CN1307480A - 提高生育力的组合物及其应用 - Google Patents

提高生育力的组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1307480A
CN1307480A CN99807938A CN99807938A CN1307480A CN 1307480 A CN1307480 A CN 1307480A CN 99807938 A CN99807938 A CN 99807938A CN 99807938 A CN99807938 A CN 99807938A CN 1307480 A CN1307480 A CN 1307480A
Authority
CN
China
Prior art keywords
klp
cell
purposes
sperm
animal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99807938A
Other languages
English (en)
Inventor
W·基茨卡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nika Health Products Ltd
Original Assignee
Nika Health Products Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nika Health Products Ltd filed Critical Nika Health Products Ltd
Publication of CN1307480A publication Critical patent/CN1307480A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Silicates, Zeolites, And Molecular Sieves (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及二聚体形式的溶菌酶在提高受伤害动物或人的生育力方面的应用。本发明还涉及动物或人的生殖疾病的预防或治疗以及溶菌酶二聚体在制备适于这类应用的药物组合物中的用途。本发明也涉及改良的保存人或动物细胞、特别是生殖细胞的方法和延长真核细胞寿命的方法。

Description

提高生育力的组合物及其应用
本发明涉及二聚体形式的溶菌酶在提高动物或人生殖细胞、例如卵母细胞和精母细胞的生育力方面的应用。本发明还涉及对动物或人的生育力或生殖疾病的预防性干预和治疗。本发明也涉及溶菌酶二聚体在制备适于这类应用的药物组合物中的用途，以及改良的保存人或动物细胞的方法和延长细胞存活时间的方法。
背景
八十年代后期，当发现了既保留了已知单聚体形式的所有有益性能、同时用于医疗时又显示没有消极副作用的分离的二聚体形式的酶以后，溶菌酶和其他治疗活性酶在实际应用中的限制才得以克服。WO89/11294中已描述了包含作为活性成分的溶菌酶二聚体或其他二聚体酶的抗病毒和抗细菌组合物，该文的整个内容引用在此作为参考。
稍后，如WO 94/01127中所述，又发现了溶菌酶二聚体的其他引人注意的特性，并且开发出该药物的其他治疗用途，特别是用于治疗细菌和病毒感染，该篇专利的整个内容也将结合在此作为参考。发明人观察到了二聚体溶菌酶的某些免疫调制作用，特别是有关调制细胞因子水平的免疫调制作用，这些作用得到了各种体外和体内实验的证实。溶菌酶二聚体除了别的以外还能调制TNFα、IL-2、IL-6和INFα的合成，能激活吞噬作用和与其相关的免疫机理。溶菌酶二聚体特别可用于治疗和预防与过度高水平的TNFα有关的疾病。
溶菌酶二聚体组合物在抑制或者甚至是全面预防体内白血病细胞增殖方面显示出卓越的效能，特别是对于病毒诱导的淋巴白血病更是如此，这一点也可成功地得到证明。其他研究涉及制备包含溶菌酶二聚体作为活性组分的药物组合物，这些组合物适用于毛发生长疾病，特别是以免疫功能失常或功能障碍为基础的毛发生长疾病，或者适用于预防或治疗与受抑制的免疫系统有关的疾病。溶菌酶二聚体的这些显著效用已公开在WO 96/21463中，该文的整个内容引用在此作为参考。
发明概述
进一步研究令人惊奇地显示，溶菌酶二聚体还能确信无疑地影响动物精液的保藏，特别是冷冻保藏。适当地保藏动物和人的精液样本，从而维持精子的活动性和生育力，并使发生形态变化(既病理改变)的精子的数目尽可能低，这是非常重要的，包括在商业利益方面。
使用不同的添加剂和助剂与精液混合来促进冷冻保藏和在融化过程中保护这些细胞，这是本领域中众所周知的。例如，俄罗斯专利申请SU-604556-A教导了一种用于稀释和冷冻农业动物精液的合成含水介质的制备，该介质包含阿拉伯胶、甘油、乳糖和10-20％重量的鸡蛋黄。
通过对保藏和储存的生物材料(特别是在将冷冻样本融化后)的最相关的生物活性或生存能力参数的评估分析，证实了溶菌酶二聚体及其对动物或人类细胞(包括组织细胞、血液细胞和精子)在不同温度下的保藏效果改善的贡献的辅助作用，尽管多数常涉及至少一个冷冻步骤。对于动物或人的精子，测定了融化后具有正常活动性、精子形态、生化和生物活性的精子百分数的改善情况。
动物或人的细胞悬液在储藏前用溶菌酶二聚体处理并且将这些细胞与溶菌酶二聚体一起储藏是特别优选的，不论储藏温度例如是在凝固点温度之上还是之下。除了溶菌酶二聚体的辅助作用以外—所得结果表明，即使在非常低的温度下，溶菌酶二聚体也能附着到精子和其它真核细胞的细胞膜上并使这些细胞膜稳定—它的抗菌活性以及对在整个保藏期间加入的潜在的病毒渗入的抑制作用也有可能提高效能，特别是在液态储藏的过程中。当在低于凝固点的温度下储藏时，优选在冷冻步骤之前将溶菌酶二聚体加入细胞悬液中。
本发明还涉及对卵母细胞生育力的改善，更具体地说是涉及改善卵母细胞的成熟以及随后受精卵细胞和早期胚胎的发育。用牛精子进行的体外实验显示，在牛卵母细胞受精时的成熟培养基中加入溶菌酶二聚体，对受精率和所得到的胚胎的质量具有有益作用。还发现，向卵母细胞的成熟培养基中加入一部分多形核细胞(PMN)或淋巴细胞的细胞培养物(在溶菌酶二聚体与促分裂原如LPS、PHA或ConA的混合物的存在下生长)的上清液，对受精率和胚胎发育具有类似的有益作用。
本发明的另一个目的是在体内改善动物或人的精液质量，以及预防性干预或治疗任何已知或未知病因的生育力或生殖疾病，特别是具有免疫、激素或代谢起因的男性生育力疾病。在首选的实施方案中，本发明涉及动物或人的精子减少症的预防或治疗，是通过对可能患或已患有这样一种生育力疾病的动物或人个体给药有效剂量的溶菌酶二聚体来避免或减轻这种病情。
精子减少症的特征是精子的浓度病理性下降，形态改变的精子的比例异常升高。除了别的原因以外，这可能是由影响精子形成(即精子的产生和/或破裂)的激素、免疫或代谢机能障碍引起的。现已在体内成功地证明，对各种雄性家养动物肌内注射了包含溶菌酶二聚体作为活性成分的药物组合物后，它们的精液质量大大改善了，包括但不限于精子浓度显著增加和形态改变的精子的数量明显下降。我们相信，溶菌酶二聚体的广泛的免疫调制作用非常有助于所观察到的有益效果。
本文中所用的与溶菌酶二聚体对动物或人免疫系统的作用有关的术语“调制的”和“调制”将表示这种作用的双功能的免疫系统平衡特性。当个体例如因传染病、化疗、压力、污染物等等原因而处于免疫抑制状态时，溶菌酶二聚体就会增强免疫系统的作用并通常修复到免疫防御能力的正常生理水平，或者至少通过包括特别是增加某些细胞因子(包括干扰素和一些白介素)的血液或血清浓度，和/或增强各种吞噬类免疫系统细胞(诸如象单核细胞、多形核细胞(PMN)和巨噬细胞)的吞噬活性的作用显著促进这种修复。另一方面，如果免疫系统受到毒性试剂或者破坏性试剂的过度刺激，或其自身产生了病理性增强的免疫应答，则给药溶菌酶二聚体可通过包括例如降低危险的高肿瘤坏死因子(TNF)水平、使高热降低至正常体温、和/或降低生物体系中存在的各种已知形式的游离氧化基(包括氧、羟基和氧化氮基)的血液或血清浓度的作用平息压倒性的免疫应答。本发明的另一个目的是提供一种治疗患有生育力失调疾病的雌性个体的方法，所述生育力失调可能是例如由产后子宫内膜炎症引起的，这经常发生在家养动物特别是母牛身上。在体内研究中可以证明，子宫内滴注溶菌酶二聚体组合物降低了内源性前列腺素的活性。并且，与未经处理的对照组相比，在用溶菌酶二聚体处理过的母牛身上观察到了卵巢滤泡的更快成熟、更快的黄体化和与雌二醇水平升高同时发生的P-4孕酮水平的更快下降。这些动态变化与前列腺素F2生成的迅速降解一起发生效用，溶菌酶二聚体处理过的母牛能比对照组的母牛早大约11±3天恢复动情周期。
本发明还涉及溶菌酶二聚体在制备将用于前述目的的药物组合物中的用途。溶菌酶二聚体优选以约0.005-5mg/kg的单剂或多剂对人或动物个体给药，更好是约0.01-1mg/kg体重，分别相当于约0.07-70或0.14-14μg溶菌酶二聚体每毫升人个体血液(以70公斤的人有5升血液为基础计算)。有利的是，该药物以含有0.01-10mg/ml、优选0.1-0.5mg/ml(溶液)浓度的溶菌酶二聚体的注射溶液形式给药。
更优选所应用的溶菌酶二聚体是通过溶菌酶单体的蛋白交联得到的二聚产物，它含有大约10重量％或更少的不需要的副产物，特别是单体和寡聚形式的溶菌酶。溶菌酶单体优选从鸡蛋中提取，不过也可能从其他天然来源包括人、动物、植物和微生物中获得，或者可以利用化学合成或基因工程方法生产。
本文中所用的术语“Lydium-KLP”是指一种液体组合物，优选为注射溶液，它包含适宜的溶剂、适宜的防腐剂、以及作为活性药物的溶菌酶二聚体，该溶菌酶二聚体是经鸡蛋白溶菌酶的化学交联得到的，其在该组合物中的浓度为0.01-10mg/ml，优选为0.1-0.5mg/ml(溶液)。
附图的简要描述
图1：显示了在不同浓度的溶聚酶二聚体的存在下受精的卵母细胞的发育情况(如下文实施例6中所述)。
为了能更全面地理解本文所描述的发明，现给出下列实施例。这些实施例仅用于说明目的而不在任何方面限制本发明。
实施例1：溶菌酶二聚体对精液保藏的作用
有关溶菌酶二聚体作用的研究利用在低温下保存的公猪精液来进行。试验在临床条件下用六只不同种的公猪进行：一只“Duron”猪，三只“Hampshire”猪，一只“Pietrain”猪和一只“WBP”猪。将这些动物用于人工授精，每星期一次。
新鲜的精液采集后立即用溶菌酶二聚体处理，剂量为1、2和4μg每1ml精液。对所有试验阶段中的精液进行充分测试，即，在向精液中加入溶菌酶二聚体之前和之后，在精液冷冻之前和融化后，都要进行测试。分析测定下列因子：精子浓度、具有正常活动性的精子的比例、精子的形态(包括顶体)、以及在各种稀释剂和各种温度下的存活率。生化测定包括：GOT(谷草转氨酶)、顶体蛋白、透明质酸酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶。使用以下冷冻保藏方法：a)球体法，b)在5ml塑料圆管中冷冻，和在7ml平管中冷冻。表1、2和3中显示了初步结果。
表1显示，与对照组不同，当4μg溶菌酶二聚体加入到1ml新鲜精液中时，在5℃下平衡后，具有正常活动性的精子的比例平均升高了10％；精液融化后，平均升高了15％。
表2显示了溶菌酶二聚体(4μg每1毫升精液)对带有在保藏过程中被破坏的顶体的精子比例的影响。在实验样品中，精子中被破坏的顶体的比例明显低于对照样品(未加溶菌酶二聚体)。
表3显示了在各个试验阶段的GOT活性测定结果。我们注意到，溶菌酶二聚体减少了精液融化后酶从精子的释放(平均429U每109个精子)，由此表明精子细胞发生破坏的情况少了。表1：在不同的低温保藏公猪精液的方法中，溶菌酶二聚体(4μg/ml精液)对具有正常活动性的精子比例的影响
平衡后的精液 融化后的精液
保藏方法 精液数目 实验组 对照组 实验组 对照组
球体法 12 60-65 50-55 45-50 30-40
在5ml圆管中保藏 15 60-65 50 35-50 15-40
在7ml平管中保藏 15 60-65 50-55 45-55 25-45
均值 共42 60-6560 50-5550 40-5045 20-4030
表2：在不同的低温保藏公猪精液的方法中，溶菌酶二聚体(4μg/ml精液)对带有破坏的顶体的精子比例的影响
平衡后的精液 融化后的精液
保藏方法 精液数目 实验组 对照组 实验组 对照组
球体法 12 13-18 12-21 29-36 26-41
在5ml圆管中保藏 15 13-18.5 17.5-21 28-30 30-34
在7ml平管中保藏 15 11.5-13.5 13-18 31-33 33-38
总共均值 42 15.2 16.4 30.1 33.0
表3：在不同的低温保藏公猪精液的方法中，溶菌酶二聚体(4μg/ml精液)对GOT活性(U/109精子)的影响
平衡后的精液 融化后的精液
保藏方法 精液数目 实验组 对照组 实验组 对照组
球体法 12 522-556 603-651 555-695 740-797
在5ml圆管中保藏 15 230-334 275-377 105-483 519-639
在7ml平管中保藏 15 103-635 110-625 110-626 117-797
总共均值 42 396 380 429 549
上述研究的有利结果表明，溶菌酶二聚体可以成功地用于保藏动物或人的精液。
实施例2：溶菌酶二聚体(KLP-602)对动物精子保藏的作用
研究利用不同雄性家养动物(6只公猪，5只狗，5只公羊和4只雄鹿)的精液进行。在采集了新鲜的精液后并在保存前，直接向其中加入溶菌酶二聚体制剂，剂量如下：1、2、4、5、10、15和20μg/ml精液。在所有试验阶段(向精液中加入溶菌酶二聚体之前和之后，就在精液冷冻之前和融化之后)对精液进行详细检验，包括测定精子浓度、适当运动的精子比例、精子(包括顶体)的形态、在不同稀释剂和温度下的存活率。生化研究包括测定GOT、透明质酸酶以及酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。精液的冷冻采用不同的超低温保护法进行，诸如在颗粒、吸管(0.25ml)、5ml圆管和1.7ml平管中冷冻。对于所有动物来说，向1ml新鲜精液中加入4-10μg溶菌酶二聚体，使得精液融化后具有前进活动性的精子实际增加了，而受破坏的顶体数降低了，GOT从保藏的精子中的释放也减少了。所得结果表明，在不同雄性动物的新鲜精液中加入溶菌酶二聚体可以稳定在低温下保藏时精子的细胞膜。
实施例3：溶菌酶二聚体在公猪精子减少症的治疗中的效能
该试验用一只六岁的公猪进行，这只公猪已持续1.5个月出现精子减少症状，并且因右睾丸萎缩导致形态改变的精子比例很高。给这只公猪肌内注射10ml含有作为活性成分的2mg溶菌酶二聚体的Lydium-KLP，相当于每公斤动物体重大约0.020mg剂量。
治疗前，每单位体积精液中的精子浓度从145.000/mm3逐渐下降到65.000/mm3，形态改变的精子从25％增至50％(平均为40％)。注射Lydium-KLP 51天后，精子浓度从100.000/mm3升高至150.000/mm3，形态改变的精子在18％至21％的范围内(平均为19.5％)。由此可以得出结论：Lydium-KLP看来在动物或人精子减少症的治疗中是一种有效的药剂。
实施例4：溶菌酶二聚体对精子存活的影响
该实施例描述了溶菌酶二聚体对公猪和公牛精子的生存和生物活性的影响。该研究包括进行下列测定：
—测定将溶菌酶二聚体加入未经保存的公猪和公牛的新鲜精液中产生的影响；
—测定溶菌酶二聚体对这些雄性动物精液的低温保藏过程的影响；以及
—溶菌酶二聚体药物组合物(Lydium-KLP)给药对精液质量差的公牛和公猪的受精能力的影响。
该研究用75只公猪和65头公牛以及它们的精液进行。
a)体外研究：
研究过程中发现，加入新鲜精液中的溶菌酶二聚体的最有效剂量是5μg每1ml精液。较低的剂量，例如1μg/ml和3μg/ml(精液)，具有降低的生物活性或没有生物活性。与此类似，高于5μg/ml(精液)的剂量也未产生明确的、可重复的生物效应。因此，在该研究中，向每1ml新鲜精液中加入5μg溶菌酶二聚体。
在新鲜精液(没有让该精液经受随后的冷冻步骤)中加入溶菌酶二聚体，使得公猪精子的存活时间与对照样品相比平均延长了约6.8±1.5小时，公牛的平均延长了约3±1.2小时。
类似地，向进行了低温保藏并在液氮(-196℃)中储存了30天然后解冻的精液中加入5μg溶菌酶二聚体，对精子存活时间的延长产生了有利影响，与类似的对照样品相比，所检验的精液中精子存活时间延长了6-14小时。
此外，在用溶菌酶二聚体处理过的精液、特别是在公猪的精液中观察到，具有正常活动性的精子的比例比未经处理的对照样品中高大约10-15％。并且，具有主要缺损的精子的数目与未加入溶菌酶二聚体的类似试验相比低大约20-25％。
另外，在用溶聚酶二聚体处理过的组中观察到的、顶体被破坏的精子浓度的降低是统计学上显著的(P＜0.01)。此作用在公猪的精液中表现得尤其明显：在对照样品中，顶体被破坏的精子的比例在35％至60％之间，而在实验样品中此比例不超过28％。
而且，向经过低温保藏并融化的精液中加入溶菌酶二聚体使得精子的破坏统计学上显著减少(P＜0.05)，这是利用释放的转氨酶(AspAT)测量的。与对照样品相比，公猪精液中被破坏的细胞减少约65±8％，公牛精液中减少约48±11％。
体内研究：
将精液质量差(精液中精子浓度低，具有主要缺损和破坏顶体的细胞比例高，具有正常形态的的精子比例低)并因此而使生殖能力大大降低的20只公猪和15头公牛用溶菌酶二聚体进行处理：
以0.02mg溶菌酶二聚体每kg体重的剂量给动物肌内注射溶菌酶二聚体药物组合物(Lydium-KLP)。该制剂以10天的间隔应用三次。在从第一次给药直到最后一次给药后的第95天这段时间内，每周检验一次精液。结果发现：Lydium-KLP第一次给药后40±5天(平均)，发育的公猪精液的镜检形态有了好的变化，公牛精液在50±4天后有好的变化，公猪的维持了最多48±6天，而公牛的维持了最多65±7天。这些变化表现在：精子的浓度与0时的初始浓度相比升高了约25-40％，具有正常活动性的精子比例与0时的情况相比增加了10-26％。
也观察到了有关带有主要缺损的精子数目的显著变化。在实验组中，它们的数目与对照组相比下降了大约20-30％。
c)生育力测试：
试验期间，用局部试验对用溶菌酶二聚体保护的公猪和公牛精液或者是从接受了Lydium-KLP治疗的公猪和公牛得到的精液进行生物学评估。研究用80只母牛和100只母猪进行。结果显示，利用加入了溶菌酶二聚体加以保护的精液授精的母牛的非重复因子(NR)为87.5±8％。在对照组母牛中该值为70±9％。在用溶菌酶二聚体保护的精液授精的母猪中该值为86±5％，而对照组的母猪该值为74±6％。
母猪使用如上所述已接受Lydisum-KLP治疗的的公猪的精液授精后产生了非常好的生物作用。在这种免疫刺激之前，母猪用这些公猪的精液授精的效力从未超过35-40％；公猪利用前述溶菌酶二聚体治疗进行了免疫刺激之后，在实验期间授精效力升高至78-85％。
实施例5：溶菌酶二聚体在动物生育力受损的治疗中的用途
该实施例所描述的试验是为了证明和解释溶菌酶二聚体对母牛子宫内膜炎的治疗活性和有关作用方式。
该研究利用120只患有产后子宫内膜炎症(产后子宫内膜炎)的母牛进行。实验组包括随机选择的60只母牛。对照组包括相同数目的母牛。使用一根导管对实验组的母牛子宫内给药存在于40-50ml 5％葡萄糖溶液中的2mg溶菌酶二聚体，对照组的母牛则滴注抗生素(Amoksiklav)。妇科学检查考虑以下因素：子宫和子宫颈的状态，退化过程和结束期，子宫腔的充填—排放的量、特征和气味，卵巢活性的测定。用来自各组(∑＝40只雌性)的20只母牛进行的实验室检查包括：测定细胞免疫的各个因子，这使用胚芽转化试验在LF-7的影响下进行，按照Wrignt法进行吞噬作用试验，硝基四唑蓝(NBT)、酯酶蓝的减少，测定体液免疫的免疫因子—总蛋白及其成分，白细胞型，测定卵巢周期的激素水平—孕酮(P-4)和雌二醇—以及PGF2α(PGFM)代谢物的活性。所采用的治疗方法的效力在下列数据的基础上进行估定：从免疫因子检验中得到的数值，PGF2α的动力学变化，卵巢周期的孕酮水平，以及计算出的生育力指数，诸如从下仔到首次发情的周期长度、妊娠指数、授精指数和受孕间期的长度。
实验室研究显示了静脉注射Lydium-KLP对所分析的细胞免疫因子的数值的有益的免疫调制影响。在实验组的母牛中观察到，滴注了Lydium-KLP之后的第3天和第5天之间，吞噬指数升高大约15-21％，吞噬活性和转化能力平均升高约10-18％，丙种球蛋白成分显著增加。在接受抗生素的对照组母牛中检测到了免疫活性的变化，所检验的各因子的数值表明了产后免疫小境(niche)的出现，其它研究中的母牛也观察到了这一现象。
子宫内滴注Lydium-KLP降低了作为PGFM测定的内源性前列腺素的活性。在溶菌酶二聚体应用后的2-5小时之间看到了该参数的动力学显著变化。其活性与滴注Lydium-KLP之前观测到的数值相比下降了约70-85％。
在静脉注射了Lydium-KLP的母牛中，与对照组的母牛的类似变数相比，卵巢滤泡更早成熟，更早黄体化，P-4水平下降更快。在P-4水平变化的同时观察到了血液中雌二醇的动力学改变。它们的增加与P-4的消失动力学相关。实验组母牛的这些变化以及他们更快的速率产生的作用是，实验组母牛比对照组母牛早大约11±3天进入动情周期。
所观察到的前列腺素F2生成的动力学变化，特别是它的迅速消失，看来是Lydium-KLP在母牛子宫内膜炎治疗中的有益的活性作用的结果。血液中孕酮和雌二醇水平的动力学变化将证实这些评论。
实施例6：溶菌酶二聚体(KLP-602)对牛卵细胞(卵母细胞)成熟和体外受精的作用
进行以下试验：
A.测定不同的溶菌酶二聚体浓度对牛卵细胞(卵母细胞)的成熟和体外受精的作用。
B.评估溶菌酶二聚体对多形核细胞(PMN)或淋巴细胞与卵母细胞成熟以及早期胚胎发育之间相互关系的影响。
C.测定在卵母细胞的体外受精过程中存在不同浓度的溶菌酶二聚体对随后的胚胎发育的影响。
结果：
Ad A.：实验结果显示，分别在0.1-100μg溶菌酶二聚体每毫升细胞或组织培养物悬液范围内的所有测试的溶菌酶二聚体浓度都削弱了卵丘膨胀(粘液化)，而卵母细胞成熟速率的下降仅在更高的物质浓度，即高于10μg溶菌酶二聚体/ml的浓度下才观察到。虽然在不超过10μg/ml的溶菌酶二聚体浓度下也观察到了对卵丘粘液化的削弱作用，但其对卵母细胞的成熟具有非常有益的影响。有关在不同溶菌酶二聚体浓度下成熟卵母细胞的体外受精和胚胎发育的结果显示，当使用10μg/ml浓度的溶菌酶二聚体时，培养36小时后，受精率和达到中期第II阶段的卵母细胞数有最大增加。并且，当在0.1-10μg溶菌酶二聚体/ml的存在下发生受精时，达到桑椹胚和胚泡阶段的受精卵细胞的比例明显更高。
Ad.B.：PMN在RPMI-1640培养基(或者加入了LPS和溶菌酶二聚体，或者没有加入这些物质)中培养3小时。培养结束后，收集培养基(上清液)并在-80℃下冷冻直至使用。在另一个实验中，淋巴细胞在加入了ConA、PHA和溶菌酶二聚体的培养基中培养24小时，然后如上所述收集培养基并储存。进行各种试验，评估以下内容：
B.I.来自PMN培养物的不同浓度的上清液对卵母细胞成熟的作用。结果显示，来自在溶菌酶二聚体的存在下培养的LPS刺激的PMN的上清液显著提高了卵母细胞成熟速率。
B.II.105个LPS刺激的或未刺激的PMN在溶菌酶二聚体的存在下的协同培养对卵母细胞成熟的影响。该实验结果显示，在所使用的实验条件下，向LPS活化的PMN中加入溶菌酶二聚体对牛卵母细胞的体外成熟具有消极作用。该作用似乎表明由PMN细胞产生的某些影响卵母细胞成熟的因子增加了。
B.III.来自PMN培养物的上清液(与B.I.中公开的类似)对体外卵母细胞成熟、受精和随后的胚胎发育的影响。结果发现，在成熟培养基中以2.5％ v/v的浓度加入在溶菌酶二聚体的存在下生长的LPS刺激的PMN细胞培养物的上清液，对卵母细胞的受精和胚胎的发育具有有益作用。
B.IV.从在ConA、PHA和溶菌酶二聚体的存在下生长的淋巴细胞的培养物得到的上清液对卵母细胞成熟、受精和随后的胚胎发育的作用。结果显示，在成熟培养基中加入浓度为10％ v/v的上清液对卵母细胞的受精和随后的胚胎发育具有有益作用。在加入了溶菌酶二聚体培养的用ConA或PHA刺激的淋巴细胞中该作用较低。
Ad.C.在卵母细胞发生受精的培养基中加入浓度为10μg/ml的溶菌酶二聚体对在体外得到的胚胎质量具有有益影响。尚待澄清的是此作用是该物质影响与受精过程有关的卵母细胞的结果还是影响精子的结果。
总的来说，我们发现，按照不同的实验方案，当以低浓度使用溶菌酶二聚体时，对体外牛卵母细胞的成熟、它们的受精和随后的胚胎发育显示出了有益作用。
实施例7：溶菌酶二聚体(KLP-602)对真核细胞生存的影响
该研究针对原代鸡胚成纤维细胞以及传代细胞系CC81(他养猫细胞系)、TBTR(牛气管细胞)和MDBK(牛肾细胞)进行。该研究的主要目的是对比各细胞系在加入了或没有加入溶菌酶二聚体的无血清的Parker培养基中的存活时间。
原代鸡胚成纤维细胞和传代细胞系按照病毒学中使用的常规方法进行繁殖。简单地说是：
a)原代鸡胚成纤维细胞：将9-10天大的胚胎切成小片，通过用pH7.5的在盐水溶液中的稀释胰蛋白酶(0.25％)处理并搅拌而使其分离成单个细胞的悬液。抛弃第一次提取物而保留后来的提取物。通过离心和洗涤除下细胞，然后将它们在血细胞计数器室中计数，并用生长培养基(组成见下文)稀释至浓度约为2.5×105细胞/ml。将该细胞悬液分配到适宜的培养管(Roux扁瓶和/或试管)中并保持在37℃下。通常在24小时后，当获得了单层培养物时，去掉生长培养基，该单层培养物用犬瘟病毒接种，洗涤并覆盖上包含溶菌酶二聚体的维持培养基(组成见下文)。
b)传代细胞系：瓶子上的单层培养物利用胰蛋白酶消化而传代培养(胰蛋白酶Difco 0.5％，维尔烯钠0.02％)。将这些细胞悬浮于生长培养基中，一旦获得了单层培养物，就立即用维持培养基替换生长培养基。进行了病毒接种后，将该细胞悬液分配到玻璃管中。
生长培养基：Eagle极限必需培养基，其中添加了没有碳酸氢纳的Hanks盐和L-谷酰胺(Sigma)；4-8％wt.的(根据所使用的细胞培养物而定)胎牛血清(Sigma；在58℃下灭活30分钟)；抗生素(100U/ml的青霉素，100μg/ml的硫酸二氢链霉素，2.5μg/ml的两性霉素B，100×泰乐菌素)。
维持培养基：Parker 199培养基(Biofactory of Sera and Vaccines，Lublin，Poland)；抗生素(与生长培养基中的相同)。
药物毒性：在细菌学试管(每种药物溶液6管)和塑料平板(每种溶液用8个孔)中评估溶菌酶二聚体(KLP 602)和己酮可可豆碱对细胞培养物的毒性。这些加有培养物的平板在一个有二氧化碳的湿润房间中保持在37℃下。在光学显微镜(一种单筒显微镜或反向显微镜)下检查药物对细胞的作用。
细胞活力的评定：融合的单层培养物通过胰蛋白酶消化而分离，将其离心，该细胞悬液用中性红染色。在Burker室中计算细胞的数目。
病毒：1、狗细小病毒的减毒株BMD(Lublin，Poland)
      2、犬瘟病毒的BP1和BP2毒株(Pulawy，Poland)
血细胞凝集用悬浮于加有0.1％牛白蛋白的Sorensen缓冲剂(pH5.8)中的猪的红细胞进行。在该研究中使用1-1000μg/ml范围内的不同浓度的溶菌酶二聚体(表4，4a，4b，4c)。
我们从实验结果发现，当溶菌酶二聚体以1-25μg每毫升细胞培养物悬液之间的浓度使用时，不仅对细胞没有毒性，而且显著延长了细胞的存活时间：这些细胞维持未改变的单层培养物形式的时间比未经处理的对照品长了2-8天(表4)。当以更高的浓度使用溶菌酶二聚体时，它似乎对真核细胞有轻微毒性(从死细胞数的增加和经过处理的细胞的形态学变化得出该结论)，但在所测试的溶菌酶二聚体的整个浓度范围(即1-1000μg每毫升细胞培养物悬液)内，它仍保持了其较高的细胞生命延长活性(表4a，4b)。
在接触了不同浓度的溶菌酶二聚体和固定浓度的己酮可可豆碱的病毒感染的动物细胞中也观察到了这种真核细胞生命延长作用(表4c)。有趣的是，在该细胞培养物实验中，在所用溶菌酶二聚体的最高剂量(即1000μg每毫升细胞培养物)下观察到了对鸡胚成纤维细胞的极强的作用。在这些实验中达到的细胞生命延长系数至少为1.3(＝与对照相比细胞生存时间延长了30％)，最多不超过1.67(＝延长了67％)。表4：溶菌酶二聚体(KLP-602)对真核细胞系在无血清的Parker 199培养基中的存活的影响
溶菌酶二聚体的浓度[μg/ml]     相对于未经处理的对照品的延长的存活时间
鸡胚成纤维细胞 细胞系CC81 细胞系TBTR 细胞系MDBK
    1.0     6     0     3     2
    2.5     6     1     3     2
    5.0     6     4     6     2
    10.0     6     3     8     0
    25.0     ND*     3     ND     ND
    50.0     ND     T**     ND     ND
    100.0     ND     T     ND     ND
*＝未确定的；**＝出现毒性作用表4a：溶菌酶二聚体(KLP-602)对鸡胚成纤维细胞在无血清的Parker199培养基中的存活的影响
溶菌酶二聚体的浓度[μg/ml]   形态学变化   死细胞[％]   存活时间[天]     注释
     8     BZ     19.4     18
    16     BZ     18.0     18
    32     BZ     20.0     18
    64     BZ     19.5     18
   125     BZ     21.0     18 在头24小时内有轻微的生长抑制
   250     +     24.0     18
   500     ++     21.0     18 在头24小时内有生长抑制，有颗粒样灶
  1000     +++     25.0     21 在头24小时内有生长抑制，高比例的颗粒
   对照     BZ     19.5     14
+ 微小的毒性改变
++ 有毒性改变的灶
+++ 明显的毒性改变
BZ 细胞形态没有改变表4b：溶菌酶二聚体(KLP-602)对CC81细胞系在无血清的Parker 199培养基中的存活的影响
溶菌酶二聚体的浓度[μg/ml]   形态学变化     死细胞[％]     存活时间[天]
    10     BZ     11.0     10
    20     BZ     15.0     10
    40     BZ     17.0     10
    50     BZ     17.0     10
    80     +     24.0     10
    100     ++     52.0     10
    对照     BZ     8.0     6
表4c：不同剂量的溶菌酶二聚体(KLP-602)结合10μg/ml的己酮可可豆碱对鸡胚成纤维细胞和CC81细胞的病毒感染的培养物在无血清的Parker 199培养基中的存活的影响
  10μg/ml己酮可可豆碱+溶菌酶二聚体[μg/ml]   犬瘟病毒/狗细小病毒感染细胞的存活时间[天]
    鸡胚成纤维细胞     细胞系CC81
    8     21/18     NB
    10     NB     13/10
    16     NB     NB
    20     NB     13/10
    32     21/18     NB
    40     NB     13/10
    50     NB     13/10
    64     21/18     NB
    80     NB     13/10
    100     NB     13/10
    125     21/18     NB
    250     21/18     T
    500     25/18     T
    1000     30/21     T
    对照     18/14     13/10
T＝药物的毒性作用；    NB＝未确定的
感染用犬瘟病毒和狗细小病毒进行；对照(CCID50/ml)的病毒效价为103.25(犬瘟病毒)/105.0(狗细小病毒)
在相当的条件下用其它细胞进行研究，特别是用莱迪希氏细胞和类似的巨噬细胞，结果证实了前述结论。它们还显示：用溶菌酶二聚体处理后，细胞的DNA含量和蛋白质合成增加了。不过，尚未完全弄清楚溶菌酶二聚体是怎样与真核细胞、特别是与哺乳动物的免疫活性细胞相互作用来干涉细胞程序死亡(即遗传预定的“编程性”细胞死亡)的。虽然如此，但迄今为止所得到的实验结果在所观察到的溶菌酶二聚体对真核细胞的抗老化作用方面仍然是非常令人兴奋的，这些结果对实践的暗示可能还未完全预测出来。

Claims (20)

1、溶菌酶二聚体在制备用于预防性干预或治疗动物或人的生育力损害的药物组合物中的用途。
2、按照权利要求1的用途，其中所述预防性干预或治疗包括改善下列的至少一种生育力参数：精液的质量，卵细胞的成熟，胚胎的发育。
3、按照权利要求1或2的用途，其中所述预防性干预或治疗包括改善下列的至少一种精液质量因子：精子活力的持续时间，精子的活动性，精子的膜稳定性，顶体的保护，形态正常的精子的浓度，精液中精子的总数。
4、按照权利要求1的用途，其中所述损害受到下列至少一种疾病的影响或由其引起：免疫疾病、激素紊乱、代谢疾病，而其中的免疫疾病可选地包括一种子宫炎症。
5、按照权利要求1的用途，其中所述生育力损害是由精子减少导致的。
6、按照权利要求1的用途，其中所述预防性干预或治疗包括调制下列至少一种参数：细胞免疫，吞噬活性，细胞因子水平，激素水平。
7、按照权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述药物组合物包含适量的溶菌酶二聚体，其量适于将所述溶菌酶二聚体以约0.005-5、优选约0.01-1mg溶菌酶二聚体每kg体重的单剂或多剂、或者以约0.07-70、优选0.14-14μg溶菌酶二聚体每ml血液的单剂或多剂对人或动物个体给药。
8、按照权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述组合物为含有浓度为0.01-10mg/ml、优选0.1-0.5mg/ml溶液的溶菌酶二聚体的液态溶液形式。
9、按照权利要求1或2的用途，用于改善卵细胞的成熟和/或胚胎发育，其中所述预防性干预或治疗包含在卵细胞成熟培养基中添加有效量的溶菌酶二聚体，优选为约1-10μg溶菌酶二聚体每ml成熟培养基。
10、溶菌酶二聚体用于改善真核细胞、特别是动物或人的生殖细胞的保藏的用途，和/或用于延长真核细胞生命的用途，是通过将真核细胞在溶菌酶二聚体的存在下、优选在0.1-50μg溶菌酶二聚体每ml含有所述细胞的悬液的存在下培养或储存而实现的。
11、按照权利要求10的用途，用于延长细胞生命，使延长系数至少不超过1.3，优选系数不超过1.67。
12、按照上述权利要求任一项所述的用途，其中所述溶菌酶二聚体是溶菌酶单体的交联二聚产物，它含有约10重量％或更少的不期望的副产物，特别是单体和寡聚物形式的溶菌酶。
13、一种用于改善真核细胞、特别是动物或人的生殖细胞的保藏的方法，和/或用于延长真核细胞生命的方法，其中该方法包括在溶菌酶二聚体的存在下、优选在0.1-50μg溶菌酶二聚体每ml含有所述细胞的悬液的存在下储存或培养所述细胞。
14、按照权利要求13的方法，其中所述保藏包括一个冷冻步骤，且其中溶菌酶二聚体加入到真核细胞中，优选在细胞经历冷冻步骤之前加入，加入量为0.1-20μg，优选为约1-4μg每1ml含有所述细胞的悬液。
15、一种用于改善卵细胞成熟和/或胚胎发育的方法，其特征在于它包含在卵细胞成熟培养基中添加有效量的溶菌酶二聚体，优选为约1-10μg溶菌酶二聚体每ml成熟培养基。
16、按照权利要求13-15任一项所述的方法，其中所述溶菌酶二聚体是溶菌酶单体的交联二聚产物，它含有约10重量％或更少的不期望的副产物，特别是单体和寡聚物形式的溶菌酶。
17、一种用于预防或治疗动物或人的生育力损害的组合物，其特征在于该组合物包含足以以约0.005-5mg溶菌酶二聚体每kg体重的剂量、或者是0.07-70μg溶菌酶二聚体每ml血液的剂量对受治疗的人或动物给药的适量溶菌酶二聚体。
18、按照权利要求17的组合物，它为含有浓度为0.01-10mg/ml、优选0.1-0.5mg/ml溶液的溶菌酶二聚体的液态溶液形式。
19、一种用于保藏真核细胞、特别是动物或人的生殖细胞的组合物，和/或用于延长真核细胞生命的组合物，其特征在于它包含足以在0.1-50μg溶菌酶二聚体每1ml含有所述细胞的悬液的存在下培养或储存所述细胞的适量的溶菌酶二聚体。
20、按照权利要求17-19任一项所述的组合物，其特征在于所述溶菌酶二聚体是溶菌酶单体的二聚产物，它含有约10重量％或更少的不期望的副产物，特别是单体和寡聚物形式的溶菌酶。
CN99807938A 1998-04-27 1999-04-15 提高生育力的组合物及其应用 Pending CN1307480A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98107602 1998-04-27
EP98107602.9 1998-04-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1307480A true CN1307480A (zh) 2001-08-08

Family

ID=8231828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99807938A Pending CN1307480A (zh) 1998-04-27 1999-04-15 提高生育力的组合物及其应用

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP1073448B1 (zh)
JP (1) JP2002512974A (zh)
KR (1) KR20010042619A (zh)
CN (1) CN1307480A (zh)
AT (1) ATE211389T1 (zh)
AU (1) AU746637B2 (zh)
BR (1) BR9909980A (zh)
CA (1) CA2329938A1 (zh)
DE (1) DE69900754T2 (zh)
DK (1) DK1073448T3 (zh)
EA (1) EA200001106A1 (zh)
ES (1) ES2171080T3 (zh)
HU (1) HUP0101602A3 (zh)
IL (1) IL139209A0 (zh)
NO (1) NO20005345L (zh)
PL (1) PL343796A1 (zh)
PT (1) PT1073448E (zh)
SI (1) SI1073448T1 (zh)
TR (1) TR200003146T2 (zh)
WO (1) WO1999055354A1 (zh)
ZA (1) ZA200005832B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588014A (zh) * 2018-03-15 2018-09-28 广州伯瑞丁生物新技术开发有限公司 一种猪精子培养基及其制备方法
CN109843217A (zh) * 2016-10-18 2019-06-04 伺马般有限公司 用于哺乳动物人工授精的装置
CN114350600A (zh) * 2022-01-26 2022-04-15 中国农业大学 一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111372654A (zh) * 2017-09-22 2020-07-03 阿德莱德大学 用于改善精子质量的方法和产品

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DZ1964A1 (fr) * 1995-01-13 2002-10-15 Nika Health Products Ltd Nouvelle applications d'un dimère de lysozyme.

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109843217A (zh) * 2016-10-18 2019-06-04 伺马般有限公司 用于哺乳动物人工授精的装置
CN109843217B (zh) * 2016-10-18 2021-03-12 伺马般有限公司 用于哺乳动物人工授精的装置
US11529222B2 (en) 2016-10-18 2022-12-20 Smartbow Gmbh Device for artificially inseminating a mammal
CN108588014A (zh) * 2018-03-15 2018-09-28 广州伯瑞丁生物新技术开发有限公司 一种猪精子培养基及其制备方法
CN114350600A (zh) * 2022-01-26 2022-04-15 中国农业大学 一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液及其应用
CN114350600B (zh) * 2022-01-26 2023-08-18 中国农业大学 一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
ATE211389T1 (de) 2002-01-15
AU746637B2 (en) 2002-05-02
NO20005345D0 (no) 2000-10-24
DE69900754D1 (de) 2002-02-28
ES2171080T3 (es) 2002-08-16
PT1073448E (pt) 2002-06-28
HUP0101602A2 (hu) 2001-08-28
ZA200005832B (en) 2001-10-31
EP1073448B1 (en) 2002-01-02
WO1999055354A1 (en) 1999-11-04
CA2329938A1 (en) 1999-11-04
HUP0101602A3 (en) 2004-10-28
NO20005345L (no) 2000-12-21
KR20010042619A (ko) 2001-05-25
IL139209A0 (en) 2001-11-25
SI1073448T1 (en) 2002-06-30
DE69900754T2 (de) 2002-08-22
AU3708199A (en) 1999-11-16
JP2002512974A (ja) 2002-05-08
EP1073448A1 (en) 2001-02-07
DK1073448T3 (da) 2002-04-22
BR9909980A (pt) 2000-12-26
PL343796A1 (en) 2001-09-10
EA200001106A1 (ru) 2001-04-23
TR200003146T2 (tr) 2001-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10660921B2 (en) Therapeutics using adipose cells and cell secretions
CN103409375B (zh) 一种接种鸡胚用病毒稀释液及其制备方法
CN103702674A (zh) 血小板裂解物的组合物、用途和制备
CN101679954A (zh) 用于活的减毒病毒的方法和组合物
CN101095950B (zh) 一种稳定的人用狂犬病疫苗冻干制剂及其制备
US20210368782A1 (en) Nucleated cell preservation by lyophilization
CN104524563A (zh) 疫苗组合物及其制备方法和应用
CN1426816A (zh) 兽医病毒类生物制品耐热冻干保护剂及制备工艺
CN1307480A (zh) 提高生育力的组合物及其应用
CN105368787A (zh) 一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法
EP2471538B1 (en) The use of lpa for encouraging pregnancy, and fertility agent
CN1232634C (zh) 蓝狐精液稀释液
CA3175599A1 (en) Regenerative nonsteroidal anti-inflammatory compositions, methods of production, and methods of use thereof
RU2430968C2 (ru) Амфифильная высокополимерная рнк из пекарских дрожжей
Stewart et al. Mouse metrial gland cells do not kill Yac-1 myeloma cells
CN103096916B (zh) 用于牛粒细胞集落刺激因子及其变体的制剂
RU2303631C1 (ru) Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием
US20190234933A1 (en) Compositions and assays
WO2024108955A1 (zh) 乙型肝炎疫苗
AU2020257078B2 (en) Stem cells and secretions for treatment of inflammatory conditions
JP2008519032A (ja) Ｆｇｆ−２０の調合物、生成方法および使用
RU2470648C1 (ru) Препарат для стимуляции обмена веществ и неспецифической резистентности животных
CN1762488A (zh) 人细胞纤连蛋白的外用药物组合物及其制备方法
Samorek-Salamonowicz et al. Effect of acyclovir on the replication of turkey herpesvirus and Marek’s disease virus
CN1764481A (zh) 细胞制剂

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication