BR112020005732A2 - métodos e produtos para melhorar a qualidade de espermatozoides - Google Patents

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Abstract

  A presente invenção refere-se a métodos e produtos para melhorar a qualidade do esperma, métodos para tratamento de indivíduos para melhorar a qualidade do esperma ou melhorar a fertilidade e uso de esperma com melhor qualidade na reprodução assistida tecnologias, compreendendo expor o espermatozóide a BGP-15 e / ou um derivado do mesmo, como BGP-15, propanolol, bimoclomol, arimoclomal, NG94, iroxanadina e / ou um derivado farmaceuticamente aceitável, pró-droga, solvato, sal, tautômero, estereoisômero, e / ou companheiro de corrida.

Description

MÉTODOS E PRODUTOS PARA MELHORAR A QUALIDADE DE ESPERMATOZOIDES REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] Este pedido de patente reivindica a prioridade do Pedido de Patente Australiana Provisório 2017903857, depositado em 22 de setembro de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a métodos e produtos para melhorar a qualidade de espermatozoides, a métodos de tratamento de indivíduos para melhorar a qualidade de espermatozoides ou melhorar a fertilidade e ao uso de espermatozoides com a qualidade melhorada em tecnologias de reprodução assistida.
ANTECEDENTS DA INVENÇÃO
[003] Apesar de inúmeros avanços na medicina reprodutiva, uma proporção significative de casais não é capaz de conceber devido à fertilidade masculina reduzida. Embora existam inúmeras causas para redução da fertilidade masculina, em alguns casos, os espermatozoides apresentam qualidade reduzida. Muitas das razões para redução na qualidade dos espermatozoides são ainda desconhecidas.
[004] Por exemplo, vários estudos indicaram que a função dos espermatozoides reduz à medida que a idade aumenta. Dado que há uma tendência para a idade paterna crescer, reduções nitidamente relacionadas à idade na qualidade dos espermatozoides são motivo de preocupação.
[005] Além disso, a taxa de obesidade masculina em homens em idade reprodutiva tem aumentado significativamente ao longo das últimas décadas e coencide com aumento na infertilidade masculina em todo o mundo. Existem indícios crescentes de que estar acima do peso ou ser obeso tem impacto negativo sobre o potencial reprodutivo masculino, incluindo por reduzirem a qualidade de espermatozoides. Estudos recentes indicam que a redução na qualidade do esperma não se deve simplesmente à quantidade produzida de espermatozoides ou à redução na motilidade.
[006] Estudos anteriores também indicaram que homens que fumam são menos férteis. Embora estudos tenham relatado que fumar cigarros pode afetar negativamente parâmetros dos espermatozoides, o plasma seminal e vários outros fatores de fertilidade, o efeito real do tabagismo sobre a fertilidade masculina permanece pouco claro.
[007] As intervenções farmacológicas disponíveis para melhorar a qualidade dos espermatozoides são limitadas. Existem alguns suplementos disponíveis que ajudam a melhorar a fertilidade masculina, os quais frequentemente dependem de vitaminas e antioxidantes para melhorar as taxas de gravidez. Técnicas de reprodução assistida também permitiram intervenção para tratar a baixa fertilidade e, em alguns casos, podem ser utilizadas como ajuda para conseguir a gravidez quando um dos motivos para subfertilidade é devido à menor qualidade dos espermatozoides. No entanto, apesar dos inúmeros avanços feitos no campo da reprodução assistida, a taxa de sucesso de técnicas de reprodução assistida continua sendo em geral baixa. As menores taxas de sucesso de técnicas de reprodução assistida, tais como fertilização in vitro (FIV), injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) e (IUI) podem dever-se, em parte, ao uso de espermatozoides de menor qualidade.
[008] Tecnologias de reprodução assistida são também utilizadas intensamente em animais, particularmente para animais de alto mérito genético. Melhorar a qualidade dos espermatozoides pode ter vantagens em melhorar as taxas de reprodução em animais e/ou a qualidade dos animais produzidos, o que proporciona vantagens econômicas.
[009] Em espécies de vida selvagem, tecnologias de reprodução assistida são urgentemente necessárias para melhorar a fertilidade de espécies em cativeiro e/ou em perigo a fim de manter a biodiversidade.
[0010]Sendo assim, por uma variedade de motivos, há necessidade de novos métodos e produtos para melhorar a qualidade de espermatozoides.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[0011]A presente invenção refere-se a métodos e produtos para melhorar a qualidade de espermatozoides, métodos para tratar indivíduos visando melhorar a qualidade de espermatozoides ou tratar a redução da fertilidade e ao uso de espermatozoides com a qualidade melhorada em tecnologias de reprodução assistida.
[0012]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a qualidade dos espermatozoides.
[0013]Certas modalidades da presente invenção provêm espermatozoides isolados produzidos expondo-se os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo como aqui descrito.
[0014]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento de um indivíduo para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou de um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a qualidade de espermatozoides no indivíduo.
[0015]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento qualidade reduzida dos espermatozoides em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou de um derivado do mesmo e, desse modo, tratar o indivíduo.
[0016]Certas modalidades da presente invenção provêm o uso de BGP-15 e/ou de um derivado do mesmo em uma composição para melhorar a qualidade de espermatozoides.
[0017]Certas modalidades da presente invenção provêm uma composição farmacêutica para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou de um derivado do mesmo.
[0018]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento de um indivíduo para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica como aqui descrita.
[0019]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de melhorar a competência para o desenvolvimento de um embrião produzido por um espermatozoide que fertiliza um oócito, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a competência para o desenvolvimento do embrião.
[0020]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de reprodução assistida utilizando espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e utilizar os espermatozoides expostos ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo no método de reprodução assistida.
[0021]Certas modalidades da presente invenção provêm um animal produzido mediante um método de reprodução assistida como aqui descrito.
[0022]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de fertilização in vitro, em que o método compreende: • expor espermatozoides in vitro a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e • fertilizar um oócito com o espermatozoide exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
[0023]Certas modalidades da presente invenção provêm um kit ou produto para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o kit ou produto compreende BGP- 15 e/ou um derivado do mesmo para exposição aos espermatozoides.
[0024]Certas modalidades da presente invenção provêm um kit ou produto para uso em uma tecnologia de reprodução assistida, em que o kit ou produto compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para exposição a espermatozoides.
[0025]Certas modalidades da presente invenção provêm um meio para fertilização in vitro for fertilizar um oócito with a sperm, em que o meio compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
[0026]Certas modalidades da presente invenção provêm um meio para fertilização in vitro de espermatozoides, em que o meio compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
[0027]Certas modalidades da presente invenção provêm um meio para preparação de espermatozoides, em que o meio compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
[0028]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de congelamento de espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo em um ou mais dentre antes, durante e/ou depois de congelamento dos espermatozoides.
[0029]Certas modalidades da presente invenção provêm um meio para congelamento de espermatozoides, em que o meio compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
[0030]Certas modalidades da presente invenção provêm um método para rastreamento de um agente que melhore a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende determinar a capacidade de um derivado de BGP-15 para melhorar a qualidade de espermatozoides e identificar o derivado como um agente que melhore a qualidade de espermatozoides.
[0031]Outras certas modalidades são reveladas no presente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0032]Certas modalidades são ilustradas pelas figuras a seguir. Deverá ser entendido que a descrição seguinte tem o objetivo de descrever modalidades em particular somente e não se destina a ser limitante com respeito à descrição.
[0033]Figura 1. Efeitos do tratamento in vitro com BGP-15 sobre a restauração da função espermática. Espermatozoides do epidídimo e do ducto deferente foram coletados de camundongos machos que eram “jovens” (~6 semanas de idade) ou “velhos” (~1 ano de idade) e deixados passar por capacitação (maturação) durante uma hora in vitro em meio controle (não tratados) ou meio contendo BGP-15 10 µM. Subsequentemente, os espermatozoides foram utilizados para fertilização in vitro de oócitos de camundongos fêmeas jovens e avaliou-se o desenvolvimento de supostos zigotos. A) Porcentagem de supostos zigotos que haviam completado a clivagem que haviam completado a clivagem 24 h após a FIV. B) Porcentagem de embriões de 2 células que completou o desenvolvimento de blastocisto 5. C) Porcentagem de blastocistos que haviam iniciado a eclosão (hatching). Cada marco de desenvolvimento foi prejudicado em embriões foram concebidos utilizando espermatozoides de camundongos velhos, no entanto, cada parâmetro de desenvolvimento foi melhorado pelo tratamento durante 1 hora de espermatozoides “velhos” in vitro com BGP-15. N= 6-12 camundongos por grupo de tratamento. A análise foi realizada com teste t pareado que comparou não tratados e tratados com BGP-15 dentro de cada grupo etário e com teste t não pareado comparando jovens e velhos.
[0034]A Figura 2 mostra os efeitos do tratamento in vivo com BGP-15 sobre a restauração da função espermática. Camundongos machos que eram “jovens” (~6 semanas de idade) ou “velhos” (~1 ano de idade) foram “não tratados” ou tratados com BGP-15 (15mg/kg) i.p uma vez ao dia durante 4 dias. Aproximadamente 12 h após a última injeção, espermatozoides foram coletados do epidídimo e do ducto deferente e utilizados para fertilização in vitro de oócitos de camundongos fêmeas jovens e avaliou- se o desenvolvimento de supostos zigotos. A) Porcentagem de supostos zigotos que haviam completado a clivagem 24 h após a FIV. B) Porcentagem de embriões de 2 células que completou o desenvolvimento de blastocisto 5. C) Porcentagem de blastocistos que haviam iniciado a eclosão. Cada marco de desenvolvimento foi prejudicado em embriões concebidos utilizando espermatozoides de camundongos velhos, no entanto, cada parâmetro de desenvolvimento foi melhorado trantando o camundongo “velho” com BGP-15. N= 1 camundongo por grupo de tratamento.
[0035]A Figura 3 mostra que machos velhos produzem menos gestações. (A) As taxas de acasalamento observadas para camundongos machos jovens e mais velhos foram semelhantes (número de coitos) quando pareados com fêmeas jovens (6-8 semanas de idade). (B) No entanto, um número significativamente reduzido de gestações foi observado no dia 18,5 depois do coito para machos mais velhos, quando comparados a machos jovens. Os dados são mostrados como valores da média. Análise estatística foi realizada com o Teste exato de Fisher (P=0,004; IC 95%: 1,75; 19,14; N=25 machos (Jovens), 33 (Velhos).
[0036]A Figura 4 mostra que machos velhos geram prole menor menos saudável. (A) Camundongos machos mais velhos que produziram uma gestação demonstraram gerar fetos que eram menos pesados do que aqueles de machos jovens no dia 18,5 do desenvolvimento embrionário. (B) Fetos de machos mais velhos tinham também placentas menores. (C) Machos mais velhos geraram filhotes recém-nascidos que eram mais leves no Dia 1 Pós-Natal do que aqueles gerados por machos mais jovens. (D) A prole gerada por machos mais velhos apresentou taxas de mortalidade neonatal (ou seja, morte antes do desmame no Dia 21 Pós-Natal), maiores do que aquelas de machos mais jovens. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com Modelo Linear Misto (A, B, C) ou teste T não pareado de Student (D).
[0037]A Figura 5 mostra o tratamento in vitro de espermatozoides com BGP-15. Representação gráfica do desenho experimental. Camundongos machos ex- reprodutores de fertilidade comprovada foram adquiridos e criados até que tivessem pelo menos 12 meses de idade; e então comparados a “controles jovens”. A fertilidade foi avaliada pelo acasalamento com fêmeas jovens em ciclo natural. Machos jovens que produziram gravidez (ou seja, eram férteis) e machos mais velhos que não conseguiram produzir gravidez (ou seja, eram subférteis) foram selecionados como doadores de espermatozoides para fertilização in vitro (FIV) e produção de embriões. No dia da fertilização in vitro (FIV), coletou-se espermatozoides, e a metade foi tratada com BGP- 15 por 1 hora durante a capacitação dos espermatozoides. Imediatamente antes da FIV, usou-se uma alíquota para análise do sêmen e ensaios da qualidade dos espermatozoides, a saber: contagem de espermatozoides, viabilidade, morfologia, motilidade (incluindo motilidade progressiva), atividade mitocondrial e capacidade de ligar-se à zona pelúcida.
[0038]A Figura 6 mostra que BGP-15 aumenta a motilidade dos espermatozoides em machos mais velhos. A análise da solução do sêmen após a capacitação mostrou que os machos mais velhos apresentavam contagem menor de espermatozoides (A), mas taxas normais de espermatozoides viáveis (B) e morfologicamente normais (C). A motilidade total (D) e a motilidade progressiva (E) estavam também diminuídas. O tratamento com BGP-15 não teve sobre contagem de espermatozoides, viabilidade ou morfologia, mas aumentou a mortalidade total (D) e a progressiva (E) em espermatozoides de machos mais velhos. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T pareado (Jovens não tratados versus Jovens tratados, Mais Velhos não tratados versus Mais Velhos tratados) ou não pareado (Jovens versus Mais Velhos) de Student.
[0039]A Figura 7 mostra que o tratamento com BGP-15 aumenta o potencial da membrana mitocondrial (MMP) de espermatozoides em machos mais velhos. (A) Imagens representativas de espermatozoides corados por JC-1 com MMP baixo (em cima) ou MMP alto (embaixo). (B) Análise por citometria de fluxo de espermatozoides corados por JC-1. Em machos mais velhos, BGP-15 aumenta a porcentagem de espermatozoides vivos mostrando MMP alto (C). Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T pareado (Jovens não tratados versus Jovens tratados, Mais Velhos não tratados versus Mais Velhos tratados) ou não pareado (Jovens versus Mais Velhos) de Student.
[0040]A Figura 8 mostra que BGP-15 melhora a capacidade de ligar-se à zona pelúcida em machos mais velhos. A avaliação da capacidade de ligar-se à zona pelúcida de espermatozoides usando o corante bisbenzamida para DNA (A) mostrou que menos espermatozoides de machos mais velhos estavam ligados à zona pelúcida de oócitos MII, mas que esses aumentavam pelo tratamento com BGP-15 (B). Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T pareado (Jovens não tratados versus Jovens tratados, Mais Velhos não tratados versus Mais Velhos tratados) ou não pareado (Jovens versus Mais Velhos) de Student.
[0041]A Figura 9 mostra que machos mais velhos apresentam desenvolvimento embrionário pré-implantação interrompido. A análise morfocinética de imagens obtidas com lapso de tempo de embriões pré-implantação após FIV mostrou que machos mais velhos demoravam mais até chegar a 2 células (A) e que apresentavam com maior frequência colapso de blastocisto (B), em comparação com machos mais jovens. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T não pareado de Student.
[0042]A Figura 10 mostra que embriões pré-implantação derivados de machos mais velhos apresentam desenvolvimento melhorado após o tratamento in vitro de espermatozoides com BGP-15. (A) Machos mais velhos apresentaram uma porcentagem reduzida de supostos zigotos que atingiram a primeira divisão (2 células) no dia 2 após a FIV (46h após a injeção de hCG) em comparação a machos mais jovens (não tratados e tratados); mas as taxas de 2 células melhoraram quando espermatozoides velhos foram tratados com BGP-15. (B) Machos mais velhos também mostraram uma diminuição na porcentagem de embriões de 2 células que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 após a FIV (112h após a injeção de hCG), a qual foi melhorada pelo tratamento dos espermatozoides com BGP-15. (C) As taxas de eclosão de blastocistos no dia 5 após a FIV estavam reduzidas em blastocistos derivadas de machos mais velhos, mas melhoraram pelo tratamento dos espermatozoides com BGP-
15. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T pareado (Jovens não tratados versus Jovens tratados, Mais Velhos não tratados versus Mais Velhos tratados) ou não pareado (Jovens versus Mais Velhos) de Student.
[0043]A Figura 11 mostra o tratamento in vivo de camundongos machos com BGP-15. Representação gráfica do desenho experimental. Camundongos machos ex- reprodutores fertilidade comprovada foram adquiridos e criados até que tivessem pelo menos 12 meses de idade; e então comparados a “controles jovens”. A fertilidade foi avaliada pelo acasalamento com fêmeas jovens em ciclo natural. Machos jovens que produziram gravidez (ou seja, eram férteis) e machos mais velhos que não conseguiram produzir gravidez (ou seja, eram subférteis) foram selecionados como doadores de espermatozoides para fertilização in vitro (FIV) e produção de embriões. Metade dos machos recebeu BGP-15 (15 mg/kg) por injeção intraperitoneal (IP) diariamente por 4 dias antes da FIV. Ao mesmo tempo que a avaliação da fertilidade masculina, um grupo de fêmeas jovens foi estimulada com hormônios a ovular, e os seus complexos cumulus-oócitos coletados. Esses COCs foram inseminados utilizando espermatozoides de todos os grupos de tratamento. Após incubação no meio para fertilização por 4 horas, os supostos zigotos foram avaliados quanto à presença de pró-núcleos e cultivados ainda in vitro por 5 dias. O desenvolvimento foi avaliado no dia 2 e dia 5 depois da FIV IVF quanto aos estágios de 2 células e de blastocisto, respectivamente.
[0044]A Figura 12 mostra que BGP-15 melhora a morfologia dos espermatozoides e o potencial da membrana mitocondrial (MMP) em espermatozoides de machos mais velhos. O tratamento in vivo com BGP-15 não afetou significativamente a contagem de espermatozoides (A), a viabilidade (B) ou a motilidade (D, E) em machos mais velhos mas, surpreendentemente, aumentou a proporção de espermatozoides morfologicamente normais (C) bem como a população de espermatozoides com MMP alto (F). Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T não pareado de Student.
[0045]A Figura 13 mostra o desenvolvimento embrionário pré-implantação melhorado após o tratamento in vivo de machos mais velhos com BGP-15. (A) Machos mais velhos não tratados apresentaram uma porcentagem reduzida de supostos zigotos que atingiu a primeira divisão (2 células) no dia 2 após a FIV (46h após a injeção de hCG) em comparação a machos jovens não tratados, mas as taxas de 2 células melhoraram em machos mais velhos tratados com BGP-15. (B) Machos mais velhos não tratados também mostraram uma diminuição na porcentagem de embriões de 2 células que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 após a FIV (112h após a injeção de hCG), a qual também melhorou naquele que receberam o tratamento com BGP-15. (C) As taxas de eclosão no dia 5 após a FIV foram semelhantes em todos os grupos. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T não pareado de Student.
[0046]A Figura 14 mostra que BGP-15 aumenta a motilidade em espermatozoides humanos. (A) Embora o tratamento com BGP-15 durante 30 minutos não tivesse efeito sobre a motilidade de espermatozoides de amostras de sêmen puro (contendo plasma seminal), ele aumentou a motilidade de espermatozoides de amostras lavadas (plasma seminal removido) do mesmo doador. Não houve efeito do tratamento com BGP-15 sobre a motilidade dos espermatozoides de amostras lavadas em 24 (B) ou 48 (C) horas. A vitalidade (ou impermeabilidade da membrana) não foi afetada pelo tratamento com BGP-15 de espermatozoides de amostras puras, mas a vitalidade foi diminuída em espermatozoides de amostras lavadas do mesmo doador, após 30 minutos de tratamento com BGP-15 (D). Não houve efeito do tratamento com BGP-15 sobre a vitalidade de espermatozoides de amostras lavadas em 24 (E) ou 48 (F)
horas. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T pareado de Student.
[0047]A Figura 15 mostra que BGP-15 reduz danos ao DNA em espermatozoides humanos. (A) A quantificação do marcador de danos ao DNA por oxidação, 8-Oxo-2'- desoxiguanosina (8OHdG), em amostras não tratadas e tratadas mostrou que a lavagem aumentou os níveis de 8OHdG de espermatozoides, mas que esse foi reduzido após o tratamento com BGP-15 por 30 minutos nos espermatozoides de amostras puras e lavadas do mesmo doador. (B) A quantificação de fragmentação do DNA pelo ensaio HALO utilizando o corante DAPI para DNA revelou que a lavagem aumentou a fragmentação do DNA dos espermatozoides que foi reduzida pelo tratamento com BGP-
15. (C) A quantificação do marcador de dano estrutural à cromatina, Cromomicina A3 (CMA3), mostrou que, embora a lavagem aumentasse os níveis de CMA3 de espermatozoides, não houve efeito de BGP-15. A análise de danos ao DNA em 24 e 48 horas mostrou que não houve efeito do tratamento com BGP-15 sobre os níveis de 8OhdG (D, G), fragmentação (E, H) ou de CMA3 (F, I) no DNA de espermatozoides, respectivamente. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T pareado de Student.
[0048]A Figura 16 mostra que a seleção de espermatozoides pela lavagem reduz a vitalidade de espermatozoides em homens mais velhos. A análise do sêmen após a remoção do plasma seminal em amostras de sêmen por lavagem mostrou contagem de espermatozoides (A) e motilidade (B) semelhantes entre homens jovens (<40 anos de idade) e mais velhos (>40 anos de idade), mas diminuiu significativamente a viabilidade (impermeabilidade da membrana) em homens mais velhos (C). A comparação da vitalidade de espermatozoides em amostras puras e lavadas mostrou que a lavagem não tinha efeito em homens mais jovens (D), mas que diminuía a vitalidade de espermatozoides em homens mais velhos (E). Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com teste T pareado de Student.
[0049]A Figura 17 mostra que BGP-15 melhora a motilidade dos espermatozoides em homens mais velhos. (A) Enquanto nem a lavagem nem o tratamento com BGP-15 afetou a motilidade dos espermatozoides em homens mais jovens (<40 anos de idade); (B) em homens mais velhos (>40 anos de idade), a lavagem reduziu a motilidade dos espermatozoides, mas essa foi aumentada com 30 minutos de tratamento com BGP-15. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com ANOVA two way (dois fatores) e testes de comparação múltipla post hoc.
[0050]A Figura 18 mostra que BGP-15 protege espermatozoides de danos ao DNA causados por estresse oxidativo. Espermatozoides de homens jovens (<40 anos de idade) foram incubados com doses crescentes de H2O2 (0; 0,0625 nM; 0,125 nM e 0,250 nM), e tratados ou não tratados com BGP-15 (10 µM) por 1 hora. A motilidade dos espermatozoides (A) e a viabilidade (B) foram anuladas pelo tratamento com H2O2. (C) A quantificação do marcador de danos ao DNA por oxidação, 8-Oxo-2'- desoxiguanosina (8OHdG), mostrou que o tratamento com H2O2 aumentou o dano oxidativo aos espermatozoides de maneira dependente da dose, enquanto a adição do tratamento com BGP-15 impediu o acúmulo de dados oxidativos ao DNA. Os dados são mostrados como valores da média ± SEM. A análise estatística foi realizada com ANOVA two way e testes de comparação múltipla post hoc.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0051]A presente invenção refere-se a métodos e produtos para melhorar a qualidade de espermatozoides, métodos de tratamento de indivíduos para melhorar a qualidade de espermatozoides e ao uso de espermatozoides com a qualidade melhorada em tecnologias de reprodução assistida.
[0052]A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, no reconhecimento de que BGP-15, e/ou um derivado do mesmo, melhora a qualidade de espermatozoides in vitro e in vivo e, em particular, tem como resultado melhorar a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos com espermatozoides tratados com BGP-15, especialmente de espermatozoides de indivíduos idosos.
[0053]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de melhorar a qualidade de espermatozoides.
[0054]Certas modalidades da presente invenção provêm um método de melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou a um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a qualidade dos espermatozoides.
[0055]O termo “espermatozoide”, neste relatório descritivo, refere-se à célula reprodutiva masculina ou um espermatozoide, e inclui um ou mais espermatozoides.
[0056]Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreendem BGP-15 (amidoxima O-[3-piperidino-2-hidroxi-1-propil]-nicotínica): ; e/ou um derivado, pró-fármaco, solvato, sal, tautômero, estereoisômero e/ou racemato aceitável do mesmo.
[0057]BGP-15 está disponível comercialmente (tipicamente como um sal aceitável) ou pode ser sintetizado por um método conhecido no estado da técnica. Exemplos de fontes comerciais de BGP-15 incluem Sigma-Aldrich (Product no B4813 SIGMA) e Cayman Chemicals (Product no 17503).
[0058]Em certas modalidades, o derivado de BGP-15 compreende propanolol, bimoclomol, arimoclomol, NG-94, iroxanadina e/ou um derivado, pró-fármaco, solvato, sal, tautômero, estereoisômero e/ou racemato farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos mencionados antes. As estruturas quimicas de propanolol, bimoclomol, arimoclomol, NG-94, iroxanadina são como segue: Iroxanadina
[0059]Os compostos acima podem ser sintetizados por um método conhecido no estado da técnica ou estão disponíveis comercialmente.
[0060]Propranolol (CAS no 318-98-9) pode ser sintetizado por um método conhecido no estado da técnica ou obtido comercialmente da LGM Pharma (EUA). Bimoclomol (cloreto de (3Z)-N-(2-hidroxi-3-piperidin-1-ilpropoxi)piridina-3-carboximidoíla) pode ser sintetizado por um método conhecido no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente Húngara No 207988 (1988). Arimoclomol (3-[cloro({[(2R)-2- hidroxi-3-(piperidin-1-il)propoxi]imino})metil]piridin-1-io-1-olato) pode ser sintetizado por um método conhecido no estado da técnica, por exemplo, como descrito no Pedido de Patente International WO0179174 ou em Tetrahedron: Asymmetr. 2012, 23: 1564-
1570. NG-094 pode ser sintetizado por um método conhecido no estado da técnica. Iroxanadina pode ser sintetizada por um método conhecido no estado da técnica e é disponibilizada comercialmente pela 360 Reagent.
[0061]Em certas modalidades, a qualidade dos espermatozoides compreende capacidade de fertilização. Em certas modalidades, a capacidade de fertilização compreende a habilidade para fertilizar um oócito, a habilidade para produzir um zigoto e/ou competência para o desenvolvimento de um embrião produzido com o espermatozoide.
[0062]Em certas modalidades, a qualidade dos espermatozoides compreende um ou mais dentre a habilidade para produzir um zigoto que tenha completado a fertilização e clivagem dentro do prazo ótimo (“no prazo”) para aquela espécie, a habilidade de um embrião de duas células para completar o desenvolvimento de blastocisto dentro do prazo ótimo (“no prazo”) para aquela espécie e/ou a habilidade de um blastocisto para iniciar a eclosão.
[0063]Em certas modalidades, a qualidade dos espermatozoides compreende a integridade do DNA. Exemplos de medidas da integridade do DNA incluem dano ao DNA, fragmentação do DNA, quebras no DNA e conformação do DNA. No estado da técnica, são conhecidos ensaios para avaliar a integridade do DNA, e incluem por exemplo, ensaios em que a fragmentação do DNA é medida diretamente incorporando sondas no local do dano para detectar quebras reais a fitas do DNA, tais como o ensaio de marcação de nicks na extremidade mediada por dUTP e terminal desoxinucleotidil transferada (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL) e tradução in situ de nick (ISNT), e ensaios que utilizam a propriedade do DNA fragmentada para desnaturar-se mais facilmente sob certas condições. O teste de dispersão da cromatina do espermatozoide (SCD), eletroforese em gel de célula única (SCGE) ou ensaio cometa, ensaio da estrutura de cromatina de espermatozoides (SCSA), coloração com laranja de acridina são exemplos em que o DNA de espermatozoides pode ser submetido a tratamento de desnaturação e, então, o dano ao DNA é quantificado.
[0064]Em certas modalidades, a qualidade dos espermatozoides é a habilidade para congelar/crioconservar o espermatozoide.
[0065]Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador que sofre ou é suscetível a uma condição que está associada com fertilidade reduzida e/ou qualidade reduzida dos espermatozoides.
[0066]Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador idoso. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador mais velho. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador que sofre ou é suscetível a uma condição de envelhecimento que está associada com fertilidade reduzida. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador obeso ou que está com sobrepeso.
[0067]Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador com idade acima de 40 anos. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador com idade acima de 45 anos.
[0068]Em certas modalidades, o espermatozoide é doador que fuma ou que fumou. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador que sofre ou é suscetível a uma condição ou estado associado com fertilidade reduzida associada com tabagismo.
[0069]Em certas modalidades, o espermatozoide é utilizado em um método ou tecnologia de reprodução assistida.
[0070]Os exemplos de tecnologias de reprodução assistida incluem inseminação artificial (também conhecida como inseminação intrauterina), fertilização in vitro (FIV), transferência intrafalopiana de gameta (GIFT), posicionamento de oócitos e espermatozoide na trompa de Falópio), transferência intrafalopiana de zigoto (ZIFT), transferência tubária de embrião (TET), transferência peritoneal de oócito e espermatozoide (POST), injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), extração de espermatozoides testiculares (TESE) e aspiração microcirúrgica de espermatozoides do epidídimo (MESA).
[0071]As tecnologias de reprodução assistida são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, como descrito no Textbook of Assisted Reproduction: Laboratory and Clinical Perspectives (2003) Editors Gardner, D. K., Weissman, A., Howies, CM., Shoham, Z. Martin Dunits Ltd, Londres, Reino Unido; e Gordon, I. (2003) Laboratory Production of Cattle Embryos, 2a edição, CABI Publishing, Oxon, Reino Unido.
[0072]Em certas modalidades, o método é utilizado na produção de espermatozoides para uso em fertilização in vitro (FIV), injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) ou inseminação intrauterina (IUI).
[0073]Métodos para execução de tecnologias de reprodução assistida em humanos e animais são conhecidos no estado da técnica.
[0074]O termo “expor” e suas variantes tais como “expõe” ou “exposição”, neste relatório descritivo, inclui também expor in vitro, expor ex vivo ou expor in vivo. Os exemplos de expor incluem expor a um agente em um meio líquido, expor a um pré- agente que é alterado ou metabolisado até agente ativo ou expor a um agente que induz a expressão do agente alvo.
[0075]Em certas modalidades, o método é utilizado para expor os espermatozoides in vitro a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo a fim de melhorar a qualidade.
[0076]Em certas modalidades, o espermatozoide é in vitro.
[0077]Em certas modalidades, o espermatozoide está presente no líquido seminal ou uma forma diluída do mesmo.
[0078]Em certas modalidades, o espermatozoide está em um meio adequado. Em certas modalidades, o espermatozoide é diluído em um meio adequado.
[0079]Em certas modalidades, o espermatozoide é enriquecido para uma determinada característica, tal como motilidade, viabilidade, vitalidade, capacitação, integridade aumentada ou maior do DNA ou qualidade reduzida ou menor do DNA.
[0080]Em certas modalidades, o espermatozoide é separado, por exemplo, por centrifugação com gradiente de densidade, por uma técnica de sedimentação-migração (swim-up) ou por citometria de fluxo. Métodos para separação de espermatozoides são conhecidos no estado da técnica.
[0081]Em certas modalidades, o espermatozoide está presente em um meio para preparação de espermatozoides. Meios para preparação de espermatozoides são conhecidos no estado da técnica e disponíveis comercialmente. Em certas modalidades, o espermatozoide está presente em um meio para lavagem de espermatozoides.
[0082]Em certas modalidades, o espermatozoide é exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo antes, durante e/ou depois da capacitação. Em certas modalidades, o espermatozoide é exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo antes, durante e/ou depois da maturação.
[0083]Em certas modalidades, o espermatozoide está presente em um meio para fertilização in vitro (FIV). Meios para FIV são conhecidos no estado da técnica e disponíveis comercialmente.
[0084]Em certas modalidades, o espermatozoide está presente em um meio para congelamento ou crioconservação. Meios para congelamento/crioconservação são conhecidos no estado da técnica e disponíveis comercialmente.
[0085]Em certas modalidades, o método compreende expor os espermatozoides ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo a uma concentração na faixa de 1 µm a 100 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 100 µM, 10 µm a 100 µM, 20 µm a 100 µM, 50 µm a 100 µM, 1 µm a 50 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 50 µM, 10 µm a 50 µM, 20 µm a 50 µM, 1 µm a 20 µM, 2 µm a 20 µM, 5 µm a 20 µM, 5 µm a 10 µM, 1 µm a 5 µM, 2 µm a 5 µM ou 1 µm a 2 µM. Outras faixas são contempladas.
[0086]Em certas modalidades, o método compreende expor os espermatozoides a um meio que compreende o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades, o método compreende expor os espermatozoides a um meio que compreende uma concentração de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo na faixa de 1 µm a 100 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 100 µM, 10 µm a 100 µM, 20 µm a 100 µM, 50 µm a 100 µM, 1 µm a 50 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 50 µM, 10 µm a 50 µM, 20 µm a 50 µM, 1 µm a 20 µM, 2 µm a 20 µM, 5 µm a 20 µM, 5 µm a 10 µM, 1 µm a 5 µM, 2 µm a 5 µM ou 1 µm a 2 µM. Outras faixas são contempladas.
[0087]Em certas modalidades, o espermatozoide é exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo durante 24 horas ou menos, 18 horas ou menos, 12 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas of less, 3 horas ou menos, 2 horas ou menos ou 1 hora ou menos.
[0088]Métodos para avaliar a qualidade de espermatozoides são conhecidos no estado da técnica.
[0089]Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a capacidade de fertilização dos espermatozoides. Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a habilidade dos espermatozoides para fertilizar um oócito e/ou a competência para o desenvolvimento de um embrião produzido com o espermatozoide que fertiliza um oócito. Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a habilidade dos espermatozoides para produzir um zigoto que tenha completado a clivagem “no prazo”, a habilidade dos espermatozoides para produzir um embrião de duas células que complete o desenvolvimento de blastocisto “no prazo” e a habilidade dos espermatozoides para produzir um blastocisto que inicie a eclosão.
[0090]Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a integridade do DNA ou a qualidade do DNA.
[0091]Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar uma ou mais características de um embrião produzido com o espermatozoide, tal como saúde do embrião, habilidade para desenvolver-se e/ou ter aptidão pós-natal. Os métodos para avaliar tais características são conhecidos no estado da técnica.
[0092]Em certas modalidades, o método compreende melhorar a qualidade dos espermatozoides em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 70%.
[0093]Em certas modalidades, o método é utilizado para expos o espermatozoide em um indivíduo a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para melhorar a qualidade. Em certas modalidades, o espermatozoide está in vivo em um indivíduo. Métodos para expor um indivíduo a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são descritos no presente.
[0094]Em certas modalidades, o indivíduo possui espermatozoides com capacidade de fertilização reduzida. Em certas modalidades, o indivíduo está sofrendo de ou é suscetível à fertilidade reduzida. Em certas modalidades, o indivíduo está sofrendo de ou é suscetível, uma doença, condição ou estado associado com fertilidade reduzida. Em certas modalidades, o indivíduo possui espermatozoides com integridade do DNA ou qualidade do DNA reduzida.
[0095]Em certas modalidades, o indivíduo é um idoso ou mais velho. Em certas modalidades, o indivíduo tem idade acima de 40 anos. Em certas modalidades, o indivíduo tem idade acima de 45 anos.
[0096]Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo obeso ou está com sobrepeso.
[0097]Em certas modalidades, o indivíduo fuma ou fumou.
[0098]Em certas modalidades, o método melhora a qualidade de espermatozoides em um indivíduo, permitindo, desse modo, que o indivíduo produza (ou tenha maior probabilidade de produzir) uma gestação bem-sucedida em um indivíduo adequado do sexo feminino. Em certas modalidades, o método melhora a qualidade de espermatozoides em um indivíduo, permitindo, desse modo, que o indivíduo produza (ou tenha maior probabilidade de produzir) uma gestação bem- sucedida por meios naturais em um indivíduo adequado do sexo feminino. Em certas modalidades, o método melhora a qualidade de espermatozoides em um indivíduo, permitindo, desse modo, que o indivíduo produza (ou tenha maior probabilidade de produzir) uma gestação bem-sucedida utilizando uma tecnologia de reprodução assistida. Em certas modalidades, o método melhora a qualidade da progênie produzida.
[0099]Em certas modalidades o indivíduo é humano.
[00100] Em certas modalidades, o indivíduo é um animal, como um animal de pecuária (como um cavalo, uma vaca, uma ovelha, uma cabra, um suíno), um animal doméstico (como um cão ou um gato) e outros tipos de animais, como macacos, coelhos, camundongos, ratos e animais de laboratório, e espécies de vida selvagem.
[00101] Em certas modalidades, expor os espermatozoides ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreende administrar o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo ao indivíduo. Em certas modalidades, a qualidade dos espermatozoides produzidos pelo indivíduo é melhorada. Em certas modalidades, a qualidade dos espermatozoides produzidos pelo indivíduo para fins de fertilização in vitro é melhorada.
[00102] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados a um indivíduo para fornecer uma concentração no sangue ou plasmática na faixa de 1 µM a 100 µM, 5 µM a 100 µM, 10 µM a 100 µM, 50 µM a 100 µM, 1 µM a 50 µM, 5 µM a 50 µM, 10 µM a 50 µM, 1 µM a 10 µM, 5 µM a 10 µM ou 1 µM a 5 µM. Outras faixas são contempladas.
[00103] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados ao indivíduo em uma quantidade que varia dentre uma das seguintes faixas selecionadas: 1 µg/kg a 1000 mg/kg, 1 µg/kg a 100 mg/kg; 1 µg/kg a 10 mg/kg; 1 µg/kg a 1 mg/kg; 1 µg/kg a 100 µg/kg; 1 µg/kg a 10µg/kg; 10 µg/kg a 1000 mg/kg, 10 µg/kg a 100 mg/kg; 10 µg/kg a 10 mg/kg; 10 µg/kg a 1 mg/kg; 10 µg/kg a 100 µg/kg; 10 µg/kg a 1000 mg/kg, 100 µg/kg a 100 mg/kg; 100 µg/kg a 10 mg/kg; 100 µg/kg a 1 mg/kg; 1 mg/kg a 1000 mg/kg, 1 mg/kg a 100 mg/kg; 1 mg/kg a 10 mg/kg; 10 mg/kg a 1000 mg/kg; 10 mg/kg a 100 mg/kg; e 100 mg/kg a 1000 mg/kg de peso corporal. Outras faixas são contempladas.
[00104] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados uma vez ao dia, duas vezes, múltiplas vezes ao dia ou continuamente. Outros esquemas de administração são contemplados.
[00105] Um período de administração adequado pode ser selecionado. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados ao indivíduo por um período de pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, ou pelo menos 4 semanas. Em certas modalidades, a administração é por um período contínuo. Outros períodos de administração são contemplados.
[00106] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados ao indivíduo em uma quantidade que varia dentre uma das seguintes faixas selecionadas: 1 µg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 1 µg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 1 mg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 100 µg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 10µg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 10 µg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 1 mg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 100 µg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 100 µg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 100 µg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 100 µg/kg/dia a 1 mg/kg/dia; 1 mg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 1 mg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 10 mg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia; 10 mg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; e 100 mg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia de peso corporal. Outras faixas são contempladas.
[00107] O BGP-15 e/ou um derivado do mesmo podem ser administrados ao indivíduo em uma forma adequada. A esse respeito, os termos “administrar” ou “fornecer” incluem administrar o agente ou administrar um pró-fármaco ou um derivado, o qual formará uma quantidade eficaz do agente desejado dentro do corpo do indivíduo. Os termos incluem vias de administração que são sistêmicas (p. ex., através de injeção como injeção intravenosa, oralmente em um comprimido, pílula, cápsula ou outra forma farmacêutica útil para administração sistêmica) e tópicas (p. ex., cremes, soluções, pastas, pomada, incluindo soluções como enxaguantes bucais, para administração tópica oral). Outras vias de administração são contempladas.
[00108] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados oralmente. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados por via intravenosa. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados através de injeção, tal como injeção intravenosa. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados por nebulização, por aerossóis ou por instilação no pulmão. Outras formas/vias de administração são contempladas.
[00109] O BGP-15 e/ou um derivado do mesmo podem ser administrados isoladamente ou pode ser fornecido em mistura com outros agentes terapêuticos e/ou agentes que, por exemplo, reforçam, estabilizam ou mantêm a atividade do agente. Em certas modalidades, usa-se um veículo para administração (p. ex., pílula, comprimido, implante, solução injetável etc.) que conteria o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e agente(s) adicional(is).
[00110] Os métodos aqui descritos podem também incluir terapia combinada. A esse respeito, o indivíduo pode ser tratado ou receber outro fármaco ou modalidade de tratamento em conjunto com o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo aqui descrito. Essa terapia combinada pode ser terapia sequencial, quando o indivíduo é tratado inicialmente com um e então com o outro, ou as duas ou mais modalidades de tratamento são fornecidas simultaneamente.
[00111] “Coadministrar” ou “co-administração” refere-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos juntos de uma vez. Os dois ou mais agentes terapêuticos podem ser coformulados em uma única forma farmacêutica ou “dose unitária combinada”, ou formulados separadamente e, em seguida, combinados em uma dose unitária combinada, tipicamente para administração intravenosa ou administração oral.
[00112] Quando administrada a um indivíduo, a dose terapeuticamente eficaz de um agente pode variar dependendo do agente em particular utilizado, o modo de administração, a condição e sua gravidade, bem como vários fatores físicos relacionados ao indivíduo em tratamento. Prevê-se que as doses variem com a via de administração e a natureza do agente administrado e de quaisquer outros agentes administrados. Em certas modalidades, os métodos compreendem administrar ao indivíduo doses escalonadas do BGP-15 e/ou de um derivado do mesmo e/ou doses repetidas.
[00113] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados oralmente. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados por via intravenosa. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados através de injeção, como injeção intravenosa. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados por via parenteral. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados por introdução direta aos pulmões, tal como administração por aerossóis, por nebulização e por instilação no pulmão. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados por implante. Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados por injeção subcutânea, via intra-articular, retal, intranasal, intraocular, vaginal ou transdérmica. Métodos de administração são conhecidos no estado da técnica.
[00114] “Administração intravenosa” é a administração de substâncias diretamente em uma veia.
[00115] “Administração oral” é uma via de administração em que uma substância é tomada através da boca, e inclui administração bucal, sublabial e sublingual, bem como administração enteral. Formas típicas para a administração oral de agentes terapêuticos incluem o uso de comprimidos ou cápsulas.
[00116] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados em uma formulação de liberação contínua.
[00117] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados em uma formulação de liberação imediata. O termo “formulação de liberação imediata” significa uma formulação que é projetada para liberar um agente terapêutico rapidamente no corpo ao longo de um período encurtado de tempo. Formulações de liberação imediata são conhecidas no estado da técnica.
[00118] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados em uma formulação de liberação sustentada. O termo “formulação de liberação sustentada” significa uma formulação que é projetada para liberar um agente terapêutico lentamente no corpo ao longo de um período prolongado de tempo. Formulações de liberação sustentada são conhecidas no estado da técnica.
[00119] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são administrados como um sal farmaceuticamente aceitável. A esse respeito, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a sais de adição de ácidos ou complexos metálicos que são utilizados corriqueiramente na indústria farmacêutica. Os complexos de metais incluem zinco, ferro e os semelhantes. Os ácidos adequados para uso na preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, aminoácidos acetilados, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido L-aspártico, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido A- acetamidobenzoico, ácido bórico, ácido (+)-canfórico, ácido canforsulfônico, ácido (+)- (lS)-canfor-10-sulfônico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclâmico, ácido ciclohexanossulfâmico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-disulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 2-hidroxi-etanossulfônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glicoheptônico, ácido D-glucônico, ácido D-glucurônico, ácido L-glutâmico, ácido oxo-glutárico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido iodídrico, ácido (+)-L-láctico, ácido (±)-DL-láctico, ácido lactobiônico, ácido láurico, ácido maleico, ácido (-)-L-málico, ácido malônico, ácido (±)-DL-mandélico, ácido metanossulfônico, ácido naftaleno-2- sulfônico, ácido naftaleno-1,5-dissulfônico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido nítrico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido L-piroglutâmico, ácido sacárico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico, ácido sebácido, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tânico, ácido (+)-L-tartárico, ácido tiociânico, ácido p-toluenossulfônico, ácido trifluoroacético, ácido undecilênico, ácido subérico, ácido valérico e os semelhantes.
[00120] As bases adequadas para uso na preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outras, bases inorgânicas, como hidróxido de magnésio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, hidróxido de zinco ou hidróxido de sódio; e bases orgânicas como aminas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias, alifáticas e aromáticas, incluindo L-arginina, benatamina, benzatina, colina, deanol, dietanolamina, dietilamina, dimetilamina, dipropilamina,
diisopropilamina, 2-(dietilamino)-etanol, etanolamina, etilamina, etilenadiamina, isopropilamina, N-metil-glucamina, hidrabamina, 1H-imidazol, L-lisina, morfolina, 4-(2- hidroxietil)-morfolina, metilamina, piperidina, piperazina, propilamina, pirrolidina, l-(2- hidroxietil)-pirrolidina, piridina, quinuclidina, quinolina, isoquinolina, aminas secundárias, trietanolamina, trimetilamina, trietilamina, N-metil-D-glucamina, 2-amino-2- (hidroximetil)-1,3-propanadiol, trometamina e os semelhantes.
[00121] Métodos para avaliar a qualidade de espermatozoides in vivo são conhecidos no estado da técnica.
[00122] Em certas modalidades, a avaliação da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a taxa na qual um indivíduo adequado do sexo feminino engravida.
[00123] Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende obter espermatozoides do indivíduo e avaliar a capacidade de fertilização dos espermatozoides. Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende obter espermatozoides do indivíduo e avaliar a habilidade dos espermatozoides para fertilizar um oócito e/ou a competência para o desenvolvimento de um embrião produzido com o espermatozoide. Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende obter espermatozoides do indivíduo e avaliar a habilidade dos espermatozoides para produzir um zigoto que tenha completado a clivagem no momento apropriado após a fertilização, a habilidade dos espermatozoides para produzir um embrião de duas células que completa o desenvolvimento de blastocisto dentro do prazo apropriado e a habilidade dos espermatozoides para produzir um blastocisto que inicia a eclosão. Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a integridade do DNA e/ou a qualidade do DNA. Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a atividade mitocondrial. Em certas modalidades, a avalição da qualidade dos espermatozoides compreende avaliar a motilidade dos espermatozoides.
[00124] Em certas modalidades, o método melhora a qualidade dos espermatozoides em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500%.
[00125] Em certas modalidades, o método é utilizado para prevenir e/ou tratar a qualidade reduzida de espermatozoides em um indivíduo, tratar um indivíduo com fertilidade reduzida ou tratar um indivíduo para melhorar a qualidade dos espermatozoides. Em certas modalidades, o método é utilizado para prevenir ou tratar uma condição ou estado como aqui descrito.
[00126] Certas modalidades da presente invenção provêm espermatozoides isolados produzidos pela exposição dos espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo como aqui descrito.
[00127] Em certas modalidades, os espermatozoides isolados são espermatozoides expostos ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo in vitro. Métodos para expor espermatozoides in vitro a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são aqui descritos. Os espermatozoides assim tratados podem, por exemplo, ser utilizados em uma tecnologia de reprodução assistida. Os espermatozoides podem, por exemplo, ser utilizados diretamente ou ser submetidos a tratamento adicional, isolamento ou enriquecimento.
[00128] Em certas modalidades, os espermatozoides isolados são espermatozoides isolados de um indivíduo exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo in vivo. Em certas modalidades, os espermatozoides isolados são espermatozoides isolados de um indivíduo exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. Métodos para exposição de espermatozoides in vivo a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são como aqui descritos. Os espermatozoides podem, por exemplo, ser utilizados diretamente ou ser submetidos a tratamento adicional, isolamento ou enriquecimento.
[00129] Em certas modalidades, os espermatozoides assim tratados (expostos in vitro e/ou in vivo) são utilizados para produzir embriões com competência melhorada para o desenvolvimento.
[00130] Em certas modalidades, os espermatozoides isolados são utilizados em um método de reprodução assistida. As tecnologias de reprodução assistida são como aqui descritas. Em certas modalidades, os espermatozoides assim isolados são utilizados para produzir embriões com competência melhorada para o desenvolvimento.
[00131] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de reprodução assistida que compreende utilizar espermatozoides com qualidade melhorada como aqui descrito.
[00132] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de reprodução assistida que compreende utilizar espermatozoides isolados como aqui descritos.
[00133] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento de um indivíduo para melhorar a qualidade de espermatozoides utilizando um método como aqui descrito.
[00134] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento de um indivíduo para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a qualidade de espermatozoides no indivíduo.
[00135] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento para qualidade reduzida dos espermatozoides em um indivíduo utilizando um método como aqui descrito.
[00136] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento para qualidade reduzida dos espermatozoides em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, tratar o indivíduo.
[00137] Certas modalidades da presente invenção provêm o uso de BGP- 15 e/ou um derivado do mesmo para melhorar a qualidade de espermatozoides.
[00138] Certas modalidades da presente invenção provêm o uso de BGP- 15 e/ou um derivado do mesmo em uma composição para melhorar a qualidade de espermatozoides.
[00139] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são utilizados em uma composição a uma concentração na faixa de 1 µm a 100 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 100 µM, 10 µm a 100 µM, 20 µm a 100 µM, 50 µm a 100 µM, 1 µm a 50 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 50 µM, 10 µm a 50 µM, 20 µm a 50 µM, 1 µm a 20 µM, 2 µm a 20 µM, 5 µm a 20 µM, 5 µm a 10 µM, 1 µm a 5 µM, 2 µm a 5 µM, ou 1 µm a 2 µM. Outras faixas de concentração são contempladas.
[00140] Em certas modalidades, a composição é um meio para preparação de espermatozoides. Meios para preparação de espermatozoides são conhecidos no estado da técnica e disponíveis comercialmente. Por exemplo, um meio para preparação de espermatozoides pode ser utilizado na coleta de sêmen, lavagem de espermatozoides e/ou isolamento de espermatozoides.
[00141] Em certas modalidades, a composição é um meio para fertilização in vitro. Meios para FIV são conhecidos no estado da técnica e disponíveis comercialmente.
[00142] Em certas modalidades, a composição é um meio para congelamento ou crioconservação de espermatozoides. Meios para congelamento ou crioconservação de espermatozoides são conhecidos no estado da técnica e disponíveis comercialmente.
[00143] Certas modalidades da presente invenção provêm um meio para preparação de espermatozoides, em que o meio compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00144] Em certas modalidades, o meio para preparação de espermatozoides compreende uma concentração de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo na faixa de 1 µm a 100 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 100 µM, 10 µm a 100 µM, 20 µm a 100 µM, 50 µm a 100 µM, 1 µm a 50 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 50 µM, 10 µm a 50 µM, 20 µm a 50 µM, 1 µm a 20 µM, 2 µm a 20 µM, 5 µm a 20 µM, 5 µm a 10 µM, 1 µm a 5 µM, 2 µm a 5 µM ou 1 µm a 2 µM. Outras faixas são contempladas.
[00145] Certas modalidades da presente invenção provêm um método para preparar espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a um meio para preparação de espermatozoides como aqui descrito. Métodos para preparação de espermatozoides são conhecidos no estado da técnica.
[00146] Certas modalidades da presente invenção provêm um meio para fertilização in vitro de espermatozoides, em que o meio compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00147] Em certas modalidades, o meio para fertilização in vitro compreende uma concentração de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo na faixa de 1 µm a 100 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 100 µM, 10 µm a 100 µM, 20 µm a 100 µM, 50 µm a 100 µM, 1 µm a 50 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 50 µM, 10 µm a 50 µM, 20 µm a 50 µM, 1 µm a 20 µM, 2 µm a 20 µM, 5 µm a 20 µM, 5 µm a 10 µM, 1 µm a 5 µM, 2 µm a 5 µM ou 1 µm a 2 µM. Outras faixas são contempladas
[00148] Meios para FIV são conhecidos no estado da técnica e compreendem tipicamente os seguintes componentes: cloreto de cálcio; sulfato de gentamicina; glicose; solução de albumina humana (ou animal); sulfato de magnésio; cloreto de potássio; bicarbonato de sódio; cloreto de sódio; fosfato de sódio; piruvato de sódio; e substituto sintético do soro.
[00149] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de fertilização in vitro, em que o método compreende expor os espermatozoides a um meio para fertilização in vitro como aqui descrito. Métodos para fertilização in vitro são conhecidos no estado da técnica.
[00150] Certas modalidades da presente invenção provêm um meio para congelamento ou crioconservação de espermatozoides, em que o meio compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00151] Em certas modalidades, o meio para congelamento ou crioconservação de espermatozoides compreende uma concentração de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo na faixa de 1 µm a 100 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 100 µM, 10 µm a 100 µM, 20 µm a 100 µM, 50 µm a 100 µM, 1 µm a 50 µM, 2 µm a 100 µM, 5 µm a 50 µM, 10 µm a 50 µM, 20 µm a 50 µM, 1 µm a 20 µM, 2 µm a 20 µM, 5 µm a 20 µM, 5 µm a 10 µM, 1 µm a 5 µM, 2 µm a 5 µM ou 1 µm a 2 µM. Outras faixas são contempladas.
[00152] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de congelamento de espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a um meio para congelamento ou crioconservação de espermatozoides como aqui descrito. Métodos de congelamento ou crioconservação de espermatozoides são conhecidos no estado da técnica.
[00153] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de congelamento de espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo em um ou mais dentre antes, durante e/ou depois do congelamento dos espermatozoides. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00154] Certas modalidades da presente invenção provêm medicamentos ou composições farmacêuticas contendo BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. Os medicamentos ou composições farmacêuticas podem ser utilizados nos métodos de tratamento de indivíduos aqui descritos.
[00155] Certas modalidades da presente invenção provêm uma composição farmacêutica para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00156] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente(s) adequado(s).
[00157] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo estão presentes em uma composição farmacêutica de modo a fornecer uma quantidade de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo no sangue ou plasma a uma concentração na faixa de 0,1 µM a 30 µM, 0,5 µM a 30 µM, 1 µM a 30 µM, 5 µM a 30 µM, 10 µM a 30 µM, 20 µM a 30 µM, 0,1 µM a 20 µM, 0,5 µM a 20 µM, 1 µM a 20 µM, 5 µM a 20 µM, 10 µM a 20 µM, 0,1 µM a 10 µM, 0,5 µM a 10 µM, 1 µM a 10 µM, 5 µM a 10 µM, 0,1 µM a 5 µM, 0,5 µM a 5 µM, 1 µM a 5 µM, ou 0,1 µM a 0,5 µM. Outras faixas são contempladas.
[00158] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo estão presentes em uma composição farmacêutica de modo a fornecer uma quantidade de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para administração ao indivíduo em uma quantidade que varia dentre uma das seguintes faixas selecionadas: 1 µg/kg a 1000 mg/kg, 1 µg/kg a 100 mg/kg; 1 µg/kg a 10 mg/kg; 1 µg/kg a 1 mg/kg; 1 µg/kg a 100 µg/kg; 1 µg/kg a 10µg/kg; 10 µg/kg a 1000 mg/kg, 10 µg/kg a 100 mg/kg; 10 µg/kg a 10 mg/kg; 10 µg/kg a 1 mg/kg; 10 µg/kg a 100 µg/kg; 10 µg/kg a 1000 mg/kg, 100 µg/kg a 100 mg/kg; 100 µg/kg a 10 mg/kg; 100 µg/kg a 1 mg/kg; 1 mg/kg a 1000 mg/kg, 1 mg/kg a 100 mg/kg; 1 mg/kg a 10 mg/kg; 10 mg/kg a 1000 mg/kg; 10 mg/kg a 100 mg/kg; e 100 mg/kg a 1000 mg/kg de peso corporal. Outras faixas são contempladas.
[00159] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo estão presentes em uma composição farmacêutica de modo a fornecer uma quantidade de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para administração ao indivíduo em uma quantidade que varia dentre uma das seguintes faixas selecionadas: 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, 0,5 mg to 10 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg, 5 mg/kg a 10 mg/kg. 0,1 mg/kg a 5 mg/kg, 0,5 mg/kg a 5 mg/kg, 1 mg/kg a 5 mg/kg, 0,1 mg/kg a 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg a 1 mg/kg. Outras faixas são contempladas.
[00160] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo está presente em uma composição farmacêutica de modo a fornecer uma quantidade de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para administração ao indivíduo em uma quantidade que varia dentre uma das seguintes faixas selecionadas: 1 µg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 1 µg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 1 mg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 100 µg/kg/dia; 1 µg/kg/dia a 10µg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 10 µg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 1 mg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 100 µg/kg/dia; 10 µg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 100 µg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 100 µg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 100 µg/kg/dia a 1 mg/kg/dia; 1 mg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia, 1 mg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia; 10 mg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia; 10 mg/kg/dia a 100 mg/kg/dia; e 100 mg/kg/dia a 1000 mg/kg/dia de peso corporal. Outras faixas são contempladas.
[00161] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo está presente em uma composição farmacêutica de modo a fornecer uma quantidade de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para administração ao indivíduo em uma quantidade que varia dentre uma das seguintes faixas selecionadas: 0,1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, 0,5 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, 5 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, 0,1 mg/kg/dia a 5 mg/kg/dia, 0,5 mg/kg/dia a 5 mg/kg/dia, 1 mg/kg/dia a 5 mg/kg/dia, 0,1 mg/kg/dia a 1 mg/kg/dia, ou 0,5 mg/kg/dia a 1 mg/kg/dia. Outras faixas são contempladas.
[00162] Em certas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para liberação ao indivíduo por uma ou mais dentre administração intravenosa, administração intratraqueal, administração por nebulização, administração por aerossóis, por instilação no pulmão, por administração oral, por administração parenteral, por implante, por injeção subcutânea, por via intra-articular, retal, intranasal, intraocular, vaginal ou transdérmica. Outras vias de administração são contempladas.
[00163] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são fornecidos com um veículo farmaceuticamente aceitável adequado para administrar a composição farmacêutica a um indivíduo. Os veículos podem ser escolhidos tendo por base várias considerações, incluindo a via de administração, o(s) agente(s) entregue(s) e o horário de entrega dos agentes. O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um aglutinante sólido, semissólido ou líquido substancialmente inerte, diluente, excipiente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo. Um exemplo de veículo farmaceuticamente aceitável é solução salina fisiológica. Outros veículso fisiologicamente aceitáveis e suas formulações são conhecidos no estado da técnica. Alguns exemplos de materiais que podem server como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem açúcares como lactose, glicose e sacarose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanta em pó; malte; gelatina; talco; excipientes como manteiga de cacau e ceras para supositório; óleos como óleo de amendoim, óleo de sementes de algodão; óleo de açafrão; óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis como propilenoglicol; ésteres como etil oleato e etil laurato; ágar; detergentes como TWEEN 80; agentes de tamponamento como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirógenos; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; e soluções tampão com fosfato, bem como outros lubrificantes não tóxicos compatíveis como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes.
[00164] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são fornecidos com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00165] Por exemplo, os excipientes adequados para uso na forma de comprimido incluem um comprimido com um núcleo do comprimido e um revestimento de filme como segue: núcleo do comprimido – amido de milho, amido pré-gelatinizado, amido glicolato de sódio, povidona, dibehenato de glicerol, estearato de magnésio; revestimento de filme – hipromelose, triacetato de glicerol, talco, dióxido de titânio (E171), óxido de ferro amarelo (E172), óxido de ferro vermelho (E172), etilcelulose. Outros excipientes são contemplados.
[00166] Por exemplo, um comprimido com BGP-15 e/ou um derivado do mesmo pode incluir uma quantidade do agente como um hidrato e um núcleo do comprimido com amido de milho, amido pré-gelatinizado, amido glicolato de sódio, povidona, dibehenato de glicerol e estearato de magnésio, e um revestimento de filme com hipromelose, triacetato de glicerol, talco, dióxido de titânio (E171), óxido de ferro amarelo (E172), óxido de ferro vermelho (E172) e etilcelulose.
[00167] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo podem ser administrados, ou estar presentes em uma composição farmacêutica, como sal farmaceuticamente aceitável.
[00168] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo podem ser administrados, ou estar presentes em uma composição farmacêutica, como um hidrato farmaceuticamente aceitável. Um hidrato é um aduto sólido contendo tanto o composto original (p. ex., o anidrato de um fármaco ou excipiente) e água.
[00169] Em certas modalidades, a composição farmacêutica aqui descrita compreende outros agentes terapêuticos e/ou agentes que reforçam, estabilizam ou mantêm a atividade do ingrediente ativo.
[00170] As formulações orais aqui descritas podem compreender quaisquer formas orais convencionalmente usadas, incluindo comprimidos, cápsulas, formas bucais, troches, pastilhas e líquidos orais, suspensões ou soluções. As cápsulas podem conter misturas do(s) composto(s) ativo(s) com aglutinantes inertes e/ou diluentes como os amidos farmaceuticamente aceitáveis (p. ex., amido de milho, batata ou tapioca), açúcares, agentes adoçantes artificiais, celuloses em pó, como celuloses cristalinas e microcristalinas, farinhas, gelatinas, gomas etc. Formulações úteis de comprimidos podem ser confeccionadas por compressão convencional, métodos de granulação a úmido ou granulação a seco, e utilizam diluentes farmaceuticamente aceitáveis, agentes de ligação, lubrificantes, desintegrantes, agentes modificadores de superfície (incluindo tensoativos), agentes de suspensão ou estabilizantes, incluindo estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, lauril sulfato de sódio, celulose microcristalina, carboximetilcelulose cálcica, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma acácia, goma xantana, citrato de sódio, silicatos complexos, carbonato de cálcio, glicina, dextrina, sacarose, sorbitol, fosfato dicálcico, sulfato de cálcio, lactose, caulim, manitol, cloreto de sódio, talco, amidos secos e açúcar em pó. Os agentes modificadores de superfície incluem agentes modificadores de superfície não iônicos e aniônicos. Exemplos representativos de agentes modificadores de superfície incluem, entre outros, poloxâmero 188, cloreto de benzalcônio, estearato de cálcio, álcool cetoestearílico, cera emulsificante cetomacrogol, ésteres de sorbitano, dióxido de silício coloidal, fosfatos, dodecilsulfato de sódio, silicato de magnésio e alumínio e trietanolamina. As formulações orais podem utilizar formulações com espera padrão ou liberação gradual (time-release) para alterar a absorção dos peptídeos. A formulação oral pode também consistir na administração do ingrediente ativo em água ou suco de frutas, contendo os solubilizantes ou emulsificantes adequados quando necessário. As formulações orais são conhecidas no estado da técnica e podem ser formuladas por um técnico no assunto.
[00171] Em certas modalidades, pode-se desejar administrar a composição farmacêutica diretamente às vias aéreas na forma de aerossol. Formulações para a administração de formas em aerossol são conhecidas no estado da técnica e podem ser formuladas por um técnico no assunto.
[00172] Em certas modalidades, uma composição pode também ser administrada por via parenteral (tal como diretamente no espaço articular) ou intraperitoneal. Por exemplo, soluções ou suspensões de agentes em forma não ionizada ou como um sal farmacologicamente aceitável podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo como hidroxipropilcelulose. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos em óleos. Em condições corriqueiras de armazenamento e uso, esses preparados contêm tipicamente um conservante para impedir o crescimento de microrganismos. Formulações parenterais são conhecidas no estado da técnica e podem ser formuladas por um técnico no assunto.
[00173] Em certas modalidades, as composições podem também ser administradas por injeção. As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, solução salina isotônica, etanol, poliol (p. ex., glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. Formulações injetáveis são conhecidas no estado da técnica e podem ser formuladas por um técnico no assunto.
[00174] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem também ser administradas por via intravenosa. Composições adequadas para administração intravenosa são conhecidas no estado da técnica e podem ser formuladas por um técnico no assunto. Por exemplo, solução salina isotônica pode ser utilizada em uma composição intravenosa contendo um antagonista.
[00175] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem também ser administradas por via transdérmica. Entende-se que administrações transdérmicas incluem todas as administrações através da superfície do corpo e nos revestimentos internos de passagens corporais incluindo tecidos epiteliais e mucosas.
Tais administrações podem ser realizadas utilizando um agente ativo como aqui descrito, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, em loções, cremes, espumas, adesivos, suspensões, soluções e supositórios (retais e vaginais).
[00176] A administração transdérmica pode também ser realizada através do uso de um adesivo transdérmico contendo o composto ativo e um veículo que seja inerte frente ao composto ativo, seja não tóxico para a pele e que permita a liberação do agente para absorção sistêmica na corrente sanguínea através da pele. O veículo pode assumer várias formas como cremes e pomadas, pastas, géis e dispositivos oclusivos. Os cremes e as pomadas podem ser emulsões viscosas líquidas ou semissólidas do tipo óleo em água ou água em óleo. Pastas compostas por pós absorvedores dispersos em petróleo ou petróleo hidrofólico contendo o ingrediente ativo podem também ser adequadas. Uma variedade de dispositivos oclusivos pode ser utilizada para liberar o ingrediente ativo na corrente sanguínea, como umam membrana semipermeiável cobrindo um reservatório que contém o ingrediente ativo com ou sem um veículo, ou uma matriz contendo o ingrediente ativo. Formulações transdérmicas são conhecidas no estado da técnica e podem ser formuladas por um técnico no assunto.
[00177] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode também ser administrada por meio de um supositório. As formulações em supositório podem ser confeccionadas com materiais tradicionais, incluindo manteiga de cacau, com ou sem a adição de ceras para alterar o ponto de fusão do supositório e glicerina. Bases de supositórios solúveis em água, como polietilenoglicóis de vários pesos moleculares, podem também ser utilizadas. Formulações em supositório são conhecidas no estado da técnica e podem ser formuladas por um técnico no assunto.
[00178] Existem inúmeros excipientes adicionais, formas farmacêuticas, agentes dispersantes e os semelhantes que são adequados para uso em conexão com a administração e/ou a formulação em medicamentos ou composições farmacêuticas. As formulações são conhecidas e descritas em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00179] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento de um indivíduo administrando ao indivíduo uma composição farmacêutica como aqui descrita.
[00180] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento de um indivíduo para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica como aqui descrita.
[00181] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de tratamento para qualidade reduzida dos espermatozoides em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica como aqui descrita.
[00182] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de melhorar a competência para o desenvolvimento de um embrião utilizando espermatozoides expostos a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00183] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de melhorar a competência para o desenvolvimento de um embrião produzido por um espermatozoide que fertiliza um oócito, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a competência para o desenvolvimento do embrião. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00184] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreendem um ou mais dentre BGP-15, propanolol, bimoclomol, arimoclomol, NG- 94, iroxanadina, e/ou um derivado farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, solvato, sal, tautômero, estereoisômero ou racemato de qualquer um dos mencionados antes.
[00185] Em certas modalidades, o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreendem BGP-15.
[00186] O termo “competência para o desenvolvimento”, neste relatório descritivo, inclui um ou mais de: (i) a habilidade e/ou a probabilidade do oócito produzir um embrião (por exemplo, quando da fertilização de um oócito ou por outros mecanismos, como ativação partenogênica); (ii) uma ou mais dentre a habilidade, a probabilidade e a taxa com que um oócito progride até o desenvolvimento de blastocisto quando da formação de um embrião; e (iii) a qualidade do embrião (por exemplo, conforme determinado por avaliação morfológica e/ou bioquímica) alcançada quando da produção de um embrião a partir de um oócito.
[00187] Métodos para determinar a competência para o desenvolvimento são conhecidos no estado da técnica.
[00188] Por exemplo, a habilidade com um embrião produzido a partir de um oócito exposto ao espermatozoide prograde até o desenvolvimento de blastocisto pode ser melhorada e/ou apresenta um ou mais dentre habilidade aumentada para progredir até o desenvolvimento de blastocisto, taxa aumentada de fertilização, probabilidade aumentada de progressão até o desenvolvimento de blastocisto, taxa aumentada de formação de um embrião de duas células, taxa aumentada de formação de um embrião de quatro células, taxa aumentada de formação de um blastocisto, taxa aumentada de progressão até o desenvolvimento de blastocisto e taxa aumentada de eclosão do blastocisto.
[00189] Em certas modalidades, o método compreende expor o oócito a espermatozoides in vitro. Em certas modalidades, o método compreende expor o oócito a espermatozoides in vivo.
[00190] Espermatozoides e doadores de espermatozoides são aqui descritos.
[00191] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de reprodução assistida utilizando espermatozoides expostos a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00192] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de reprodução assistida utilizando espermatozoides, em que o método compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e utilizar os espermatozoides expostos ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo no método de reprodução assistida. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00193] Tecnologias de reprodução assistida são como aqui descritas.
[00194] Em certas modalidades, a tecnologia de reprodução assistida compreende fertilização in vitro. Em certas modalidades, a tecnologia de reprodução assistida compreende inseminação artificial.
[00195] Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador idoso ou um mais velho. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador com idade acima de 40 anos. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador com idade acima de 45 anos. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador obeso ou com sobrepeso. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um doador que é ou foi tabagista.
[00196] Em certas modalidades, o espermatozoide é de um indivíduo com fertilidade reduzida. Em certas modalidades, o espermatozoide é de um indivíduo que sofre de ou é suscetível a uma doença, condição ou estado associado com fertilidade reduzida.
[00197] Em certas modalidades, o espermatozoide é exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo in vitro. Métodos para exposição in vitro de espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são como aqui descritos.
[00198] Em certas modalidades, o espermatozoide é exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo in vivo. Métodos para exposição de espermatozoides in vivo a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo, administrando-se o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo a um indivíduo, são como aqui descritos.
[00199] Em certas modalidades, o método é uma tecnologia de reprodução assistida em um humano.
[00200] Em certas modalidades, o método é uma reprodução assistida em um animal.
[00201] Certas modalidades da presente invenção provêm um embrião isolado produzido por uma tecnologia de reprodução assistida como aqui descrita. Em certas modalidades, o embrião isolado é um embrião animal.
[00202] Certas modalidades da presente invenção provêm um animal produzido utilizando uma tecnologia de reprodução assistida como aqui descrita.
[00203] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de inseminação artificial, em que o método compreende: expor um espermatozoide in vitro a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e inseminar artificialmente um indivíduo com o espermatozoide exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
[00204] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de inseminação artificial, em que o método compreende: obter espermatozoides de um indivíduo exposto a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e inseminar artificialmente um indivíduo com o espermatozoide.
[00205] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de fertilização in vitro, em que o método compreende:
expor espermatozoides in vitro to BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e fertilizar um oócito com o espermatozoide exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
[00206] Certas modalidades da presente invenção provêm um método de fertilização in vitro, em que o método compreende: obter espermatozoides de um indivíduo exposto a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e fertilizar um oócito com o espermatozoide.
[00207] FIV refere-se à fertilization de um oócito in vitro, em que o oócito é isolado do indivíduo e tipicamente incubado em meio líquido com espermatozoides para permitir a fertilização do oócito. Prevê-se que a fertilização do oócito pelo espermatozoide ocorrerá geralmente em mais de 24 horas, nas normalmente em menos de 60 horas, depois da etapa de coleta do oócito, de tal modo que a maturidade do oócito esteja em um estágio subsequente para maximizar o êxito das etapas subsequentes no procedimento de FIV.
[00208] Certas modalidades da presente invenção provêm um kit ou produto para executar um método como aqui descrito.
[00209] O kit ou produto pode conter um ou mais reagentes e/ou componentes como aqui descritos e/ou instruções para a execução de um método como aqui descrito.
[00210] Em certas modalidades, o kit ou produto é utilizado para melhorar a qualidade de espermatozoides.
[00211] Certas modalidades da presente invenção provêm um kit ou produto para melhorar a qualidade de espermatozoides, em que o kit ou produto compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para exposição aos espermatozoides. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00212] Por exemplo, um kit ou produto pode conter BGP-15 e/ou um derivado do mesmo em uma forma adequada e um meio para preparação de espermatozoides (ou componentes do mesmo) a serem combinados para tratar espermatozoides.
[00213] Em certas modalidades, o kit ou produto é utilizado em uma tecnologia de reprodução assistida.
[00214] Certas modalidades da presente invenção provêm um kit ou produto para uso em uma tecnologia de reprodução assistida, em que o kit ou produto compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para exposição a espermatozoides. BGP-15 e derivados são como aqui descritos.
[00215] Certas modalidades da presente invenção provêm um produto combinado.
[00216] Certas modalidades da presente invenção provêm um produto combinado que compreende: (i) um meio para preparação de espermatozoides; (ii) BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e opcionalmente instruções para exposição dos espermatozoides ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo no meio para preparação de espermatozoides.
[00217] Certas modalidades da presente invenção provêm um produto combinado que compreende: (i) um meio para FIV; (ii) BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e opcionalmente instruções para o uso de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo no meio para FIV.
[00218] Certas modalidades da presente invenção provêm um produto combinado que compreende: (i) um meio para congelamento de espermatozoides; (ii) BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e opcionalmente instruções para exposição dos espermatozoides ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo no meio para congelamento de espermatozoides.
[00219] Certas modalidades da presente invenção provêm um método para o rastreamento de um agente que melhore a qualidade de espermatozoides.
[00220] Certas modalidades da presente invenção provêm um método para o rastreamento de um agente que melhore a qualidade de espermatozoides, em que o método compreende determinar a capacidade de um derivado de BGP-15 para melhorar a qualidade de espermatozoides e identificar o derivado como um agente que melhore a qualidade de espermatozoides.
[00221] Métodos para determinar a qualidade de espermatozoides são como aqui descritos.
[00222] Em certas modalidades, o método compreende determinar a habilidade do derivado in vitro para melhorar a qualidade dos espermatozoides. Métodos para exposição de espermatozoides a agentes in vitro são como aqui descritos.
[00223] Em certas modalidades, o método compreende o uso de espermatozoides animais para avaliar a habilidade do derivado para melhorar a qualidade de espermatozoides.
[00224] Em certas modalidades, o método compreende o uso de espermatozoides humanos para avaliar a habilidade do derivado para melhorar a qualidade de espermatozoides.
[00225] Em certas modalidades, o método compreende determinar a habilidade do derivado in vivo para melhorar a qualidade dos espermatozoides. Métodos para exposição de espermatozoides em um indivíduo a agentes são como aqui descritos.
[00226] Em certas modalidades, o método compreende o uso de indivíduo animal ou modelo para avaliar a habilidade do derivado para melhorar a qualidade de espermatozoides in vivo.
[00227] Em certas modalidades, o derivado compreende um derivado de um dentre propanolol, bimoclomol, arimoclomal, NG-94 ou iroxanadina.
[00228] Em certas modalidades, o derivado compreende um derivado substituído.
[00229] Em certas modalidades, o derivado compreende um grupo funcional alterado.
[00230] A presente invenção é descrita mais detalhadamente pelos exemplos a seguir. deverá ser entendido que as descrições seguintes têm como objetivo descrever modalidades em particular somente e não se destinam ser limitantes com respeito a descrição acima. EXEMPLO 1 – Tratamento de espermatozoides in vitro com BGP-15 restaura a função espermática em camundongos mais velhos
[00231] Um estudo pré-clínico examinou se o tratamento com BGP-15 in vitro pode melhorar a qualidade de espermatozoides que foram afetados negativamente pelo envelhecimento. Espermatozoides de camundongos C57BL6 que eram “velhos” (>12 meses de idade) ou “jovens” (<6 meses de idade), tratados com
BGP-15 (ou veículo), foram coletados e utilizados para fertilizar o oócito de camundongos fêmeas jovens e o desenvolvimento embrionário foi avaliado.
[00232] Materiais e Métodos: As substâncias químicas foram adquiridas da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) a menos que indicado de outra forma. A concentração (1 mM) do estoque de BGP-15 (gentilmente fornecido pelos N-Gene Research Laboratories) foi preparada em água MilliQ antes do uso.
[00233] Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade de Adelaide e foram realizados de acordo com o Código de Prática no Cuidado e Uso de Animais para Propósitos Científicos da Austrália (Australian Code of Practice for the Care e Use of Animals for Scientific Purposes). Camundongos C57BL/6 foram obtidos do Laboratory Animal Services da Universidade de Adelaide ou do Animal Resources Centre (WA), e alojados nas Instalações para Animais sob um ciclo claro:escuro de 14:10 horas com acesso ad libitum a alimentos e água. Os camundongos machos eram jovens (< 6 meses de idade) ou velhos (>12 meses de idade) e com fertilidade comprovada. Cada camundongo macho foi “acasalado” com camundongos fêmeas jovens (6-8 semanas de idade), em ciclo natural 4 a 7 dias prior da coleta de espermatozoides. Os camundongos machos foram sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical, e as duas caudas do epidídimo dissecadas para isolamento de espermatozoides e FIV.
[00234] Para geração de oócitos destinados à FIV, camundongos fêmeas (6 a 8 semanas de idade) foram induzidas a ovular com hormônio por injeção intraperitoneal (i.p.) de 5 UI (unidades internacionais) por 12 g de peso corporal de Pregnant Mare Serum Gonadotrophin [Gonadotrofina sérica de égua prenhe] (PMSG; National Hormone and Peptide Program, Torrance, CA, EUA), seguida 48 horas mais tarde por 5 UI por 12 g de peso corporal de gonadotrofina coriônica humana (hCG; Merck, Sharp e Dohme), cada qual em 0,1 mL de solução salina 0,9%. Os camundongos fêmeas foram sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical 15 h depois da hCG, e COCs obtidos de ovidutos e coletados no meio para manuseio contendo meio essencial -mínimo (MEM) com tampão HEPES (Life Technologies, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro fetal bovino 1% (SFB) (Life Technologies, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e pré-aquecido até 37 ºC antes do uso.
[00235] Uma cauda do epidídimo e um ducto deferente de cada camundongo foi colocado aleatoriamente em 500 µL de meio para fertilização morno (37 ºC) contendo BGP-15 10 µM. O conteúdo dos túbulos seminíferos, contendo ou não líquido seminal e os espermatozoides, foi então extraído para o meio e o tecido restante, descartado. Os espermatozoides foram deixados no meio e colocado em uma incubadora para capacitação por 1 hora a 37 ºC e CO2 6%, O2 5%, balanço de nitrogênio. Após a capacitação, 10 µL de meio para fertilização contendo espermatozoides foram adicionados a cada 90 µL de fertilização (ver abaixo).
[00236] COCs ovulados coletados em meio para manuseio α-MEM foram lavados em meio para manuseio α-MEM fresco e, então, transferidos para meio de lavagem Cook aquecido (37 ºC) (Cook Medical, Queensland, Austrália) antes da fertilização com espermatozoides. Os meios para fertilização, lavagem e cultura de embrios eram Research Vitro Fertilisation, Research Vitro Wash e Research Vitro Cleave, respectivamente, da Cook Medical. Dez µL de espermatozoides capacitados (35.000 espermatozoides/mL) de cada grupo de tratamento foram adicionados a 90 µL da gota de fertilização, que continha os COCs lavados (15-20 COCs por gota), seguido por co- incubação por 4 h a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 6% O2 5%, balanço de nitrogênio.
[00237] Os presumíveis zigotos foram então coletados e transferidos para o meio de clivagem Cook. Os zigotos foram limpos dos espermatozoides ainda fixados à zona pelúcida e deixados cultivar durante 5 dias a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 6% O2 5%, balanço de nitrogênio, a uma concentração de 20 embriões por 20 µL.
[00238] No Dia 2, a fertilisação foi avaliada e embriões foram classificados quanto à primeira clivagem. Embriões de 2 células foram então transferidos para uma gota de 20 µL de meio para clivagem Cook fresco (10-15 embriões por gota) e cultivados a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% O2 5%, balanço de nitrogênio. Os embriões foram cultivados até o dia 5, quando submetidos à avaliação de formação de blastocisto e status de eclosão. A morfolofia dos embriões foi classificada como adequadamente desenvolvida (“no prazo”) utilizando os critérios seguintes; no Dia 2, embriões no estágio de 2 células e no Dia 5, blastocistos ou eclosão de blastocistos. A taxa de desenvolvimento foi avaliada no Dia 2 como a porcentagem de embriões atendendo aos critérios de desenvolvimento no prazo desde o número inicial de oócitos; enquanto o desenvolvimento no Dia 5 como a porcentagem de embriões atendendo aos critérios de desenvolvimento no prazo desde embriões de 2 células.
Análises estatísticas
[00239] Todos os dados tiveram a normalidade da distribuição testada antes das análises. Todas as medições são relatads como média ± SEM. A significância estatística foi determinada como indicado, por teste t de Student, utilizando GraphPad Prism v008 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA) para Windows.
[00240] Os dados são apresentados na Figura 1, que mostra o efeito do tratamento in vitro com BGP-15 sobre restauração da função espermática. Os espermatozoides foram coletados do epidídimo e ducto deferente de camundongos machos que eram “jovens” (6 semanas de idade) ou “velhos” (1 ano de idade) e deixados passar por capacitação (maturação) por um hora in vitro em meio controle (não tratados) ou meio contendo BGP-15 10 µM. Subsequentemente, os espermatozoides foram utilizados para fertilização in vitro de oócitos de camundongos fêmeas jovens e avaliou-se o desenvolvimento de supostos zigotos: A) Porcentagem de supostos zigotos que haviam completado a clivagem que haviam completado a clivagem 24 h após a FIV. B) Porcentagem de embriões de 2 células que completou o desenvolvimento de blastocisto 5no Dia 5; e C) Porcentagem de blastocistos que haviam iniciado a eclosão. N= 6-12 camundongos por grupo de tratamento. A análise foi realizada com teste t pareado que comparou comparou não tratados e tratados com BGP-15 dentro de cada grupo etário e com teste t não pareado comparando jovens e velhos.
[00241] Para os dados relativos à porcentagem de zigotos a completar a clivagem 24 horas após a FIV, houve melhoria acima de 70% em espermatozoides de um doador idoso na geração de um embrião que completou a clivagem após o tratamento with BGP-15. BGP-15 também aumentou marginalmente a taxa de clivagem de embriões em espermatozoides de jovens doadores.
[00242] Para os dados relativos à porcentagem de embriões de 2 células a completar o desenvolvimento de blastocisto no dia 5, houve melhoria acima de 70% em espermatozoides de um doador idoso na geração de embriões que completam o desenvolvimento de blastocisto após o tratamento with BGP-15. BGP-15 também aumentou marginalmente a taxa de desenvolvimento de blastocisto de embriões em espermatozoides de jovens doadores.
[00243] Para os dados relativos à porcentagem de blastocisto que iniciaram a eclosão, houve melhoria acima de 50% em espermatozoides de um doador idoso na geração de embriões que iniciam a eclosão após o BGP-15. BGP-15 também aumentou a taxa de desenvolvimento de blastocisto em espermatozoides de jovens doadores by greater than 60%.
[00244] Cada marco de desenvolvimento foi prejudicado em embriões concebidos utilizando os espermatozoides de camundongos velhos, no entanto, cada parâmetro de desenvolvimento foi melhorado pelo tratamento por 1 hora de espermatozoides “velhos” in vitro com BGP-15. EXEMPLO 2 – Tratamento in vivo com BGP-15 restaura a função espermática em camundongos mais velhos
[00245] Um experimento examinou se o tratamento com BGP-15 in vivo pode melhorar a qualidade de espermatozoides que foram afetados negativamente pelo envelhecimento. Camundongos C57BL6 machos that que eram “velhos” (>12 meses de idade) ou “jovens” (<6 meses de idade) foram tratados com BGP-15 (ou veículo), seguido pela coleta de espermatozoides, fertilização de oócitos de camundongos fêmeas jovens e avaliação do desenvolvimento embrionário. Materiais e Métodos
[00246] As substâncias químicas foram adquiridas da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) a menos que indicado de outra forma. A concentração (1 mM) do estoque de BGP-15 (gentilmente fornecido pelos N-Gene Research Laboratories) foi preparada em água MilliQ antes do uso.
[00247] Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade de Adelaide e foram realizados de acordo com o Código de Prática no Cuidado e Uso de Animais para Propósitos Científicos da Austrália. Camundongos C57BL/6 foram obtidos do Laboratory Animal Services da Universidade de Adelaide ou do Animal Resources Centre (WA), e alojados nas Instalações para Animais sob um ciclo claro:escuro de 14:10 horas com acesso ad libitum a alimentos e água.
[00248] Os camundongos machos eram jovens (< 6 meses de idade) ou velhos (>12 meses de idade) e com fertilidade comprovada. Cada camundongo macho “acasalou” com camundongos fêmeas jovens (6-8 semanas de idade) em ciclo natural, 4 a 7 dias prior da coleta de espermatozoides. Os camundongos machos foram sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical, e as duas caudas do epidídimo dissecadas para isolamento de espermatozoides e FIV.
[00249] Para geração de oócitos destinados à FIV, camundongos fêmeas (6 a 8 semanas de idade) foram induzidas a ovular com hormônio por injeção intraperitoneal (i.p.) de 5 UI (unidades internacionais) por 12 g de peso corporal de Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (PMSG; National Hormone and Peptide Program, Torrance, CA, EUA), seguida 48 horas mais tarde por 5 UI por 12 g de peso corporal de gonadotrofina coriônica humana (hCG; Merck, Sharp e Dohme), cada qual em 0,1 mL de solução salina 0,9%. Os camundongos fêmeas foram sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical 15 h depois da hCG, e COCs obtidos de ovidutos e coletados no meio para manuseio contendo meio essencial -mínimo (MEM) com tampão HEPES (Life Technologies, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro fetal bovino 1% (SFB) (Life Technologies, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e pré-aquecido até 37 ºC antes do uso.
[00250] Para os experimentos de tratamento com BGP-15 in vivo, os machos foram acasalados, depois receberam uma injeção IP de BGP-15, 15 mg/Kg de peso corporal, em solução de NaCl 0,9%, durante 4 dias antes da coleta de espermatozoides. Os espermatozoides foram então coletados e capacitados para uso em fertilização em vitro como descrito anteriormente (acima).
[00251] COCs ovulados coletados em meio para manuseio α-MEM foram lavados em meio para manuseio α-MEM fresco e, então, transferidos para meio de lavagem Cook aquecido (37 ºC) (Cook Medical, Queensland, Austrália) antes da fertilização com espermatozoides. Os meios para fertilização, lavagem e cultura de embrios eram Research Vitro Fertilisation, Research Vitro Wash e Research Vitro Cleave, respectivamente, da Cook Medical (Queensland, Austrália). Dez µL de espermatozoides capacitados (35.000 espermatozoides/mL) de cada grupo de tratamento foram adicionados a 90 µL da gota de fertilização, que continha os COCs lavados (15-20 COCs por gota), seguido por co-incubação por 4 h a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 6% O2 5%, balanço de nitrogênio.
[00252] Os presumíveis zigotos foram então coletados e transferidos para o meio de clivagem Cook. Os zigotos foram limpos dos espermatozoides ainda fixados à zona pelúcida e deixados cultivar durante 5 dias a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 6% O2 5%, balanço de nitrogênio, a uma concentração de 20 embriões por 20 µL.
[00253] No Dia 2, a fertilisação foi avaliada e embriões foram classificados quanto à primeira clivagem. Embriões de 2 células foram então transferidos para uma gota de 20 µL de meio para clivagem Cook fresco (10-15 embriões por gota) e cultivados a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% O2 5%, balanço de nitrogênio. Os embriões foram cultivados até o dia 5, quando submetidos à avaliação de formação de blastocisto e status de eclosão. A morfolofia dos embriões foi classificada como adequadamente desenvolvida (“no prazo”) utilizando os critérios seguintes; no Dia 2, embriões no estágio de 2 células e no Dia 5, blastocistos ou eclosão de blastocistos. A taxa de desenvolvimento foi avaliada no Dia 2 como a porcentagem de embriões atendendo aos critérios de desenvolvimento no prazo desde o número inicial de oócitos; enquanto o desenvolvimento no Dia 5 como a porcentagem de embriões atendendo aos critérios de desenvolvimento no prazo desde embriões de 2 células.
[00254] Os dados são apresentados na Figura 2, que mostra os efeitos do tratamento in vivo com BGP-15 sobre a restauração da função espermática. Camundongos machos que eram “jovens” (6 semanas de idade) ou “velhos” (1 ano de idade) foram “não tratados” ou tratados com BGP-15 (15 mg/kg) i.p uma vez ao dia durante 4 dias. Aproximadamente 12 h após a última injeção, espermatozoides foram coletados do epidídimo e ducto deferente utilizados para fertilização in vitro de oócitos de camundongos fêmeas jovens e avaliou-se o desenvolvimento de supostos zigotos. A) Porcentagem de supostos zigotos que haviam completado a clivagem 24 h após a FIV. B) Porcentagem de embriões de 2 células que completaram o desenvolvimento de blastocisto 5. C) Porcentagem de blastocistos que haviam iniciado a eclosão. N= 1 camundongo por grupo de tratamento.
[00255] Para os dados relativos à porcentagem de zigotos a completar a clivagem 24 horas após a FIV, houve melhoria acima de 500% em espermatozoides de um doador idoso na geração de embriões que completam a clivagem após o tratamento com BGP-15 quando comparado a um macho idoso não tratado. BGP-15 também aumentou em 30% a taxa de clivagem em espermatozoides de um doador jovem tratado quando comparado a um macho não tratado.
[00256] Para os dados relativos à porcentagem de embriões de 2 células a completar o desenvolvimento de blastocisto no dia 5, houve uma melhoria intensa em espermatozoides de um doador idoso na geração de um embrião que completou o desenvolvimento de blastocisto após o tratamento com BGP-15 quando comparado a um doador idoso que não recebeu tratamento.
[00257] Para os dados relativos à porcentagem de blastocistos que iniciaram eclosão, houve uma melhoria intensa na habilidade de espermatozoides de um doador idoso para gerar a um blastocisto em eclosão após o tratamento com BGP-
15. BGP-15 também aumentou o desenvolvimento de blastocisto até a eclosão em espermatozoides de um doador jovem em mais de 100% em comparação a espermatozoides de um doador jovem não tratado.
[00258] Cada marco de desenvolvimento foi prejudicado em embriões concebidos utilizando espermatozoides de camundongos velhos, no entanto, cada parâmetro de desenvolvimento foi melhorado pelo tratamento do camundongo “velho” com BGP-15. EXEMPLO 3 – Camundongos mais velhos produzem menos gravidez, proles menores e maior mortalidade neonatal
[00259] Camundongos machos foram acasalados com fêmeas em ciclo natural (proporção 1:1) para avaliar os seus status de fertilidade. As fêmeas foram verificadas quanto à presença de um tampão copulatório vaginal 16-18 h após o pareamento, o que indicava o acasalamento bem-sucedido. As fêmeas foram então separadas dos machos e mantidas durante aproximadamente 3 semanas para verificação de sinais de gestação ou o aparecimento de ninhadas. Camundongos machos foram classificados como férteis (quando produziam uma gestação após confirmado o acasalamento) ou subférteis (quando não produziam gestação após confirmado o acasalamento). As gestações produzidas por machos férteis foram selecionadas para estudo adicional do fenótipo da prole. Para analisar o desenvolvimento fetal, as fêmeas prenhes foram sacrificadas de modo humanitário por deslocamento cervical no dia embrionário (E) 18,5 e os fetos coletados. O número de fetos viáveis e a sua posição nos cornos uterinos foram registrados. Os fetos foram separados de tecidos extra-embrionários e lavados em Solução Salina com Tampão Fosfato (PBS) morna a 37 ºC, então medidos e pesados. As suas placentas foram isoladas, lavadas e pesadas. Para analisar o desenvolvimento do recém-nascido, foi permitido que algumas fêmeas prenhes dessem à luz. No dia pós-natal (PND) 1, o tamanho da ninhada e o número de filhotes recém-nascidos viáveis foram registrados, bem como medidos e pesados. O número de filhoetes viáveis foi registrado até o desmame em PND21-24.
[00260] Os resultados fornecidos na Figura 3 mostram que camundongos machos mais velhos produzem aproximadamente 15% menos gravidez quando comparados a machos jovens (Figura 3B), apesar de terem apresentado taxas semelhantes de acasalamento bem-sucedido (Figura 3A).
[00261] A Figura 4 mostra que camundongos mais velhos geram proles menores e exibem mortalidade neonatal maior.
[00262] Em gestações geradas por camundongos mais velhos, os fetos foram 0,14 g (10%) mais leves em E18,5 (Figura 4A) e as placentas foram 0,01 g mais leves (10%) em E18,5 (Figura 4B). Em ninhadas geradas por camundongos mais velhos, os filhotes recém-nascidos foram 0,6 g mais leves (Figura 4C) e a mortalidade de filhotes antes do desmame foi aumentada em 14% (Figura 4D).
[00263] Esses estudos mostram que o fenótipo de camundongos machos mais velhos simula aquela de homens mais velhos, a saber, o de que apresentam baixa fertilidade e má evolução neonatal. EXEMPLO 4 – Tratamento in vitro com BGP-15 não modifica a contagem de espermatozoides, viabilidade ou morfologia, mas melhora a motilidade em espermatozoides de machos mais velhos
[00264] Depois de avaliação da fertilidade (como descrita na metodologia no Exemplo 3), machos jovens férteis (jovens controles) e machos mais velhos subférteis foram selecionados para esse estudo.
[00265] Camundongos machos foram acasalados 4-7 dias antes da coleta de sêmen para análise dos espermatozoides e produção in vitro de embriões. Os camundongos foram sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical e as caudas do epidídimo e os ductos deferentes foram coletados. Um de cada par foi posicionado aleatoriamente no meio para fertilização in vitro COOK Research K-RVFE-50 (COOK MEDICAL, QLD, Austrália), contendo ou não BGP-15 10 µM. O conteúdo dos tratos reprodutivos, contendo o líquido seminal e os espermatozoides, foi então extraído para o meio, e o tecido descartado. Foi deixado que os espermatozoides capacitassem durante 1 hora a 37 ºC/CO2 6%/O2 5%.
[00266] A contagem de espermatozoides, viabilidade, morfologia e motilidade foram realizadas seguindo as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS) (100 contagens de espermatozoides para cada amostra). A contagem de espermatozoides foi determinada pela contagem em um hemocitômetro (Neubauer
Brightline, Livingstone International, NSW, Austrália). A viabilidade dos espermatozoides foi avaliada de modo cego quanto ao grupo de tratamento em amostras coradas 1:1 com Eosina utilizando um microscópio de luz, classificando 100 espermatozoides por grupo como viável (não corado) ou não viável (corado). A viabilidade foi expressa em porcentagem de espermatozoides viáveis. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada sob um microscópio de luz, classificando 100 espermatozoides por grupo como móvel progressivo, móveis não progressivo ou imóvel. A motilidade foi então expressa em percentual de motilidade total (espermatozoides móveis progressivos e não progressivos) ou percentual de motilidade para frente (espermatozoides móveis progressivos somente). Para a avaliação da morfologia dos espermatozoides, 100 espermatozoides por grupo foram classificados como normal ou anormal (defeito na cauda ou cabeça). A morfologia é expressa em porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais. Todas as amostras foram avaliadas de modo cego quanto ao grupo de tratamento utilizando microscópio de luz para cada análise.
[00267] Investigou-se se os parâmetros masculinos de espermatozoides em camundongos idosos podem ser melhorados com o tratamento de espermatoizes antes da FIV, ou de camundongos machos idosos antes da concepção utilizando BGP-
15. O protocolo do estudo é mostrado na Figura 5.
[00268] Os resultados são mostrados na Figura 6. A análise revelou que machos mais velhos apresentavam contagem significativamente menor de espermatozoides, mas semelhantes viabilidade e proporção de espermatozoides morfologicamente normais. Além disso, a motilidade deles estava também significativamente diminuída. Embora o tratamento in vitro com BGP-15 não tenha modificado a contagem de espermatozoides, a viabilidade ou a morfologia, o tratamento melhorou a motilidade (tanto motilidade total como motilidade progressiva) em espermatozoides de machos mais velhos em 10%. EXEMPLO 5 – Tratamento in vitro com BGP-15 aumenta o potencial da membrana mitocondrial (MMP) de espermatozoides
[00269] A motilidade dos espermatozoides foi vinculada à função mitocondrial, portanto, o potencial da membrana mitocondrial (MMP) dos espermatozoides foi examinada utilizando ensaios de fluorescência em células vivas para identificar e quantificar células viáveis individuais com baixo MMP e alto MMP por FACS utilizando um corante JC-1 de potenciômetro (1H-Benzimidazólio, 5,6-dicloro-2-[3-
(5,6-dicloro-1,3-dietil-1,3-dihidro-2H-benzimidazol-2-ilideno)-1-propenil]-1,3-dietil-, iodeto, (E)- 47729-63-5; ThermoFisher Scientific, MA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, aproximadamente um milhão de células foram incubadas durante 15 minutos a 37 ºC com 5 µM de solução de trabalho de JC-1 em meio para fertilização. As células foram então lavadas e analisadas por citometria de fluxo. Para todas as amostras, a população de espermatozoides foi delimitada tendo como base medições por espalhamento de luz. A fração de espermatozoides viáveis foi detectada por coloração de vivo/morto com Iodeto de Propídio (PI) (Sigma-Aldrich, MI, EUA), um corante fluorescente que penetra somente células mortas. A aquisição por citometria de fluxo de células coradas por PI foi realizada através de PE-Cy7 para fluorescência vermelha (~617 nm); enquanto a aquisição de células coradas com JC-1 foi realizada através de FITC para fluorescência verde (~525 nm) e PE para vermelha/laranja (~590). Para cada experimento, examinaram-se pelo menos 100.000 células. Todos os experimentos foram realizados em um sistema de citometria de fluxo FACSCANTO II (BD Biosciences, NSW, Austrália).
[00270] Em seguida, buscou-se comparar o potencial da membrana mitocondrial em espermatozoides de camundongos jovens e de mais velhos, uma vez que o MMP foi definido como regulador da motilidade dos espermatozoides e está vinculado à qualidade e potencial de fertilização dos espermatozoides em roedores e em humanos.
[00271] Os resultados são mostrados na Figura 7. Um exemplo de células espermáticas utiliza o corante JC-1 para MMP, em que alto MMP está em vermelho (Figura 7A). Um exemplo da análise por citometria de fluxo de população de espermatozoides mostrando aqueles com baixo MMP em verde e aqueles com alto MMP em azul é mostrado na Figura 7B. Quantificou-se as porções em azul em um grande número de machos (Figura 7C) e verificou-se que, embora os níveis de MMP não fossem diferentes entre os grupos de machos, ele aumentou significativamente em espermatozoides de machos mais velhos após o tratamento, indicando que a sua motilidade aumentada é pelo menos parcialmente explicada pelo MMP maior. EXEMPLO 6 – Um número menor de espermatozoides de machos mais velhos liga-se à zona pelúcida
[00272] Para avaliar a capacidade de espermatozoides para ligar-se à zona pelúcida e fertilizar um oócito, complexos cúmulos-oócitos (COCs) maduros foram coletados de camundongos C57BL fêmeas com 6 semanas de idade, 15 horas após superovulação com uma injeção intraperitoneal de PMSG, seguida 48 horas mais tarde por hCG. Os COCs (N=10 por macho experimental) foram colocados em gotas de 80 μL de meio para fertilização in vitro COOK Research K-RVFE-50 (COOK MEDICAL, QLD, Austrália) a 37 ºC/CO2 6%/O2 5%. Os oócitos foram inseminados com uma alíquota de amostras de espermatozoides capacitados quer tratados ou não com BGP-15, e gametas coincubados durante 4 horas. Nesse momento, a ligação dos espermatozoides à zona pelúcida dos oócitos foi avaliada por incubação durante 5 minutos com corante bisbenzimida para DNA (25 μg/mL) seguida pela imagem sob luz ultravioleta. O número de espermatozoides ligados à zona pelúcida foi avaliado pela contagem de núcleos de espermatozoides.
[00273] Investigou-se a habilidade de espermatozoides de machos mais velhos para ligar-se à zona pelúcida de oócitos MII de fêmeas jovens utilizando o corante nuclear bisbenzimida, como mostrado nesses exemplos. Os resultados são mostrados na Figura 8.
[00274] Verificou-se que a capacidade para se ligar à zona estava significativamente reduzida em machos mais velhos, mas também que esta aumentou após o tratamento com BGP-15. EXEMPLO 7 - BGP-15 resgata o desenvolvimento embrionário em machos mais velhos
[00275] A fim de coletar oócitos para a produção in vitro de embriões, camundongos fêmeas submeteram-se à hiperestimulação ovariana induzida por hormônio. Resumidamente, os animais receberam uma injeção intraperitoneal (IP) de Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG; National Hormone and Peptide Program, Torrence, EUA) em solução salina 0,9% estéril a uma dose de 5 UI/12 g de peso corporal; seguida 48 horas mais tarde por uma segunda injeção IP de Gonadotrofina coriônica humana (hCG; Pregnyl, Merck Sharp & Dohme Pty Ltd, Austrália) em solução salina 0,9% estéril a uma dose de 5 UI/12 g de peso corporal. Os camundongos foram então sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical 14 horas após a injeção de hCG, e os complexos cumulus-óocito (COCs) ovulados foram coletados do oviduto e utilizados para produzir embriões por fertilização in vitro. Resumidamente, os COCs foram lavados duas vezes em meio para lavagem Research Vitro Wash (COOK Medical, QLD, Austrália), então colocados em meio Research Vitro Fertilisation (COOK
Medical) com espermatozoides a uma concentração de 1:10 (10 µl:100 µL). Amostras de espermatozoides haviam sido coletadas anteriormente do epidídimo e ducto deferente e deixadas capacitar por 1 hora em meio Research Vitro Fertilisation a 37 ºC em CO2 6%, O2 5%. Depois de 4 horas, os presumíveis zigotos foram coletados, lavados e colocados em meio Research Vitro Cleave (10 zigotos/gota de 20 µL; COOK Medical) para cultura in vitro de embriões até o estágio de blastocisto a 37 ºC em CO2 6%, O2 5%. Os zigotos foram registrados por imagem em tempo real utilizando o sistema Primovision Time-lapse (Vitrolife Pty Ltd, Boteborg, Suécia) para análise detalhada de seus marcos de desenvolvimento, incluindo o intervalo de tempo entre divisões celulares e frequência de eventos adversos (divisão celular desigual, presença de núcleos múltiplos, colapso da cavidade blastocele). Embriões de cada macho individual foram mantidos separados durante toda a análise.
[00276] Mostrou-se que espermatozoides de machos mais velhos apresentam marcadores de baixa qualidade, mas que a motilidade, atividade mitocondrial e capacidade de ligação à zona são melhoradas por tratamento in vitro com BGP-15. Ao mesmo tempo que a avaliação da fertilidade masculina, um grupo de fêmeas jovens foi estimulado por hormônio e seus complexos cumulus-oócitos coletados. Esses COCs foram inseminados utilizando espermatozoides de todos os grupos de tratamento.
[00277] Depois de incubação no meio para fertilização por 4 horas, os supostos zigotos foram avaliados quanto à presença de pró-núcleos e cultivados in vitro por 5 dias. O desenvolvimento embrionário foi registrado durante esse tempo usando a tecnologia de imagem com lapso de tempo. O desenvolvimento foi avaliado nos dias 2 e 5 após a FIV quanto aos estágios de 2 células e de blastocisto, respectivamente.
[00278] Os resultados são mostrados na Figura 9. Camundongos machos mais velhos apresentaram desenvolvimento embrionário pré-implantação alterado, caracterizado por tempo em atraso para primeira clivagem em embriões fertilizados e maior frequência de colapso do blastocisto durante a expansão e antes da eclosão. EXEMPLO 8 - BGP-15 resgata o desenvolvimento embrionário em machos mais velhos
[00279] A fim de coletar oócitos para a produção in vitro de embriões, fêmeas submeteram-se à hiperestimulação ovariana induzida por hormônio. Resumidamente, os animais receberam uma injeção intraperitoneal (IP) de Pregnant
Mare Serum Gonadotropin (PMSG; National Hormone and Peptide Program, Torrence, EUA) em solução salina 0,9% estéril a uma dose de 5 UI/12 g de peso corporal; seguida 48 horas mais tarde por uma segunda injeção IP de Gonadotrofina coriônica humana (hCG; Pregnyl, Merck Sharp & Dohme Pty Ltd, Austrália) em solução salina 0,9% estéril a uma dose de 5 UI/12 g de peso corporal. Os camundongos foram então sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical 14 horas após a injeção de hCG e os complexos cumulus-óocito (COCs) ovulados foram coletados do oviduto e utilizados para produzir embriões por fertilização in vitro. Resumidamente, os COCs foram lavados duas vezes em meio Research Vitro Wash (COOK Medical, QLD, Austrália), então colocados em meio Research Vitro Fertilisation (COOK Medical) com espermatozoides a uma concentração de 1:10 (10 µL:100 µL). Amostras de espermatozoides haviam sido coletadas anteriormente do epidídimo e ducto deferente e deixadas capacitar por 1 hora em meio Research Vitro Fertilisation a 37 ºC em CO2 6%, O2 5%. Depois de 4 horas, os presumíveis zigotos foram coletados, lavados e colocados em meio Research Vitro Cleave (10 zigotos/gota de 20 µL; COOK Medical) para cultura in vitro de embriões até o estágio de blastocisto a 37 ºC em CO2 6%, O2 5%. O desenvolvimento no prazo dos embriões foi analisado pela avaliação de seus estágios de desenvolvimento no dia 2 (primeira clivagem) no dia 5 (formação de blastocisto e status de eclosão). Os embriões de cada macho individual foram mantidos separados por toda a análise.
[00280] Depois da FIV e cultura in vitro, a porcentagem de embriões de 2 células no dia 2 e a de embriões em blastocisto no dia 5 foram menores para pais mais velhos. Os resultados são mostrados na Figura 10.
[00281] Depois do tratamento com BGP-15 dos espermatozoides durante a capacitação, a porcentagem de embriões de 2 células no dia 2 e blastocisto e embriões com blastocisto em eclosão no dia 5 melhoraram para pais mais velhos. EXEMPLO 9 - In vivo BGP-15 melhora a morfologia e MMP de espermatozoides em machos mais velhos
[00282] O tratamento in vitro melhorou a qualidade de espermatozoides e o desenvolvimento embrionário, assim, em seguida, testou-se se este melhoraria a qualidade e competência de espermatozoides para o desenvolvimento quando usado in vivo.
[00283] Delineou-se, em seguida, uma abordagem experimental semelhante, em que alguns daqueles machos mais velhos que não haviam conseguido produzir uma gravidez, foram tratados com BGP-15 diariamente por 4 dias antes da FIV. O protocolo é mostrado na Figura 11.
[00284] Após avaliação da fertilidade (como descrita na metodologia no exemplo 3), machos jovens férteis (jovens controles) e machos mais velhos subférteis foram selecionados para esse estudo.
[00285] Camundongos machos foram acasalados 5-7 dias antes do seu uso como doador de espermatozoides para análise do sêmen e a produção in vitro de embriões. A metade dos machos mais velhos recebeu uma injeção intraperitoneal diária de BGP-15 a 15 mg/Kg durante 4 dias antes da coleta de sêmen. Os camundongos foram sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical e as caudas do epidídimo e os ductos deferentes foram coletados e colocados no meio para fertilização in vitro COOK Research K-RVFE-50 (COOK MEDICAL, QLD, Austrália). O conteúdo dos tratos reprodutivo, contendo o líquido seminal e os espermatozoides, foi então extraído no meio, e o tecido removido. Os espermatozoides foram deixados capacitar 1 hora a 37 ºC em CO2 6%, O2 5%.
[00286] A contagem de espermatozoides, viabilidade, morfologia e motilidade foram realizadas seguindo as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS) (100 contagens de espermatozoides para cada amostra). A contagem de espermatozoides foi determinada pela contagem em um hemocitômetro (Neubauer Brightline, Livingstone International, NSW, Austrália). A viabilidade dos espermatozoides foi avaliada de modo cego quanto ao grupo de tratamento em amostras coradas 1:1 com eosina sob um microscópio de luz, classificando 100 espermatozoides por grupo como viáveis ou não viáveis. A viabilidade foi expressa em porcentagem de espermatozoides viáveis. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada sob um microscópio de luz, classificando 100 espermatozoides por grupo como móveis progressivos, móveis não progressivos ou imóveis. A motilidade foi então expressa em percentual de motilidade total (espermatozoides móveis progressivos e não progressivos) ou percentual de motilidade para frente (espermatozoides móveis progressivos somente). Para a avaliação de morfologia dos espermatozoides, 100 espermatozoides por grupo foram classificados como normais ou anormais (defeito na cauda ou cabeça). A morfologia é expressa em porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais. Todas as amostras foram avaliadas de modo cego quanto ao grupo de tratamento sob um microscópio de luz para cada análises.
[00287] A fim de coletar oócitos para a produção in vitro de embriões, camundongos fêmeas foram submetidas à hiperestimulação ovariana induzida por hormônio. Resumidamente, os animais receberam uma injeção intraperitoneal (IP) de Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG; National Hormone and Peptide Program, Torrence, EUA) em solução salina 0,9% estéril a uma dose de 5 UI/12 g de peso corporal; seguida 48 horas mais tarde por uma segunda injeção IP de Gonadotrofina coriônica humana (hCG; Pregnyl, Merck Sharp & Dohme Pty Ltd, Austrália) em solução salina 0,9% estéril a uma dose de 5 UI/12 g de peso corporal. Os camundongos foram então sacrificados de modo humanitário por deslocamento cervical 14 horas após a injeção de hCG, e os complexos cumulus-oócito (COCs) ovulados foram coletados do oviduto e usados para produzir embriões por fertilização in vitro. Resumidamente, os COCs foram lavados duas vezes em meio Research Vitro Wash (COOK Medical, QLD, Austrália), então colocados em meio Research Vitro Fertilisation (COOK Medical) com espermatozoides a uma concentração de 1:10 (10 µL:100 µL). Amostras de espermatozoides haviam sido coletadas anteriormente do epidídimo e ducto deferente e deixadas capacitar por 1 hora em meio Research Vitro Fertilisation a 37 ºC em CO 2 6%, O2 5%. Depois de 4 horas, os presumíveis zigotos foram coletados, lavados e colocados em meio Research Vitro Cleave (10 zigotos/gota de 20 µL; COOK Medical) para cultura em vitro de embriões até o estágio de blastocisto a 37 ºC em CO2 6%, O2 5%. O desenvolvimento no prazo dos embriões foi analisado avaliando os seus estágios de desenvolvimento no dia 2 (primeira clivagem) e no dia 5 (formação de blastocisto e status de eclosão).
[00288] O Potencial de Membrana (MMP) foi examinado utilizando ensaios de fluorescência em células vivas para identificar e quantificar células viáveis individuais com baixo MMP e alto MMP por FACS utilizando um corante JC-1 de potenciômetro (1H-Benzimidazólio, 5,6-dicloro-2-[3-(5,6-dicloro-1,3-dietil-1,3-dihidro-2H- benzimidazol-2-ilideno)-1-propenil]-1,3-dietil-, iodeto, (E)- 47729-63-5; ThermoFisher Scientific, MA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, aproximadamente um milhão de células foi incubada durante 15 minutos a 37 ºC com 5 µM de solução de trabalho de JC-1 em meio para fertilização. As células foram então lavadas e analisadas por citometria de fluxo. Para todas as amostras, a população de espermatozoides foi delimitada tendo como base medições por espalhamento de luz. A fração de espermatozoides viáveis foi detectada por coloração de vivo/morto com
Iodeto de Propídio (PI) (Sigma-Aldrich, MI, EUA), um corante fluorescente que penetra somente células mortas. A aquisição por citometria de fluxo de células coradas por PI foi realizada através de PE-Cy7 para fluorescência vermelha (~617 nm); enquanto a aquisição de células coradas com JC-1 foi realizada através de FITC para fluorescência verde (~525 nm) e PE para vermelha/laranja (~590). Para cada experimento, examinaram-se pelo menos 100.000 células. Todos os experimentos foram realizados em um sistema de citometria de fluxo FACSCANTO II (BD Biosciences, NSW, Austrália).
[00289] Os resultados são mostrados na Figura 12. O tratamento in vivo com BGP-15 não afetou significativamente a contagem de espermatozoides, viabilidade ou motilidade em machos mais velhos mas, surpreendentemente, aumentou a proporção de espermatozoides morfologicamente normais, sugerindo que este pode estar afetando a espermatogênese, este também aumentou a população de espermatozoides com alto MMP.
[00290] Verificou-se também que o tratamento antes da FIV resgatou o desenvolvimento embrionário em machos mais velhos a níveis semelhantes aos de machos jovens. O desenvolvimento de embriões de 2 células e blastocistos de machos mais velhos foi aumentado até níveis idênticos àqueles de embriões provenientes de camundongos machos jovens. Esse achado indica que o tratamento in vivo com BGP-15 pode potencialmente restaurar o potencial reprodutivo em machos mais velhos (Figura 13).
[00291] Em conclusão, mostra-se que a idade afeta negativamente a qualidade dos espermatozoides e o potencial de desenvolvimento, e esses são associados com a falha em produzir uma gestação de camundongos mais velhos. No entanto, o tratamento com BGP-15 melhora a qualidade dos espermatozoides e resgata o desenvolvimento embrionário depois da FIV, indicando que este poderia ser uma terapia potencial para tratar infertilidade relacionada à idade ou outros tipos de subfertilidade masculina. EXEMPLO 10 – Tratamento com BGP-15 in vitro em espermatozoides humanos
[00292] Pacientes do sexo masculino na Fertility SA (Austrália do Sul) consentiram em doar amostras de sêmen que excediam os seus tratamentos. Essas amostras descartadas foram usadas para testar o efeito de BGP-15 sobre espermatozoides humanos. O volume de amostra, a contagem de espermatozoides, viabilidade, morfologia e motilidade foram realizados seguindo as diretrizes da
Organização Mundial da Saúde (OMS) (100 contagens de espermatozoides para cada amostra por cada teste). Os espermatozoides foram diluídos 1:20 em líquido de diluição de espermatozoides, depois, 10 µL foram utilizados para contar o número de espermatozoides por mL com um hemocitômetro (Neubauer Brightline, Livingstone International, NSW, Austrália). A viabilidade dos espermatozoides foi avaliada, de modo cego quanto ao grupo de tratamento, em amostras coradas 1:1 com eosina sob um microscópio de luz, classificando 100 espermatozoides por grupo como viáveis (não corados) ou não viáveis (corados). A viabilidade foi expressa em porcentagem de espermatozoides totais. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada sob um microscópio de luz, classificando 100 espermatozoides por grupo como móveis progressivos, móveis não progressivos ou imóveis. A motilidade foi então expressa em percentual de motilidade total (espermatozoides móveis progressivos e não progressivos) ou percentual de motilidade para frente (espermatozoides móveis progressivos somente). Para avaliação de morfologia dos espermatozoides, 100 espermatozoides por grupo foram classificados como normais ou anormais (defeito na cauda ou cabeça). A morfologia é expressa em porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais. Todas as amostras foram avaliadas de modo cego quanto ao grupo de tratamento, utilizando um microscópio de luz para cada análise.
[00293] Amostras de sêmen humano foram divididas em duas alíquotas, e uma metade permaneceu intacta (sêmen puro) enquanto a outra metade foi lavada com centrifugação (espermatozoides lavados). A lavagem foi no meio celular Biggers, Whitten e Whittingham (BWW) contendo álcool polivinílico 1 mg/mL (PVA) com osmolaridade entre 290-310 mOsmo/kg, a 500 g por 10 minutos para remover qualquer plasma seminal. O pellet contendo as células espermáticas foi gentilmente ressuspenso em 1 mL de meio BWW/PVA morno. A contagem de espermatozoides, viabilidade e motilidade foram avaliadas como descrito anteriormente. Depois disso, as amostras, pura e lavada, foram ainda divididas na metade e tratadas ou não com BGP- 15 10 µM. Após incubação por 30 minutos, as células foram lavadas em BWW/PVA, então divididas para os seguintes ensaios: MitoSox Red (MSR), Potencial de Membrana (JC-1 e TMRM), 8-oxoguanina (8OHdG), Cromomicina A3 (CMA3) e Teste de Dispersão da Cromatina de Espermatozoides (SCD/Halo), os quais são descritos mais detalhadamente abaixo.
[00294] As análises por citometria de fluxo foram conduzidas em um citômetro FACS-Canto II Flow (Becton Dickinson, CA) com laser de argônio a 488 nm. Mediu-se o espalhamento para frente e o espalhamento lateral para gerar um gráfico de espalhamento, o qual foi usado para delimitar células espermáticas somente, excluindo qualquer células ou resíduos contaminantes. No total, 10.000 eventos foram registrados para cada amostra. Todos os dados foram analisados por meio do software BD FACSDiva (Becton Dickinson).
[00295] Materiais: MitoSox Red (no M36008), SYTOX Green Nucleic Acid Stain (no S7020), kit Live/Dead Fixable Far red dead cell stain (no L10120), JC-1 (T3168) e Alexa Fluor 488 de cabra anti-IgG de camundongo (no A11001) são da Life Technologies, atualmente Thermo Fisher (Waltham, MA, EUA). O anticorpo DNA/RNA Damage (NB110-96878) é adquirido da Novus Biologicals (Littleton, CO, EUA) e Cromomicina A3 (no 230752) é da Calbiochem, atualmente Merck Millipore (Burlington, MA, EUA). DAPI (no D9542), os reagentes Perclorato do éster metílico de tetrametilrodamina (no T5428) e o meio BWW são da Sigma Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA).
[00296] Ensaio de produção mitocondrial de ROS (Mitosox Red): As células foram coradas com MitoSOX Red (MSR) (2 μM) e Sytox Green (0,05 μM) durante 15 minutos a 37°C, protegidas da luz. A isso, seguiu-se centrifugação a 500 g por 5 minutos e ressuspensão em BWW/PVA para análise por citometria de fluxo.
[00297] Ensaio de potencial da membrana mitocondrial (MMP) (JC-1): As células foram coradas com JC-1 (2 µM) e com o kit Live/Dead Fixable Far red com corante para células mortas durante 15 minutos a 37 °C, protegidas da luz. A isso, seguiu-se centrifugação a 500 g por 5 minutos e ressuspensão em BWW/PVA para análise por citometria de fluxo.
[00298] Ensaio de potencial da membrana mitocondrial (MMP) (TMRM): As células foram coradas com Perclorato do éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) (25 nM) e o corante Sytox Green para vitalidade (0,05 μM) por 30 minutos a 37 °C, no escuro. A isso, seguiu-se centrifugação a 500 g por 5 minutos e ressuspensão em BWW/PVA para análise por citometria de fluxo.
[00299] Ensaio de dano ao DNA (8OHdG): As células foram centrifugadas a 500 g e ressuspensas em tampão de descondensação (DL-Ditiotreitol 2 mM e Triton X- 100 0,5% em PBS) durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram fixadas em paraformaldeído 4% durante 15 minutos a 4 ºC. As células foram então bloqueadas com soro de cabra 1,5%/PBS por 1 hora à temperatura ambiente e, a seguir, incubadas com o anticorpo DNA/RNA Damage Antibody (Novus Biologicals, NB110-96878) durante a noite a 4 ºC. O anticorpo secundário era α de Cabra contra Camundongo acoplado ao corante Alexa Fluor 488. As células foram contadas sob um microscópio de fluorescência como positiva ou não positiva para coloração de 8OHdG.
[00300] Ensaio de dano ao DNA (CMA3): Espermatozoides humanos foram fixados em paraformaldeído2 % durante 15 minutos a 4 ºC. As células foram centrifugadas a 500 g e permeabilizadas com triton 0,2% durante 15 minutos à temperatura ambiente. As células foram centrifugadas a 500 g por 5 minutos e o pellet celular foi ressuspenso em tampão de Mc’Ilvaines (18 mL de ácido cítrico 0,1 mol/L misturados com 82 mL de Na2HPO4 0,2 mol/L e MgCl2 10 mmol/L, pH 7,0). O CMA3 foi dissolvido em tampão de Mc’Ilvaines até uma concentração de 0,25 mg/mL. A cromatina das células espermáticas foi marcada por incubação com CMA3 durante 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. As células foram lavadas com tampão de Mc’Ilvaines por centrifugação a 500 g por 5 minutos e ressuspensão do pellet celular em tampão de Mc’Ilvaines antes da contagem de células marcadas com um microscópio de fluorescência.
[00301] Ensaio de dano ao DNA (HALO): Espermatozoides humanos foram congelados em nitrogênio líquido e descongelados à temperatura ambiente. As células foram misturadas com agarose 1% de baixo ponto de fusão até uma concentração final de agarose 0,7% a 37ºC. A mistura célula-agarose foi colocada sobre uma lâmina previamente revestida com agarose padrão 0,65%. As lâminas foram solidificadas a 4 ºC por 4 minutos. A cobertura foi cuidadosamente removida e a lâmina colocada horizontalmente em solução de desnaturação ácida (HCl 0,08N) por 7 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então incubadas em solução neutralizante e de lise 1 (Tris 0,4 M, DTT 0,8 M, SDS 1% e EDTA 50 mM, pH 7) por 10 minutos à temperatura ambiente, então, em solução neutralizante e de lise 2 (Tris 0,4 M, NaCl 2 M e SDS 1%, pH 7,5) por 5 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas em tampão Tris-borato-EDTA (Tris-borato 0,09 M e EDTA 0,002 M, pH 7,5) por 2 minutos, desidratadas em etanol 70%, 90% e 100% por 2 minutos, cada vez à temperatura ambiente, e secas ao ar. As lâminas foram coradas com DAPI (1/2000) por 10 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram contadas sob um microscópio de fluorescência quanto a “halo” ou “ausência de halo”.
[00302] As características das amostras de sêmen puro dos indivíduos utilizados para análise são mostradas na Tabela 1. Tabela 1 Contagem (x106 Idade (anos) Volume (mL) Motilidade (%) Viabilidade (%) Morfologia (%) espermatozoides /mL) Número Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP Total 35 38,1 6,4 1,5 1,0 115,8 84,4 64,9 14,7 75,0 14,5 24,1 10,6
[00303] Os resultados são mostrados na Figura 14. Como pode ser visto, BGP-15 aumentou a motilidade de espermatozoides lavados em 7,8%
[00304] Nenhum efeito foi observado no perfil mitocondrial, incluindo ROS (dados não mostrados).
[00305] A Tabela 2 mostra as características das amostras de sêmen puro dos indivíduos utilizados para análise tendo por base a idade. Tabela 2 Contagem (x106 Idade (anos) Volume (mL) Motilidade (%) Viabilidade (%) Morfologia (%) espermatozoides /mL) Número Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP Total 35 38,1 6,4 1,5 1,0 115,8 84,4 64,9 14,7 75,0 14,5 24,1 10,6 Homens 19 34,4 2,6 1,3 0,8 114,4 99,6 67,4 14,7 80,7 8,6 19,6 10,8 <40 anos Homens 11 44,5 3,5 1,6 1,0 117,0 70,0 60,2 15,9 67,5 16,9 28,4 7,4 >40 anos
P (homens <40 vs. >40 <0,0001 0,5 0,9 0,2 0,01 0,02 anos Sig. **** ns ns ns * ns
[00306] Como pode ser visto, 13,2% de viabilidade reduzida dos espermatozoides em amostras de sêmen puro de homens acima de 40 anos de idade.
[00307] Foi também verificado que BGP-15 impede danos ao DNA em espermatozoides humanos (Figura 15). Isso foi demonstrado com 3 ensaios diferentes de danos ao DNA: detecção de 8-OHdg, ensaio de fragmentação de DNA (halo) e coloração com cromomicina A3.
[00308] A Figura 16 mostra 21,02% de viabilidade reduzida em amostras de sêmen lavado de homens acima de 40 anos de idade (Figura 16C) e que a lavagem afetou a viabilidade de espermatozoides em homens acima de 40 anos de idade (Figura 16E), reduzindo-a em 11,7 %.
[00309] Usando sêmen de “jovem normal”, induziu-se ROS in vitro (utilizando H2O2) e foi testado se BGP-15 tinha qualquer efeito protetor. O tratamento com BGP-15 por 1 hora impediu danos ao DNA contra concentrações crescentes de H2O2.
[00310] Os métodos de seleção de espermatozoides que fazem uso de centrifugação para separar as células espermáticas do plasma seminal, tal como lavagem, afetam a vitalidade e a motilidade dos espermatozoides, enquanto aumentam os danos ao DNA.
[00311] Um tratamento por 30 minutos in vitro com BGP-15 melhorou a motilidade em espermatozoides lavados de homens mais velhos, enquanto também reduzindo os danos ao DNA em amostras puras e lavadas. Além disso, a co-incubação com BGP-15 por 1 hora pode proteger o DNA de espermatozoides de dano oxidativo contra estresse oxidativo in vitro. EXEMPLO 11 –Meio para preparação de espermatozoides contendo BGP-15
[00312] O Exemplo 1 fornece apoio experimental para o uso de BGP-15 em um meio que permite a capacitação de espermatozoides.
[00313] Tipicamente, como a capacitação de espermatozoides é essencial para tecnologias de reprodução assistida, os espermatozoides são separados do plasma seminal assim que possível após a ejaculação e colocados em um meio capaz de apoiar a capacitação.
[00314] Para tecnologias de reprodução assistida humana, os métodos para preparar e utilizar espermatozoides são descritos, por exemplo, no Capítulo 7 de “A Practical Guide to Basic Laboratory Andrology”, 2010 por Lars Björndahl, David Mortimer, Christopher L. R. Barratt, Jose Antonio Castilla, Roelof Menkveld, Ulrik Kvist, Juan G. Alvarez, Trine B. Haugen; Cambridge University Press.
[00315] BGP-15 e/ou um derivado do mesmo como aqui descrito podem ser adicionados ao meio para coleta do sêmen ou preparar espermatozoides humanos para uso em uma tecnologia de reprodução assistida:
[00316] Um método para preparação de espermatozoides utilizando meio contendo BGP-15 é descrito abaixo.
[00317] Tipicamente, utiliza-se um meio de cultura com tampão bicarbonato contendo albumina sérica humana ou um substituto sérico sintético. Por exemplo, o meio Sperm Preparation Medium (Cat. no 10690010A) fornecido pela Origio pode ser utilizado e BGP-15 adicionado a uma concentração de BGP-15 10 µM.
[00318] Os procedimentos para lavagem de espermatozoides e isolamento de espermatozoides móveis viáveis pode ser pelo método swim-up (sedimentação- marcação) ou por um método com gradiente de densidade (por exemplo, o método com gradiente de densidade SupraSperm® (Origio Ref. 1091/1092/1097)).
[00319] Esse procedimento pode ser utilizado para produzir espermatozoides adequados para tratamento de FIV de mulheres, quer a causa da infertilidade seja masculina ou feminina.
[00320] Composição: BGP-15 (p. ex., 10 µM); Substituto Sérico Sintético (EUA: ART Supplement), albumina sérica humana (HSA); glicose; piruvato de sódio; sais fisiológicos; bicarbonato de sódio; HEPES e sulfato de gentamicina 10 µg/mL.
[00321] Metodologia: Equilibrar o meio para preparação de espermatozoides por, no mínimo, 2 horas em CO2 5-6% a 37 °C antes do uso. Logo após a coleta, uma amostra de sêmen é misturada bastante à temperatura ambiente. Depois de concluído o processo de mistura, a concentração e motilidade dos espermatozoides devem ser avaliadas (sob o microscópio). Dispor o sêmen liquefeito em camadas de 0,5-1mL em um tubo debaixo de 1-2 mL de meio para preparação de espermatozoides pré-equilibrado. Incubar em um ambiente com CO2 a 37 °C por 30-60 minutos. Depois do swim-up, a camada superior de 0,2-1 mL é aspirada e avaliada quanto à concentração e motilidade dos espermatozoides. Se a contagem de espermatozoides for baixa demais, os 0,5 mL seguintes são incluídos também. Agrupar os aspirados. Se for necessário concentrar mais o meio aspirado com os espermatozoides, adicionar 5 mL do meio para preparação de espermatozoides aos aspirados agrupados, misturar e centrifugar a 400 g por 10 minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet restante em volume adequado do meio para preparação de espermatozoides pré-equilibrado.
[00322] Essa composição e método podem ser particularmente adequados para melhorar a qualidade de espermatozoides de doadores que sofrem de subfertilidade, sofrem de qualidade reduzida dos espermatozoides ou com idade acima de 40 anos.
[00323] Kits e/ou produtos utilizando os reagentes acima e/ou instruções para realização do método podem ser produzidos. EXEMPLO 12 – Meio para FIV contendo BGP-15
[00324] O uso de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo em um meio para
FIV humana adequado para fertilização de um oócito é também contemplado.
[00325] Um meio para FIV humana, tal como o Universal IVF Medium, disponibilizado comercialmente pela Origio (Universal IVF Medium, Cat. no 1030/1031), e contendo BGP-15 (10 µM) pode ser utilizado. Tal meio pode ser utilizado para fertilização do oócito com espermatozoides não tratados, e o embrião resultante cultivado até o estágio de 2-8 células.
[00326] Composição: Substituto Sérico Sintético (EUA: ART Supplement), albumina sérica humana (HSA), sais fisiológicos, glicose, piruvato de sódio, bicarbonato de sódio e sulfato de gentamicina (10 µg/mL); e BGP-15 (p. ex., 10 µM).
[00327] Metodologia: Equilibrar o meio para preparação de espermatozoides por, no mínimo, 2 horas em CO2 5-6% a 37 °C antes do uso. Recuperar os oócitos como habitual e preparar os espermatozoides. Os espermatozoides podem ser preparados utilizando um meio com BGP-15 ou sem BGP- 15, por exemplo, como descrito no Exemplo 11. Fertilizar os oócitos (Dia 0) em meio para FIV pré-equilibrado contendo BGP-15. Quando ICSI é necessária, a injeção é realizada em meio de manutenção pré-aquecido contendo BGP-15. Em 16-20 horas (Dia 1), verificar a formação de pró-núcleos, então lavar e transferir cuidadosamente os zigotos para microgotas frescas de 50 µL ou cavidades/pratos de 0,5 mL de Universal IVF Medium cobertas com Parafina Líquida. Os embriões devem ser cultivados isoladamente ou em múltiplos até no máximo 4 por cavidade. Transferir os embriões no Dia 2 ou Dia 3. Os embriões são preparados e transferidos para o útero em 20 a 30 µL de meio de transferência pré-equilibrado ou meio Universal IVF fresco. Lavar o cateter de transferência com meio de transferência escolhido antes do uso.
[00328] Kits e/ou produtos utilizando os reagentes acima e/ou instruções para realizar o método podem ser produzidos. EXEMPLO 13 – Crioconservação de espermatozoides
[00329] O uso de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para ajudar o congelamento de espermatozoides humanos é também contemplado. As melhorias nos espermatozoides como descritas nos Exemplos acima por exposição a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo são contempladas para produzir espermatozoides com mais capazes de serem crioconservados.
[00330] Um meio para congelamento de espermatozoides humanos, tal como o meio para congelamento Cryosperm disponível comercialmente (Origio
Cryosperm; produto no 1101), e contendo BGP-15 (p. ex., 10 µM) pode ser utilizado. Tal meio pode ser utilizado para o congelamento de espermatozoides, como ajuda para manter a qualidade dos espermatozoides.
[00331] Composição: Glicerol, rafinose, glicose, piruvato de sódio; lactato de sódio, sais fisiológicos; aminoácidos; bicarbonato de sódio; HEPES; sulfato de gentamicina (10 µg/mL); BGP-15 (10 µM).
[00332] Metodologia: A. Congelamento. Assegurar que a amostra de sêmen e o meio para congelamento estejam à temperatura ambiente e diluir o sêmen 1:1 (v/v) com o meio para congelamento. O meio deve ser adicionado gota a gota ao sêmen, e a solução cuidadosamente misturada depois de cada adição do meio. A mistura é deixada à temperatura ambiente por, no mínimo, dez minutos. Carregar o sêmen diluído para canudos ou crio-tubos e lacrar de acordo com as recomendações do fabricante. Suspender os canudos horizontalmente por 30 minutos, um pouco acima da superfície do nitrogênio líquido. Os crio-tubos devem ser fixados a uma vareta e, então, suspensos acima da superfície do nitrogênio líquido pelo mesmo período de tempo. Transferir os canudos ou crio-tubos para nitrogênio líquido e armazenar a -196 ºC. B. Descongelamento. Aquecer os canudos ou crio-tubos à temperatura ambiente por 5 minutos. Abrir os canudos ou crio-tubos e remover os espermatozoides descongelados. Preparar imediatamente os espermatozoides pelo procedimento com gradiente de densidade ou o swim-up.
[00333] Kits e/ou produtos utilizando os reagentes acima e/ou instruções para realizar o método podem ser produzidos. EXEMPLO 14 – Tratamento de indivíduos do sexo masculino com fertilidade reduzida
[00334] Uma composição para administração intravenosa de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo pode ser preparada combinando uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente em uma quantidade adequada de solução salina isotônica, para administração a um indivíduo do sexo masculino com qualidade reduzida dos espermatozoides. Por exemplo, uma dose de 20 mg/kg de BGP-15 pode ser administrada por via intravenosa a um indivíduo uma vez ao dia por 8 semanas.
[00335] Alternativamente, por exemplo, duas cápsulas de 100 mg BGP-15 podem ser administradas oralmente, duas vezes a dia, a um indivíduo do sexo masculino com fertilidade reduzida por 8 semanas.
[00336] O indivíduo do sexo masculino será monitorado após a administração. A eficácia da administração pode ser pela avaliação de parâmetros como motilidade (total e progressiva), viabilidade, morfologia, atividade mitocondrial, integridade do DNA e capacidade como apoio à competência do embrião para o desenvolvimento.
[00337] Prevê-se que o procedimento acima melhorará a fertilidade do indivíduo do sexo masculino, e que também melhorará a qualidade de espermatozoides isolados do indivíduo para uso em tecnologias de reprodução assistida.
[00338] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a modalidades em particular, será reconhecido que a invenção pode ser concretizada em muitas outras formas. Será também reconhecido que a invenção aqui descrita é suscetível a variações e modificações além daquelas especificamente descritas. Deverá ser entendido que a invenção inclui todas tais variações e modificações. A invenção inclui igualmente todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individual ou coletivamente, e todas e quaisquer combinações de quaisquer duas ou mais das etapas ou características.
[00339] Além disso, deve-se notar que, neste relatório descritivo, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem aspectos no plural, a menos que o contexto já indique o contrário.
[00340] Por todo este relatório descritivo, a menos que o contexto requeira de outra forma, a palavra “compreender”, ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo”, será entendida no sentido da inclusão de um elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros declarados, mas não da exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou de números inteiros.
[00341] A referência a qualquer técnica anterior neste relatório descritivo não é, nem deve ser considerada um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que essa técnica anterior faça parte do conhecimento geral comum em qualquer país.
[00342] Os títulos individuais aqui utilizados são incluídos somente para facilidade de referência do leitor e não devem ser usados para limitar a matéria-objeto encontrada por toda a invenção ou as reivindicações. Os títulos individuais não devem ser usados na interpretação do âmbito das reivindicações ou das limitações às reivindicações.
[00343] A descrição aqui fornecida é relativa a diversas modalidades, as quais podem compartilhar características e atributos comuns. Deverá ser entendido que uma ou mais características de uma modalidade podem ser combináveis com uma ou mais características das outras modalidades. Além disso, uma única característica ou combinação de características das modalidades pode constituir modalidades adicionais.
[00344] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma no presente ou claramente contraindicado pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou redução exemplar (p. ex., “tal como”) aqui fornecidos, destina-se simplesmente a ilustrar melhor as modalidades de exemplo e não impõe uma limitação sobre o âmbito da invenção reivindicada a menos que reivindicado de outra forma. Nenhum texto no relatório descritivo deve ser interpretado como indicação de qualquer elemento não reivindicado como essencial.
[00345] Pedidos de patente futuros podem ser depositados tendo por base o presente pedido de patente, por exemplo, por reivindicação de prioridade ao presente pedido de patente, por reivindicação de status divisório e/ou por reivindicação de status de continuidade. Deverá ser entendido que as reivindicações a seguir são fornecidas a título de exemplo somente, e que não se destinam a limitar o âmbito daquilo que pode ser reivindicado em qualquer um de tais pedidos de patente futuros. Nem deve as reivindicações ser consideradas limitações ao entendimento de (ou excluir outros entendimentos de) a presente invenção. Características podem ser adicionadas ou omitidas das reivindicações de exemplo em data posterior.

Claims (43)

REIVINDICAÇÕES
1. MÉTODO PARA MELHORAR A QUALIDADE DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a qualidade dos espermatozoides.
2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreende um ou mais dentro BGP-15, propanolol, bimoclomol, arimoclomal, NG-94, iroxanadina e/ou um derivado farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, solvato, sal, tautômero, estereoisômero e/ou racemato de qualquer um dos mencionados antes.
3. MÉTODO de acordo com a reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreende BGP-15.
4. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a qualidade dos espermatozoides compreende a capacidade de fertilização.
5. MÉTODO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a capacidade de fertilização compreende a habilidade para fertilizar um oócito e/ou a competência para o desenvolvimento de um embrião produzido com o espermatozoide.
6. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o espermatozoide é um espermatozoide de um doador idoso e/ou um doador obeso ou com sobrepeso.
7. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o espermatozoide está in vitro.
8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o espermatozoide é exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo por um período de uma hora ou menos.
9. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o espermatozoide está in vivo em um indivíduo.
10. MÉTODO de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a exposição dos espermatozoides ao BGP-15 e/ou a um derivado do mesmo compreende administrar o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo a um indivíduo.
11. MÉTODO de acordo com a reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui espermatozoides com capacidade reduzida de fertilização.
12. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo idoso ou um indivíduo obeso ou com sobrepeso.
13. ESPERMATOZOIDES ISOLADOS, caracterizados pelo fato de que são produzidos pela exposição dos espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivodo do conforme definido por uma das reivindicações 1 a 12.
14. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO PARA MELHORAR A QUALIDADE DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a qualidade de espermatozoides no indivíduo.
15. MÉTODO DE TRATAMENTO QUALIDADE REDUZIDA DOS ESPERMATOZOIDES EM UM INDIVÍDUO, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, tratar o indivíduo.
16. ESPERMATOZOIDES ISOLADOS, caracterizados pelo fato de que são obtidos de um indivíduo que recebeu BGP-15 e/ou um derivado do mesmo conforme definido por uma das reivindicações 14 ou 15.
17. USO DE BGP-15 E/OU UM DERIVADO DO MESMO EM UMA COMPOSIÇÃO, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a qualidade de espermatozoides.
18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA MELHORAR A QUALIDADE DE ESPERMATOZOIDES, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
19. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO PARA MELHORAR A QUALIDADE DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica confome definida pela reivindicação 18.
20. MÉTODO DE MELHORAR A COMPETÊNCIA PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM EMBRIÃO PRODUZIDO POR UM ESPERMATOZOIDE QUE FERTILIZA UM OÓCITO, caracterizado pelo fato de que compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e, desse modo, melhorar a competência para o desenvolvimento do embrião.
21. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreende um ou mais dentre BGP-15, propanolol, bimoclomol, arimoclomal, NG-94, iroxanadina e/ou um derivado farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, solvato, sal, tautômero, estereoisômero, ou racemato de qualquer um dos mencionados antes.
22. MÉTODO de acordo com a reivindicações 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo compreende BGP-15.
23. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o espermatozoide é um espermatozoide de um doador idoso e/ou um doador obeso ou com sobrepeso.
24. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o método compreende expor os espermatozoides a o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo in vitro.
25. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 20 to 23, caracterizado pelo fato de que o método compreende expor os espermatozoides a o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo in vivo em um indivíduo.
26. MÉTODO de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o BGP-15 e/ou um derivado do mesmo ao indivíduo.
27. MÉTODO DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA UTILIZANDO ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo e utilizar os espermatozoides expostos ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo no método de reprodução assistida.
28. MÉTODO de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o espermatozoide é um espermatozoide de um doador idoso e/ou um doador obeso ou com sobrepeso.
29. MÉTODO de acordo com a reivindicações 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o método de reprodução assistida compreende fertilização in vitro.
30. MÉTODO de acordo com a reivindicações 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o método de reprodução assistida compreende inseminação artificial.
31. ANIMAL PRODUZIDO, caracterizado pelo fato de ser pelo uso de um método de reprodução assistida conforme reivinidcaçãoes 27 a 30.
32. MÉTODO DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO, caracterizado pelo fato de que compreende: expor espermatozoides in vitro a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo; e fertilizar um oócito com o espermatozoide exposto ao BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
33. KIT OU PRODUTO PARA MELHORAR QUALIDADE DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para exposição aos espermatozoides.
34. KIT OU PRODUTO PARA USO EM UM MÉTODO DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA, caracterizado pelo fato de que compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo para exposição a espermatozoides.
35. KIT OU PRODUTO, caracterizado pelo fato de que é para realizar um método conforme definido por uma das reivindicações 1 a 12, 20 a 30 ou 32.
36. MEIO PARA FERTILIZAÇÃO IN VITRO COM ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
37. MEIO PARA PREPARAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
38. MÉTODO DE CONGELAMENTO DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende expor os espermatozoides a BGP-15 e/ou um derivado do mesmo em um ou mais de antes, durante e/ou depois do congelamento dos espermatozoides.
39. MEIO PARA CONGELAMENTO DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende BGP-15 e/ou um derivado do mesmo.
40. MÉTODO PARA RASTREAMENTO DE UM AGENTE QUE MELHORE A QUALIDADE DE ESPERMATOZOIDES, caracterizado pelo fato de que compreende determinar a capacidade de um derivado de BGP-15 para melhorar a qualidade de espermatozoides e identificar o derivado como um agente que melhore a qualidade de espermatozoides.
41. MÉTODO de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o método compreende determinar a habilidade do derivado in vitro para melhorar a qualidade dos espermatozoides.
42. MÉTODO de acordo com a reivindicações 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o método compreende determinar a habilidade do derivado in vivo para melhorar a qualidade dos espermatozoides.
43. MÉTODO de acordo com uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que o derivado compreende um derivado de um dentre propanolol, bimoclomol, arimoclomal, NG-94 e iroxanadina.
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