻男性(<40岁)的精子运动性；(B)在年老男性(>40岁)中，洗涤降低精子的运动性，但是用BGP-15处理30分钟后精子的运动性增加。数据显示为平均值±SEM。统计学分析是双向ANOVA和事后多重比较检验。

图18显示BGP-15保护精子免受氧化应激引起的DNA损伤。将年轻男性(年龄<40岁)的精子与递增剂量的H₂O₂(0、0.0625nM、0.125nM和0.250nM)温育，并且用BGP-15(10uM)处理或不处理1小时。H₂O₂处理取消了精子运动性(A)和存活(B)。(C)DNA氧化损伤标记物8-氧代-2’-脱氧鸟苷(8OHdG)的定量分析表明H₂O₂处理以剂量依赖方式增加了精子氧化损伤，而加入BGP-15防止了DNA氧化损伤的积累。数据显示为平均值±SEM。统计学分析是双向ANOVA和事后多重比较检验。

详细描述

本公开涉及用于改善精子质量的方法和产品，用于治疗个体以改善精子质量的方法，以及具有改善的质量的精子在辅助生殖技术中的用途。

本发明至少部分基于以下认识：BGP-15和/或其衍生物改善了体外和体内精子质量，并且特别是具有改善胚胎发育能力的结果，所述胚胎是由用BGP-15处理的精子产生的，特别是对于年老个体的精子。

本公开的某些实施方案提供了改善精子质量的方法。

本文所用的术语“精子”是指雄性生殖细胞或精子(spermatozoon)，并且包括一个或多个精子(spermatozoa)。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物包括BGP-15(O-[3-哌啶子基-2-羟基-1-丙基]-烟碱氨肟)：

和/或其可接受的衍生物、前药、溶剂化物、盐、互变异构体、立体异构体和/或外消旋体。

BGP-15是商业上可得到的(通常作为适合的盐)或者可以通过本领域已知的方法合成。BGP-15的商业来源的实例包括Sigma-Aldrich(产品#B4813 SIGMA)和CaymanChemicals(产品#17503)。

在某些实施方案中，BGP-15的衍生物包括普萘洛尔(propanolol)、氯吡哌醇(bimoclomol)、阿莫氯醇(arimoclomal)、NG-94、iroxanadine和/或任何上述物质的药学上可接受的衍生物、前药、溶剂化物、盐、互变异构体、立体异构体和/或外消旋体。普萘洛尔、氯吡哌醇、阿莫氯醇、NG-94、iroxanadine的化学结构如下：

上述化合物可以通过本领域已知的方法合成或者是可商购获得的。

普萘洛尔(CAS#318-98-9)可以通过本领域已知的方法合成或者从LGM Pharma(USA)商购获得。氯吡哌醇((3Z)-N-(2-羟基-3-哌啶-1-基丙氧基)吡啶-3-甲亚胺酰氯)可以通过本领域已知的方法合成，例如匈牙利专利第207988号(1988)中所述。阿莫氯醇(3-[氯({[(2R)-2-羟基-3-(哌啶-1-基)丙氧基]亚氨基})甲基]吡啶-1-

-1-醇盐)可以通过本领域已知的方法合成，例如描述于国际专利申请WO0179174或Tetrahedron：Asymmetr.2012，23：1564-1570。NG-094可以通过本领域已知的方法合成。Iroxanadine可以通过本领域已知的方法合成，并且可以从360Reagent商购获得。

在某些实施方案中，精子的质量包括受精能力。在某些实施方案中，受精能力包括使卵母细胞受精的能力、产生合子的能力和/或由精子产生的胚胎的发育能力。

在某些实施方案中，精子的质量包括产生在该物种的最佳时间范围(“工作时间”)内完成卵裂受精的合子的能力、2细胞胚胎在该物种的最佳时间范围(“工作时间”)内完成胚泡发育的能力和/或胚泡开始孵化的能力中的一种或多种。

在某些实施方案中，精子的质量包括DNA完整性。DNA完整性的测量的实例包括DNA损伤、DNA片段化、DNA破碎和DNA构象。用于评估DNA完整性的测定是本领域已知的，并且包括例如其中通过在损伤位点掺入探针来直接测量DNA片段化以检测实际DNA链断裂的测定，例如末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记测定(TUNEL)和原位切口翻译(ISNT)，以及利用片段DNA的性质以在某些条件下更容易变性的测定。精子染色质分散(SCD)、单细胞凝胶电泳(SCGE)或彗星试验、精子染色质结构试验(SCSA)、吖啶橙染色是其中精子DNA可以进行变性处理然后对DNA损伤进行定量的实例。

在某些实施方案中，精子的质量是冷冻/低温保存精子的能力。

在某些实施方案中，精子来自患有或易患与生育力降低和/或精子质量降低相关的病症的供体。

在某些实施方案中，精子来自衰老供体。在某些实施方案中，精子来自年老供体。在某些实施方案中，精子来自患有或易患与生育力降低相关的衰老病症的供体。在某些实施方案中，精子来自肥胖或超重供体。

在某些实施方案中，精子来自年龄大于40岁的供体。在某些实施方案中，精子来自年龄大于45岁的供体。

在某些实施方案中，精子来自吸烟或吸过烟的供体。在某些实施方案中，精子来自患有或易患与吸烟相关的生育力降低相关的病症或状态的供体。

在某些实施方案中，精子用于辅助生殖方法或技术中。

辅助生殖技术的实例包括人工授精(也称为子宫内授精)、体外受精(IVF)、配子输卵管内转移(GIFT)、将卵母细胞和精子置于输卵管中、合子输卵管内转移(ZIFT)、管胚胎转移(TET)、腹膜卵母细胞和精子转移(POST)、胞质内精子注射(ICSI)、睾丸精子提取(TESE)和显微手术附睾精子抽吸(MESA)。

辅助生殖技术是本领域已知的，例如如Textbook of Assisted Reproduction:Laboratory and Clinical Perspectives(2003)编辑Gardner,D.K.,Weissman,A.,Howies,CM.,Shoham,Z.Martin Dunits Ltd,London,UK；和Gordon,I.(2003)LaboratoryProduction of Cattle Embryos第2版CABI Publishing,Oxon,UK所述。

在某些实施方案中，该方法用于产生体外受精(IVF)、胞浆内精子注射(ICSI)或子宫内授精(IUI)所用的精子。

在人和动物中进行辅助生殖技术的方法是本领域已知的。

本文所用的术语“暴露”及其变化形式还包括体外暴露、离体暴露或体内暴露。暴露的实例包括暴露于液体介质中的活性剂，暴露于被改变或代谢为活性剂的前活性剂，或暴露于诱导靶活性剂表达的一种活性剂。

在某些实施例中，该方法用于将精子体外暴露于BGP-15和/或其衍生物以改善质量。

在某些实施方案中，精子是体外的。

在某些实施方案中，精子存在于精液或其稀释形式中。

在某些实施方案中，精子在适合的介质中。在某些实施方案中，精子在适合的介质中稀释。

在某些实施方案中，精子因特定的特征而富集，所述特征例如运动性、存活、活力、获能、增加或更高的DNA完整性，或者降低或更低的DNA质量。

在某些实施方案中，例如通过密度梯度离心、通过上游技术或通过流式细胞术分选精子。分选精子的方法是本领域已知的。

在某些实施方案中，精子存在于精子制备介质中。精子制备培养基是本领域已知的，并且是可商购获得的。在某些实施方案中，精子存在于精子洗涤介质中。

在某些实施方案中，精子在获能之前、期间和/或之后暴露于BGP-15和/或其衍生物。在某些实施方案中，精子在成熟前、成熟中和/或成熟后暴露于BGP-15和/或其衍生物。

在某些实施方案中，精子存在于体外受精(IVF)介质中。IVF培养基是本领域已知的，并且是可商购获得的。

在某些实施方案中，精子存在于冷冻或低温保存介质中。冷冻/低温保存介质是本领域已知的，并且是可商购获得的。

在某些实施方案中，该方法包括将精子暴露于浓度范围为1μM至100μM、2μM至100μM、5μM至100μM、10μM至100μM、20μM至100μM、50μM至100μM、1μM至50μM、2μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至50μM、1μM至20μM、2μM至20μM、5μM至20μM、5μM至10μM、1μM至5μM、2μM至5μM或1μM至2μM的BGP-15和/或其衍生物。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，该方法包括将精子暴露于包含BGP-15和/或其衍生物的介质。在某些实施方案中，所述方法包括将精子暴露于包含浓度为1μM至100μM、2μM至100μM、5μM至100μM、10μM至100μM、20μM至100μM、50μM至100μM、1μM至50μM、2μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至50μM、1μM至20μM、2μM至20μM、5μM至20μM、5μM至10μM、1μM至5μM、2μM至5μM或1μM至2μM的BGP-15和/或其衍生物的介质。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，精子暴露于BGP-15和/或其衍生物24小时或更少、18小时或更少、12小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少、2小时或更少，或者1小时或更少。

用于评估精子质量的方法是本领域已知的。

在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估精子的受精能力。在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估精子使卵母细胞受精的能力，和/或由使卵母细胞受精的精子产生的胚胎的发育能力。在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估精子产生“准时”完成分裂的合子的能力、精子产生“准时”完成胚泡发育的2细胞胚胎的能力和精子产生启动孵化的胚泡的能力。

在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估DNA完整性或DNA质量。

在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估由精子产生的胚胎的一个或多个特征，例如胚胎健康、发育能力和/或出生后健康。用于评估这些特征的方法是本领域已知的。

在某些实施方案中，该方法包括将精子的质量改善至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

在某些实施方案中，该方法用于将个体的精子暴露于BGP-15和/或其衍生物以改善质量。在某些实施方案中，精子在个体体内。本文描述了将个体暴露于BGP-15和/或其衍生物的方法。

在某些实施方案中，个体具有受精能力降低的精子。在某些实施方案中，个体患有或易患生育力降低。在某些实施方案中，个体患有或易患与生育力降低相关的疾病、病症或状态。在某些实施方案中，个体具有DNA完整性或DNA质量降低的精子。

在某些实施方案中，个体是年老或年老的个体。在某些实施方案中，个体的年龄大于40岁。在某些实施方案中，个体的年龄大于45岁。

在某些实施方案中，个体是肥胖或超重个体。

在某些实施方案中，个体吸烟或吸过烟。

在某些实施方案中，该方法改善了个体的精子质量，从而允许个体在适合的雌性个体中产生成功的妊娠(或产生的可能性增加)。在某些实施方案中，该方法改善了个体的精子质量，从而允许个体在适合的雌性个体中通过自然方式产生成功的妊娠(或产生的可能性增加)。在某些实施方案中，该方法改善了个体的精子质量，从而允许个体利用辅助生殖技术产生成功的妊娠(或产生的可能性增加)。在某些实施方案中，该方法改善了所产生的后代的质量。

在某些实施方案中，个体是人个体。

在某些实施方案中，个体是动物个体，例如家畜动物(例如马、牛、绵羊、山羊、猪)、家养动物(例如狗或猫)和其它类型的动物，例如猴、兔、小鼠、大鼠和实验动物，以及野生物种。

在某些实施方案中，精子暴露于BGP-15和/或其衍生物包括给个体施用BGP-15和/或其衍生物。在某些实施方案中，由个体产生的精子的质量得到改善。在某些实施方案中，由个体产生的用于体外受精目的精子的质量得到改善。

在某些实施方案中，将BGP-15和/或其衍生物施用于个体，以提供1μM至100μM、5μM至100μM、10μM至100μM、50μM至100μM、1μM至50μM、5μM至50μM、10μM至50μM、1μM至10μM、5μM至10μM或1μM至5μM范围的血液或血浆浓度。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物以以下选择范围之一的量施用于个体：1μg/kg至1000mg/kg、1μg/kg至100mg/kg；1μg/kg至10mg/kg；1μg/kg至1mg/kg；1μg/kg至100μg/kg；1μg/kg至10μg/kg；10μg/kg至1000mg/kg，10μg/kg至100mg/kg；10μg/kg至10mg/kg；10μg/kg至1mg/kg；10μg/kg至100μg/kg；10μg/kg至1000mg/kg、100μg/kg至100mg/kg；100μg/kg至10mg/kg；100μg/kg至1mg/kg；1mg/kg至1000mg/kg，1mg/kg至100mg/kg；1mg/kg至10mg/kg；10mg/kg至1000mg/kg；10mg/kg至100mg/kg；和100mg/kg至1000mg/kg体重。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物每天施用一次、两次、多次或连续施用。其它施用方案是可预期的。

可以选择适合的施用周期。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物给个体施用至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少3周或至少4周的时间。在某些实施方案中，施用持续一段连续的时间。其它施用周期是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物以以下选择范围之一的量施用于个体：1μg/kg/天至1000mg/kg/天，1μg/kg/天至100mg/kg/天；1μg/kg/天至10mg/kg/天；1μg/kg/天至1mg/kg/天；1μg/kg/天至100μg/kg/天；1μg/kg/天至10μg/kg/天；10μg/kg/天至1000mg/kg/天，10μg/kg/天至100mg/kg/天；10μg/kg/天至10mg/kg/天；10μg/kg/天至1mg/kg/天；10μg/kg/天至100μg/kg/天；10μg/kg/天至1000mg/kg/天，100μg/kg/天至100mg/kg/天；100μg/kg/天至10mg/kg/天；100μg/kg/天至1mg/kg/天；1mg/kg/天至1000mg/kg/天，1mg/kg/天至100mg/kg/天；1mg/kg/天至10mg/kg/天；10mg/kg/天至1000mg/kg/天；10mg/kg/天至100mg/kg/天；和100mg/kg/天至1000mg/kg/天体重。其它范围是可预期的。

BGP-15和/或其衍生物可以以适合的形式施用于个体。在这方面，术语“施用”或“提供”包括施用活性剂，或施用前药或衍生物，其将在个体体内形成有效量的所需活性剂。该术语包括全身性(例如，通过注射例如静脉内注射，以片剂、丸剂、胶囊剂或其它可用于全身性施用的剂型口服)和局部(例如，用于局部口服施用的乳膏剂、溶液剂、糊剂、软膏剂，包括溶液剂例如漱口水)的施用途径。其它施用途径是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物口服施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物静脉内施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物通过注射，例如静脉内注射施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物通过雾化施用、通过气雾化施用或通过滴注到肺中施用。其它施用形式/途径是可预期的。

BGP-15和/或其衍生物可以单独施用，或者可以与其它治疗剂和/或例如增强、稳定或保持该治疗剂活性的活性剂的混合物递送。在某些实施方案中，使用施用载体(例如丸剂、片剂、植入剂、可注射溶液等)，并且将含有BGP-15和/或其衍生物和一种或多种附加剂。

本文所述的方法还可以包括组合治疗。在这方面，可以结合如本文所述的BGP-15和/或其衍生物来治疗或给予个体另一种药物或治疗形式。这种组合治疗可以是顺序治疗，其中首先用一种治疗个体，然后用另一种治疗个体，或者同时给予两种或更多种治疗方式。

“共施用”或“共同施用”是指一次一起施用两种或多种治疗剂。两种或更多种治疗剂可以共同配制成单一剂型或“组合剂量单位”，或单独配制，随后组合成组合剂量单位，通常用于静脉内施用或口服施用。

当给个体施用时，活性剂的治疗有效剂量可以取决于所用的特定活性剂、施用模式、其状况和严重程度以及与所治疗的个体相关的多种身体因素而不同。预期剂量随施用途径、所施用的活性剂和所施用的任何其它活性剂的性质而不同。在某些实施方案中，该方法包括给个体施用剂量递增的BGP-15和/或其衍生物和/或重复剂量。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物口服施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物静脉内施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物通过注射，例如静脉内注射施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物非肠道施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物通过直接引入到肺中来施用，例如通过气雾剂施用、通过喷雾施用和通过滴注到肺中。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物通过植入物施用。在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物通过皮下注射、关节内、直肠、鼻内、眼内、阴道或经皮施用。施用方法是本领域已知的。

“静脉内施用”是将物质直接施用到静脉中。

“口服施用”是通过口摄取物质的施用途径，包括口腔、唇下和舌下施用，以及肠内施用。治疗剂的口服施用的典型形式包括使用片剂或胶囊剂。

在某些实施例中，BGP-15和/或其衍生物作为连续释放制剂施用。

在某些实施例中，BGP-15和/或其衍生物作为立即释放制剂施用。术语“立即释放制剂”是设计成在体内历经短的时间快速释放治疗剂的制剂。立即释放制剂是本领域已知的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物作为持续释放制剂施用。术语“持续释放制剂”是设计成在体内历经延长的时间缓慢释放治疗剂的制剂。持续释放制剂是本领域已知的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物作为药学上可接受的盐施用。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指通常用于制药工业的酸加成盐或金属络合物。金属络合物包括锌、铁等。用于制备药学上可接受的盐的适合的酸包括但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、酰化氨基酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、A-乙酰氨基苯甲酸、硼酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(LS)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、环己烷氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、L-谷氨酸、氧代-戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖醛酸、月桂酸、马来酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、高氯酸、磷酸、L-焦谷氨酸、糖二酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸、辛二酸、戊酸等。

用于制备药学上可接受的盐的适合的碱包括但不限于无机碱，例如氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化锌或氢氧化钠；和有机碱，例如伯、仲、叔和季、脂族和芳族胺，包括L-精氨酸、苯乙苄胺(benethamine)、苄星(benzathine)、胆碱、丹醇(deanol)、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二异丙胺、2-(二乙基氨基)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、异丙胺、N-甲基-葡糖胺、海巴明(hydrabamine)、1H-咪唑、L-赖氨酸、吗啉、4-(2-羟基乙基)-吗啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、吡咯烷、1-(2-羟基乙基)-吡咯烷、吡啶、奎宁环、喹啉、异喹啉、仲胺、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、N-甲基-D-葡糖胺、2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3-丙二醇、氨丁三醇等。

评估体内精子质量的方法是本领域已知的。

在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估适合的雌性个体怀孕的比率。

在某些实施方案中，精子质量的评估包括从个体获得精子和评估精子的受精能力。在某些实施方案中，精子质量的评估包括从个体获得精子并且评估精子使卵母细胞受精的能力，和/或由精子产生的胚胎的发育能力。在某些实施方案中，精子质量的评估包括从个体获得精子并且评估精子产生受精后适当时间完成分裂的合子的能力、精子产生在适当时间范围完成胚泡发育的2细胞胚胎的能力，以及精子产生启动孵化的胚泡的能力。在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估DNA完整性和/或DNA质量。在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估线粒体活性。在某些实施方案中，精子质量的评估包括评估精子运动性。

在某些实施方案中，该方法使精子的质量改善至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。

在某些实施方案中，该方法用于预防和/或治疗个体精子质量降低、治疗生育力降低的个体或治疗个体以改善精子质量。在某些实施方案中，该方法用于预防或治疗如本文所述的病症或状态。

本发明的某些实施方案提供了通过如本文所述的将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物而产生的分离的精子。

在某些实施方案中，分离的精子是在体外暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子。在体外将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物的方法如本文所述。这样处理的精子可以例如用于辅助生殖技术。精子可以例如直接使用，或进行进一步的处理、分离或富集。

在某些实施方案中，分离的精子是从体内暴露于BGP-15和/或其衍生物的个体中分离的精子。在某些实施方案中，分离的精子是从暴露于BGP-15和/或其衍生物的个体中分离的精子。将精子在体内暴露于BGP-15和/或其衍生物的方法如本文所述。精子可以例如直接使用，或进行进一步的处理、分离或富集。

在某些实施方案中，如此处理的精子(暴露于体外和/或体内)用于产生具有改善的发育能力的胚胎。

在某些实施方案中，分离的精子用于辅助生殖方法中。辅助生殖技术如本文所述。在某些实施方案中，如此分离的精子用于产生具有改善的发育能力的胚胎。

本公开的某些实施方案提供了辅助生殖的方法，包括使用如本文所述的具有改善的质量的精子。

本公开的某些实施方案提供了辅助生殖的方法，包括使用如本文所述的分离的精子。

本公开的某些实施方案提供了使用如本文所述的方法治疗个体以改善精子质量的方法。

本公开的某些实施方案提供了使用如本文所述的方法治疗个体中精子质量降低的方法。

本公开的某些实施方案提供了BGP-15和/或其衍生物用于改善精子质量的用途。

在某些实施方案中，以1μM至100μM、2μM至100μM、5μM至100μM、10μM至100μM、20μM至100μM、50μM至100μM、1μM至50μM、2μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至50μM、1μM至20μM、2μM至20μM、5μM至20μM、5μM至10μM、1μM至5μM、2μM至5μM或1μM至2μM的浓度范围将BGP-15和/或其衍生物用于组合物中。其它浓度范围是可以预期的。

在某些实施方案中，组合物是精子制备介质。精子制备培养基是本领域已知的，并且是可商购获得的。例如，精子制备培养基可用于收集精液、洗涤精子和/或分离精子。

在某些实施方案中，组合物是体外受精介质。IVF培养基是本领域已知的，并且是可商购获得的。

在某些实施方案中，组合物是精子冷冻或低温保存介质。精子冷冻或低温保存培养基是本领域已知的，并且是可商购获得的。

本公开的某些实施方案提供了精子制备介质，该介质包含BGP-15和/或其衍生物。BGP-15和衍生物如本文所述。

在某些实施方案中，所述精子制备介质包含浓度范围为1μM至100μM、2μM至100μM、5μM至100μM、10μM至100μM、20μM至100μM、50μM至100μM、1μM至50μM、2μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至50μM、1μM至20μM、2μM至20μM、5μM至20μM、5μM至10μM、1μM至5μM、2μM至5μM或1μM至2μM的BGP-15和/或其衍生物。其它范围是可预期的。

本公开的某些实施方案提供了制备精子的方法，该方法包括将精子暴露于如本文所述的精子制备介质。精子制备方法是本领域已知的。

本发明的某些实施方案提供了用于精子的体外受精介质，该介质包含BGP-15和/或其衍生物。BGP-15和衍生物如本文所述。

在某些实施方案中，体外受精介质包含浓度范围为1μM至100μM、2μM至100μM、5μM至100μM、10μM至100μM、20μM至100μM、50μM至100μM、1μM至50μM、2μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至50μM、1μM至20μM、2μM至20μM、5μM至20μM、5μM至10μM、1μM至5μM、2μM至5μM或1μM至2μM的BGP-15和/或其衍生物。其它范围是可以预期的。

IVF培养基是本领域已知的，并且通常包含以下组分：氯化钙；硫酸庆大霉素；葡萄糖；人(或动物)白蛋白溶液；硫酸镁；氯化钾；碳酸氢钠；氯化钠；磷酸钠；丙酮酸钠；和合成血清替代品。

本公开的某些实施方案提供了体外受精的方法，该方法包括将精子暴露于本文所述的体外受精介质。体外受精的方法是本领域已知的。

本发明的某些实施方案提供了精子冷冻或低温保存介质，该介质包含BGP-15和/或其衍生物。BGP-15和衍生物如本文所述。

在某些实施方案中，精子冷冻或低温保存介质包含浓度范围为1μM至100μM、2μM至100μM、5μM至100μM、10μM至100μM、20μM至100μM、50μM至100μM、1μM至50μM、2μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至50μM、1μM至20μM、2μM至20μM、5μM至20μM、5μM至10μM、1μM至5μM、2μM至5μM或1μM至2μM的BGP-15和/或其衍生物。其它范围是可预期的。

本公开的某些实施方案提供了冷冻精子的方法，该方法包括将精子暴露于如在此描述的精子冷冻或低温保存介质。冷冻或低温保存精子的方法是本领域已知的。

本公开的某些实施方案提供了冷冻精子的方法，该方法包括在冷冻精子之前、期间和/或之后的一个或多个时间将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物。BGP-15和衍生物如本文所述。

本公开的某些实施方案提供了含有BGP-15和/或其衍生物的药物或药物组合物。所述药物或药物组合物可以用于如本文所述的治疗个体的方法中。

本公开的某些实施方案提供了用于改善精子质量的药物组合物，该组合物包含有效量的BGP-15和/或其衍生物。BGP-15和衍生物如本文所述。

在某些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或适合的赋形剂。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物存在于药物组合物中，以便在血液或血浆中提供浓度范围为0.1μM至30μM、0.5μM至30μM、1μM至30μM、5μM至30μM、10μM至30μM、20μM至30μM、0.1μM至20μM、0.5μM至20μM、1μM至20μM、5μM至20μM、10μM至20μM、0.1μM至10μM、0.5μM至10μM、1μM至10μM、5μM至10μM、0.1μM至5μM、0.5μM至5μM、1μM至5μM或0.1μM至0.5μM的BGP-15和/或其衍生物。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物存在于药物组合物中，以便提供以下选择范围之一的量的BGP-15和/或其衍生物，用于施用于个体：1μg/kg至1000mg/kg、1μg/kg至100mg/kg；1μg/kg至10mg/kg；1μg/kg至1mg/kg；1μg/kg至100μg/kg；1μg/kg至10μg/kg；10μg/kg至1000mg/kg，10μg/kg至100mg/kg；10μg/kg至10mg/kg；10μg/kg至1mg/kg；10μg/kg至100μg/kg；10μg/kg至1000mg/kg、100μg/kg至100mg/kg；100μg/kg至10mg/kg；100μg/kg至1mg/kg；1mg/kg至1000mg/kg，1mg/kg至100mg/kg；1mg/kg至10mg/kg；10mg/kg至1000mg/kg；10mg/kg至100mg/kg；和100mg/kg至1000mg/kg体重。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物存在于药物组合物中，以便提供以下选择范围之一的量的BGP-15和/或其衍生物，用于施用于个体：0.1mg/kg至10mg/kg、0.5mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至10mg/kg。0.1mg/kg至5mg/kg、0.5mg/kg至5mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、0.1mg/kg至1mg/kg或0.5mg/kg至1mg/kg。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物存在于药物组合物中，以便提供以下选择范围之一的量的BGP-15和/或其衍生物，用于施用于个体：1μg/kg/天至1000mg/kg/天，1μg/kg/天至100mg/kg/天；1μg/kg/天至10mg/kg/天；1μg/kg/天至1mg/kg/天；1μg/kg/天至100μg/kg/天；1μg/kg/天至10μg/kg/天；10μg/kg/天至1000mg/kg/天，10μg/kg/天至100mg/kg/天；10μg/kg/天至10mg/kg/天；10μg/kg/天至1mg/kg/天；10μg/kg/天至100μg/kg/天；10μg/kg/天至1000mg/kg/天，100μg/kg/天至100mg/kg/天；100μg/kg/天至10mg/kg/天；100μg/kg/天至1mg/kg/天；1mg/kg/天至1000mg/kg/天，1mg/kg/天至100mg/kg/天；1mg/kg/天至10mg/kg/天；10mg/kg/天至1000mg/kg/天；10mg/kg/天至100mg/kg/天；和100mg/kg/天至1000mg/kg/天体重。其它范围是可预期的。

在某些实施例中，BGP-15和/或其衍生物存在于药物组合物中，以便提供以下选择范围之一的量的BGP-15和/或其衍生物，用于施用于个体：0.1mg/kg/天至10mg/kg/天、0.5mg/kg/天至10mg/kg/天、1mg/kg/天至10mg/kg/天、5mg/kg/天至10mg/kg/天、0.1mg/kg/天至5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、1mg/kg/天至5mg/kg/天、0.1mg/kg/天至1mg/kg/天、或0.5mg/kg/天至1mg/kg/天。其它范围是可预期的。

在某些实施方案中，药物组合物适合于通过静脉内施用、气管内施用、通过雾化施用、通过气雾化施用、通过滴注到肺中、通过口服施用、通过非肠道施用、通过植入物、通过皮下注射、关节内、直肠、鼻内、眼内、阴道或经皮中的一种或多种递送至个体。其它给药途径是可预期的。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物与适于将药物组合物施用于个体的药学上可接受的载体一起提供。载体可以基于多种考虑来选择，包括施用途径、递送的活性剂和活性剂递送的时程。术语“药学上可接受的载体”是指基本上惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、赋形剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。药学上可接受的载体的实例是生理盐水。其它生理学上可接受的载体及其制剂是本领域已知的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；清洁剂，例如TWEEN 80；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒的相容润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物与药学上可接受的赋形剂一起提供。

例如，用于片剂形式的适合赋形剂包括具有如下片芯和薄膜包衣的片剂：片芯-玉米淀粉、预胶化淀粉、淀粉羟乙酸钠、聚维酮、二山嵛酸甘油酯、硬脂酸镁；薄膜衣-羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、滑石、二氧化钛(E171)、氧化铁黄(E172)、氧化铁红(E172)、乙基纤维素。其它赋形剂是预期的。

例如，含有BGP-15和/或其衍生物的片剂可以包含一定量的作为水合物的活性剂，和含有玉米淀粉、预胶化淀粉、淀粉羟乙酸钠、聚维酮、二山

酸甘油酯和硬脂酸镁的片芯，和含有羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、滑石、二氧化钛(E171)、氧化铁黄(E172)、氧化铁红(E172)和乙基纤维素的薄膜衣。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物可以药学上可接受的盐的形式施用，或存在于药物组合物中。

在某些实施例中，BGP-15和/或其衍生物可以药学上可接受的水合物形式施用，或存在于药物组合物中。水合物是含有母体化合物(例如，药物或赋形剂的无水物)和水的固体加合物。

在某些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含其它治疗剂和/或增强、稳定或维持活性物质活性的活性剂。

本文所述的口服制剂可以包括任何常规使用的口服形式，包括片剂、胶囊剂、口含形式、锭剂、糖锭剂和口服液体、混悬液或溶液。胶囊剂可以含有活性化合物与惰性填充剂和/或稀释剂的混合物，所述惰性填充剂和/或稀释剂例如药学上可接受的淀粉(例如玉米、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人工甜味剂、粉状纤维素例如结晶和微晶纤维素、面粉、明胶、树胶等。可用的片剂制剂可以通过常规的压制、湿法制粒或干法制粒方法制备，并利用药学上可接受的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、助悬剂或稳定剂，包括硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、十二烷基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、海藻酸、阿拉伯胶、黄原胶、柠檬酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露醇、氯化钠、滑石、干淀粉和糖粉。表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、鲸蜡硬脂醇、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、胶态二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。口服制剂可以利用标准延迟或时间释放制剂来改变肽的吸收。口服制剂还可以包括施用在水或果汁中的活性成分，根据需要含有适当的增溶剂或乳化剂。口服制剂是本领域已知的，并且可以由技术人员配制。

在某些实施方案中，可能需要将药物组合物以气雾剂的形式直接施用至气道。用于气雾剂形式施用的制剂是本领域已知的，并且可以由技术人员配制。

在某些实施方案中，组合物还可以非肠道(例如直接进入关节间隙)或腹膜内施用。例如，非离子化形式或作为药理学上可接受的盐的活性剂的溶液或混悬液可以在适当地混合有表面活性剂如羟丙基纤维素的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂通常含有防腐剂以防止微生物的生长。非肠道制剂是本领域已知的，并且可以由技术人员配制。

在某些实施方案中，组合物也可通过注射施用。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、等渗盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适合的混合物和植物油。可注射制剂是本领域已知的，并且可以由技术人员配制。

在某些实施方案中，药物组合物也可静脉内施用。适于静脉内施用的组合物是本领域已知的，并且可以由技术人员配制。例如，等渗盐水可用于含有拮抗剂的静脉内组合物。

在某些实施方案中，药物组合物也可经皮施用。经皮施用理解为包括所有穿过身体表面和身体通道的内层(包括上皮和粘膜组织)的施用。这样的施用可以使用本文所述的活性剂或其药学上可接受的盐以洗剂、乳膏剂、泡沫剂、贴剂、混悬剂、溶液剂和栓剂(直肠和阴道)进行。

经皮施用还可以通过使用经皮贴剂来完成，所述经皮贴剂包含活性化合物和对活性化合物惰性、对皮肤无毒，并且允许将用于全身吸收的活性剂通过皮肤递送到血流中的载体。载体可以采用任何形式，例如乳膏剂和软膏剂、糊剂、凝胶剂和闭合装置。乳膏剂和软膏剂可以是水包油或油包水型的粘性液体或半固体乳液。由分散在石油或亲水性石油中的含有活性成分的吸收性粉末组成的糊剂也可以是适合的。可以使用多种封闭装置将活性成分释放到血流中，例如覆盖含有活性成分的储库的半透膜，该储库含有或不含有载体，或者含有活性成分的基质。经皮制剂是本领域已知的，并且可以由技术人员配制。

在某些实施方案中，药物组合物还可以通过栓剂的方式施用。栓剂制剂可以由传统材料制成，包括可可脂，加入或不加入蜡以改变栓剂的熔点，以及甘油。也可使用水溶性栓剂基质，例如多种分子量的聚乙二醇。栓剂制剂是本领域已知的，并且可以由技术人员配制。

另外的多种赋形剂、剂型、分散剂等，其适合与施用和/或配制成药物或药物组合物结合使用。制剂是已知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版。Mack Publishing Company，Easton，PA.,1985，其全部内容通过引用并入本文。

本公开的某些实施方案提供了通过给个体施用如本文所述的药物组合物来治疗个体的方法。

本公开的某些实施方案提供了治疗个体以改善精子质量的方法，该方法包括给个体施用如本文所述的药物组合物。

本公开的某些实施方案提供了治疗个体中精子质量降低的方法，该方法包括给个体施用如本文所述的药物组合物。

本公开的某些实施方案提供了通过使用暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子来改善胚胎发育能力的方法。BGP-15和衍生物如本文所述。

本公开的某些实施方案提供了改善通过对卵母细胞受精产生的胚胎的发育能力的方法，该方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，从而改善胚胎的发育能力。BGP-15和衍生物如本文所述。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物包括BGP-15、普萘洛尔、氯吡哌醇、阿莫氯醇、NG-94、iroxanadine中的一种或多种，和/或上述任何物质的药学上可接受的衍生物、前药、溶剂化物、盐、互变异构体、立体异构体或外消旋体。

在某些实施方案中，BGP-15和/或其衍生物包括BGP-15。

如本文所用的术语“发育能力”包括以下一种或多种：(i)卵母细胞产生胚胎的能力和/或可能性(例如，在卵母细胞受精时或通过其它机制，例如单性生殖活化)；(ii)卵母细胞在胚胎形成时通过胚泡发育进展的能力、可能性和比率中的一种或多种；和(iii)在从卵母细胞产生胚胎时获得的胚胎质量(例如，通过形态和/或生物化学评估确定)。

用于确定发育能力的方法是本领域已知的。

例如，由暴露于精子的卵母细胞产生的胚胎通过胚泡发育而进展的能力可以得到改善和/或具有以下一种或多种：通过胚泡发育而进展的能力增加、受精率增加、通过胚泡发育而进展的可能性增加、形成2细胞胚胎率增加、形成4细胞胚胎率增加、形成胚泡率增加、通过胚泡发育进展率增加和胚泡孵化率增加。

在某些实施方案中，该方法包括将卵母细胞体外暴露于精子。在某些实施方案中，该方法包括将卵母细胞在体内暴露于精子。

精子和精子供体如本文所述。

本发明的某些实施方案提供了使用暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子来辅助生殖的方法。BGP-15和衍生物如本文所述。

本公开的某些实施方案提供了使用精子辅助生殖的方法，该方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，并且将暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子用于辅助生殖的方法中。BGP-15和衍生物如本文所述。

辅助生殖技术如本文所述。

在某些实施方案中，辅助生殖技术包括体外受精。在某些实施方案中，辅助生殖技术包括人工授精。

在某些实施方案中，精子来自衰老供体或年老供体。在某些实施方案中，精子来自年龄大于40岁的供体。在某些实施方案中，精子来自年龄大于45岁的供体。在某些实施方案中，精子来自肥胖或超重供体。在某些实施方案中，精子来自吸烟或吸过烟的供体个体。

在某些实施方案中，精子来自生育力降低的个体。在某些实施方案中，精子来自患有或易患与生育力降低相关的疾病、病症或状态的个体。

在某些实施方案中，精子在体外暴露于BGP-15和/或其衍生物。精子在体外暴露于BGP-15和/或其衍生物的方法如本文所述。

在某些实施方案中，精子在体内暴露于BGP-15和/或其衍生物。通过将BGP-15和/或其衍生物施用于个体使精子在体内暴露于BGP-15和/或其衍生物的方法如本文所述。

在某些实施方案中，该方法是人的辅助生殖技术。

在某些实施方案中，该方法是动物的辅助生殖。

本公开的某些实施方案提供了通过如本文所述的辅助生殖技术产生的分离的胚胎。在某些实施方案中，分离的胚胎是动物胚胎。

本公开的某些实施方案提供了使用如本文所述的辅助生殖技术生育的动物。

本公开的某些实施方案提供了人工授精的方法，该方法包括：

将精子体外暴露于BGP-15和/或其衍生物；以及

用暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子人工授精个体。

从暴露于BGP-15和/或其衍生物的个体中获得精子；以及

用所述精子人工授精个体。

将精子体外暴露于BGP-15和/或其衍生物；以及

用暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子使卵母细胞受精。

从暴露于BGP-15和/或其衍生物的个体中获得精子；以及

用所述精子使卵母细胞受精。

IVF涉及卵母细胞的体外受精，其中卵母细胞从个体分离，并且通常在液体培养基中与精子一起温育以允许卵母细胞受精。预期卵母细胞被精子受精一般在卵母细胞收集步骤后超过24小时，但通常不晚于60小时发生，以便卵母细胞处于足够的成熟阶段以使IVF程序中后续步骤的成功最大化。

本公开的某些实施方案提供了用于实施本文所述方法的试剂盒或产品。

试剂盒或产品可以含有一种或多种如本文所述的试剂和/或组分，和/或用于进行如本文所述的方法的说明书。

在某些实施方案中，试剂盒或产品用于改善精子质量。

本公开的某些实施方案提供了用于改善精子质量的试剂盒或产品，该试剂盒或产品包含用于暴露于精子的BGP-15和/或其衍生物。BGP-15和衍生物如本文所述。

例如，试剂盒或产品可以包含适合形式的BGP-15和/或其衍生物和用于结合以处理精子的精子制备介质(或其组分)。

在某些实施方案中，试剂盒或产品用于辅助生殖技术。

本公开的某些实施方案提供了用于辅助生殖技术的试剂盒或产品，该试剂盒或产品包含用于暴露于精子的BGP-15和/或其衍生物。BGP-15和衍生物如本文所述。

本公开的某些实施方案提供了组合产品。

本公开的某些实施方案提供了组合产品，其包含：

(i)精子制备介质；

(ii)BGP-15和/或其衍生物；以及

任选将精子暴露于精子制备介质中的BGP-15和/或其衍生物的说明书。

本公开的某些实施方案提供了组合产品，其包含：

(i)IVF介质；

(ii)BGP-15和/或其衍生物；以及

任选在IVF介质中的BGP-15和/或其衍生物的使用说明书。

本公开的某些实施方案提供了组合产品，其包含：

(i)精子冷冻介质；

(ii)BGP-15和/或其衍生物；以及

任选将精子暴露于精子冷冻介质中的BGP-15和/或其衍生物的说明书。

本公开的某些实施方案提供了用于筛选改善精子质量的活性剂的方法。

用于确定精子质量的方法如本文所述。

在某些实施方案中，该方法包括确定在体外衍生物改善精子质量的能力。将精子暴露于活性剂的方法如本文所述。

在某些实施方案中，该方法包括使用动物精子来评估衍生物改善精子质量的能力。

在某些实施方案中，该方法包括使用人精子来评估衍生物改善精子质量的能力。

在某些实施方案中，该方法包括确定衍生物在体内改善精子质量的能力。用于将个体中的精子暴露于活性剂的方法如本文所述。

在某些实施方案中，该方法包括使用动物个体或动物模型来评估衍生物在体内改善精子质量的能力。

在某些实施方案中，该衍生物包括普萘洛尔、氯吡哌醇、阿莫氯醇、NG-94或iroxanadine之一的衍生物。

在某些实施方案中，该衍生物包括取代的衍生物。

在某些实施方案中，该衍生物包含改变的官能团。

通过以下实施例进一步描述本公开。应当理解，以下描述仅用于描述特别实施方案的目的，而不是要限制以上描述。

实施例1-在体外用BGP-15处理精子恢复了年老小鼠的精子功能

临床前研究检查体外BGP-15处理是否可以改善已经受衰老负面影响的精子的质量。从“年老”(>12月龄)或“年轻”(<6月龄)的C57BL6小鼠收集精子，用BGP-15(或载体)处理，用于受精年轻雌性小鼠的卵母细胞并且评估胚胎发育。

材料和方法：除非另有说明，否则化学品购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。在使用前，在MilliQ水中制备BGP-15(由N-Gene Research Laboratories友情提供)的储备浓度(1mM)。

所有试验程序都得到了University of Adelaide Animal Ethics Committee批准，并且根据Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals forScientific Purposes进行。C57BL/6小鼠获自University of Adelaide LaboratoryAnimal Services或the Animal Resources Centre(WA)，并且在14:10小时的明暗循环下饲养在动物设施中，随意获取食物和水。雄性小鼠是年轻的(<6月龄)或者年老的(>12月龄)并且具有证实的生育力。在收集精子前4至7天，将每只雄性小鼠与年轻的(6-8周龄)自然循环的雌性小鼠“时间交配”。通过颈椎脱位人道处死雄性小鼠，解剖两尾附睾以分离IVF用的精子。

为了产生IVF用的卵母细胞，将雌性小鼠(6-8周龄)激素诱导排卵，腹膜内(i.p.)注射每12g体重5IU(国际单位)的孕马血清促性腺激素(PMSG；National Charmone andPeptide Program，Torrance，CA，USA)，48小时后，注射每12g体重5IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG；Merck，Sharp and Dohme)，各自在0.1mL 0.9％盐水中。在hCG后15小时通过颈椎脱位人道处死雌性小鼠，并且COC从输卵管获得并且收集在HEPES-缓冲的α-最低必需介质(MEM)处理培养基(Life Technologies，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，所述培养基补充有1％胎牛血清(FCS)(Life Technologies，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，并且在使用前预温热至37℃。

将每只小鼠的一个尾附睾和输精管随机放入500μL含有或不含10μM BGP-15的温热(37℃)受精培养基中。然后将含有精液和精子的生精小管的内容物提取到培养基中，并且丢弃剩余的组织。将精子置于培养基中并且置于培养箱中，在37℃和6％CO₂、5％O₂、氮气平衡下获能1小时。获能后，将10μL含有精子的受精培养基加入到各90μL受精中(见下文)。

收集到α-MEM处理培养基中的排出的COC在新鲜的α-MEM处理培养基中洗涤，然后转移到温热(37℃)的Cook洗涤培养基(Cook Medical，Queensland，Australia)中，然后用精子受精。受精、洗涤和胚胎培养基分别是来自Cook Medical的Research VitroFertilisation、Research Vitro Wash和Research Vitro Cleave。将来自每个处理组的10μL获能精子(35,000个精子/mL)加入至90μL受精滴中，其含有洗涤的COC(每滴15-20个COC)，随后在37℃在6％CO₂、5％O2、氮平衡的气氛中共温育4小时。

然后收集假定合子并且转移到Cook裂解介质中。清除合子中的精子，精子仍附着在透明带上，并且在37℃，6％CO₂，5％O₂，氮平衡气氛中，浓度为20个胚胎/20μL，让合子生长5天。

在第2天，评估受精并且对胚胎进行第一次分裂评分。然后将2-细胞胚胎转移到20μL新鲜Cook分裂介质液滴中(每滴10-15个胚胎)，并且在37℃在5％CO₂、5％O₂、氮平衡的气氛中培养。培养胚胎直至第5天，此时评估胚泡形成和孵化状态。使用以下标准将胚胎形态分类为适当发育(“准时”)；第2天，胚胎处于2-细胞期，并且第5天，胚泡或孵化胚泡。在第2天，发育率被评估为满足准时发育标准的胚胎占卵母细胞的起始数的百分数；而在第5天发育被评估为满足准时发育标准的胚胎占2-细胞胚胎的百分数。

统计分析

在分析之前测试所有数据的分布正态性。所有测量结果都报告为平均值±SEM。统计学显著性通过Student’s i-检验，使用Windows版本的GraphPad Prism v008(GraphPadSoftware，La Jolla，CA，USA)进行确定。

数据如图1所示，其显示了体外BGP-15处理对恢复精子功能的作用。从“年轻”(6周龄)或“年老”(1年龄)的雄性小鼠附睾和输精管收集精子，并且在对照培养基(未处理)或含有10uM BGP-15的培养基中体外获能(成熟)1小时。随后将精子用于体外受精来自年轻雌性小鼠的卵母细胞，并且如下评估假定合子的发育：A)IVF后24小时完成分裂的假定合子的百分数；B)到第5天完成胚泡发育的2细胞胚胎的百分数；和C)开始孵化的胚泡百分数。N＝6-12只小鼠/处理组。分析是配对t-检验，比较每个年龄组内未处理的和BGP-15处理的，以及未配对t-检验，比较年轻的和年老的。

对于与IVF后24小时合子完全分裂的百分数相关的数据，用BGP-15处理后，来自年老供体的精子有大于70％的改善，产生完全分裂的胚胎。BGP-15也略微提高了来自年轻供体的精子的胚胎分裂率。

对于与到第5天2细胞胚胎与完全胚泡发育的百分数相关的数据，在用BGP-15处理后，来自年老供体的精子有大于70％的改善，产生完全胚泡发育的胚胎。BGP-15也略微增加了来自年轻供体的精子中胚胎胚泡发育率。

对于与开始孵化的胚泡百分数相关的数据，在用BGP-15处理后，来自年老供体的精子有大于50％的改善，产生开始孵化的胚胎。BGP-15也使来自年轻供体的精子的胚胎胚泡发育率提高了60％以上。

在使用来自年老小鼠的精子受孕的胚胎中，每个发育阶段都是受损的，然而每个发育参数通过在体外用BGP-15处理“年老”精子1小时而得到改善。

实施例2-BGP-15体内处理恢复了年老小鼠的精子功能

试验检验了体内BGP-15处理是否可以改善已经受衰老负面影响的精子的质量。用BGP-15(或载体)处理“年老”(>12月龄)或“年轻”(<6月龄)的C57BL6雄性小鼠，然后收集精子，受精年轻雌性小鼠的卵母细胞并且评估胚胎发育。

材料和方法

除非另有说明，否则化学品购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。在使用前，在MilliQ水中制备BGP-15(由NT-Gene Research Laboratories友情提供)的储备浓度(1mM)。

所有试验程序都得到了University of Adelaide Animal Ethics Committee批准，并且根据Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals forScientific Purposes进行。C57BL/6小鼠获自University of Adelaide LaboratoryAnimal Services或the Animal Resources Centre(WA)，并且在14:10小时的明暗循环下饲养在动物设施中，随意获取食物和水。

雄性小鼠是年轻的(<6月龄)或者年老的(>12月龄)并且具有证实的生育力。在收集精子前4至7天，将每只雄性小鼠与年轻的(6-8周龄)自然循环的雌性小鼠“时间交配”。通过颈椎脱位人道处死雄性小鼠，解剖两尾附睾以分离IVF用的精子。

对于体内BGP-15处理试验，雄性时间交配，然后在收集精子前接受IP注射在0.9％NaCl溶液中的15mg/Kg体重的BGP-15，4天。然后收集精子并且获能以用于如先前所述(上文)的体外受精。

将收集到α-MEM处理培养基中的排出的COC在新鲜的α-MEM处理培养基中洗涤，然后在用精子受精前转移到温热(37℃)的Cook洗涤培养基(Cook Medical，Queensland，Australia)中。受精、洗涤和胚胎培养基分别是来自Cook Medical(Queensland,Australia)的Research Vitro Fertilisation、Research Vitro Wash和Research VitroCleave。将来自每个处理组的10μL获能精子(35,000个精子/mL)加入至90μL受精滴中，其含有洗涤的COC(每滴15-20个COC)，随后在37℃在6％CO₂、5％O2、氮平衡的气氛中共温育4小时。

数据如图2所示，其显示了BGP-15体内处理对恢复精子功能的作用。“年轻”(～6周龄)或“年老”(～1岁)的雄性小鼠是“未处理的”或用BGP-15(15mg/kg)每日一次腹膜内处理4天。最后一次注射后约12小时，从附睾和输精管收集精子并且用于体外受精来自年轻雌性小鼠的卵母细胞，并且评估假定合子的发育：A)IVF后24小时完成裂解的假定合子的百分数；B)到第5天完成胚泡发育的2细胞胚胎的百分数；和C)开始孵化的胚泡的百分数。N＝1只小鼠/处理组。

对于与IVF后24小时合子完全分裂的百分数相关的数据，与未处理的年老雄性相比，用BGP-15处理后，年老供体的精子产生完全裂分裂的胚胎有大于500％的改善。与未处理的雄性相比，BGP-15也使来自年轻处理供体的精子的分裂率增加30％。

对于与到第5天2细胞胚胎完全胚泡发育的百分数相关的数据，与未接受处理的年老供体相比，在用BGP-15处理后，来自年老供体的精子有了很大的改善，产生完全胚泡发育的胚胎。

对于与开始孵化的胚泡百分数相关的数据，在用BGP-15处理后，来自雄性的精子产生孵化胚泡的能力有了很大的改善。BGP-15也使来自年轻供体的精子中胚泡发育至孵化比未处理的年轻供体的精子提高100％以上。

在使用来自年老小鼠的精子受孕的胚胎中，每个发育阶段都是受损的，然而每个发育参数通过用BGP-15处理“年老”小鼠而得到改善。

实施例3-年老小鼠妊娠更少，后代更小，新生仔死亡率更高

使雄性小鼠与自然循环的雌性(1:1比率)交配以评估它们的生育力状态。在配对后16-18小时检查雌性是否存在阴道交配塞，这表明成功交配。然后将雌性与雄性分开，并且保持约3周以检查妊娠迹象或幼仔的出现。将雄性小鼠分类为可育的(当它们在确认交配后产生妊娠)或低生育力的(当它们在确认交配后不产生妊娠)。选择由可育雄性产生的妊娠用于进一步研究后代表型。为了分析胎儿发育，在胚胎期(E)18.5天通过颈椎脱位人道杀死怀孕的雌性，并且收集胎儿。记录存活胎儿的数目和它们在子宫角中的位置。从胚外组织分离胎儿，并且在37℃在温热磷酸盐盐水缓冲液(PBS)中洗涤，然后测量并且称重。还将它们的胎盘分离、洗涤并且称重。为了分析新生仔发育，允许一些怀孕雌性分娩。在出生后第1天(PND)记录一窝产仔数和存活的新生幼仔的数量，并且测量和称重。记录存活幼仔的数量直到在PND21-24断奶。

图3中提供的结果显示，年老的雄性小鼠与年轻的雄性小鼠相比妊娠减少约15％(图3B)，尽管它们具有相似的成功交配率(图3A)。

图4显示了年老小鼠具有更小的后代和更高的新生仔死亡率。

在年老小鼠的妊娠中，胎儿在E18.5轻0.14g(10％)(图4A)，胎盘在E18.5轻0.01g(10％)(图4B)。在由年老小鼠繁殖的幼仔中，新生幼仔轻0.6g(图4C)，并且断奶前的幼仔死亡率增加14％(图4D)。

这些研究表明，年老雄性小鼠的表型模拟年老的男性的表型，即它们具有差的生育力和差的新生儿结果。

实施例4-BGP-15体外处理未改变精子计数、存活或形态，但改善了年老雄性精子的运动性

在生育力评估(如实施例3的方法中所述)后，选择能育的年轻雄性(年轻对照)和低生育力的年老雄性进行本研究。

在收集雄性小鼠的精液用于精子分析和体外产生胚胎之前，将它们交配4-7天。通过颈椎脱位人道地杀死小鼠，并且收集附睾尾和输精管。将每对之一随机置于含有或不含10μM BGP-15的COOK研究体外受精培养基K-RVFE-50(COOK Medical，QLD，Australia)中。然后将含有精液和精子的生殖道内容物提取到培养基中，并且弃去组织。使精子在37℃/6％CO₂/5％O₂下获能1小时。

精子计数、存活、形态和运动性按照世界卫生组织(WHO)的指导(每个样品计数100个精子)进行。精子计数通过在血细胞计数器(Neubauer Brightline，LivingstoneInternational，NSW，Australia)上计数来确定。使用光学显微镜，在用曙红1:1染色的样品上，对处理组盲法评估精子存活，将每组100个精子分类为存活的(未染色的)或未存活的(染色的)。存活表示为存活精子的百分数。在光学显微镜下评价精子的运动性，将每组100个精子分类为前进运动、非前进运动或不运动。然后将运动性表示为总运动性百分数(前进和非前进运动精子)或前进运动性百分数(仅前进运动精子)。为了评估精子形态，将每组100个精子分类为正常或异常(尾部或头部缺陷)。形态表示为形态正常精子的百分数。对于每个分析，使用光学显微镜对所有样品进行盲法评估。

我们接着研究了年老小鼠的雄性精子参数是否可以通过IVF之前或年老雄性小鼠受孕之前应用BGP-15的精子处理来改善。研究方案如图5所示。

结果示于图6，分析显示年老雄性具有显著更低的精子计数，但存活和形态正常精子的比例相似。此外，它们的运动性也显著降低。尽管体外BGP-15处理不改变精子计数、存活或形态，但处理使年老雄性精子的运动性(总运动性和前进运动性)改善了10％。

实施例5-体外BGP-15处理增加精子线粒体膜电位(MMP)

精子运动性与线粒体功能有关，因此使用活细胞荧光测定法检测精子线粒体膜电位(MMP)，以通过FACS使用JC-1电位计染料((E)-5,6-二氯-2-[3-(5,6-二氯-1,3-二乙基-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-亚基)-1-丙烯基]-1,3-二乙基-1H-苯并咪唑

碘化物，47729-63-5；ThermoFisher Scientific，MA，USA)，根据制造商的说明书鉴定和定量具有低MMP和高MMP的个体存活细胞。简言之，在37℃，在受精培养基中用5uM JC-1工作溶液培养约一百万个细胞15分钟。然后洗涤细胞并且通过流式细胞术分析。对于所有样品，基于光散射测量门控精子群。使用碘化丙锭(PI)活/死染色剂(Sigma-Aldrich，MI，USA)，一种仅穿透死细胞的荧光染料，检测存活精子级分。通过PE-Cy7进行红色荧光(～617nm)的PI染色细胞的流式细胞术获取；而JC-1染色细胞的获得是通过FITC对绿色(～525nm)和PE对红色/橙色荧光(～590)进行的。对于每个试验，检查至少10,000个细胞。所有试验都在FACSCANTO II流式细胞术系统(BD Biosciences，NSW，Australia)上进行。

接下来，我们试图比较来自年轻和年老小鼠的精子中的线粒体膜电位，因为MMP已被定义为精子运动性的调节剂，并且与啮齿动物和人的精子质量和受精电位有关。

结果示于图7。使用JC-1MMP染料染色精子细胞的实例，其中高MMP为红色(图7A)。显示具有低MMP的绿色和具有高MMP的蓝色的精子群的流式细胞术分析的实例如图7B所示。我们定量了大量雄性中的蓝色部分(图7C)，并且发现即使雄性组间MMP水平没有差异，但处理后来自年老雄性的精子中MMP水平显著增加，表明其运动性增加至少部分由更高的MMP解释。

实施例6-更少的年老雄性精子与透明带结合

为了评价精子结合透明带和使卵母细胞受精的能力，在腹膜内注射PMSG超数排卵后15小时，从6周龄的雌性C57BL小鼠中收集成熟的卵丘卵母细胞复合物(COC)，然后48小时后用hCG。在37℃/6％CO₂/5％O₂，将COC(N＝10/试验雄性)置于80μL滴COOK研究体外受精培养基K-RVFE-50(COOK Medical，QLD，Australia)中。用等分的获能精子样品对卵母细胞进行授精，用BGP-15处理或不处理，并且配子共温育4小时。此时，通过在双苯酰亚胺DNA染色剂(25μg/mL)中温育5分钟，然后在紫外光下成像，来评估精子与卵母细胞透明带的结合。通过计数精子核来评估结合到透明带的精子的数量。

我们接着使用双苯酰亚胺核染色研究了来自年老雄性的精子与来自年轻雌性的MII卵母细胞的透明带结合的能力，如这些实施例中所示。结果示于图8中。

我们发现，在年老雄性中透明带结合能力显著降低，但在用BGP-15处理后它也增加。

实施例7-BGP-15恢复了年老雄性的胚胎发育

为了收集卵母细胞用于体外产生胚胎，雌性小鼠经历激素诱导的卵巢过度刺激。简言之，动物接受腹膜内(IP)注射无菌0.9％盐水中的孕马血清促性腺激素(PMSG；National Charmone and Peptide Program，Torrence，USA)，剂量为5IU/12g体重；48小时后，第二次IP注射在0.9％无菌盐水中的人慢性促性腺激素(hCG；Pregnyl，Merck Sharp&Dohme Pty Ltd，Australia)，剂量为5IU/12g体重。然后在hCG注射后14小时通过颈椎脱位人道地杀死小鼠，并且从输卵管收集排出的卵丘-卵母细胞复合物(COC)，并且用于通过体外受精产生胚胎。简言之，COC在研究用体外洗涤介质(COOK Medical,QLD,Australia)中洗涤两次，然后置于研究用体外受精介质(COOK Medical)中，精子浓度为1:10(10μL:100μL)。先前从附睾和输精管收集精子样品，并且在研究用体外受精介质中37℃、6％CO₂、5％O₂中获能1小时。4小时后，收集假定合子，洗涤并且置于研究用体外分裂培养基(10个合子/20μL液滴；COOK Medical)中，在37℃，6％CO₂、5％O₂中体外胚胎培养至胚泡阶段。通过使用Primovision Time-Slessing系统(Vitrolife Pty Ltd，Boteborg，Sweden)的实时成像记录合子，用于详细分析它们的发育阶段，包括细胞分裂之间的时间间隔和不良事件的频率(不均匀的细胞分裂、多核的存在、囊胚腔破坏)。在整个分析中，来自每个雄性个体的胚胎保持分离。

我们已经证明，年老雄性的精子表现出低质量的标记，但是通过体外BGP-15处理改善了运动性、线粒体活性和透明带结合能力。在评估雄性生育力的同时，对一组年轻雌性进行激素刺激并且收集它们的卵丘-卵母细胞复合体。这些COC用所有处理组的精子授精。

在受精培养基中温育4小时后，评估假定合子的原核存在，并且在体外培养5天。在此期间使用延时成像技术记录胚胎发育。在IVF后第2天和第5天分别对2细胞和胚泡期的发育进行评价。

结果示于图9。年老雄性小鼠具有破坏的植入前胚胎发育，其特征在于在受精胚胎中第一次分裂的延迟时间和在扩张期间和孵化之前更高频率胚泡破坏。

实施例8-BGP-15恢复了年老雄性的胚胎发育

为了收集卵母细胞用于体外产生胚胎，雌性小鼠经历激素诱导的卵巢过度刺激。简言之，动物接受腹膜内(IP)注射无菌0.9％盐水中的孕马血清促性腺激素(PMSG；National Charmone and Peptide Program，Torrence，USA)，剂量为5IU/12g体重；48小时后，第二次IP注射在0.9％无菌盐水中的人慢性促性腺激素(hCG；Pregnyl，Merck Sharp&Dohme Pty Ltd，Australia)，剂量为5IU/12g体重。然后在hCG注射后14小时通过颈椎脱位人道地杀死小鼠，从输卵管收集排出的卵丘-卵母细胞复合物(COC)，并且用于通过体外受精产生胚胎。简言之，COC在研究用体外洗涤介质(COOK Medical，QLD，Australia)中洗涤两次，然后置于研究用体外受精介质(COOK Medical)中，精子浓度为1:10(10μL:100μL)。先前从附睾和输精管收集精子样品，并且在研究用体外受精介质中37℃、6％CO₂、5％O₂中获能1小时。4小时后，收集假定合子，洗涤并且置于研究用体外分裂介质(10个合子/20μL液滴；COOK Medical)中，在37℃，6％CO₂、5％O₂中体外胚胎培养至胚泡阶段。通过评估胚胎在第2天(第一次分裂)和第5天(胚泡形成和孵化状态)的发育阶段来分析胚胎的准时发育。在整个分析中，来自每个雄性个体的胚胎保持分离。

IVF和体外培养后，对于年老的父亲，第2天的2-细胞胚胎和第5天的胚泡胚胎的百分数降低。结果示于图10中。

在获能期间用BGP-15处理精子后，对于年老的父亲，第2天的2-细胞胚胎和第5天的胚泡和孵化胚泡胚胎的百分数改善。

实施例9-体内BGP-15改善年老雄性精子的形态和MMP

体外处理改善了精子质量和胚胎发育，因此接下来我们测试了当体内使用时它是否会改善精子质量和发育能力。

我们接着设计了类似的试验方法，其中在IVF前，我们用BGP-15每天处理未能产生妊娠的年老雄性中的一些4天。该方法在图11中示出。

在生育力评估(如实施例3中的方法所述)后，选择能育的年轻雄性(年轻对照)和低生育力的年老雄性进行本研究。

在雄性小鼠用作精液分析和体外产生胚胎的精子供体之前5-7天将它们交配。一半的年老雄性在收集精液前每天腹膜内注射15mg/Kg的BGP-15，4天。通过颈椎脱位人道地杀死小鼠，并且收集两个附睾尾和输精管，并且将它们置于COOK研究体外受精介质K-RVFE-50(COOK Medical，QLD，Australia)中。然后在培养基中提取含有精液和精子的生殖道内容物，并且除去组织。使精子在37℃/6％CO₂/5％O₂下获能1小时。

精子计数、存活、形态和运动性按照世界卫生组织(WHO)的指导(每个样品计数100个精子)进行。精子计数通过在血细胞计数器(Neubauer Brightline，LivingstoneInternational，NSW，Australia)上计数来确定。在光学显微镜下，用曙红1:1染色的盲试样品上评估精子存活，将每组100个精子分类为存活的或未存活的。存活表示为存活精子的百分数。在光学显微镜下评价精子的运动性，将每组100个精子分类为前进运动、非前进运动或不运动。然后将运动性表示为总运动性百分数(前进和非前进运动精子)或前进运动性百分数(仅前进运动精子)。为了评估精子形态，将每组100个精子分类为正常或异常(尾部或头部缺陷)。形态表示为形态正常精子的百分数。对于每个分析，所有样品在光学显微镜下对处理组盲测。

为了收集卵母细胞用于体外产生胚胎，雌性小鼠经历激素诱导的卵巢过度刺激。简言之，动物接受腹膜内(IP)注射在无菌0.9％盐水中的孕马血清促性腺激素(PMSG；National Charmone and Peptide Program，Torrence，USA)，剂量为5IU/12g体重；48小时后，第二次IP注射在0.9％无菌盐水中的人慢性促性腺激素(hCG；Pregnyl，Merck Sharp&Dohme Pty Ltd，Australia)，剂量为5IU/12g体重。然后在hCG注射后14小时通过颈椎脱位人道地杀死小鼠，并且从输卵管收集排出的卵丘-卵母细胞复合物(COC)，并且用于通过体外受精产生胚胎。简言之，COC在研究用体外洗涤介质(COOK Medical，QLD，Australia)中洗涤两次，然后置于研究用体外受精介质(COOK Medical)中，精子浓度为1:10(10μL:100μL)。先前从附睾和输精管收集精子样品，并且在研究用体外受精介质中37℃、6％CO₂、5％O₂获能1小时。4小时后，收集假定合子，洗涤并且置于研究用体外分裂介质(10个合子/20μL滴；COOK Medical)中，用于在37℃，6％CO₂、5％O₂中体外胚胎培养至胚泡阶段。通过评估胚胎在第2天(第一次分裂)和第5天(胚泡形成和孵化状态)的发育阶段来分析胚胎的准时发育。

膜电位(MMP)使用活细胞荧光分析进行检测，以通过FACS使用JC-1电位计染料((E)-5,6-二氯-2-[3-(5,6-二氯-1,3-二乙基-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-亚基)-1-丙烯基]-1,3-二乙基-1H-苯并咪唑

结果示于图12。在体内用BGP-15处理对年老雄性的精子计数、存活或运动性没有显著影响，但令人惊奇的是，它增加了形态正常精子的比例，这表明它可能影响精子发生。并且它还增加了具有高MMP的精子群。

我们还发现，在IVF之前进行处理可以恢复年老雄性的胚胎发育至与年轻雄性相似的水平。年老雄性的2细胞胚胎和胚泡的发育增加到与来自年轻雄性小鼠的胚胎相同的水平。这一发现表明，体内用BGP-15处理可以潜在地恢复年老雄性的生殖潜能(图13)。

总之，我们表明年龄负面影响精子质量和发育潜力，并且这些与在年老小鼠中不能产生妊娠有关。然而，用BGP-15处理改善了精子质量并且恢复了IVF后的胚胎发育，表明它可以是治疗与年龄相关的不育或其它类型的雄性低生育力的潜在疗法。

实施例10-BGP-15体外处理人精子

生育力SA(South Australia)的男性患者同意捐献对他们的治疗过量的精液样品。这些丢弃的样品用于测试BGP-15对人精子的作用。按照世界卫生组织(WHO)的指导(每个测试的每个样品计数100个精子)进行样品体积、精子计数、存活、形态和运动性。将精子以1:20稀释于精子稀释液中，然后使用10uL用血细胞计数器(Neubauer Brightline，Livingstone International，NSW，Australia)计数每mL精子的数目。在光学显微镜下，对用曙红1:1染色的样品评估精子存活(对处理组盲测)，将每组100个精子分类为存活的(未染色的)或未存活的(染色的)。存活以总精子的百分数表示。在光学显微镜下评估精子的运动性，将每组100个精子分类为前进运动、非前进运动或不运动。然后将运动性表示为总运动性百分数(前进和非前进运动精子)或前进运动性百分数(仅前进运动精子)。为了评估精子形态，将每组100个精子分类为正常或异常(尾部或头部缺陷)。形态表示为形态正常精子的百分数。对于每个分析，使用光学显微镜对所有样品进行盲法评估。

将人精液样品等分成两份，一半保持完整(纯精液)，而另一半离心洗涤(洗涤精子)。在含有1mg/mL聚乙烯醇(PVA)的细胞介质Biggers，Whittenn and Whittingham(BWW)，摩尔渗透压浓度为290-310mOsmo/kg中，以500g洗涤10分钟以除去任何精浆。将含有精子细胞的沉淀轻轻地重悬于1mL温热的BWW/PVA培养基中。如前所述评估精子计数、存活和运动性。此后，将纯的和洗涤的样品进一步分成两半，用或不用10uM BGP-15处理，在30分钟温育后，用BWW/PVA洗涤细胞，然后分成以下测定：MitoSox Red(MSR)、膜电位(JC-1和TMRM)、8-氧代鸟嘌呤(8OHdG)、色霉素A3(CMA3)和精子染色质分散试验(SCD/Halo)，这些将在下面进一步描述。

流式细胞术分析在FACS-Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson，CA)上用488nm氩激光器进行。进行前向散射和侧向散射测量以生成散点图，其用于仅针对精子细胞进行门控，排除任何污染细胞或碎片。每个样品总共记录10,000个事件。使用BD FACSdiva软件(Becton Dickinson)分析所有数据。

材料：MitoSox Red(#M36008)、SYTOX Green核酸染色剂(#S7020)、活/死可固定远红死细胞染色试剂盒(#L10120)、JC-1(T3168)和Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG(#A11001)来自Life Technologies，现在是Thermo Fisher(Waltham，MA，USA)。DNA/RNA损伤抗体(NB110-96878)来源于Novus Biologicals(Littleton，CO，USA)，以及色霉素A3(#230752)来源于Calbiochem，现在是Merck Millipore(Burlington，MA，USA)。DAPI(#D9542)、四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐(#T5428)和BWW培养基试剂来自Sigma Aldrich(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)。

线粒体ROS产生测定(Mitosox Red)：细胞用MitoSOX Red(MSR)(2μM)和SytoxGreen(0.05μM)在37℃避光染色15分钟。然后在500g离心5分钟，并且重悬于BWW/PVA中，进行流式细胞术分析。

线粒体膜电位(MMP)测定(JC-1)：细胞用JC-1(2uM)和用活/死固定的远红死细胞染色试剂盒在37℃避光染色15分钟。然后在500g离心5分钟，并且重悬于BWW/PVA中，进行流式细胞术分析。

线粒体膜电位(MMP)测定(TMRM)：细胞用四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐(TMRM)(25nM)染色，活力染色Sytox Green(0.05μM)在37℃在黑暗中染色30分钟。然后在500g离心5分钟，并且重悬于BWW/PVA中，进行流式细胞术分析。

DNA损伤测定(8OHdG)：将细胞以500g离心，并且在室温重悬于去浓缩缓冲液(2mMDL-二硫苏糖醇和0.5％Triton X-100的PBS溶液)中10分钟。细胞在4％低聚甲醛中4℃固定15分钟。然后，用1.5％山羊血清/PBS在室温封闭细胞1小时，然后与DNA/RNA损伤抗体(Novus Biologicals，NB110-96878)在4℃温育过夜。二抗是偶联Alexa Fluor 488染料的山羊α小鼠。在荧光显微镜下计数8OHdG染色阳性或非阳性的细胞。

DNA损伤测定(CMA3)：人精子在2％低聚甲醛中4℃固定15分钟。将细胞在500g离心并且在室温用0.2％Triton渗透15分钟。将细胞在500g离心5分钟，并且将细胞沉淀重悬于Mc’Ilvaines缓冲液(18mL 0.1mol/L柠檬酸与82mL 0.2mol/L Na₂HPO₄和10mmol/L MgCl₂混合，pH7.0)中。将CMA3溶解在Mc’Ilvaines缓冲液中至浓度为0.25mg/mL。通过在室温在黑暗中与CMA3温育20分钟标记精子细胞的染色质。通过在500g离心5分钟，用Mc’Ilvaines缓冲液洗涤细胞，并且将细胞沉淀重悬于Mc’Ilvaines缓冲液中，然后用荧光显微镜计数标记的细胞。

DNA损伤分析(HALO)：将人精子冷冻在液氮中并且在室温解冻。在37℃，将细胞与1％低熔点琼脂糖混合，达到琼脂糖的终浓度为0.7％。将细胞-琼脂糖混合物置于预先用0.65％标准琼脂糖包被的载玻片上。载玻片在4℃固化4分钟。小心除去盖玻片，并且将载玻片在室温水平置于酸变性溶液(0.08N HCl)中7分钟。然后将载玻片在中和裂解溶液1(0.4MTris、0.8M DTT、1％SDS和50mM EDTA，pH7)中室温温育10分钟，然后在中和裂解溶液2(0.4MTris、2M NaCl和1％SDS，pH7.5)中室温温育5分钟。然后将载玻片在Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液(0.09M Tris-硼酸盐和0.002M EDTA，pH7.5)中洗涤2分钟，在70％、90％和100％乙醇中脱水，每次在室温脱水2分钟，并且风干。载玻片在室温用DAPI(1/2000)染色10分钟。在荧光显微镜下对载玻片进行“晕圈”或“无晕圈”计数。

用于分析的个体的纯精液样品的特征示于表1。

表1

结果示于图14中。可以看出BGP-15使洗涤的精子的运动性增加了7.8％。

没有观察到对线粒体分布的影响，包括ROS(数据未显示)。

表2显示了用于分析的个体的纯精液样品的年龄特征。

表2

可以看出，在40岁以上男性的纯精液样品中，精子存活降低13.2％。

还发现BGP-15防止人精子中的DNA损伤(图15)。这使用3种不同的DNA损伤测定来证明：8-OHdg检测、DNA片段化(晕圈)测定和色霉素A3染色。

图16显示了在来自40岁以上男性的洗涤精液样品中，精子存活降低21.02％(图16C)，洗涤影响了40岁以上男性精子存活(图16E)，降低11.7％。

使用“年轻正常”精液，我们在体外诱导ROS(使用H₂O₂)，并且测试BGP-15是否具有任何保护作用。BGP-15处理1小时防止了DNA损伤，对抗H₂O₂浓度的增加。

使用离心从精浆分离精子细胞的精子选择方法，例如洗涤，影响精子活力和运动性，同时增加DNA损伤。

用BGP-15进行30分钟的体外处理改善了来自年老男性的洗涤精子的运动性，同时也降低了纯的和洗涤的样品中的DNA损伤。另外，与BGP-15共温育1小时可以保护精子DNA在体外免受氧化应激的氧化损伤。

实施例11-含有BGP-15的精子制备介质

实施例1提供了在允许精子获能的培养基中使用BGP-15的试验支持。

通常，因为精子的获能对于辅助生殖技术是必需的，所以在射精后尽快将精子与精浆分离，并且将精子置于能够支持获能的介质中。

对于人辅助生殖技术，制备和使用精子的方法描述于例如“A Practical Guideto Basic Laboratory Andrology”2010，Lars

David Mortimer,ChristopherL.R.Barratt,Jose Antonio Castilla,Roelof Menkveld,Ulrik Kvist,Juan G.Alvarez,Trine B.Haugen；Cambridge University Press的第7章。

可以将如本文所述的BGP-15和/或其衍生物加入到用于精液收集或制备用于辅助生殖技术的人精子的培养基中：

下面描述了使用含BGP-15的介质的精子制备方法。

通常使用利用含有人血清白蛋白或合成血清替代物的碳酸氢盐缓冲的培养介质。例如，可以使用从Origio可获得的精子制备介质(Cat#10690010A)，并且加入BGP-15至浓度为10μM BGP-15。

精子洗涤和分离运动存活精子的方法可以是通过上游法或通过密度梯度法(例如

密度梯度法(Origio Ref 1091/1092/1097))。

该方法可用于产生适合于女性IVF处理的精子，无论不育的原因是男性还是女性。

组成：BGP-15(例如10μM)；合成血清替代品(USA：ART补充物)、人血清白蛋白(HSA)；葡萄糖；丙酮酸钠；生理盐；碳酸氢钠；HEPES和硫酸庆大霉素10μg/mL。

方法：在使用前，在37℃，在5-6％CO₂中平衡精子制备介质至少2小时。收集后不久，在室温充分混合精液样品。在混合过程完成后，应该(在显微镜下)评估精子浓度和运动性。将0.5-1mL液化精液分层于试管中，试管中放置1-2mL预平衡的精子制备介质。在CO₂环境中37℃温育30-60分钟。上游法后，吸出上层0.2-1mL并且评估精子浓度和运动性。如果精子计数太低，则还包括下一个0.5mL。合并抽吸物。如果需要进一步浓缩吸出的精子介质，则向合并的抽吸物中加入5mL精子制备介质，混合，并且400g离心10分钟。吸出上清液，并且将剩余的沉淀重新悬浮在适合体积的预平衡的精子制备介质中。

该组成和方法特别适用于改善来自患有低生育力、患有精子质量降低或年龄超过40岁的供体的精子的质量。

可以生产利用用于实施该方法的上述试剂和/或说明书的试剂盒和/或产品。

实施例12-含有BGP-15的IVF介质

BGP-15和/或其衍生物在适于卵母细胞受精的人IVF介质中的用途也可以预期。

可以使用人IVF介质，例如可从Origio商购获得的通用IVF介质(通用IVF介质，Cat#1030/1031)，并且含有BGP-15(10μM)。这种介质可用于用未处理的精子使卵母细胞受精，并且将所得胚胎培养至2-8细胞期。

组成：合成血清替代品(USA：ART补充品)、人血清白蛋白(HSA)、生理盐、葡萄糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠和硫酸庆大霉素(10μg/mL)；和BGP-15(例如10μM)。

方法：在使用前，在37℃，在5-6％CO₂中平衡培养基至少2小时。卵母细胞照常回收并且制备精子。可以使用含BGP-15或不含BGP-15的介质制备精子，例如如实施例11所述。使卵母细胞受精(第0天)于含有BGP-15的预平衡IVF培养基中。当需要ICSI时，在含有BGP-15的预温热的保温培养基中进行注射，16-20小时(第1天)，检查原核的形成，然后小心洗涤并且将合子转移至新鲜的50μL微滴或0.5mL孔/皿的用液体石蜡覆盖的通用IVF介质中。胚胎应该单独培养或以多个培养至每孔最多4个。在第2天或第3天将胚胎转移。在20至30μL预平衡的转移介质或新鲜的通用IVF介质中，制备胚胎并且将其转移到子宫中。在使用前用选择的转移介质冲洗转移导管。

实施例13-精子的低温保存

使用BGP-15和/或其衍生物来帮助冷冻人精子也是可以预期的。通过暴露于BGP-15和/或其衍生物而对本文实施例所述的精子进行的改进，预期产生具有改善的低温保存能力的精子。

可以使用含有BGP-15(例如10μM)的人精子冷冻介质，例如商购可获得的Cryosperm冷冻介质(Origio Cryosperm；产品#1101)。这种介质可以用于冷冻精子，以帮助保持精子的质量。

组成：甘油、棉子糖、葡萄糖、丙酮酸钠；乳酸钠，生理盐；氨基酸；碳酸氢钠；HEPES；硫酸庆大霉素(10μg/mL)；BGP-15(10μM)。

方法：A.冷冻。确保精液样本和冷冻介质均处于室温，并且用冷冻介质稀释精液1:1(v/v)。应将介质逐滴加入到精液上，并且在每次加入介质后小心混合溶液。将混合物在室温放置最少10分钟。将稀释的精液装入吸管或冻存管中，并且按照制造商的推荐进行密封。将吸管水平悬30分钟，刚好在液氮表面之上。冻存管应被连接到条上，然后在液氮表面上方悬相同的时间。将吸管或冻存管转移至液氮中并且储存在-196℃。B.解冻。在室温温热吸管或冻存管5分钟。打开吸管或冻存管并且取出解冻的精子。立即通过密度梯度或上游方法制备精子。

实施例14-生育力降低的男性个体的治疗

用于静脉内施用BGP-15和/或其衍生物的组合物可以通过将治疗有效量的活性剂组合在适合量的等渗盐水中来制备，用于给精子质量降低的男性个体施用。例如，剂量为20mg/kg的BGP-15可以每天一次静脉内施用于个体，持续8周。

可选择的是，例如两个100mg BGP-15胶囊可以每天两次口服施用于生育力降低的男性个体，持续8周。

在施用后将监测男性个体。施用的有效性可以通过评估参数来进行，所述参数例如运动性(总的和前进的)、存活、形态、线粒体活性、DNA完整性和支持胚胎发育能力的能力。

可以预期，上述方法将改善男性个体的生育力，并且还将改善从个体分离的精子的质量，用于辅助生殖技术。

尽管已经参考特别实施例描述了本公开，但是将理解，本公开可以以许多其它形式实施。还将理解，本文描述的公开内容易于进行除具体描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本公开包括所有这样的变化和修改。本公开还包括在本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个步骤或特征的任何和所有组合。

此外，应注意，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数方面，除非上下文已经另外指明。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或其变体如“包括”或“含有”将被理解为暗示包括所述的元件或整体或者元件或整体的组，但不排除任何其它元件或整体或者元件或整体的组。

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除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何适合的顺序进行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明示例性实施方案，而不是对要求保护的发明的范围施加限制。说明书中的语言不应被解释为将任何未要求保护的元素指示为必要的。

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Claims

1.改善精子质量的方法，该方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，从而改善精子的质量。

2.根据权利要求1的方法，其中BGP-15和/或其衍生物包括BGP-15、普萘洛尔、氯吡哌醇、阿莫氯醇、NG-94、iroxanadine和/或上述任何的药学上可接受的衍生物、前药、溶剂化物、盐、互变异构体、立体异构体和/或外消旋体中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2的方法，其中BGP-15和/或其衍生物包括BGP-15。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中精子的质量包括受精能力。

5.根据权利要求4的方法，其中受精能力包括使卵母细胞受精的能力和/或由精子产生的胚胎的发育能力。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中精子是来自年老供体和/或肥胖或超重供体的精子。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中精子是体外的。

8.根据权利要求7的方法，其中精子暴露于BGP-15和/或其衍生物1小时或更短的时间。

9.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中精子在个体体内。

10.根据权利要求9的方法，其中精子暴露于BGP-15和/或其衍生物包括给个体施用BGP-15和/或其衍生物。

11.根据权利要求9或10的方法，其中个体包含受精能力降低的精子。

12.根据权利要求9至11中任一项的方法，其中个体是年老个体或肥胖或超重个体。

13.分离的精子，其通过将精子暴露于根据权利要求1-12中任一项的BGP-15和/或其衍生物而产生。

14.治疗个体以改善精子质量的方法，该方法包括给个体施用有效量的BGP-15和/或其衍生物，从而改善个体的精子质量。

15.治疗个体精子质量降低的方法，该方法包括给个体施用有效量的BGP-15和/或其衍生物，从而治疗个体。

16.分离的精子，其从根据权利要求14或15的方法施用BGP-15和/或其衍生物的个体中获得。

17.BGP-15和/或其衍生物在用于改善精子质量的组合物中的用途。

18.用于改善精子质量的药物组合物，该组合物包含有效量的BGP-15和/或其衍生物。

19.治疗个体以改善精子质量的方法，该方法包括给个体施用根据权利要求18的药物组合物。

20.改善通过对卵母细胞进行受精产生的胚胎的发育能力的方法，该方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，从而改善胚胎的发育能力。

21.根据权利要求20的方法，其中BGP-15和/或其衍生物包括BGP-15、普萘洛尔、氯吡哌醇、阿莫氯醇、NG-94、iroxanadine和/或上述任何的药学上可接受的衍生物、前药、溶剂化物、盐、互变异构体、立体异构体和/或外消旋体中的一种或多种。

22.根据权利要求20或21的方法，其中BGP-15和/或其衍生物包括BGP-15。

23.根据权利要求20至22中任一项的方法，其中精子是来自年老供体和/或肥胖或超重供体的精子。

24.根据权利要求20-23中任一项的方法，其中该方法包括将精子在体外暴露于BGP-15和/或其衍生物。

25.根据权利要求20-23中任意一项的方法，其中该方法包括在个体体内将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物。

26.根据权利要求25的方法，其中该方法包括给个体施用BGP-15和/或其衍生物。

27.使用精子辅助生殖的方法，该方法包括将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物，并且将暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子用于辅助生殖的方法中。

28.根据权利要求27的方法，其中精子是来自年老供体和/或肥胖或超重供体的精子。

29.根据权利要求27或28的方法，其中辅助生殖的方法包括体外受精。

30.根据权利要求27或28的方法，其中辅助生殖的方法包括人工授精。

31.使用根据权利要求27至30中任一项的辅助生殖方法生育的动物。

32.体外受精方法，该方法包括：

将精子体外暴露于BGP-15和/或其衍生物；以及

用暴露于BGP-15和/或其衍生物的精子使卵母细胞受精。

33.用于改善精子质量的试剂盒或产品，该试剂盒或产品包含用于暴露于精子的BGP-15和/或其衍生物。

34.用于辅助生殖方法的试剂盒或产品，该试剂盒或产品包含用于暴露于精子的BGP-15和/或其衍生物。

35.用于实施根据权利要求1至12、20至30或32中任一项的方法的试剂盒或产品。

36.精子的体外受精介质，该介质包含BGP-15和/或其衍生物。

37.精子制备介质，该介质包含BGP-15和/或其衍生物。

38.冷冻精子的方法，该方法包括在冷冻精子之前、期间和/或之后的一个或多个时间将精子暴露于BGP-15和/或其衍生物。

39.精子冷冻介质，该介质包含BGP-15和/或其衍生物。

40.筛选改善精子质量的活性剂的方法，该方法包括测定BGP-15衍生物改善精子质量的能力，并且将该衍生物鉴定为改善精子质量的活性剂。

41.根据权利要求40的方法，其中该方法包括在体外确定衍生物改善精子质量的能力。

42.根据权利要求40或41的方法，其中该方法包括在体内确定衍生物改善精子质量的能力。

43.根据权利要求40至42中任一项的方法，其中衍生物包括普萘洛尔、氯吡哌醇、阿莫氯醇、NG-94和iroxanadine中的一种的衍生物。