MXPA00010560A - Composicion para mejorar la fertilidad y aplicacion de la misma - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con aplicaciones de una forma dimerizada de la lisozima para mejorar la fertilidad variada de animales o humanos. Además, se relaciona con la prevención o tratamiento de trastornos reproductivos en animales o humanos y con el uso de un dímero de lisozima para la manufactura de una composición farmacéutica adecuada para tales aplicaciones, asícomo con un método mejorado para la preservación de có1ulas humanas y animales, particularmente cé1ulas proliferativas o embrionarias, y para la prolongación de la vida de células eucarióticas.

Description

COMPOSICIÓN PARA MEJORAR LA FERTILIDAD Y APLICACIÓN DE LA MISMA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con aplicaciones a una forma dimerizada de lisozima para el mejoramiento de la fertilidad de células embrionarias animales o humanas, por ejemplo ovocitos y espermatocitos . Además se relaciona con la intervención profiláctica o el tratamiento terapéutico de la fertilidad o trastornos reproductivos en animales y humanos. La invención también se relaciona con el uso de un dimero de lisozima para la manufactura de una composición farmacéutica adecuada para tales aplicaciones y con un método mejorado para la preservación de células humanas o animales, y con una prolongación del tiempo de sobrevivencia de las células.

ANTECEDENTES La limitación del uso práctico de la lisozima y otras enzimas terapéuticamente activas fue superada a finales de los ochenta, cuando se descubrió que las formas dimerizadas aisladas de las enzimas, aunque retenían todas las propiedades benéficas de las formas diméricas conocidas, no exhibían efectos laterales negativos cuando se utilizaban en dosis terapéuticas. Las composiciones antivirales y antibacteriana que comprenden como el ingrediente activo dimero de lisozima u otras enzimas di erizadas han sido descritas en la WO 89/11294, todo el contenido de la cual será incorporado aqui como referencia. Posteriormente, se descubrieron características atractivas adicionales del dimero de lisozima y se desarrollaron aplicaciones terapéuticas adicionales del fármaco, especialmente para el tratamiento de infecciones bacterianas y virales como se describe en la WO 94/01127, todo el contenido de la cual se incorporará aqui como referencia. El inventor observó ciertos efectos inmunomoduladores de la lisozima dimerizada, particularmente en relación a la modulación de los niveles de citocina, confirmados por experimentos in vi tro e in vivo. El dimero de lisozima es capaz - entre otras cosas - de modular la síntesis de TNF , IL-2, IL-6 y INFa, y de activar la fagocitosis y los mecanismos inmunológicos relacionados con ésta. El dimero de lisozima particularmente útil para el tratamiento y profilaxis de enfermedades asociadas con niveles excesivamente altos de TNFa. También pudo de mostrarse exitosamente que las composiciones de dímero de lisozima presentan una potencia notable en la inhibición o aún la prevención total de la proliferación de células leucémicas in vivo, particularmente en el caso de la leucemia linfática inducida por virus.

Investigaciones adicionales condujeron a la manufactura de composiciones farmacéuticas que comprenden dímeros de lisozima como el componente activo aplicable en casos de trastornos del crecimiento del pelo, particularmente trastornos de crecimiento del pelo basados en mal funcionamientos o disfunciones inmunológicas, o en la prevención o tratamiento de enfermedades relacionadas con un sistema inmune suprimido. Esos efectos notables del dímero de lisozoma han sido descritos en la WO 96/21463, todo el contenido de la cual será incorporado aquí como referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De manera sorprendente, investigaciones adicionales revelaron que el dímero de lisozima también era capaz de afectar positivamente la preservación, particularmente la preservación por congelamiento de semen animal. Es de considerable importancia - también en términos de beneficios comerciales - tener muestras de esperma animal y humano preservadas apropiadamente para mantener la motilidad y fertilidad de los espermatozoides (=células de esperma) y para mantener el número de células de esperma morfológicamente cambiadas (es decir patológicamente alteradas-) tan bajo como sea posible. Es bien sabido en la técnica como utilizar varios aditivos adyuvantes en mezcla con semen para facilitar la preservación por congelamiento y proteger las células durante el descongelamiento. Por ejemplo, la solicitud de patente rusa SÜ-604556-A enseña la preparación de un medio acuoso sintético para diluir y congelar esperma de animales agrícolas, que comprende goma arábiga, glicerol, lactosa y 10 a 20% en peso de yema de huevo de pollo. El efecto del adyuvante del dímero de lisozima y su contribución a una mejora en la preservación a varias temperaturas - aunque muy frecuentemente implica al menos un paso de congelamiento profundo - de células de animal o humano incluyendo células tisulares, células sanguíneas y células de esperma es probado por la evaluación analítica de los parámetro más relevantes de actividad biológica o viabilidad del material biológico preservado y almacenado, particularmente después del descongelamiento de muestras congeladas profundamente. En el caso de células de esperma de animal o humano, las mejoras en el porcentaje de espermatozoides con motilidad normal, morfología del espermatozoide, actividad bioquímica y biológica son determinados después del descongelamiento. El tratamiento de células animales o humanas con el dímero de lisozima antes del almacenamiento y el almacenamiento de las células junto con dímero de lisozima es particularmente preferido, sin importar la temperatura de almacenamiento, por ejemplo por encima o por debajo de la temperatura del punto de congelamiento. Además el efecto del adyuvante del dímero de lisozima, los resultados indican que puede adherirse a y estabilizar las membranas celulares de los espermatozoides y otras células eucarióticas aún a temperaturas muy bajas - es también probablemente, de su actividad antibiótica y su inhibición de la penetración de posibles virus que se suma a la mejora de la eficacia de la preservación total, particularmente durante el almacenamiento líquido. Cuando se almacena a temperaturas inferiores al punto de congelamiento, se prefiere agregar el dímero de lisozima a las suspensiones celulares antes del paso de congelamiento . La presente invención también está dirigida a la mejora de la fertilidad de los ovocitos, de manera más particular con una maduración mejorado de los ovocitos y el desarrollo posterior mejorado de la célula huevo fertilizada y el embrión primario. En experimentos in vi tro sobre células embrionales bovinas se reveló que la presencia del dímero lisozima en el medio de maduración en el cual toma lugar la fertilización de los ovocitos bovinos tuvo un efecto benéfico sobre la tasa de fertilización de la calidad de los embriones resultantes. También se encontró que la adición de una porción del sobrenadante de un cultivo de células polimorfonucleares (PMN) o de linfocitos, crecidos en presencia de una combinación de dímero de lisozima y mitógeno tal como LPS, PHA, o ConA, al medio de maduración de los ovocitos tuvo un efecto ventajoso similar sobre la tasa de fertilización y el desarrollo del embrión. Otro objetivo de la presente invención es la mejora de la calidad del esperma animal o humano in vivo, así como la intervención profiláctica o tratamiento terapéutico de la fertilidad o trastornos de la reproducción de cualquier etiología conocida o desconocida y en particularmente de trastornos de fertilidad en machos que tienen un origen inmunológico, hormonal o metabólico. En la modalidad más preferida, la presente invención está dirigida a la profilaxis o tratamiento terapéutico de la oligospermia en animales o humanos mediante la administración de una dosis efectiva de enzima a un animal o individuo humano en riesgo de u objeto de tal trastorno de la fertilidad para evitar o aliviar tal condición. La oligospermia se caracteriza por una concentración patológicamente disminuida de espermatozoides y un porcentaje anormalmente alto de espermatozoides morfológicamente cambiados. Esta puede ser causada - entre otras cosas - por disfunciones hormonales, inmunológicas o metabólicas que afectan la espermiogénesis, es decir la producción de y/o maduración de los espermatozoides. Se demostró exitosamente in vivo que después de la inyección intramuscular de una composición farmacéutica que comprende dímero de lisozima como el componente activo a varios animales domésticos macho, la calidad del esperma fue mejorada considerablemente, comprendiendo pero sin limitarse a un incremento drástico de la concentración de células de esperma y una disminución notable en la cantidad de espermatozoides morfológicamente cambiados. Se cree que la amplia gama de acciones de inmuno oduladoras del dímero de lisozima contribuye significativamente a los efectos benéficos observados. Los términos "modular" y "modulación" utilizados aquí con respecto a la acción del dímero de lisozima sobre el sistema inmune animal o humano deberán expresar la naturaleza equilibradora del sistema inmune, bifuncional, de esa acción. En el caso de un estado inmunslógico suprimido de un individuo, por ejemplo causado por enfermedades infecciosas, quimioterapia, tensión, contaminantes y similares, el dímero de lisozima refuerza al sistema inmune y usualmente restablece un nivel fisiológicamente normal de la capacidad de defensa inmunológica o al menos contribuye significativamente a tal restablecimiento a través de acciones que comprenden inter alia aumento de los niveles de sangre o suero de ciertas citocinas, incluyendo el interferón y algunas interleucinas, y/o aumento de la actividad fagocítica de los diferentes tipos fagocitantes de células del sistema inmune tales como, por ejemplo, monocitos, células polimorfonucleares (PMN) y macrófagos. Por otro lado, si el sistema inmune es sobredesafiado por agentes tóxicos o dañinos de otro modo o produce en sí una respuesta inmune patológicamente exagerada, la administración de dímero de lisozima puede calmar la respuesta inmune abrumante a través de acciones que comprende, por ejemplo, hacer disminuir niveles de factor de la necrosis tu oral (TNF) peligrosamente altos, hacer disminuir la alta fiebre a temperatura corporal normal y/o hacer disminuir los niveles de sangre o suero de las diferentes formas bien conocidas de radicales u oxidantes libres que ocurren en los sistemas biológicos (incluyendo los radicales oxígeno, hidróxilo y óxido de nitrógeno) . Un objeto más de la presente invención es proporcionar un método para tratar individuos hembra que sufren de una fertilidad perturbada, la cual puede ser causada, por ejemplo, por una inflamación postparto del endometrio uterino, como es frecuentemente el caso con animales domésticos, en particular con vacas. Pudo demostrarse en estudios in vivo que la infusión intrauterina de una composición de dímero de lisozima disminuyó la actividad de la prostaglandina endógena. También, se observó una maduración más rápida de los folículos ováricos, luteinización más rápida y una disminución más rápida del nivel de progesterona P-4 a un incremento simultáneo del nivel de estradiol en las vacas tratadas con dímero de lisozima en comparación con el grupo control no tratado. Esos cambios dinámicos, junto con una rápida interrupción de la producción de prostaglandina F2 tuvo el efecto de que las vacas tratadas con dímero de lisozima fueron capaces de reasumir el ciclo de estrógeno aproximadamente 11±3 días antes que las vacas del grupo control. La presente invención está dirigida, además, al uso del dímero de lisozima para la manufactura de una composición farmacéutica a ser aplicada para los propósitos anteriormente mencionados. Se prefiere que el dímero de lisozima sea administrado al individuo humano o animal en una sola o dosis repetida de aproximadamente 0.005 a 5 mg/kg, de manera preferible de aproximadamente 0.01 a 1 mg/kg de peso corporal, que corresponde a aproximadamente 0.07 a 70 ó 0.14 a 14 µg de dímero de lisozima por ml de sangre de un individuo humano, respectivamente (calculada sobre la base de un hombre de 70 kg que tiene 5 litros de sangre) . De manera ventajosa, el fármaco se administra en forma de una solución inyectable que contiene el dímero de lisozima a una concentración de 0.01 a 10 mg/ml, de manera preferible de 0.1 a 0.5 mg/ml de la solución. Se prefiere, además, que el dímero de lisozima aplicado sea un producto de la dimerización obtenido por reticulación proteica de monómeros de lisozima, los cuales contienen aproximadamente 10% en peso de productos indeseables, particularmente formas monoméricas u oligoméricas de lisozima. Los monómeros de lisozima se derivan preferiblemente de huevos de gallina, pero también pueden obtenerse de otras fuentes naturales que comprenden a los humanos, animales, plantas y microorganismos o pueden manufacturarse por síntesis química o por métodos de ingeniería genética. El término Lydium-KLP como se utiliza aquí se refiere a una composición líquida, de manera preferible una solución inyectable, que comprende un solvente adecuado, un preservativo adecuado, y el dímero de lisozima en forma de fármaco activo -obtenido vía la reticulación química de lisozima de clara de huevo - a una concentración de 0.01 a 10 mg/ml, de manera preferible de 0.1 a 0.5 mg/ml de la solución.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra el desarrollo de ovocitos fertilizados en presencia de concentraciones diferentes de dímero de lisozima (como se describen el el Ejemplo 6 aquí posteriormente) . Para que la invención descrita aquí sea más completamente comprendida, se exponen los siguientes ejemplos. Los ejemplos son para propósitos ilustrativos únicamente y no deben constituirse en limitantes de esta invención en ningún aspecto.

Ejemplo 1 : Efecto del dímero de lisozima sobre la preservación del semen Se efectuaron investigaciones sobre el efecto del dímero de lisozima sobre semen de verraco preservado a bajas temperaturas. Los experimentos se condujeron bajo condiciones clínicas en seis verracos de diferentes carnadas: un "Duroc", tres "Hampshire", un "Pietrain" y un "WBP". Los animales fueron utilizados para inseminación artificial una vez a la semana. El semen fresco fue tratado con dímero de lisozima inmediatamente después de la recolección en las dosis de 1, 2 y 4 µg/ml de semen. El eyaculado fue probado perfectamente en todas las fases del experimento, es decir antes y después de agregar dímero de lisozima al semen, antes de congelar el semen, y después de descongelar. Se ensayaron los siguientes factores; concentración de espermatozoos, porcentaje de espermatozoides con motilidad normal, morfología del espermatozoo (incluyendo acrosomas) , y tasas de sobrevivencia en varios diluentes y a varias temperaturas. Los ensayos bioquímicos incluyeron: GOT (glutamato-oxaloacetato-transaminasa) , acrosina, hialuronidasa, fosfatasa acida, y fosfatasa alcalina. Se utilizaron los siguientes métodos de preservación por congelamiento: a) el método de bola, b) congelamiento en tubos redondos de plástico de 5 ml, y congelamiento en tubos planos de 7 ml . Los resultados preliminares se presentan en las tablas 1, 2 y 3.

La Tabla 1 muestra que, a diferencia del grupo control, cuando se agregaron 4 µg de dímero de lisozima a 1 ml de de semen fresco, el porcentaje de espermatozoide con motilidad normal se incrementó en promedio en un 10% después del equilibrio a 5°C y en promedio en un 15% después del descongelamiento del semen. La Tabla 2 muestra el efecto del dímero de lisozima (4 µg por 1 ml de semen) sobre el porcentaje de espermatozoides con acrosoma que se dañaron durante el proceso de preservación. En la muestra experimental, el porcentaje de acrosomas dañados en los espermatozoides es significativamente menor que en las muestras control (sin dímero de lisozima agregado) . La Tabla 3 muestra los resultados de ensayos de actividad de GOT a fases individuales del experimento. Se notó que el dímero de lisozima redujo las descarga de la enzima de los espermatozoides después del descongelamiento (429 U por 109 espermatozoides en promedio) indicando de este modo menos ocurrencias frecuentes de daños a células de espermatozoo.

Tabla 1 : Efecto del dímero de lisozima (4 µg/ml de semen) sobre el porcentaje de espermatozoides con motilidad normal en diferentes métodos de preservación de semen de verraco a bajas temperaturas.

Tabla 2 : Efecto del dímero de lisozima (4µg/ml de semen) sobre el porcentaje de espermatozoides con acrosomas dañados en diferentes métodos de preservación de semen de verraco a bajas temperaturas.

Tabla 3 : Efecto del dímero de lisozima (4µg/ml de semen) sobre la actividad de GOT (U/109 espermatozoides) en diferentes métodos de preservación de semen de verraco a bajas temperaturas (continuación Tabla 3) Los resultados prometedores de las investigaciones descritas anteriormente indican que el dímero de lisozima puede ser utilizado exitosamente en la preservación de esperma de animal o humano.

Ejemplo 2 : Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la preservación de espermatozoides de animal Se llevaron a cabo estudios sobre semen de diferentes machos de animales domésticos (6 verracos, 5 perros, 5 carneros y 4 gamos) . La preparación de dímero de lisozima se aplicó al semen fresco directamente después de la recolección y antes de la conservación, en las siguientes dosis: 1, 2, 4, 5, 10, 15 y 20 µg/ml de semen. En todas las etapas del experimento (antes y después de agregar dímero de lisozima al semen, justo antes del congelamiento y después del descongelamiento del semen) se efectúo un examen detallado del semen incluyendo la determinación de concentración de espermatozoides, porcentaje de espermatozoides propiamente móviles, morfología de los espermatozoides (incluyendo los acrosomas), tasas de sobrevivencia a varias diluciones y temperaturas. Las investigaciones bioquímicas incluyeron la determinación de GOT, hialuronidasa, y actividad de fosfatasa acida y alcalina. El congelamiento del semen se efectuó utilizando varios métodos de crioprotección, tales como el congelamiento en granulos, popotes (0.25 ml) , tubos redondos de 5 ml y planos de 1.7 ml. La adición de 4-10 µg de dímero de lisozima a 1 ml del semen fresco causó un incremento real de espermatozoides con motilidad progresiva después del descongelamiento y disminución del número de acrosomas dañados y liberación reducida de GOT de los espermatozoides preservados para todos los animales. Los resultados obtenidos indican que la adición de dímero de lisozima al semen fresco de diferentes animales macho pueden estabilizar las membranas celulares de los espermatozoides para la preservación a bajas temperaturas.

Ejemplo 3 : Eficacia del dímero de lisozima en el tratamiento de la oligospermia en verracos El experimento se efectúo en un verraco de seis años con síntomas de oligospermia que persistieron durante 1.5 meses, y un alto porcentaje de espermatozoides morfológicamente cambiados causado por atrofia de la testis derecha. El verraco fue administrado intramuscularmente con 10 ml de Lydium-KLP que comprendió 2 mg de lisozima como el ingrediente activo, correspondientes a una dosis de aproximadamente 0.020 mg/kg de peso corporal del animal. Antes del tratamiento, la concentración de espermatozoides por unidad de volumen eyaculado disminuyó gradualmente de 145,000 a 65,000 por mm3 y los cambios morfológicos en los espermatozoides variaron del 25% al 50% (valor medio del 40%) . 51 días después de la inyección de Lydium-KLP, la concentración de espermatozoos se incrementó de 100,000 a 150,000 por mm3 y los cambios morfológicos en los espermatozoides estuvieron dentro del intervalo de 18 al 21% (valor medio de 19.5%) . De este modo puede concluirse de lo mismo que el Lydium-KLP parece ser un agente notable en el tratamiento de la oligospermia en animales o humanos.

Ejemplo 4 : Efecto del dímero de lisozima sobre la sobrevivencia de células de esperma Este ejemplo describe el efecto del dímero de lisozima sobre la sobrevivencia y actividad biológica de espermatozoides de verracos y toros. El estudio comprende la determinación de la: - influencia de la' adición del dímero de la lisozima a semen fresco de verracos y toros sin conservación subsecuente; - influencia del dímero de lisozima en un proceso de conservación de semen de esos machos, e - influencia de la administración de una composición farmacéutica del dímero de lisozima (Lydium-KLP) sobre la capacidad fertilizante de toros y verracos con pobre calidad de semen. Los estudios se llevaron a cabo en 75 verracos y 65 toros y sus eyaculados. a) Estudio in vitro: En el curso del estudio, se encontró que una dosis más efectiva de dímero de lisozima agregada al semen fresco era de 5 µg por 1 ml de semen. Dosis más bajas, por ejemplo de 1 y 3 µg/ml de semen tuvieron actividad biológica reducida o ausente. De manera similar, dosis mayores de 5 µg/ml de semen no produjeron efectos biológicos repetibles, unívocos. Por lo tanto, en este estudio se utilizó la adición de 5 µg de dímero de lisozima por 1 ml de semen fresco.

La adición de dímero de lisozima al semen fresco (sin someter el semen a un congelamiento posterior) provocó un alargamiento por medio del tiempo de sobrevivencia de los espermatozoides de verraco de aproximadamente 6.8 ± 1.5 horas, y de los toros de aproximadamente 3 ± 1.2 h, en comparación con las muestras control. De manera similar, la adición 5 µg de dímero de lisozima al semen con crioconservación y almacenamiento subsecuente durante 30 días en nitrógeno líquido (-196°C) y el descongelamiento subsecuente, tuvo una influencia ventajosa sobre el alargamiento del tiempo de sobrevivencia de las células de esperma, las cuales en eyaculados examinados fluctuaron de 6 a 14 h en comparación con muestras control análogas. Adicionalmente, se observó que en los eyaculados tratados con dímero de lisozima, particularmente en el semen de verracos, el porcentaje de espermatozoides con motilidad normal fue aproximadamente 10-15% mayor que en los controles no tratados. También, el número de espermatozoides con defectos primarios fue de aproximadamente 20-25% menor en comparación con ensayos análogos sin la adición de dímero de lisozima. Además, en el grupo tratado con dímero de lisozima la concentración más baja observada de espermatozoides con daños de acrosomas fue estadísticamente significativa (p<0.01). Este efecto fue particularmente visible con el semen de verracos: en muestras control el porcentaje de espermatozoides con daños de acrosomas fluctuó entre 35 y 60%, mientras que en las muestras expermentales el porcentaje no excedió del 28%. Además, la adición de dímero de lisozima al semen con la subsecuente crioconservación y congelación produjo una disminución siginificativa (p<0.05) de destrucción de células de esperma, de acuerdo a lo medido por medio de las transaminasas descargadas (AspAT) . En el semen de verraco, se observó una reducción en células dañadas de aproximadamente 65 ± 8%, en el semen de toros de aproximadamente 48 ± 11%, en comparación con las muestras control.

Estudio ip vivo: 20 verracos y 15 toros que tenían una pobre calidad de semen (baja concentración de espermatozoides en el eyaculado, un alto porcentaje de células con defectos primarios y acrozomas dañados, bajo porcentaje de espermatozoides con motilidad normal) y como consecuencia de lo mismo, una capacidad reproductiva considerablemente reducida, fueron sometidos a tratamiento con dímero de lisozima: Se administró una composición farmacéutica del dímero de lisozima (Lydium-KLP) intramuscularmente a los animales a una dosis de 0.02 mg de dímero de lisozima por kg de peso corporal. La preparación se aplico tres veces en intervalos de 10 días. El eyaculado fue examinado una vez a la semana en el periodo de la primera administración hasta el 95avo día después de la última administración. Se encontró que se desarrollaron cambios positivos en la apariencia microscópica del semen de verraco - en promedio - después de 40 ± 5 días después de la primera aplicación del Lydium-KLP, y de semen de toro después de 50 ± 4 días y se mantuvo hasta 48 ± 6 días en el verraco y hasta 65 + 7 días en los toros. Esos cambios se manifestaron por un incremento en la concentración de espermatozoides de aproximadamente 25 ± 40% en comparación con la concentración inicial al tiempo cero, un incremento del porcentaje de células de esperma con motilidad normal de aproximadamente 10 a 26% en comparación con la situación a tiempo cero. También se observaron cambios distintos con respecto al numero de espermatozoides con defectos primarios. En el grupo experimental, su número disminuyó de aproximadamente 20 a 20% en comparación con los grupos control. c) prueba de fertilidad: En el periodo experimental, se efectuó une evaluación biológica de semen de verraco y toro patrocinado por dímero de lisozima u obtenido de machos que recibieron tratamiento con Lydium-KLP en pruebas locales. Se llevaron a cabo estudios en 80 vacas y 100 cerdas. Se demostró, que el factor sin repetición (NR) en vacas inseminadas por semen protegido por la adición de dímero de lisozima fue del 87.5 ± 8%. En la población de vacas control ese valor fue del 70 ± 9%. En la población de cerdas inseminadas por semen protegido con dímero de lisozima el valor fue de 86 ± 5% y en la población de cerdas del grupo control fue de 74 ± 6%. Se obtuvieron efectos biológicos particularmente positivos después de la inseminación de cerdas utilizando semen de verraco que habían recibidos un tratamiento con Lydium-KLP como se describió anteriormente. Antes de esta inmunoestimulación, la eficacia de la inseminación de las cerdas por eyaculados de esos verracos nunca excedió del 35 -40%; después de la inmunoestimulación de los verracos por la terapia con dímero de lisozima anteriormente mencionada, la eficacia de la inseminación se incrementó al 78 - 85% durante el periodo experimental.

Ejemplo 5: Uso del dímero de lisozima en el tratamiento de fertilidad dañada en animales Este ejemplo describe un ensayo experimental para demostrar y explicar la actividad y los modos de acción implicados del dímero de lisozima hacia la endometritis en vacas. Los estudios se llevaron a cabo en 120 vacas con inflamación postparto del endometrio uterino (endometritis puerparalis) . El grupo experimental comprendió 60 vacas seleccionadas aleatoriamente. El grupo control comprendió el mismo número de vacas. Las vacas del grupo experimental recibieron 2 mg de dímero de lisozima en 40 - 50 ml de una solución de glucosa al 5% intrauterinamente utilizando un catéter. Las vacas del grupo control recibieron una infusión de antibióticos (Amoksiklav) . Los exámenes ginecológicos tomaron _en~ consideración: el estado el útero y el cervix uterino, uso de involución y plazo de finalización, ocupación de la cavidad uterina - cantidad, carácter y olor de las descargas, estimación de la actividad ovárica. Las investigaciones de laboratorio llevadas a cabo en 20 vacas de cada grupo (S = 40 hembras) incluyeron: determinación de factores de la inmunidad celular, utilizando la prueba de transformación blástica bajo la influencia de LF-7, prueba de fagocitosis ~ de acuerdo a Wright, reducción del azul de nitrotetrazolio (NBT) , azul de esterasa, determinación de factores de inmunidad de la inmunidad humoral - proteína total y sus fracciones, patrón de leucocitos, determinación del nivel de hormona del ciclo ovárico - progesterona (P-4) y estradiol - y actividad de los metabolitos de PGF2 alfa (PGFM) . La eficacia del procedimiento terapéutico aplicado se estimó sobre la base de los valores obtenidos de los factores inmunológicos investigados, la dinámica de los cambios de PGF2 alfa, nivel de progesterona del ciclo ovárico, y los índices de fertilidad calculados tales como el intervalo de tiempo de la ingravidez hasta el primer celo, índice de preñez, índice de inseminación y longitud del periodo de intergestación. Las investigaciones de laboratorio mostraron una influencia inmunomoduladore benéfica del Lydium-KLP administrado intravenosamente sobre los valores de los factores analizados de la inmunidad celular. En vacas del grupo experimental se observó un incremento del índice de fagocitosis de aproximadamente 15 a 21%, un incremento de la actividad fagocítica y capacidad de transformación de aproximadamente 10 a 18% en promedio, y un incremento distinto de la fracción de gamaglobulina entre el 3er y 5o día después de la infusión de Lydium-KLP. En el grupo control de vacas que recibieron los antibióticos, se detectaron cambios en la actividad inmunológica y los valores de los factores investigados indicaron la aparición de un nicho inmunológico postparto, observado también en vacas en otros estudios. La infusión intrauterina de Lydium-KLP disminuyó la actividad de la prostaglandina endógena, determinada como PGFM. Particularmente, se observaron cambios distintos de la dinámica de este parámetro entre las 2 y 5 horas después de la aplicación de dímero de lisozima. La actividad disminuyó en aproximadamente 70 - 85% en comparación con el valor, que se observó antes de la infusión del Lydium-KLP. En vacas que recibieron Lydium-KLP intravenosamente, se observó una maduración temprana de los folículos ováricos, y una luteinización temprana, y una disminución rápida en el nivel de P-4 en comparación con cambios análogos en las vacas del grupo control. Simultáneamente con los cambios en el nivel de P-4, se observaron cambios en la dinámica de los estradioles en sangre. Su incremento se correlacionó con la dinámica de desaparición de P-4. Esos cambios y sus velocidades más rápidas en las vacas del grupo experimental tuvieron por efecto que las vacas de este grupo se encontraban en el ciclo estrógeno a aproximadamente 11 ± 3 días más temprano que las vacas del grupo control. Los cambios observados en la dinámica de producción de prostaglandina F2 y particularmente su degradación rápida parece ser el resultado principal de la actividad benéfica del Lydium-KLP en la terapia de la endometritis en vacas. La dinámica de los cambios en los niveles de progesterona y estradiol en sangre confirmó esas observaciones.

Ejemplo 6: Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la maduración y fertilización de células huevo bovinas (ovocitos) in vitro Se efectuaron los siguientes experimentos: A. Determinación del efecto de diferentes concentraciones de dímero de lisozima sobre la maduración y en la fertilización in vi tro de células huevo bovinas (ovocitos) . B. Evaluación de la influencia del dímero de lisozima sobre la interrelación entre células polimorfonucleares (PMN) o linfocitos, y la maduración del ovocito ep el desarrollo embriónico primario. C. Determinación de la influencia de las diferentes concentraciones de dímero de lisozima presentes durante la fertilización in vi tro de ovocitos en el desarrollo embrionario subsecuente.

Resultados : Ad. A: Los resultados experimentales indicaron que todas las concentraciones probadas de dímero de lisozima dentro del intervalo de 0.1 a 100 µg de dímero de lisozima por ml de suspensión células o cultivo tisular, respectivamente, dañó la expansión de cúmulos oóforos (mucificación) , mientras que se observó una disminución de la velocidad de maduración de los ovocitos únicamente a concentraciones mayores de la sustancia, es decir a concentraciones superiores a 10 µg de dímero de lisozima por ml. La concentración de dímero de lisozima de hasta 10 µg/ml tuvo un efecto benéfico significativo sobre la maduración de los ovocitos a pesar del efecto dañino observado sobre la mucificación del cúmulo. Los resultados de la fertilización in vitro y el desarrollo embrionario de los ovocitos madurados en presencia de diferentes concentraciones de dímero de lisozima mostraron un incremento máximo en la tasa de fertilización y el número de ovocitos que alcanzaron la etapa de la metafase II después de 36 horas de incubación, cuando el dímero de lisozima fue utilizado en una concentración de 10 µg/ml. También el porcentaje de ovocitos fertilizados que alcanzó las etapas de mórula y blastoquiste fue significativamente mayor cuando la fertilización tomó lugar en presencia de 0.1 a 10 µg de dímero de lisozima/ml (Figura 1) . Ad. B: Se incubaron PMN durante 3 horas en RPMI - medio 1640 ya sea con la adición de LPS y dímero de lisozima o sin esas sustancias. Después de la incubación el medio de cultivo (sobrenadante) fue recolectado y congelado a una temperatura de -80 °C hasta ser utilizado. En otro experimento se incubaron linfocitos durante 24 horas con la adición de Con A, PHA y dímero de lisozima, a continuación el medio de cultivo fue recolectado y almacenado como se mencionó anteriormente. Se condujeron varios experimentos en los cuales se evaluó lo siguiente: B.I. El efecto de diferentes concentraciones del sobrenadante del cultivo de OMN sobre la maduración de los ovocitos. Los resultados indicaron que el sobrenadante de PMN estimulados con PMN cultivados en presencia del dímero de lisozima se incremento significativamente la velocidad de maduración de los ovocitos. B.II. La influencia de un cocultivo de 105 PMN estimulados con LPS o no estimulados en presencia de dímero de lisozima sobre la maduración de los ovocitos. Los resultados experimentales indicaron que la adición de dímero de lisozima a los PMN activados con LPS afectó negativamente la maduración in vi tro de los ovocitos bovinos bajo las condiciones experimentales aplicadas. Este efecto pareció indicar una producción incrementada de algunos factores por las células PMN que afectan la maduración de los ovocitos. B.III. La influencia de un sobrenadante de un cultivo de PMN - de manera similar a lo descrito en B.I. -sobre la maduración de los ovocitos, la fertilización y desarrollo embrionario subsecuente in vitro . Se encontró que la adición del sobrenadante de un cultivo celular de PN estimulados con LPS crecidos en presencia de dímero de lisozima al medio de maduración a una concentración del 2.5% en volumen/volumen tuvo un efecto benéfico sobre la fertilización de los ovocitos y el desarrollo del embrión. B.IV. El efecto de un sobrenadante derivado de un cultivo de linfocitos crecidos en presencia de Con A. PHA y dímero de lisozima sobre la maduración de los ovocitos, fertilización y desarrollo posterior del embrión. Los resultados mostraron que una concentración de 10% en volumen/volumen del sobrenadante en el medio de maduración tuvo un efecto benéfico sobre la fertilización de los ovocitos y el desarrollo embrionario subsecuente. Este efecto fue menor en el caso de los linfocitos estimulados con Con A o PHA con la adición del dímero de lisozima. Ad.C: Una concentración de dímero de lisozima de 10 µg/ml en el medio del cual la fertilización de los ovocitos tuvo lugar tuvo un efecto benéfico sobre la calidad de los embriones obtenidos in vi tro. Esto se aclara mejor si este efecto resultase de la influencia de esta sustancia sobre los ovocitos o sobre los espermatozoides implicados en los proceso de fertilización.

En general, se encontró que cuando el dímero de lisozima es utilizado a bajas concentraciones de acuerdo a los diferentes protocolos experimentales mostró un efecto benéfico sobre la maduración de los ovocitos bovinos in vitro, su fertilización y desarrollo embrionario subsecuente.

Ejemplo 7: Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la sobrevivencia de células eucarióticas El estudio se condujo sobre fibroblatos de embrión de pollo primarios, y sobre linajes celulares continuos CC81 (línea celular de gato xenotrópico, TBTR (células de traquea bovina)) y MDBK (células de riñon bovino). Su objetivo principal fue comparar el tiempo de sobrevivencia de las líneas celulares en medio de Parker libre de suero con y sin la adición de dímero de lisozima. Los fibroblatos de embrión de pollo primarios y las líneas de células continuas se propagaron de acuerdo a los métodos de rutina empleados en virología. En resumen: a) Fibroblastos de embrión de pollo primarios: embriones de 9 - 10 días se cortaron en pequeñas piezas y se disociaron en una suspensión de células solas por tratamiento con tripsina diluida (0.25%) en solución salina a pH 7.5 y se agitaron. La primera' extracción se desechó, mientras que las siguientes extracciones se retuvieron. Las células fueron removidas por centrifugación y lavadas. Ellas fueron entonces contadas en una cámara de hemocitómetro y diluidas en medio de crecimiento (véase la composición más adelante) a una concentración de aproximadamente 2.5 x 105 células/ml. A continuación la suspensión celular fue distribuida en recipientes de cultivo adecuados (matraces de Roux y/o tubos de prueba) y se almacenó a 37 °C. Usualmente 24 horas después, cuando los cultivos ganaron una monocapa, el medio de cultivo fue desechado y las monocapas fueron inoculadas con virus del moquillo, lavadas y cubiertas con medio de mantenimiento (véase la composición más adelante) que comprende dímero de lisozima. b) Líneas celulares continuas: Se subcultivaron cultivos de monocapa en botellas por tripsinización (tripsina Difco al 0.5%, verseno sódico al 0.02%) y las células fueron suspendidas en medio de crecimiento. Tan pronto los cultivos ganaron una monocapa el medio de crecimiento fue reemplazado por medio de mantenimiento. La inoculación del virus se llevó a cabo antes de que la suspensión celular fuese distribuida a recipientes de vidrio. Medio de Crecimiento: Medio esencial mínimo de Eagle suplementado con sales de Hanks y L-glutamina sin bicarbonato de sodio (Sigma) ; 4-8% en peso (dependiendo del cultivo celular utilizado) de suero de carnero fetal (Sigma; inactivado a 58°C durante 30 minutos); antibióticos (100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de sulfato de dihidroestreptomicina, 2.5 µg/ml de amfotericina B; tilosina lOOx) . Medio de Mantenimiento: Medio 199 de Parker (Biofactory de Sera y Vaccines, Lublin, Polonia) ; antibióticos (los mismos que en el medio de crecimiento) . Toxicidad de los Fármacos: la toxicidad del dímero de lisozima (KLP 602) y la pentoxifilina se evaluaron sobre cultivos- celulares en tubos de prueba bacteriológicos (6 tubos por cada solución de fármaco) y placas de plástico (8 pozos por cada solución) . Las placas con los cultivos se almacenaron a 37 °C en una cámara húmeda con dióxido de carbono. El efecto de los fármacos sobre las células se examinó bajo un microscopio de luz (un microscopio simple o inverso) . Evaluación de la vialidad celular: Las monocapas confluentes se desprendieron por tripsinización, se centrifugaron y la suspensión celular se tiñó con rojo neutro. Se contó el número de células en una cámara de Burker. Virus: 1. Cepa BMD atenuada de parvovius canino (Lublin, Polonia) 2. Cepas BPl y BP2 de virus del moquillo (Pulawy, Polonia) .

La hemaglutinación se efectuó con eritrocitos de cerdos (0.25%) suspendidos en amortiguador de Sorensen con 0.1% de albúmina bovina, pH 5.8. En este estudio el dímero de lisozima se aplicó a varias concentraciones fluctuando de 1 a 1000 µg/ml (Tablas 4, 4a, 4b, 4c) . Como resultado de los experimentos se encontró el dímero de lisozima cuando se utiliza a concentraciones de entre 1 y 25 µg por ml de suspensión de cultivo celular no únicamente era tóxico a las células sino que también prolongó notablemente los tiempos de sobrevivencia de las células: las células persistieron en forma de monocapas sin cambios durante 2 a 8 días más que los controles sin tratar (Tabla 4) . Cuando se aplicó a concentraciones mayores el dímero de lisozima pareció ser ligeramente tóxico a las células eucarióticas (de acuerdo a lo concluido a partir de un incremento en el conteo de células muertas y de los cambios morfológicos de las células tratadas) pero retuvo aún su excitante actividad prolongadora de la vida celular en todo el intervalo (es decir de 1 a 1000 µg por ml de suspensión de cultivo celular) de las concentraciones de dímero de lisozima probadas (Tablas 4a, Tabla 4b) . Este efecto de prolongación de la vida de las células eucarióticas también ser observó con células animales infectadas con virus expuestas a varias concentraciones de dímero de lisozíma en combinación con una concentración fija de pentoxifilina (Tabla 4c) . De manera interesante, en este experimento de cultivo celular se observó un efecto extremadamente fuerte con fibroblastos de embrión de pollo a la más alta dosis de dímero de lisozima aplicada (es decir 100 µg por ml de cultivo celular) . La prolongación de la vida celular a una relación de al menos 1.3 (=30% de incremento del tiempo de la vida celular en comparación con los controles) y hasta 1.67 (= incremento del 67%) en el extremo fue regularmente alcanzada en los experimentos .

Tabla 4 : Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la sobrevivencia de líneas de células eucarióticas en medio 199 de Parker libre de suero Tabla 4: Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la sobrevivencia de líneas de células eucarióticas en medio 199 de Parker libre de suero (continuación) Tabla 4a: Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la sobrevivencia de fibroblatos de embrión de pollo en medio 199 de Parker libre de suero Tabla 4a: Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la sobrevivencia de fibroblatos de embrión de pollo en medio 199 de Parker libre de suero (continuación) + cambios tóxicos mínimos + + focos de cambios tóxicos + + + cambios tóxicos distintos BZ morfología celular sin cambios Tabla 4b: Efecto del dímero de lisozima (KLP-602) sobre la sobrevivencia de células CC81 en medio 199 de Parker libre de suero Tabla 4b: (continuación) Tabla 4c : Efecto de varias dosis del dímero de lisozima (KLP- 602) en combinación con lOµg/ml de pentoxifilina sobre la sobrevivencia de cultivos infectados con virus de fibroblastos de embrión de pollo y células CC81 en medio 199 de Parker libre de suero Tabla 4c : (continuación) T= acción tóxica del fármaco; NB= no determinado La infección se efectuó con virus del moquillo y parvovirus canino; los títulos virales del control (en CCIDso/ l) fueron de 103'25 (virus del moquillo/105-0 (parvovirus canino) ) . Investigaciones llevadas a cabo con otras células bajo condiciones comparables, en particular con células de Leydig y macrófagos similares, confirmaron los resultados anteriormente mencionados. Ellas revelaron además que el contenido de ADN de las células y la síntesis de proteínas se incrementó después del tratamiento con dímero de lisozima. Sin embargo, no está completamente comprendido aún como es que el dímero de lisozima interactúa con las células eucarióticas y particularmente con células inmunocompetentes de mamífero para interferir con la apoptssis, es decir la muerte celular "programada" predeterminada genéticamente. Los resultados experimentales obtenidos son, no obstante, muy excitantes con respecto al efecto antienvejecimiento observado del dímero de lisozima sobre las células eucarióticas y las implicaciones prácticas del mismo no pueden ser aún completamente anticipadas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. El uso de un dímero de lisozima para la manufactura de una composición farmacéutica para la intervención profiláctica o el tratamiento terapéutico de la fertilidad animal o humano dañada.
2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde la intervención profiláctica o el tratamiento terapéutico comprende mejorar al menos uno de los siguientes parámetros de fertilidad: calidad del esperma, maduración de la célula huevo, desarrollo del embrión.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, donde la intervención profiláctica o el tratamiento terapéutico comprende mejorar al menos uno de los siguientes factores de calidad del esperma: duración de la viabilidad de las células de esperma, motilidad de las células del esperma, estabilidad de la membrana de las células de esperma, protección contra acrosomas, concentración de células de esperma morfológicamente normales, conteo total de células de esperma en el eyaculado.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde el daño es efectuado o causado por al menos uno de los siguientes trastornos: trastorno inmunológico, trastorno hormonal, trastorno metabólico, y donde el trastorno inmunológico opcionalmente comprende una inflamación del útero.
5. 5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde el daño de la fertilidad se debe a la oligospermia.
6. 6. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde la intervención profiláctica o el tratamiento terapéutico comprende modular al menos uno de los siguientes parámetros: inmunidad celular, actividad fagocítica, un nivel de citocina, un nivel de hormona.
7. 7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la composición farmacéutica comprende dímero de lisozima en una cantidad adecuada para administrar el dímero de lisozima a un individuo humano o animal en una sola dosis repetida de aproximadamente 0.005 a 5, de manera preferible de 0.01 a 1, mg de dímero de lisozima por kg de peso corporal, o una sola o dosis repetida de aproximadamente 0.07 a 70, de manera preferible 0.14 a 14 µg de dímero de lisozima por ml de sangre.
8. 8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición está en forma de una solución líquida que contiene el dímero de lisozima a una concentración de 0.01 a 10, de manera preferible 0.1 a 0.5 mg/ml de la solución.
9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, para mejorar la maduración de las célula huevo y/o desarrollo del embrión donde la intervención profiláctica o tratamiento terapéutico comprende suplementar un medio de maduración de célula huevo con una cantidad efectiva de dímero de lisozima, de manera preferible con aproximadamente 1 a 10 µg de dímero de lisozima por ml de medio de maduración.
10. 10. El uso de un dímero de lisozima para la preservación mejorada de células eucarióticas, particularmente de células proliferativas o embrionarias animales o humanas, y/o para la prolongación de la vida de la célula eucariótica, combinando o almacenando células eucarióticas en presencia de dímero de lisozima, de manera preferible en presencia de 0.1 a 50 µg por dímero de lisozima por ml de una suspensión que contiene tales células.
11. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, para una prolongación de la vida celular en un factor de al menos hasta 1.3, de manera preferible en un factor de hasta 1.67.
12. 12. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dímero de lisozima es un producto de la dimerización, reticulado, de monómeros de lisozima y que contiene aproximadamente 10% en peso o menos de subproductos indeseables, particularmente de formas monoméricas y oligoméricas de lisozima.
13. 13. Un método para una preservación mejorada de células eucarióticas, particularmente de células proliferativas o embrionarias animales o humanas y/o para la prolongación de la vida de la célula eucariótica, caracterizado porque el método comprende almacenar o incubar las células en presencia de dímero de lisozima, de manera preferible en presencia de 0.1 a 50 µg de dímero de lisozima por ml de una suspensión que contiene tales células.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la preservación comprende un paso de congelamiento y donde el dímero de lisozima se agrega a las células eucarióticas, de manera preferible antes de someter las células al paso de congelamiento, a una dosis de 0.1 a 20 µg, de manera preferible de aproximadamente 1 a 4 µg por ml de una suspensión que contiene las células.
15. 15. Un método para mejorar la maduración de la célula huevo y/o desarrollo embrionario, caracterizado porque comprende suplementar un medio de maduración de célula huevo con una cantidad efectiva de dímero de lisozima, de manera preferible con aproximadamente 1 a 10 µg de dímero de lisozima por ml de medio de maduración.
16. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el dímero de lisozima es un producto de la dimerización, reticulado, de monómeros de lisozima y comprende aproximadamente 10% en peso o menos de subproductos indeseables, particularmente de formas monoméricas y oligoméricas de lisozima.
17. 17. Una composición para utilizarse en la prueba en la prevención o tratamiento de la fertilidad animal o humana, caracterizada porque la composición comprende dímero de lisozima en una cantidad suficiente para administrar a un sujeto humano o animal una dosis de aproximadamente 0.005 a 5 mg de dímero de lisozima por kg de peso corporal, o de 0.07 a 70 µg de dímero de lisozima por ml de sangre.
18. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque está en forma de una solución líquida que contiene el dímero de lisozima a una concentración de 0.01 a 10, de manera preferible de 0.1 a 0.5 mg/ml de la solución.
19. 19. Una composición para utilizarse en la preservación de células eucarióticas, particularmente de células proliferativas o embrionarias de animales o humanas, y/o para la prolongación de la vida de la célula eucariótica, caracterizada porque comprende dímero de lisozima en una cantidad suficiente para incubar o almacenar tales células en presencia de 0.1 a 50 µg de dímero de lisozima por ml de una suspensión que contiene tales células. -
20. 20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque el dímero de lisozima es un producto de la dimerización de monómeros de lisozima y contiene aproximadamente 10% en peso o menos de subproductos indeseables, particularmente de formas monoméricas y oligoméricas de lisozima.