DK175017B1 - Fremgangsmåde til adskillelse af proteinholdige materialer fra nucleinsyrer - Google Patents

Description

DK 175017 B1

T

X

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af nucleinsyreprøver, som er forurenet med proteinholdigt materiale, under anvendelse af materialer til fastfaseekstraktion, dvs. en fremgangsmåde til adskil-5 lelse og af proteinholdige materialer fra nucleinsyrer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at a) en opløsning indeholdende proteinholdige materialer og nucleinsyrer bringes i kontakt med et rehydratiseret silicagel, som er et partikel formet materiale, som på over- 10 fladen praktisk taget ikke indeholder polyvalente kationer, og som har overfladehydroxylgrupper i en minimumskoncentration på 0,1 ^mol/m^ og ved en pKa-værdi mellem 6 og 10, idet den rehydratiserede silicagel har et specifikt overfladeareal på mindst 50 m^/g og gennemgående porer med en 15 effektiv diameter på mere end 6 nm, der er i stand til at binde proteinholdige materialer og lade en ubunden fraktion indeholdende nucleinsyrerne passere, og at b) den ubundne fraktion isoleres.

Fra T. Maniatis, et al. [Molecular Cloning - A Labora-20 tory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), side 458-460] kendes en fremgangsmåde til rensning af nucleinsyrer baseret på processerne beskrevet af K. S. Kirby [Biochim. J. , Vol. 66, 494-504 (1957)] og J. Marmur [J.

Mol. Biol., Vol. 3, 208-218 (1961)]. Ved denne fremgangsmåde 25 anvendes phenol i en væske-væske-ekstraktionsproces, hvorved proteinet, som forurener en vandig nucleinsyreprøve, ekstra-heres over i phenolfasen, mens nucleinsyren forbliver i den vandige fase. Denne nucleinsyrerensningsmetode kan faktisk omfatte en række væske-væske-ekstraktioner, hvor en vandig 30 nucleinsyreprøve ekstraheres sekventielt med lige store rumfang af hhv. flydende phenol, phenol/chloroform/isoamyl-alkohol (50/48/2) og chloroform/isoamylalkohol (96/4) . Efter hver enkelt ekstraktion ekstraheres den organiske fase, som indeholder protein (og noget nucleinsyre) tilbage med en 35 vandig puffer for at udvinde eventuel nucleinsyre, som er ekstraheret over i den organiske fase. Den vandige nuclein- 2 DK 175017 B1 syreprøve skal derefter ekstraheres fuldstændigt med diethyl-ether for et fjerne enhver rest af phenol, chloroform eller isoamylalkohol. Til sidst fjernes rester af diethylether enten under reduceret tryk eller ved at blæse en nitrogen-5 strøm hen over prøven i 10 minutter. Fjernelsen af rester af organiske opløsningsmidler er af afgørende betydning, da de ellers ville gribe forstyrrende ind i senere kloningseller hybridiseringsprocesser, hvori nucleinsyren kan anvendes .

10 Selvom ekstraktion med phenol er en meget effektiv metode til rensning af nucleinsyreprøver og er anvendt i vid udstrækning, er metoden imidlertid også arbejdskrævende og tidsrøvende. Blandt andre ulemper ved denne metode kan nævnes risici (irritationsfremkaldende kemikalier, carcinogen 15 virkning, lugtgener og brandfare) forbundet med anvendelsen af de organiske opløsningsmidler (phenol, chloroform, isoamylalkohol og diethylether).

En anden metode til rensning af nucleinsyrer er baseret på den foretrukne adsorption af nucleinsyrer ved anven-20 delse af nucleinsyrerensningspatroner forhandlet under varemærket "NENSORB 20"® (DuPont). En proteinholdig DNA-prøve ledes gennem en søjle af "NENSORB"® partikler, hvorved DNA'et bindes til partiklerne, og størsteparten af det protein-holdige materiale kan udvaskes fra søjlen med en vandig 25 puffer. Den bundne nucleinsyre desorberes derefter fra partiklerne ved at lede 20%'s vandig ethylalkohol (eller 50%'s vandig methylalkohol) gennem søjlen, og DNA'et opsamles i afgangsstrømmen fra søjlen. Inden DNA'et anvendes til kloning eller hybridisering, er det nødvendigt at fjerne alkoholen 3 0 fra DNA-opløsningen ved at anbringe prøven i vakuum i adskillige timer.

Anvendelsen af "NENSORB"® har andre begrænsninger. Foruden at binde nucleinsyre binder "NENSORB"®-materialet også protein i varierende grad. Dette begrænser ikke blot 35 materialets kapacitet til at binde nucleinsyre kvantitativt fra en prøve, som er kraftigt forurenet med proteinholdigt 3 DK 175017 B1 materiale (f.eks. blodserum, vævshomogenat), men det bevirker endvidere, at noget løst bundet protein kan elueres med nucleinsyren, når denne desorberes fra "NENSORB"®-materialet ved anvendelsen af den vandige alkohol. Der kræves tre for-5 skellige opløsningsmidler til at aktivere "NENSORB"®-søjlen, udvaskning af det ubundne protein fra søjlen og efterfølgende eluering af nucleinsyren fra søjlen. Nucleinsyren elueres fra søjlen i et opløsningsmiddel (20%'s ethylalkohol eller 50%'s methylalkohol), som er uforligeligt ved senere anven-10 delse af nucleinsyren, f.eks. til kloning og hybridiserings-analyser. Rensningsmetoden under anvendelse af "NENSORB"® kan være tidsrøvende, idet der kræves mindst én time til rensning af en enkelt nucleinsyreprøve.

Fra C. A. Thomas et al., Analytical Biochemistry, 15 Vol. 93, 158-166 (1979) er det kendt at anvende glasfiber filtre til adsorption af proteiner og protein-DNA-komplekser fra vandige DNA-prøver. Denne metode er behæftet med følgende ulemper: 1) Den vandige DNA-prøve skal indeholde mindst 300 mM NaCl, for at proteinet kan bindes effektivt til glasfiber-20 filtret. Inden den videre anvendelse af DNA'et i biologiske reaktioner, såsom spaltning af DNA'et med et restriktionsenzym, vil det være nødvendigt at nedsætte denne relativt høje saltkoncentration ved at fjerne saltet fra DNA-prøven (eller ved at fortynde opløsningen) . 2) Der opnås kun en 25 høj DNA-udvinding fra filtret, hvis dette vaskes i udstrakt grad med en vandig puffer. 3) Glasfibrenes lave specifikke overfladeareal (ca. 2 m2/g) resulterer i en lav proteinbindingskapacitet for glasfiberfiltret. Den maksimale proteinbindingskapacitet anslås til at være 8,5 mg bovint serum-30 albumin (BSA) pr. gram glasfiberfilter.

Fra B. Vogelstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, Vol. 26, nr. 2, 615-619 (1979) kendes en fremgangsmåde til at separere DNA fra agarose ved at binde DNA'et til glas, fortrinsvis glaspulver, i nærværelse af Nal. DNA'et 35 fjernes fra glasset ved eluering med Tris-HCl, pH 7,2/0,2 M NaCl/2 mM EDTA). Det anføres endvidere, at silicagel og 4 DK 175017 B1 porøse glasperler er uegnede til rensning af DNA.

Fra J. Kirkland, J. Chromatographic Sci., Vol. 9, 206-214 (1971) er det endvidere kendt at fremstille over flademodificerede silicageler ved at omsætte silanreagenser 5 med overfladen af den porøse skal på "Zipax"® chromatografi-bæremateriale med reguleret overflade.

Fra J. Kohier, et al., J. Chromatography, Vol. 385, 125-150 (1987) er det tillige kendt at fremstille kalcineret siliciumdioxid, som er fuldstændig hydroxyleret, ved opløs-10 ning og genfældning af kiselsyre.

Endelig er det fra T. Watanabe et al., J. Solid-Phase Biochem., Vol. 3, 161-173 (1978) kendt at fremstille immo- biliserede tanniner til proteinadsorption.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe en 15 forbedret fremgangsmåde til fastfaseekstraktion til fjernelse af proteinholdige urenheder fra nucleinsyreprøver. Denne fremgangsmåde skal kunne fjerne store proteinandele fra små mængder nucleinsyre, som skal udvindes på biologisk aktiv form. Fremgangsmåden skal endvidere være hurtig, hensigts -20 mæssig, give kvantitativ udvinding af nucleinsyren og anvende farlige materialer i mindst mulig udstrækning. Ved fremgangsmåden må der endvidere i nucleinsyreprøven ikke indføres forurenende stoffer eller urenheder, som kan gribe forstyrrende ind ved de senere anvendelser af nucleinsyren.

25 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til adskillelse af de proteinholdige materialer fra nucleinsyrer bringes en opløsning, som indeholder de proteinholdige materialer og nucleinsyrer, i kontakt med et f astf aseekst rakt ionsmateriale, som kan binde proteiner, til dannelse af bundne og ubundne 30 fraktioner, hvorefter den ubundne fraktion, som indeholder nucleinsyrerne, isoleres.

Fastfaseekstraktionsmaterialerne, som kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til adskillelse af proteiner og nucleinsyrer, er partikelformede faste mate-35 rialer med meget høj affinitet til proteinholdige materialer og meget lav affinitet til nucleinsyrer. Fastfaseekstrak- DK 175017 B1

D

tionsmaterialerne er karakteriseret ved, at de har et stort specifikt overfladeareal med høje overfladekoncentrationer af svagt sure hydroxylgrupper og lave overfladekoncentrationer af polyvalente kationer.

5 Fastfaseekstraktionsmaterialer med stort specifikt overfladeareal foretrækkes på grund af deres evne til at fjerne store mængder protein. Ekstraktionsmaterialets specifikke overfladeareal er fortrinsvis mindst 50 m2/g, især mindst 100 m2/g. Disse høje overfladearealer skyldes fore-10 komsten af porer igennem det partikelformede materiale. Porerne bør have en effektiv diameter, som er større end 60 Å, og selvom der ikke er nogen øvre grænse for porediameteren, foretrækkes en rimelig grænse på 500 Å af hensyn til opretholdelse af et stort specifikt areal. Det foretrukne 15 interval er fra 60 til 150 Å.

Høje koncentrationer af svagt sure hydroxylgrupper på ekstraktionsmaterialet tjener såvel til at forøge ekstraktionsmaterialets affinitet overfor proteinholdige eller proteinagtige forbindelser som til at nedsætte dets affinitet 20 overfor polyanioner, såsom nucleinsyrer. Den minimale effektive koncentration af svagt sure hydroxylgrupper er 0,1 μιηοΐ/m2. Koncentrationen af svagt sure hydroxylgrupper er fortrinsvis 1-8 μηιοΐ/τη2, især 8 μπιοΐ/m2.

Overfladehydroxylgrupperne har fortrinsvis en pKa-25 -værdi på fra 6-10.

Koncentrationen af polyvalente kationer på overfladen af fastfaseekstraktionsmaterialet bør være så lav som muligt for at hindre komplekseringen af anioniske nucleinsyrer med kationer på overfladen. Trivalente metaller, såsom jern 30 og aluminium, er særligt skadelige for ekstraktionsmaterialernes funktion.

Fastfaseekstraktionsmaterialer med de ovenfor omtalte ønskede egenskaber kan fremstilles på forskellige måder, idet man enten anvender et homogent partikelformet materiale 35 eller et partikelformet kernemateriale, på hvis overflade man indfører de ønskede funktionelle grupper eller dele ved 6 DK 175017 B1 hjælp af kemiske reaktioner. I det førstnævnte tilfælde har det vist sig, at rehydratiseret silicagel har de ønskede egenskaber. Silicagel har i sig selv en høj overfladekoncentration (8 μπποΐ/m2) af svagt sure (6 < pKa < 10) hydroxyl -5 grupper og opfylder således de ovenfor omtalte hovedbetingelser. Det er endvidere i stand til at adsorbere proteinholdige materialer i meget høj grad. Imidlertid skal overfladen af silicagelen være fri for polyvalente kationer, hvis man vil undgå, at nucleinsyrer adsorberes på silicagelpartiklernes 10 overflade. Dette kan opnås på flere måder.

Ved den foretrukne fremgangsmåde foretages rehydroxy-lering og rensning af silicagelpartiklernes overfladelag ved opløsning og genfældning af overfladelaget af partiklerne under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Kohier et al., J.

15 Chromatography, Vol. 385, 125-150 (1987). Ved denne proces opløses silicapartiklernes ydre overflade i en fortyndet hydrogenfluoridsyreopløsning ved forhøjet temperatur. Den opløste silica genfældes derpå på overfladen af hver partikel ved at henstille opløsningen, som indeholder den opløste 20 silica, til afkøling til stuetemperatur, hvor den har en lav opløselighed i vandige medier. Når laget genfældes, forbliver urenheder, der findes i det ydre lag af silicagelen, og som er blevet opløst, i opløsningen, og der dannes et praktisk taget rent lag silica omkring partikelkernen.

25 Eventuelt kan polyvalente metalurenheder udludes fra silicagelen ved at behandle denne sekventielt med moderat koncentreret saltsyre og moderat koncentreret salpetersyre ved højere temperaturer. Ved denne metode opløseliggøres og ekstraheres metalurenheder, som findes på silicagelpartikler-30 nes overflade, hvorefter man får en overflade af praktisk taget ren silicagel.

En tredie metode til fremstilling af fastfaseekstrak-tionsmaterialet er at polymerisere et tykt lag organisk materiale, som har et stort indhold af svagt sure hydroxyl-35 grupper, på overfladen af et porøst bæremateriale. Dette kan gøres ved at omsætte en organisk silan, der indeholder 7 DK 175017 B1 den ønskede kemiske funktion, med siliciumdioxid, hvor silanen danner tværbindinger dels internt og dels med silicagel-partiklerne, hvorved der dannes et tykt lag immobiliseret organisk polymer [J. Kirkland, et al., J. Chromatographic 5 Sci., Vol. 9, 206-214 (1971)], som har det ønskede indhold af svagt sure hydroxylgrupper. På grund af hydroxylgruppemes tilstedeværelse kan overfladen adsorbere store mængder pro-teinholdigt materiale, og hydroxylgrupperne afskærmer tillige nucleinsyrerne fra eventuelle polyvalente kationer i par-10 tikelkernen under laget af den organiske polymer og hindrer således at nucleinsyrer bindes til fastfaseekstraktions-materialet. Adskillige organiske silaner kan anvendes til denne reaktion. Anvendelse af silaner til at immobilisere phenol (pKa = 9,9), β-naphthol (pKa = 9,6) eller tannin 15 (polyhydroxycarboxylsyrer) på overfladen af bærerpartikierne vil eksempelvis give nyttige fastfaseekstraktionsmaterialer.

Som bærematerialer kan eksempelvis anvendes siliciumdioxid, cellulose, agarose og andre materialer, som har et stort indhold af aktive overfladegrupper.

20 Uanset hvilken fremgangsmåde, som har været anvendt til fremstilling af fastfaseekstraktionsmaterialet, kan det anvendes på mindst to måder til fjernelse af proteinholdige urenheder fra nucleinsyreprøver. Ifølge en første udførelsesform sættes en del af det partikelformede fastfastekstrak-25 tionsmateiale til et rumfang af prøven, som skal deprotei-niseres. Blandingen omrøres forsigtigt, således at det partikelformede materiale holdes i suspension. På grund af fastfaseekstraktionsmaterialets lille størrelse og store overfladeareal diffunderer og adsorberer det proteinholdige 30 materiale hurtigt på fastfaseekstraktionsmaterialet (i løbet af nogle minutter). Det partikelformede materiale, som indeholder det adsorberede protein, adskilles derpå fra den vandige nucleinsyreprøve på vilkårlig hensigtsmæssig måde, f.eks. ved centrifugering eller filtrering. Denne udførelses-35 form er mest effektiv, når et stort rumfang prøve (>l ml) indeholder små mængder protein og således kun kræver en 8 DK 175017 B1 lille mængde partikler (f.eks. <10 mg) til kvantitativ fjernelse af proteinet.

Ved en anden udførelsesform pakkes fastfastekstraktionsmaterialet i en søjle, og den vandige prøve ledes gennem 5 søjlen. Til dette formål afvejes en partikelmængde i en centrifugesøjle, som pakkes ved let bankning af den lukkede ende af søjlen mod bordet. Søjlen kan også centrifugeres ved stor hastighed i en centrifuge, hvorved centrifugalkraften pakker partiklerne tæt i bunden af søjlen. Derefter 10 fugtes søjlen ved pipettering af et rumfang af den egnede puffer {rumfanget svarer i det mindste til rumfanget af partiklerne i søjlen) til søjlen, og søjlen henstår til nedsivning af pufferen i søjlelaget. Derefter fjernes overskud af puffer fra søjlelaget ved at centrifugere søjlen med 15 stor hastighed i en centrifuge i ca. 30 sekunder. Puffer, som eventuelt udskilles fra søjlen, hældes bort. Søjlen er nu klar til at modtage nucleinsyreprøven, som skal depro-teiniseres. Prøven pipetteres på søjlehovedet, og søjlen henstår til nedsivning af prøven i søjlelaget, hvor det 20 proteinholdige materiale bindes til partiklerne, og nuclein-syrerne forbliver i opløsning. Derefter centrifugeres søjlen med stor hastighed i en centrifuge til udskillelse af den vandige fase, som indeholder nucleinsyrerne, i et opsamlingsrør. Nucleinsyreudvindingen fra søjlen er typisk større 25 end 80% af den mængde, som anbringes på søjlen. Udvindingen kan øges til ca. 95%, hvis et lille rumfang (typisk 1/3 til 1/2 af det rumfang prøve, der oprindeligt anbringes på søjlen) af den egnede puffer pipetteres på søjlens hoved, hvorpå søjlen centrifugeres med stor hastighed i centrifugen. På 30 denne måde udvaskes al indelukket nucleinsyre gennem søjlelaget, og denne vaskevæske bør sættes til afgangsvæsken fra søjlen, som indeholder størsteparten af nucleinsyren. Denne udførelsesform virker bedst med prøver, som er kraftigt forurenet med proteinholdigt materiale, når det er nødvendigt 35 at anvende en stor mængde partikler (i forhold til prøvens rumfang). Endvidere er denne udførelsesform nyttig, når der 9 DK 175017 B1 skal foretages deproteinisering af et meget lille prøverumfang (f.eks. 50 μΐ), og anvendelse af den foregående metode ville være besværlig.

De puffere, som anvendes i søjlebefugtningstrinet og 5 i søjlevaskningstrinet som beskrevet ovenfor, skal opfylde forskellige betingelser. Pufferens kemiske sammensætning synes ikke at være af afgørende betydning, selvom anvendelsen af salte af polyvalente metalkationer, f.eks. Al, Fe og Ti, bør undgås. Biokemiske standardpuffere, såsom TE (10 mM 10 Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,75), STE (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7,0) eller PBS (120 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 10 mM phosphat pH 7,4), kan udmærket anvendes. Almindeligvis bør pufferens pH-værdi ligge i området fra 6 til 7,5. Ved lavere pH-værdier kan nucleinsyre binde til fastfastekstrak-15 tionsmaterialet, hvorved der fås formindskede udbytter, hvorimod bærematerialet ved høje pH-værdier kan gå i opløsning, da silicagel har en betydelig opløselighed i basiske opløsninger. Hvis nucleinsyreprøven har en pH-værdi, som ligger udenfor det ovennævnte interval, må den af samme 20 grund indstilles på en pH-værdi i området 6-7,5, inden den anbringes på søjlen på henblik på fjernelse af proteiner.

Det foretrukne pH-interval for alle puffere og prøver ligger i området fra 6,5 til 7,0.

Porediameteren i fastfaseekstraktionsmaterialet bør 25 være tilstrækkelig stor til, at proteiner kan trænge ind i materialet og adsorberes på de indre porers overflade. Derved opnår bæreren størst mulig kapacitet til fjernelse af protein fra prøver. Porerne skal også være tilstrækkeligt store til, at nucleinsyre ikke indfanges i porernes indre. Det har 30 vist sig, at minimumsporediametre i området 60 til 150 Å giver de ønskede egenskaber. Der er ingen kritisk øvre grænse for porediameteren, men det specifikke overfladeareal falder med stigende porediameter for partiklerne. En rimelig øvre grænse kan derfor fastsættes til 300-500 Å. Partikler med 35 porediametre, som ligger over denne grænse, har et mindre overfladeareal og dermed formindsket proteinbindingskapaci- 10 DK 175017 B1 tet.

Fastfaseekstraktionsmaterialet er nyttigt til fjernelse af proteinagtige eller proteinholdige urenheder fra vidt forskellige nueleinsyreprøver. Det er påvist, at mate-5 rialet kan anvendes til fjernelse af enzymer fra restriktionsspaltningsblandinger, til fjernelse af alkalisk phosphatase fra dephosphoryleringsreaktionsblandinger og til fjernelse af kinaseenzymer fra identifikationsreaktionsblandinger. Det antages, at andre almindelige enzymer, såsom 10 revers transkriptase, DNA-polymerase, DNA-ligase og terminal transferase, der er almindeligt anvendt i molekylærbiologien, også kan fjernes fra nucleinsyreprøver under passende forsøgsbetingelser .

Endvidere kan fastfaseekstraktionsmaterialet anvendes 15 til isolering og rensning af nucleinsyrer fra et stort antal biologiske prøver. Materialet har været anvendt til rensning af DNA fra organismer i prøver af ufraktioneret blod (hel-blod). Det formodes, at lignende isoleringer fra andre klinisk interessante prøver, såsom spyt, urin, fæces og væv, 20 vil kunne gennemføres, når først der er udviklet en passende rensningsmetode. Sådanne rensede nucleinsyreprøver skulle kunne anvendes direkte i kliniske hybridiseringsanalyser. Endvidere kan fastfaseekstraktionsmaterialet anvendes til isolering og rensning af nucleinsyrer fra organismer, der 25 er dyrket i vækstmedier med det ene formål at producere DNA til kloningsformål eller anden rekombinant genteknologi.

Fastfaseekstraktionsmaterialet kan anvendes til fjernelse af proteinholdige urenheder fra mange forskellige nucleinsyrer. Materialet kan eksempelvis anvendes til at 30 fjerne kinaseenzymer, der anvendes til radioaktiv mærkning af mononucleotider, såsom dATP, dCTP og andre. Materialet kan også anvendes til at fjerne alkalisk phosphatase fra DNA-blandinger på fra 125 basepar (bp) til 21.226 bp. Materialet har i vid udstrækning været anvendt med pBR322 DNA 35 (43 62 bp) . Materialet har desuden været anvendt med intakt λ DNA (49.000 bp) , og der er ikke konstateret nedbrydning 11 DK 175017 B1 af dette DNA som følge af mekaniske forskydningskraefter.

Større DNA-strenge kan være udsat for en nedbrydning som følge af forskydningskræfter, når de passerer gennem søjlen med fast faseekstrakt ionsmaterialet, uden at der dog er vished 5 derfor. Dette problem kan helt eller delvis løses ved at anvende partikler med en større størrelse til fremstilling af fastfaseekstraktionsmaterialet, hvorved man opnår at formindske forskydningskræfterne i søjler, som er pakket med disse partikler.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til deproteiniserin- gen af prøver, som indeholder nucleinsyrer, har følgende fordele i forhold til de for tiden anvendte metoder: 1. Da fastfaseekstraktionsmaterialet er praktisk taget uopløseligt i egnede vandige puffere, går det ikke i 15 opløsning i nucleinsyreprøven, og efterfølgende foranstaltninger, f.eks. ekstraktioner, til dets fjernelse er således ikke nødvendige som det er tilfældet ved phenol/chloroform--ekstraktionerne.

2. Nucleinsyren elueres i et vandigt medium, som er 20 stort set identisk (bortset fra, at proteinerne er fjernet) med det medium, hvormed den blev anbragt på søjlen. Nucleinsyren forekommer således i et opløsningsmiddel, som er forligeligt med de efterfølgende biologiske processer, hvori den anvendes. Der forekommer ingen urenheder, dvs. phenol, 25 chloroform, ethanol og lignende stoffer, der kan inhibere eller deaktivere enzymer, som anvendes i senere biologiske processer.

3. Rensningsmetoden, hvorved dette materiale anvendes, kræver 5-10 minutter til behandling af en prøve, hvorimod 30 metoder baseret på phenol/chloroform-ekstraktioner eller på "NENSORB"® materiale, kan kræve en time eller derover. Dertil kommer, at behandling af flere prøver blot kræver to minutter pr. prøve.

4. Der kræves ingen særlige reagenser til gennemfø-35 relse af denne rensningsmetode. TE (pH-værdi 6,75) er en brugbar puffer til befugtning og vaskning af søjlen, og 12 DK 175017 B1 denne puffer findes i alle laboratorier, som arbejder med nucleinsyrer. Desuden kræves der ingen toksiske eller farlige reagenser.

5. Der opnås høj nucleinsyreudvinding, typisk 80-95%.

5 6. Til forskel fra rensningsmetoder, som er baseret på adsorption af DNA på et bæremateriale, sker der ved denne fremgangsmåde ingen opskæring af store DNA-fragmenter. Der opnås således en bibeholdelse af prøvens integritet. Opskæring af DNA-strenge kan forekomme ved fremgangsmåder, som 10 er baseret på adsorption af nucleinsyren til et fastfase-materiale, da i tilfælde af lange DNA-fragmenter, f.eks. 10 kilobasepar eller derover, de to ender af DNA-strengen kan adsorberes samtidig på hver sin partikel, og når der foretages omrøring, vil de to partikler bevæge sig i forskellige 15 retninger, hvorved DNA-strengen trækkes over i to mindre stykker. Da DNA'et ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke adsorberes til den faste fase (dette sker for proteinet) , kan en sådan nedbrydning af DNA'et ikke finde sted.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efter-20 følgende eksempler, hvori der anvendes pBR322 DNA og PST restriktionsenzym fra Pharmacia,

Inc., Piscataway, N.J.

10 x PST restriktionsspaltningspuffer indeholdende 500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2 og 10 mM 25 dithiothreitol, alkalisk phosphatase fra kalvetarm fra Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN., og BCIP (5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat) fra Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD.

30 EKSEMPEL 1

Fremstilling og anvendelse af silanbehandlet silicagel A. Præparering af silicagelbærematerialet.

20,5 g "Fractosil"® (E. Merck, Darmstadt, Tyskland) 35 vaskes med 3 x 100 ml 25%'s (r/r) salpetersyre ved stuetemperatur ved suspendering af silicagelpartiklerne i den 13 DK 175017 B1 vandige syre i 10 minutter, hvorpå overskud af syre dekanteres, når partiklerne er aflej ret på bunden af bægerglasset.

De syrebehandlede partikler skylles grundigt med destilleret, deioniseret vand, indtil supernatanten har en pH-værdi på 5 5,5. Derefter overføres partiklerne til en Biichner-tragt forsynet med et filtrerpapir med middelporøsitet, hvorpå partiklerne skylles med 3 x 100 ml methanol af høj renhed og tørres i l time ved 80°C og 630 mm Hg.

10 B. Polymerisation af aminophenyltrimethoxysilan på sili- cagelbærematerialet.

4,0 ml aminophenyltrimethoxysilan (Petrarch Systems,

Inc., Bristol, PA) sættes til 24 ml destilleret, deioniseret vand og 12 ml isopropyl alkohol i en rundbundet kolbe forsynet 15 med en tilbagesvaler og en magnetisk omrører. Den dannede blanding omrøres, indtil silanen er fuldstændigt opløst.

Til silanopløsningen sættes 6,1 g syrevaskede silicagelpar-tikler, og blandingen tilbagesvales i 2 timer ved 81°C. Til kolben sættes 3,5 ml iseddike, og blandingen tilbagesvales 20 i yderligere 1 time. Suspensionen henstår til afkøling til stuetemperatur, hvorved silicagelpartiklerne aflej res på bunden af kolben. Den sorte supernatant dekanteres, og partiklerne vaskes grundigt med methanol af høj renhed, indtil vaskevæsken er farveløs. Derefter overføres de aminophenyl-25 derivateriserede silicagelpartikler til en Buchner-tragt, og der suges luft gennem partiklerne til fjernelse af rester af alkohol. Partiklerne tørres yderligere under belysning med en lampe med middelintensitet. Analyse af partiklerne for carbon og nitrogen viser, at der på overfladen af sili-30 cagelpartiklerne er polymeriseret et tykt lag carbonholdigt materiale (6,27% C, 1,13% N).

C. Diazotering af det silanbehandlede bæremateriale.

6,90 g aminophenylderivatiseret silicagel sættes til 35 10,00 ml af en isafkølet opløsning af vand og 7,0 g kon centreret svovlsyre, og partiklerne suspenderes i opløsningen 14 DK 175017 B1 ved magnetisk omrøring. Ca. 17 g finknust is sættes til blandingen, hvorpå der dråbevis tilsættes en opløsning af 2,24 g natriumnitrit i 5,33 g vand i løbet af 8-10 minutter. Blandingens temperatur holdes mellem 0 og 5°C under tilsæt-5 ningsperioden. Blandingen henstår til aflejring af partiklerne, hvorpå supernatanten dekanteres fra blandingen. Partiklerne vaskes derpå tre gange ved suspendering i 100 ml koldt vand, aflejring af partiklerne og dekantering af super-natanten. De opnåede partikler, hvor aminerne på overfladen 10 er blevet omdannet til de tilsvarende diazoniumsalte, anvendes ved den i det følgende beskrevne hydrolysereaktion.

D. Hydrolyse af diazoniumsaltet.

32 ml koncentreret svovlsyre sættes til 24 ml vand, 15 og denne blanding opvarmes til kogning (ca. 160°C) . De diazo-niumsaltholdige partikler sættes langsomt til den varme syre, medens kogningen opretholdes med en svag brusen fra nitrogengassen, som dannes ved spaltningen af diazoniumsaltet. Blandingen koges i ca. 5 minutter, hvorpå den an-20 bringes i et isbad til hurtig afkøling. Den sure supernatant dekanteres fra partiklerne, som derefter vaskes med 5 x 200 ml destilleret, deioniseret vand. Partiklerne samles på en Biichner-tragt forsynet med et filterpapir med middelporøsitet, hvorpå de skylles med 200 ml methanol. Luft suges 25 gennem partikellaget for at fjerne rester af methanol, og partiklerne tørres under en infrarød lampe med middelintensitet . Elementæranalyse viser, at partiklerne på vægtbasis indeholder 0,55% carbon og mindre end 0,01% nitrogen.

30 E. Fjernelse af protein under anvendelse af silanbehand- let silicagel.

Den silanbehandlede silicagel beskrevet ovenfor i afsnit D afprøves for dens effektivitet til fjernelse af et modelprotein (bovint serumalbumin, BSA) fra opløsning samt 35 for dens evne til ikke at binde DNA (laksesperm DNA). Lige store mængder BSA anbringes i forskellige phosphatpuffere 15 DK 175017 B1 (pH-værdi = 5,0-7,0), prøverne blandes med 250 mg silan-behandlet silicagel, og derpå adskilles opløsningerne fra silicagelen ved pelletering af silicagelpartiklerne i en centrifuge. Den oprindelige pufrede proteinopløsning samt 5 filtratet underkastes UV-absorptionsanalyse (200-480 nm) . Sammenligning af UV-spektrene viser, at proteinfjernelsen i alle tilfælde er større end 90%. Tilsvarende prøver under anvendelse af lige store mængde laksesperm DNA viser, at DNA-udvindingen i alle tilfælde er større end 85%.

10 EKSEMPEL 2

Rensning af nucleinsvre under anvendelse af hvdrooenfluorid-svrebehandlet silicagel A. Præparering af rehydratiseret silicagel.

15 140 g silicagel ("PSM300 Zorbax", parti 9, Du Pont) opvarmes i en kvartsdigel til 975°C i 2 timer i en muffelovn, hvorpå 15 g af den afkølede silicagel anbringes i en rund-bundet kolbe forsynet med en tilbagesvaler. Til kolben sættes 150 ml destilleret, deioniseret vand indeholdende 75 ppm HF, 20 og blandingen tilbagesvales ved 110°C i 72 timer. Blandingen henstår til afkøling til stuetemperatur, hvorpå silicagelen vaskes med 1 liter destilleret, deioniseret vand. Silicagelen koges natten over i 150 ml vand, hvorpå den vaskes med 500 ml vand og derpå med 300 ml acetone, hvorefter den tørres 25 ved 110°C i 5 timer.

B. Anvendelse af rehydratiseret silicagel.

Til glas A sættes 1 Mg (15 μΐ) pBR322 DNA, 32 enheder (2 μΐ) PST restriktionsenzym, 6 μΐ 10 x PST restriktions -30 spaltningspuffer (restriktionspuffer med lav styrke) og 37 μΐ vand. Rørets indhold blandes, og der inkuberes ved 37°C i 1,25 timer. Til glas B sættes de samme reagenser som til glas A. Umiddelbart efter blandingen pipetteres imidlertid indholdet af dette glas til toppen af en centrifugesøjle, 35 som indeholder 60 mg hydrogenfluoridsyrebehandlet silicagel.

Søjlen er pakket og befugtet med 1 x PST restriktionspuffer 16 DK 175017 B1 umiddelbart inden påsætning af prøven. Prøven får lov til at suge ned i søjlelaget, og søjlen centrifugeres i 5 minutter i en Eppendorf-centrifuge (model 5412), og afgangsvæsken opsamles. En portion af afgangsvæsken fra søjlen overføres 5 til et tredie reaktionsglas (glas C) , og der tilsættes 1 μΐ (16 enheder) PST-restriktionsenzym. Der foretages blanding af bestanddelene i glasset, hvorpå der inkuberes i 1,25 timer ved 37°C. Alikvoter fra glassene A-C blandes derpå med en puffer til påsætning på agarosegel (0,25% bromphenol-10 blåt, 0,25% xylencyanol og 30% glycerol i vand), og en portion af hver sættes på en 0,7% agaroseelektrophoresegel (0,105 g agarose, 14,8 ml TBE-puffer indeholdende 0,5 Mg/ml ethidiumbromid) i et submarint minicelleelektroforeseap-paratur fra BioRad. Der anlægges en spænding på 100 volt 15 over gelen i ca. 4 timer i en 0,5X TBE-puffer (0,5X TBE = 0,0445 M tris-borat, 0,0445 M borsyre, 0,001 M EDTA, pH 8,0). Der optages fotografier af gelen under gennemlysning med ultraviolet lys af 254 nm.

Fra glas A fås et lineariseret DNA-fragment med en 20 længde, som svarer til længden af en lineariseret pBR322--standard, hvilket viser, at PST-restriktionsenzymet skærer det cirkulære pBR322 på ét sted. DNA'et fra glas B migrerer som cirkulært DNA. Der konstateres intet DNA-bånd i den position på gelen, som svarer til lineariseret pBR322, hvil-25 ket viser, at DNA'et ikke er blevet skåret med enzymet, dvs. enzymet er fjernet under passagen af søjlen. Fra glas C fås også et lineariseret DNA-fragment med en længde svarende til længden af en lineariseret pBR322-standard, hvilket viser, at DNA'et kan skæres af restriktionsenzymet, og at 30 migreringen af DNA'et gennem søjlen ikke ændrer dets biologiske aktivitet eller fjerner nogen af de nødvendige puffer-bestanddele, f.eks. MgCl2» hvilket vil sige, at kun PST--restriktionsenzymet er fjernet.

Dette eksempel viser, at migrering af en prøve, som 35 indeholder DNA og protein, gennem en centrifugesøjle, som indeholder rehydratiseret silicagel, effektivt fjerner disse 17 DK 175017 B1 proteiner, f.eks. PST-restriktionsenzym, fra prøven. Det viser endvidere, at DNA'et opsamlet i afgangsvæsken fra søjlen er biologisk aktivt, og at søjlen ikke overfører urenheder til DNA'et, som kunne inhibere enzymer, som anven-5 des til at modificere DNA'et i senere biologiske reaktioner.

EKSEMPEL 3

Fjernelse af Eco RI-restriktionsenzvm

Der gås frem på samme måde som beskrevet i eksempel 10 2 bortset fra, at der anvendes Eco RI-restriktionsenzym og puffer (middelstyrke) i stedet for PST-restriktionsenzymet og pufferen. Kun cirkulært pBR322-DNA konstateres i søjleafgangsvæsken fra glas B, hvilket viser, at migreringen af blandingen gennem søjlen har fjernet alt Eco RI-restriktions-15 enzym, inden det kunne skære DNA'et.

EKSEMPEL 4

Fjernelse af Sal I-restriktionsenzym

Der gås frem på samme måde som beskrevet i eksempel 20 2, bortset fra, at der anvendes Sal I-restriktionsenzym og puffer (høj styrke) i stedet for PST-restriktionsenzymet og pufferen. Der iagttages kun cirkulært pBR322-DNA i afgangs-væsken fra søjlen fra glas B, hvilket viser, at migrering af blandingen gennem søjlen fjerner alt Sal I-restriktions-25 enzymet, inden det kan skære DNA'et.

EKSEMPEL 5

Præparering af rehvdratiseret silicagel under anvendelse af saltsyre og salpetersyre 30 Silicagel ("PSM300 Zorbax", Du Pont) opvarmes først til 300°C i 2 timer, hvorefter det opvarmes til 540°C i 21 timer i en kvartsdigel i en muff elovn. Tyve gram af denne silicagel anbringes derpå i et "Teflon"®-belagt bægerglas indeholdende 500 ml 10%'s (r/r) saltsyre, og blandingen 35 opvarmes til 100°C i 4 timer. Blandingen henstilles til afkøling til stuetemperatur i flere timer, hvorpå den filt- 18 DK 175017 B1 reres. Silicagelen vaskes med 1 liter destilleret, deionise-ret vand, hvorpå den anbringes i et "Teflon"®-bægerglas indeholdende 500 ml 10%'s (r/r) salpetersyre. Blandingen opvarmes til 100°C i 4 timer, hvorefter den henstår til 5 afkøling til stuetemperatur og filtreres. Silicagelen vaskes med 1 liter vand, hvorefter vaskeprocesserne med saltsyre og salpetersyre gentages. Til sidst opvarmes silicagelen i 500 ml destilleret, deioniseret vand i 4 timer ved 100°C, hvorpå den henstår til afkøling til stuetemperatur, filtre-10 res, vaskes med 1,5 liter destilleret, deioniseret vand, skylles med 300 ml acetone og tørres ved 110°C.

En portion af denne rehydratiserede silicagel afprøves for DNA-udvinding som beskrevet i eksempel 1, og der opnås en udvinding på 87,2% af en DNA-prøve på 1 μg.

15 EKSEMPEL 6

Fjernelse af alkalisk phosphatase fra denhosphorvlerings-reakt ionsblandinoer

Lineariseret DNA (pBR322-DNA spaltet med PST-restrik-20 tionsenzym) opløses i 80 μΐ dephosphoryleringspuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,2), og der tilsættes 1 μΐ (0,5 enheder) alkalisk phosphatase fra kalvetarm. Blandingen inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Der udtages 40 μΐ af reaktionsblandingen, hvortil der sættes 7,6 μΐ 0,25 M saltsyre 25 til indstilling af pH-værdien på 6,0. Den neutraliserede blanding centrifugeres derefter gennem en 40 mg søjle af rehydratiseret silicagel præpareret som beskrevet i eksempel 2, som forinden er blevet pakket og befugtet med dephosphoryleringspuf fer (pH 6,0).

30 Den opsamlede afgangsvæske fra søjlen analyseres derpå for indhold af aktiv alkalisk phosphatase ved en enzymanalyse: Til afgangsvæsken fra søjlen sættes 10 μΐ 1 M Tris-HCl (pH 8,0) til indstilling af pH-værdien på 7,8. Blandingen sættes derpå til 100 μΐ analysepuffer indeholdende 35 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl og 0,22 μg/ml BCIP, et farveløst substrat for enzymet alkalisk phosphatase, 19 DK 175017 B1 som omdannes af enzymet til et farvet produkt. Efter en analysereaktionstid på 2 timer opsamles det uopløselige farvede produkt på filtre med en diameter på 2 mm.

Kontrolreaktioner med prøver indeholdende 0,25 enheder 5 aktiv alkalisk phosphatase giver meget kraftige blå farver. Fortyndinger på 0,0025 og 0,00025 enheder alkalisk phosphatase giver også blå farver. Der findes intet synligt blåt bundfald fra afgangsvæsken fra søjlen, der oprindeligt indeholder 0,25 enheder forud for passagen af søjlen, hvilket 10 viser, at søjlen har fjernet mindst 99,99% af den alkaliske phosphatase fra prøven under passagen af søjlen. For at sikre fuldstændig fjernelse af enzymet er det nødvendigt at syrne den alkaliske phosphatase-dephosphoryleringsblanding, inden den ledes gennem søjlen. Ved pH 8,2 fjernes kun 99,9% 15 af enzymet.

Ved et lignende forsøg fjernes op til 5 enheder alkalisk phosphatase med en fjernelsesgrad på >99,99% under anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.

20 EKSEMPEL 7

Rensning af bakteriel DNA fra ufraktioneret blod (helblod)

Ufraktioneret humant blod fra sunde donorer tilsættes E. coli-bakterier, hvis DNA indeholder et insert af herpes simplex virus-DNA (5 μgί New England Nuclear Corp., Bil-25 lerica, MA). 10 ml af denne blodprøve lyseres i et "Isolator"® glas (Du Pont) til oplukning af de røde blodlegemer. Intakte bakterier isoleres derpå ved centrifugering af "Isolator"®-glasset i en centrifuge til dannelse af et 1,5 ml lag af bakteriesediment i glassets bund, hvorpå super-30 natanten fjernes. Bakterierne lyseres derpå i 2%'s natrium-dodecylsulfat (SDS) i 30 minutter ved 65°C. Bakterierne fra blodprøven opvarmes til 100°C i 10 minutter til koagulering af størsteparten af det proteinholdige materiale. Koagulatet sedimenteres derpå i en centrifuge i 10 minutter, og super-35 natanten udtages. Den koagulerede masse løsnes derpå i 1 ml destilleret vand til udvaskning af eventuelt DNA fra massen, 20 DK 175017 B1 hvorpå der centrifugeres, og supernatanten udvindes og sættes til den oprindelige supernatant. Denne proces gentages derpå.

På dette trin er det frigjorte bakterielle DNA isoleret i 4 ml væske, som stadig indeholder en væsentlig mængde 5 protein (>10 mg/ml), hvilket ses af prøvens rustrøde farve, som skyldes restindhold af bl.a. blodproteiner. Til fjernelse af restproteinet anbringes prøven på toppen af en centrifugesøjle pakket med rehydratiseret silicagel (fremstillet som i eksempel 2), som forinden er blevet befugtet med 4 ml TE-10 -puffer (pH 6,75). Prøven føres til søjlelaget ved centrifugering ved lav hastighed, hvorefter centrifugen indstilles på høj hastighed for at transportere DNA'et ud af søjlen.

Efter opsamling af afgangsvæsken (10 minutter), vaskes søjlen med 1 ml TE-puffer (pH 6,75), og vaskevæsken sættes til 15 afgangsvæsken fra søjlen. Den rensede DNA-prøve inddampes til tørhed under vakuum, hvorpå den analyseres under anvendelse af hybridiseringsfilterstandardanalyse.

12 (il 1 M NaOH-opløsning og 12 μΐ 3 M NaCl-opløsning sættes til den tørrede DNA-prøve opløst i 100 ml TE-puffer 20 (pH = 6,75). Prøven opvarmes til 95°C i 5 minutter til denaturering af DNA'et, hvorpå den afkøles og opbevares på is for at hindre rehybridisering.

Alikvoter af den denaturerede prøve afsættes på "Gene-Screen Plus"® (New England Nuclear), som forinden er blevet 25 anbragt i et Hybridot Manifold-apparatur (Bethesda Research Laboratory) og befugtet med 5X SSC puffer (0,75 M NaCl, 0,075 M natriumcitrat, pH 7,0). Prøverne trækkes langsomt gennem filteret ved hjælp af et vakuum, hvorpå de pi et formede prøver vaskes ved at suge 100 (il 3 M ammoniumacetatopløsning 30 gennem prøvepletterne. Filtret med prøvepletterne fjernes fra manifolden og præhybridiseres i 3 0 minutter ved 50°C i 1 mL 0,5 M natriumphosphatpuffer (pH 7,0) indeholdende 2 mg/ml laksesperm-DNA behandlet med lydbølger (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) og 1% (v/r) natriumdodecylsulfat (SDS) 35 (Sigma Chemical Co.).

Til hybridiseringsblandingen sættes 200 μΐ (0,15 Mg) 21 DK 175017 B1 32P-mærket pHSVIOS DNA-sonde (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) , som er komplementær til HSV DNA-insertet i E. coli--DNA’et. Filteret opvarmes til 60°C i 30 minutter, hvorpå det vaskes ved 60°C med 2 x 50 ml 0,1 M natriumphospha tpuf fer 5 (pH 7,0) indeholdende 1% (v/r) SDS til fjernelse af eventuelt ikke-hybridiseret DNA-sonde. Filteret lufttørres ved stuetemperatur, hvorpå det autoradiograferes med Kodak RP-film * natten over.

Resultaterne af dette forsøg og et analogt forsøg, 10 hvor der anvendes en phenolekstraktionsstandardproces, viser, at intakt, hybridiserbart DNA udvindes fra centrifugesøjlen med omtrentlig samme effektivitet som ved en phenolekstrak-tion. Endvidere giver blindblodprøver, som ikke er tilsat E. coli-DNA) efter migrering gennem centrifugesøjlerne ikke 15 pletter i hybridiseringsanalysen, hvilket viser, at den rehydratiserede silicagel i centrifugesøjlerne ikke fremkalder forstyrrelser eller indfører urenheder i prøverne.

Udvinding af DNA fra forskellige silicagelprøver 20 I den efterfølgende tabel er anført den mængde DNA, som er udvundet fra ni rehydratiserede silicagelprøver (prøver A-I) , fra fire ubehandlede, kommercielt tilgængelige silicageler (prøve J-N) og fra to rehydratiserede silicageler (prøve O-P), som bevidst er forurenet med forskellige metal-25 ler.

i 22 DK 175017 B1

TABEL

Silicagel DNA-udvinding i % A 90,7 5 B 89,9 C 92,5 D 76,1 E 87,7 F 91,5 10 G 92,9 H 89,4 I 91,8 J 22,4 K 61,2 15 L 66,3 M 26,8 N 41,3 0 26,6 P 18,4 20

Prøve A = "Zorbax"® silicagel (PSM2000, Du Pont) porestørrelse 2000 Å, præpareret som beskrevet i eksempel 2A.

B = "Zorbax"® silicagel (PSM 1000, Du Pont) , pore-25 størrelse 1000 Å, præpareret som beskrevet ovenfor 1 eksempel 2A.

C = "Zorbax"® silicagel (PSM300, Du Pont), porestørrelse 300 Å, opvarmet til 925°C, derpå præpareret som beskrevet i eksempel 2A.

30 D = "Zorbax"® silicagel (PSM300, Du pont), porestør relse 300 Å, opvarmet til 850°C, derpå præpareret som beskrevet i eksempel 2A.

E og F = "Zorbax"® silicagel (PSM300, Du Pont), porestørrelse 300 Å, opvarmes til 975°C, derpå 35 præpareret som beskrevet i eksempel 2A.

23 DK 175017 B1 G = silicagel med en porestørrelse på 300 Å fremstillet ud fra tetraethylorthosilicat.

H og I = "Fractosil"® 500 (E. Merck) , behandlet med HCI/HNO3 som beskrevet i eksempel 1A.

5 J = Zorbax"® silicagel (PSM150, Du Pont), porestør relse 150 Å, ubehandlet.

K = "Vydac"® silicagel (parti 3700, The Sep/a/ra/- • tions Group, Hesperia, CA).

L = "Fractosil"® 500 (E. Merck), ubehandlet.

10 M = "Nucleosil" -100-S (Machery-Nagel, Tyskland), ubehandlet.

N = "Nucleosil"-300 (Machery-Nagel, Tyskland), ubehandlet .

O = Prøve F kontamineret med 500 ppm af hhv. Fe, Mg 15 og Na.

P = Prøve F kontamineret med 500 ppm Al.

♦

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til adskillelse af proteinholdige materialer fra nucleinsyrer, kendetegnet ved, at a) en opløsning indeholdende proteinholdige materialer 5 og nucleinsyrer bringes i kontakt med en rehydratiseret sili-cagel, som er et partikel formet materiale, som på overfladen praktisk taget ikke indeholder polyvalente kationer, og som t har overfladehydroxylgrupper i en minimumskoncentration på 0,1 /imol/m^ og ved en pKa-værdi mellem 6 og 10, idet den 10 rehydratiserede silicagel har et specifikt overfladeareal på mindst 50 m2/g og gennemgående porer med en effektiv diameter på mere end 6 nm, der er i stand til at binde proteinholdige materialer og at lade en ubunden fraktion indeholdende nucleinsyrerne passere, og at 15 b) den ubundne fraktion isoleres.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nucleinsyrerne indeholder DNA. ♦