NO177856B

NO177856B - Fremgangsmåte for separasjon av proteinholdige materialer fra nukleinsyrer

Info

Publication number: NO177856B
Application number: NO913545A
Authority: NO
Inventors: Randy Miles Mccormick
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1987-12-28
Filing date: 1991-09-09
Publication date: 1995-08-28
Also published as: DE68906799D1; DE68906799T2; WO1990010637A1; EP0462100B1; ATE89827T1; NO177856C; JPH04503942A; FI914240A0; AU625639B2; DK156191D0; AU3352589A; NO913545L; NO913545D0; AU632284B2; JP2703636B2; DK175017B1; DK156191A; FI95270B; FI95270C; EP0462100A1

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for separasjon av proteinholdige materialer fra nukleinsyrer.

Bakgrunn

T. Maniatis et al. [Molecular Cloning - A Laboratory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982),

s. 458-460] beskriver en fremgangsmåte for rensing av nukleinsyrer basert på fremgangsmåten beskrevet av K. S. Kirby [Biochim. J., vol. 66, s. 494-504 (1957)] og J. Marmur [J. Mol. Biol., vol. 3, s. 208-218 (1961)]. Ved denne fremgangsmåten anvendes fenol i en væske/væske-ekstraksjonsfremgangsmåte, hvorved proteinet som forurenser en vandig nukleinsyreprøve, ekstraheres over i fenolfasen og etterlater nukleinsyren i vannfasen. Denne fremgangsmåte for nukleinsyrerensing kan faktisk omfatte en serie av væske/væske-ekstraksjoner hvor et vandig volum av nukleinsyreprøve ekstraheres i rekkefølge med like volumer av fenol som er gjort flytende, fenol/kloroform/isoamylalkohol (50/48/2) og kloroform/isoamylalkohol (96/4). Etter hver ekstraksjon tilbakeekstraheres den organiske fase som inneholder protein (og noe nukleinsyre), med en vandig buffer for å utvinne enhver nukleinsyre ekstrahert over i den organiske fase. Den vandige nukleinsyreprøve må

så ekstraheres grundig med diethylether for å fjerne eventuell gjenværende fenol, kloroform eller isoamylalkohol.

Til sist fjernes den gjenværende diethylether enten under redusert trykk eller ved å blåse nitrogen over prøven i 10 minutter. Fjerning av de gjenværende, organiske oppløs-ningsmidler er av største viktighet ettersom de ellers ville virke inn på etterfølgende klonings- eller hybridi— seringsfremgangsmåter hvor nukleinsyren vil kunne bli brukt.

Selv om fenolekstraksjon er en svært effektiv

metode for rensingen av nukleinsyreprøver og har en svært utbredt anvendelse, er fremgangsmåten også arbeids- og tid-krevende. Andre ulemper ved denne teknikken omfatter

risikoene (kjemisk irritasjon, carcinogen, vond lukt og brennbarhet) forbundet med bruken av de organiske oppløs-ningsmidlene (fenol, kloroform, isoamylalkohol og diethylether) .

En andre fremgangsmåte for nukleinsyrerensing er basert på preferanseadsorpsjonen av nukleinsyrer under anvendelse av "Nensorb 20" nukleinsyrerensepatroner (DuPont).

En proteinholdig DNA-prøve sendes gjennom en kolonne med "Nensorb"-partikler, hvorved DNA bindes til partiklene, og mesteparten av det proteinholdige materiale får bli vasket ut fra kolonnen med en vandig buffer. Den bundne nukleinsyre desorberes så fra partiklene ved å sende 20% vandig ethylalkohol (eller 50% vandig methylalkohol) gjennom kolonnen, og DNA samles opp i kolonneeffluenten. Før bruk av DNA ved kloning eller hybridisering må alkoholen fjernes fra DNA-oppløsningen ved å sette et vakuum på prøven i flere timer.

Anvendelsen av "Nensorb" har andre begrensninger. "Nensorb"-materialet binder også protein i en varierende utstrekning ved siden av å binde nukleinsyre. Dette begrenser ikke bare kapasiteten for kvantitativ binding av nukleinsyre fra en prøve som er svært forurenset med proteinmateriale (f.eks. blodserum, vevhomogenat), det gir også den mulighet at noe svakt bundet protein kan eluere sammen med nukleinsyren når den sistnevnte desorberes fra "Nensorb" ved anvendelsen av vandig alkohol. Tre forskjellige oppløsnings-midler trengs for å aktivere "Nensorb"-kolonnen, vaske det ubundne protein fra kolonnen og så eluere nukleinsyren fra kolonnen. Nukleinsyre elueres fra kolonnen i et oppløs-ningsmiddel (20% ethylalkohol eller 50% methylalkohol) som er uforenlig ved fremgangsmåter med etterfølgende anvendelser av nukleinsyren (f.eks. kloning, hybridiserings-analyser, etc). Rensefremgangsmåten under anvendelse av "Nensorb" kan være tidsforbrukende, idet den krever 1 time eller mer for å rense en enkel prøve av nukleinsyre.

C. A. Thomas et al., Analytical Biochemistry,

vol. 93, s. 158-166 (1979), beskriver bruken av glassfiber-

filtere for å adsorbere protein og protei.n-DNA-komplekser fra vandige DNA-prøver. Denne fremgangsmåten lider av de følgende ulemper: 1) Den vandige prøve av DNA må inneholde minst 300 mM NaCl for at proteinet skal bindes effektivt til glassfiberfilteret. Denne forholdsvis høye saltkonsentra-sjon ville måtte senkes ved å fjerne saltet fra DNA-prøven (eller fortynne oppløsningen) før videre bruk av DNA i biologiske reaksjoner, slik som oppløsning av DNA med et restriksjonsenzym. 2) Utvinningen av DNA fra filteret er høy bare dersom filteret vaskes grundig med en vandig buffer. 3) Det lave, spesifikke overflateareal (ca. 2 m 2/g) til glassfibrene resulterer i en lav proteinbindingskapasitet hos glassfiberfilteret. Den maksimale proteinbindende kapa-sitet er beregnet til å være 8,5 mg bovint serumaibumin (BSA) pr. gram glassfiberfilter.

B. Vogelstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 26, nr. 2, s. 615-619 (1979), beskriver en fremgangsmåte for å skille DNA fra agarose ved å binde DNA til glass, fortrinnsvis glasspulver, i nærvær av Nal. DNA ble fjernet fra glasset ved å eluere med Tris-HCl, pH 7,2/0,2 M NaCl/2 mM EDTA. Det beskrives også at silicagel og porøse glass-kuler er uegnet for DNA-rensing.

J. Kirkland, J. Chromatographic Sei., vol. 9,

s. 206-214 (1971), beskriver fremstillingen av overflate-modifiserte silicageler ved omsetning av silanreagenser med overflaten til det porøse skallet til "Zipax" kromato-grafisk bærer med regulert overflate.

J. Kohler et al., J. Chromatography, vol. 385,

s. 125-150 (1987), beskriver fremstillingen av fullstendig hydroxylert, kalsinert silica ved oppløsning av gjen-utfelling av kiselsyre..

T. Watanabe et al., J. Solid-Phase Biochem.,

vol. 3, s. 161-173 (1978)/ beskriver fremstillingen av immo-biliserte tanniner for proteinadsorpsjon.

Formålet ved denne oppfinnelse er å tilveiebringe en forbedret f ast f ase-eks tråks jons fremgangsmåte for fjerning av proteinforurensninger fra nukleinsyreprøver. Fremgangsmåten burde være i stand til å fjerne store andeler av proteiner fra små mengder av nukleinsyre og utvinne den sistnevnte i en biologisk aktiv tilstand. Fremgangsmåten burde også være hurtig, bekvem, gi kvantitativ utvinning av

nukleinsyren og minimalisere bruken av risikofylte materi-

; aler. Den burde heller ikke innføre forurensinger eller urenhet i nukleinsyreprøven som kan virke inn på etterfølg-ende anvendelser av nukleinsyre.

Oppsummering av oppfinnelsen

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for separasjon av proteinholdige materialer fra nukleinsyrer er kjennetegnet ved at

a) en oppløsning inneholdende proteinholdige materialer og nukleinsyrer bringes i kontakt med en rehydratisert silicagel som er et partikkelmateriale som i det vesentlige er fritt for flerverdige kationer på overflaten og har overflate-hydroxylgrupper i en minimumskonsentrasjon på

0,1 pmol/m<2> ved en pKa mellom 6 og 10, idet den rehydratiserte silicagel med et spesifikt overflateareal på minst 50 m<2>/g og porer gjennom det hele med en effektiv diameter som er større enn 6 nm, er i stand til å binde proteinholdige materialer slik at det blir tilbake en ubundet fraksjon som inneholder nukleinsyrene, og

b) den ubundne fraksjon isoleres.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Fastfase-ekstraksjonsmaterialene som kan anvendes ved den krevde fremgangsmåte for separasjon av proteiner og nukleinsyrer, er partikkelformet, rehydratisert silicagel med svært høye affiniteter for proteinmaterialer og svært lave affiniteter for nukleinsyrer. Fastfase-ekstraksjonsmaterialene er kjennetegnet ved å ha store spesifikke overflatearealer med høye konsentrasjoner av svakt sure overflatehydroxylgrupper og lave overflatekonsentrasjoner av flerverdige kationgrupper.

Fastfase-ekstraksjonsmaterialer med store spesifikke overflatearealer er foretrukket på grunn av deres evne til å fjerne store mengder av proteiner. Det spesifikke overflateareal til ekstraksjonsmaterialet er minst 50 m<2>/g, helst er det minst 100 m<2>/g. Disse høye overflatearealene skyldes tilstedeværelsen av porer i partikkelmaterialet. Porene har en effektiv diameter som er mer enn 6 nm, og selv om det ikke er noen øvre grense for porediameteren, er det foretrukket med en rimelig grense på 50 nm for å opprettholde et høyt, spesifikt areal. Det foretrukne område er 6 nm til 15 nm.

Høye konsentrasjoner av svakt sure hydroxylgrupper på ekstraksjonsmaterialet tjener både til å øke ekstrak-sjonsmaterialets affinitet for proteinforbindelser og redusere dets affinitet for polyanioner, slik som nukleinsyrer. Den minimale, effektive konsentrasjon av svakt sure hydroxylgrupper er 0,1 umol/m 2. Fortrinnsvis er konsentrasjonen av svakt sure hydroxylgrupper 1-8 umol/m 2 , helst er den 8 pmol/m 2.

pK til overflatehydroxylgruppene er fortrinnsvis mellom 6 og 10.

Konsentrasjonen av flerverdige kationgrupper på overflaten av.fastfase-ekstraksjonsmaterialet bør minimaliseres for å forhindre kompleksdannelsen mellom anioniske nukleinsyrer <p>g kationiske overflategrupper. Treverdige metaller, slik som jern og aluminium, er særlig skadelige for ekstrak-sjonsmaterialenes yteevne.

Fastrase-ekstraksjonsmaterialer med de ønskelige egenskaper omtalt ovenfor, kan fremstilles på flere

måter, idet det enten anvendes et homogent partikkeImateri-ale eller et kjernepartikkelmateriale på hvis overflate de ønskede, funksjonelle rester er innført via kjemiske reaksjoner. For det førstnevnte tilfelle er rehydratisert silicagel blitt funnet å ha de ønskede egenskaper. Silicagel har intrinsisk en stor overflatepopulasjon (8 pmol/m 2)

av svakt sure (6 < pK cl < 10) hydroxylgrupper og oppfyller således hovedkravene ovenfor. Den er også svært effektiv når det gjelder å adsorbere proteinmaterialer. Overflaten på silicagelen må imidlertid være fri for flerverdige kationgrupper dersom nukleinsyrer skal forhindres fra å

bli adsorbert på overflaten av silicapartiklene. Dette kan oppnås på flere måter.

Den foretrukne fremgangsmåte omfatter rehydroxyl-eringen og rensingen av overflatelaget til silicapartiklene ved oppløsning og gjenutvinning av overflatelaget, til partiklene

ifølge Kohler et al., J. Chromatography, vol. 385,

s. 125-150 (1987). Ved denne fremgangsmåten oppløses den ytre overflate på silicapartiklene i en fortynnet oppløs-ning av flussyre ved en forhøyet temperatur. Den oppløste silica gjenutfelles så på overflaten av hver partikkel ved å la oppløsningen som inneholder den oppløste silica, av-kjøles til værelsetemperatur hvor den har en lavere opp-løselighet i vandige medier. Etter hvert som laget gjenutfelles, blir forurensninger som er til stede i det ytre lag av silica som var blitt oppløst, i oppløsningen, og et i det vesentlige rent lag av silica dannes rundt kjerne-partikkelen.

Alternativt kan flerverdige metallforurensninger utlutes fra silicaen ved å behandle den i rekkefølge med middels konsentrert saltsyre og salpetersyre ved forhøyede temperaturer. Denne fremgangsmåten oppløseliggjør og ekstra-herer metallurenheter på overflaten av silicagelpartiklene og etterlater en overflate som er i det vesentlige ren silica.

Uansett hvilken fremgangsmåte for fremstilling av fastfase-ekstraksjonsmaterialet som anvendes, kan minst to fremgangsmåter iverksettes for dets anvendelse ved fjerning av proteinforurensning fra prøver fra nukleinsyrer. Ifølge den første fremgangsmåten tilsettes en mengde av det par-tikulære fastfase-ekstraksjonsmateriale til et volum av prøve som skal avproteiniseres. Blandingen rystes forsik-tig for å holde partikkelmaterialet i suspensjon. På grunn av den lille størrelsen og det store overflateareal til fastfase-ekstraksjonsmaterialet skjer diffusjon og adsorpsjon av proteinmaterialet til fastfase-ekstraksjonsmaterialet hurtig (i størrelsesorden minutter). Partikkelmaterialet som inneholder det adsorberte protein, skilles så fra den vandige nukleinsyreprøve ved hvilken som helst passende metode, f.eks. sentrifugering eller filtrering. Denne fremgangsmåten er mest effektiv når et stort volum

> 1 ml) prøve inneholder små mengder protein, og følgelig er bare en liten mengde partikler (f.eks. < 10 mg) påkrevet for kvantitativ fjerning av proteinet.

Ved en andre fremgangsmåte pakkes fastfase-ekstraksjonsmaterialet i en kolonne, og den vandige prøve sendes gjennom kolonnen. For å gjennomføre dette utveies en mengde av partikler i en spinnkolonne og pakkes ved å slå den lukkede ende av kolonnen mot benkeplaten. Kolonnen kan også sentrifugeres ved høy hastighet i en sentrifuge, hvorved sentrifugalkraften pakker partiklene tett i bunnen av kolonnen. Kolonnen fuktes så ved å pipettere et volum av den passende buffer (et volum som i det minste er likt med volumet til partikler i kolonnen) i kolonnen, og bufferen får så sive ned i laget i kolonnen. Overskuddsbufferen fjernes så fra kolonnelaget ved å sentrifugere kolonnen ved høy hastighet i en sentrifuge i ca. 30 sekunder. Eventuell buffer som elueres fra kolonnelaget, kastes. Kolonnen er nå klar til å motta prøven av nukleinsyre som skal avproteiniseres; prøven pipetteres til toppen av kolonnen og får sive ned i laget i kolonnen hvor proteinmaterialet bindes til partiklene og nukleinsyrene forblir i oppløsning. Kolonnen sentrifugeres så ved høy hastighet i en sentrifuge for å eluere vannfasen som inneholder nukleinsyrene inn i et oppsamlingsrør. Utvinning av nukleinsyre fra kolonnen er typisk > 80% av mengden som tilføres kolonnen. Utvinningen kan forbedres til ca. 95% dersom et lite volum (vanligvis 1/3 til 1/2 av prøvevolumet som opprinnelig ble tilført kolonnen) av den passende buffer pipetteres til toppen av kolonnen og sentrifugeres gjennom ved høy hastighet i sentrifugen. Dette vasker enhver innfanget nukleinsyre gjennom kolonnelaget, og denne vaskingen bør tilsettes kolonneeffluenten som inneholder mesteparten av nukleinsyren. Denne fremgangsmåten virker best for prøver som er svært forurenset med proteinmateriale når det er nødvendig å bruke en stor mengde partikler (i forhold til volumet av prøven). Denne fremgangsmåten er også nyttig når et svært likt prøvevolum (f.eks. 50 ul) må avproteiniseres og iverksettelse av deri forrige fremgangsmåten ville være problematisk.

Som redegjort for tidligere, kan det legges flere begrensninger på egenskapene til bufferne som anvendes i kolonnefuktetrinnet og i kolonnevasketrinnet. Den kjemiske natur til bufferen synes ikke å være betydningsfull, selv om bruken av salter av flerverdige metallkationer (f.eks. Al,

Fe, Ti, etc.) bør unngås. Standard biokjemiske buffere, slik som TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,75), STE

(10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,0) eller PBS (120 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 10 mM fosfat, pH 7,4) virker svært godt. Generelt bør pH i bufferen være i området 6-7,5; ved lavere pH-verdier kan nukleinsyre bindes til fastfase-ekstraksjonsmaterialet, noe som resulterer i reduserte ut-vinninger, mens ved høye pH-verdier kan bæreren oppløses ettersom silicagel har en betydelig oppløselighet i alkaliske oppløsninger. Dersom prøven av nukleinsyre har en pH som ligger utenfor området ovenfor, må den av samme grunn nøy-traliseres til en pH på 6-7,5 før den tilføres kolonnen for fjerning av proteiner. Det foretrukne pH-område for alle buffere og prøver ville være i området 6,5-7,0.

Diameteren til porene i fastfase-ekstraksjonsmaterialet bør være tilstrekkelig stor til å muliggjøre inntreden av proteiner slik at de kan adsorberes på overflaten av de inn-vendige porer. Dette vil maksimalisere kapasiteten til bæreren når det gjelder å fjerne protein fra prøver. Porene må også være tilstrekkelig store til å forhindre nukleinsyre fra å bli holdt tilbake i porevolumet. Det er funnet at minimale porediametre på et eller annet sted mellom 6 og 15 nm gir de nødvendige karakteristika. Det er ingen krit-isk øvre grense for porediameteren selv om det spesifikke overflateareal avtar etter hvert som porediameteren til par-tikkelen øker. En rimelig øvre grense på 30-50 nm kan således defineres. Partikler med porediametre som er større enn denne grensen, har redusert overflateareal og følgelig redusert proteinbindingskapasitet.

Fastfase-ekstraksjonsmaterialet kan anvendes for fjerning av proteinforurensninger fra et bredt område av nukleinsyreprøver. Demonstrerte anvendelser omfatter fjerning av enzymer fra restriksjonsoppløsninger, fjerning av alkalisk fosfatase fra defosforyleringsreaksjonsblandinger og fjerning av kinaseenzymer fra merkingsreaksjonsbland-inger. Det regnes med at andre vanlige enzymer, slik som reverstranskriptase, DNA-polymerase, DNA-ligase og ende-transferase, som er vanlig brukt innen molekylærbiologi, også vil kunne fjernes fra nukleinsyreprøver under de passende

forsøksbetingelser.

I tillegg har fastfase-ekstraksjonsmaterialet anvendbarhet for isoleringen og rensingen av nukleinsyrer fra et stort antall biologiske prøver. Materialet er.blitt demonstrert for rensing av DNA fra organismer i prøver av helblod; det regnes med at lignende isoleringer fra andre prøver av klinisk interesse, slik som spytt, urin, avføring og vev, vil være mulig så snart den passende rensingsfrem-gangsmåte er blitt utviklet. Slike rensede nukleinsyreprøver burde være direkte anvendbare i kliniske hybridiserings-analyser. Fastfase-ekstraksjonsmaterialet burde dessuten ha anvendbarhet for isoleringen og rensingen av nukleinsyrer' fra organismer dyrket i kulturmedier utelukkende for det formål å fremstille DNA for kloningsformål eller andre anvendelser innen genteknikk.

Fastfase-ekstraksjonsmaterialet kan anvendes for fjerning av proteinholdige urenheter fra et bredt område av nukleinsyrer. F.eks. kan materialet anvendes for å fjerne kinaseenzymer som brukes i den radioaktive merking av mono-nukleotider, slik som dATP, dCTP, etc. Materialet er også blitt brukt til å fjerne alkalisk fosfatase fra en blanding av DNA i området fra 125 basepar (bp) til 21.226 bp. Materialet er blitt mye brukt med pBR322-DNA (4362 bp). I tillegg er materialet blitt brukt med intakt lambda-DNA (49.000 bp), og det ble ikke observert noen nedbrytning av denne DNA ved mekanisk skjærkraft. Større tråder av DNA kan være mottakelige for nedbrytning ved skjærkrefter etter hvert som de passerer gjennom kolonnen av fastfase-ekstraksjonsmateriale selv om dette ikke er kjent med sikkerhet. Dette problemet kunne minimaliseres ved å bruke en større partikkelstørrelse for fremstilling av fastfase-ekstraksjonsmaterialet for derved å redusere skjærkreftene i kolon-ner pakket med slike partikler.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for avprotein-isering av prøver som inneholder nukleinsyrer, har de følg-ende fordeler sammenlignet med de fremgangsmåter som brukes for tiden: 1. Ettersom fastfase-ekstraksjonsmaterialet er i det vesentlige uoppløselig i passende, vandige buffere, vil det ikke oppløses i nukleinsyreprøven, og følgelig er etterfølgende fremgangsmåter (f.eks. ekstraksjoner) for å fjerne det ikke nødvendige, slik som ved fenol/kloroform-ekstraksjonene. 2. Nukleinsyren elueres i et vandig medium som er i det vesentlige identisk (bortsett fra fjerningen av proteiner) med mediet hvor det ble tilført kolonnen. Nukleinsyren er således i et oppløsningsmiddel som er forenlig med etterfølgende biologiske fremgangsmåter h<y>or den brukes. Ingen forurensninger (dvs. fenol, kloroform, ethanol, etc.) er til stede for å inhibere eller deaktivere enzymer brukt i etterfølgende biologiske fremgangsmåter. 3. Rensefremgangsmåten hvor dette materialet brukes, krever 5-10 minutter gjennomføring for én prøve, mens fremgangsmåter basert på fenol/kloroform-ekstraksjoner eller "Nensorb" kan kreve 1 time eller mer. I tillegg krever bearbeidelse av tilleggsprøver 2 minutter pr. prøve. 4. Ingen spesielle reagenser er påkrevet for å ut-føre denne fremgangsmåten. TE (pH 6,75) er en akseptabel buffer for fukting og vasking av kolonnen, og denne bufferen er tilgjengelig i alle laboratorier hvor det arbeides med nukleinsyrer. I tillegg unngås behovet for toksiske eller farlige reagenser. 5. Utvinning av nukleinsyrer er høy, vanligvis 80-95%. 6. I motsetning til rensemetoder basert på adsorpsjon av DNA til en bærer, kutter ikke denne fremgangsmåten store fragmenter av DNA. Helheten til prøven opprettholdes således. Kutting av DNA er mulig i fremgangsmåter basert på adsorpsjon av nukleinsyren til et fastfase-materiale ettersom, med lange fragmenter av DNA (f.eks. 10 kilobase-par eller mer), de to endene til DNA-trådene kan adsorberes til to forskjellige partikler samtidig, og under rysting

beveger de to partiklene seg i motsatte retninger og trekker DNA-tråden til to mindre fragmenter. Ettersom DNA ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke adsorberes til den faste fasen (proteinet er i stedet), er denne nedbrytning av DNA ikke mulig.

De følgende eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen.

Eksempler

Generelle fremgangsmåter og reagenser.

pBR322-DNA og PST restriksjonsenzym ble erholdt fra Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J. 10x PST restriksjons-oppløsningsbuffer inneholder 500 mM NaCl,..100 mM Tris-HCl,

pH 7,5, 100 mM MgCl2 og 10 mM dithiothreitol. Alkalisk fosfatase fra kalvetarm ble erholdt fra Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN. BCIP (5-brom-4-klor-3-indolylfosfat) ble erholdt fra Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD.

Eksempel 1

Fremstilling og anvendelse av silanbehandlet silicagel

A. Fremstilling av silicabæreren.

"Fractosil 500" (20,5 g, E. Merck, Darmstadt, Tyskland) ble vasket med tre 100 ml aliquoter av 25%

(volum/volum) salpetersyre ved værelsetemperatur ved å oppslemme silicapartiklene i 10 minutter i den vandige syre og så dekantere den overskytende syre så snart partiklene var blitt avsatt på bunnen av begerglasset. De syrebehandlede partikler ble grundig skyllet med destillert, avionisert vann inntil supernatanten hadde nådd en pH på 5,5. Partiklene ble så overført til en Buchner-trakt utstyrt med filterpapir av middels porøsitet, skyllet med høyren methanol (3 x 100 ml) og tørket i 1 time ved 80°C (630 mm Hg).

B. Polymerisering av aminofenyltrimethoxysilan på silicabæreren.

Aminofenyltrimethoxysilan (4,0 ml, Petrarch Systems, Inc., Bristol, PA) ble tilsatt til destillert, avionisert vann (24 ml) og isopropylalkohol (12 ml) i en rundbunnet kolbe utstyrt med en tilbakeløpskjøler og en magnetisk rørepinne. Den resulterende blanding ble omrørt inntil silanet var fullstendig oppløst. Syrevaskede silicapartikler (6,1 g) ble tilsatt til silanoppløsningen, og blandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling i 2 timer ved 81°C. Iseddik (3,5 ml) ble tilsatt til kolben, og blandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling i en ytterligere time. Suspensjonen fikk avkjøles til værelsetemperatur, hvoretter silicapartiklene var blitt avsatt på bunnen av kolben. Den sorte supernatant ble dekantert, og partiklene ble grundig vasket med methanol av høy kvalitet inntil vaskevæsken var fargeløs. De aminofenylderivatiserte silicapartikler ble så samlet opp på en Buchner-trakt, og luft ble trukket gjennom partikkel-laget for å fjerne gjenværende alkohol. Partiklene ble videre tørket under en middels sterk lampe. Carbon- og nitrogenanalyse av partiklene indikerte at et tykt lag av carbonholdig materiale var blitt polymerisert på overflaten av silicapartiklene (6,27% C, 1,13% N).

C. Diazotisering av den silanbehandlede bærer

Den aminofenylderivatiserte silicagel (6,90 g) ble tilsatt til en iskald oppløsning av vann (10,0 ml) og konsentrert svovelsyre (7,0 g), og partiklene ble oppslemmet i denne oppløsning ved magnetisk omrøring. Finknust is (ca. 17 g) ble tilsatt blandingen ovenfor, og så ble en oppløs-ning av natriumnitritt (2,24 g) i vann (5,33 g) tilsatt dråpevis i løpet av et tidsrom på 8-10 minutter. Tempera-turen i blandingen ble holdt mellom 0 og 5°C i løpet av denne tiden. Partiklene fikk avsettes, og så ble supernatanten dekantert fra blandingen. Partiklene ble så vasket tre ganger ved å oppslemme dem i 100 ml kaldt vann, la partiklene bunnfelles og dekantere supernatanten. De resulterende partikler hvor overflateaminene har blitt omdannet til de tilsvarende diazoniumsalter, ble brukt i hydrolyse-reaksjonen beskrevet nedenunder.

D. Hydrolyse av diazoniumsaltet

Konsentrert svovelsyre (32 ml) ble tilsatt til

vann (24 ml), og denne blandingen ble varmet opp til koking (ca. 160°C). De diazoniumsaltholdige partikler ble sakte tilsatt til den varme syre mens koking ble opprettholdt med en rolig bobling fra nitrogengassen utviklet fra dekompon-eringen av diazoniumsaltet. Blandingen ble kokt i omtrent 5 minutter og så plassert i et isbad for å fremskynde av-kjøling. Den sure supernatant ble dekantert fra partiklene som så ble vasket med destillert, avionisert vann (5 x 200 ml). Partiklene ble samlet opp på en Buchner-trakt utstyrt med filterpapir av middels"porøsitet og skyllet med methanol (200 ml). Luft ble trukket gjennom partikkel-laget for å fjerne gjenværende methanol, og partiklene ble tørket under en middels sterk, infrarød lampe. Elementær-analyse avslørte at partiklene inneholdt 0,55 vekt% carbon og mindre enn 0,01 vekt% nitrogen.

E. Fjerning av protein under anvendelse av silanbehandlet silicagel

Den silanbehandlede silicagel beskrevet i del D ovenfor, ble testet med hensyn på effektiviteten når det gjelder å fjerne et modellprotein (bovint serumalbumin, BSA) fra oppløsning, samt med hensyn på dens mangel på binding til DNA (laksesperm-DNA). Aliquoter av BSA ble plassert i forskjellige fosfatbuffere (pH = 5,0 - 7,0), prøvene ble blandet med 250 mg silanbehandlet silicagel, og så ble oppløsningene separert fra silicagelen ved pelletering av silicapartiklene i en sentrifuge. Den opprinnelige, bufrede proteinoppløs-ning og filtratet ble analysert ved hjelp av UV-absorbans (200-480 nm). Sammensetning av UV-spektraene viste at proteinfjerning alltid var >90%. Lignende testing under anvendelse av aliquoter av laksesperm-DNA viste at DNA-utvinning alltid var >85%.

Eksempel 2

Nukleinsyrerensing under anvendelse av flussyre-

behandlet silicagel

A. Fremstilling av rehydratisert silicagel.

Silicagel (140 g, PSM300 "Zorbax" , parti 9, Du Pont) ble varmet opp i en kvartssmeltedigel ved 975°C i 2 timer i en muffelovn, og så ble 15 g av den avkjølte silicagel plassert i en rundbunnet kolbe utstyrt med en tilbakeløps-kjøler. Destillert., avionisert vann (150 ml) inneholdende 75 ppm HF, ble tilsatt til kolben, og blandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling ved 110°C i 72 timer. Blandingen fikk avkjøles til værelsetemperatur, og så ble silicagelen vasket med 1 liter destillert, avionisert.vann. Silicagelen ble kokt over natten i vann (150 ml), vasket først med vann (500 ml) og så med aceton (300 mi), og endelig tørket ved 110°C i 5 timer.

B. Anvendelse av rehydratisert silicagel.

Til rør A ble det tilsatt 1 ug (15 pl) pBR322-DNA, 32 enheter (2 ul) PST restriksjonsenzym, 6 pl 10x PST restriksjonsoppløsningsbuffer (en restriksjonsbuffer med lav styrke) og 37 pl vann. Innholdet i dette røret ble blandet og inkubert ved 37°C i 1,25 time. Til rør B ble det tilsatt reagenser som er identiske med de i rør A. Umiddelbart etter blanding ble imidlertid innholdet i dette røret pipettert over til toppen av en spinnkolonne inneholdende 60 mg flussyrebehandlet silicagel. Kolonnen var blitt pakket og fuktet med lx PST restriksjonsbuffer umiddelbart før til-setning av prøven. Prøven fikk sive ned i kolonnelaget, og kolonnen ble sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge (modell 5412), og effluenten ble samlet opp. En aliquot av kolonneeffluenten ble fjernet til et tredje reak-sjonsrør (rør C), og 1 pl (16 enheter) PST restriksjonsenzym ble tilsatt. Innholdet i dette røret ble blandet og inkubert i 1,25 time ved 37°C. Aliquoter av rørene A-C ble så blandet med buffer for påfylling på agarosegel (0,25% bromfenoIblått, 0,25% xylencyanol og 30% glycerol i vann), og en porsjon av hver ble tilført en 0,7% agaroseelektroforesegel (0,105 g agarose, 14,8 ml TBE-buffer inneholdende 0,5 pg/ml ethidium-bromid) i et BioRad "Mini-Cell Submarine" elektroforese-apparat. Gelen ble kjørt ved 100 volt påført spenning i ca. 4 timer i en 0,5X TBE-buffer (0,5X TBE = 0,0445 M tris-borat, 0,0445 M borsyre, 0,001 M EDTA, pH 8,0). Fotografier av gelen ble tatt via gjennomlysning med 254 nm UV-lys.

Et linearisert DNA-fragment med lengde lik en linearisert pBR322-standard, ble erholdt fra rør A, noe som indikerer at PST-restriksjonsenzymet kutter det ringformede pBR322 på ett sted. DNA fra rør B kom ut som ringformet DNA; ingen DNA-bånd ble observert i stillingen på gelen som svarer til linearisert pBR322, noe som indikerer at DNA ikke var blitt kuttet av enzymet, dvs. enzymet var blitt fjernet ved passering i kolonnen. Et linearisert DNA-fragment med lengde lik med en linearisert pB/R322-standard, ble også erholdt fra rør C, noe som indikerer at DNA kunne kuttes ved hjelp av restriksjonsenzymet og at sending av DNA gjennom kolonnen ikke endret DNA-ens biologiske aktivitet eller fjerner noen av de nødvendige bufferbestanddeler (f.eks. MgC^); det fjernet bare PST-restriksjonsenzymet.

Dette eksemplet demonstrerer at passering av en prøve som inneholder DNA og proteiner gjennom en spinnkolonne inneholdende rehydratisert silicagel, effektivt fjerner disse proteinene, f.eks. PST restriksjonsenzym, fra prøven. Det indikerer også at DNA samlet opp i effluenten fra kolonnen,

er biologisk aktiv og at kolonnen ikke tilfører urenheter til DNA-en som ville inhibere enzymer brukt til å modifisere DNA-en i etterfølgende biologiske reaksjoner.

Eksempel 3

Fjerning av Eco RI restriksjonsenzym

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2, ble gjentatt under anvendelse av Eco RI restriksjonsenzym og buffer (en buffer av middels styrke) istedenfor PST-restriksjonsenzymet og bufferen. Bare ringformet pBR322-DNA ble observert i kolonneeffluenten fra rør B, noe som indikerer at passering av blandingen gjennom kolonnen hadde fjernet alt av Eco RI-restriksjonsenzymet før det kunne kutte DNA-en.

Eksempel 4

Fjerning av Sal I restriksjonsenzym

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2, ble gjentatt ved å bruke Sal I restriksjonsenzym og buffer (en buffer med høy styrke) istedenfor PST-restriksjonsenzymet og bufferen. Bare ringformet pBR322-DNA ble observert i kolonne-ef f luenten fra rør B, noe som indikerer at passering av blandingen gjennom kolonnen hadde fjernet alt av Sal I-restriksjonsenzymet før det kunne kutte DNA-en.

Eksempel 5

Fremstilling av rehydratisert silicagel under, anvendelse

av saltsyre og salpetersyre

Silicagel (PSM300 "Zort)^', Du Pont) ble først varmet opp ved 300°C i 2 timer og så ved 540°C i 21 timer i en kvartssmeltedigel i en muffelovn. 20 g av denne silicagel ble så plassert i et tildekket "Teflon" begerglass inneholdende

500 ml 10% (volum/volum) saltsyre, og blandingen ble varmet opp ved 100°C i 4 timer. Blandingen fikk avkjøles til værelsetemperatur i løpet av flere timer og ble så filtrert. Silicagelen ble vasket med 1 liter destillert, avionisert vann og så overført til et "Teflon" begerglass inneholdende 500 ml 10% (volum/volum) salpetersyre. Blandingen ble varmet opp til 100°C i 4 timer, fikk avkjøles til værelsetemperatur og ble så filtrert. Silicagelen ble vasket med 1 liter vann, og så ble saltsyre- og salpetersyrevaskingene gjentatt. Til sist ble silicagelen varmet opp i destillert, avionisert vann (500 ml) i 4 timer ved 100°C, fikk avkjøles til værelsetemperatur, ble filtrert, vasket med destillert, avionisert vann (1,5 liter), skyllet med aceton (300 ml) og tørket ved 110°C.

En del av denne rehydratiserte silicagel ble testet med hensyn på DNA-utvinning som beskrevet i eksempel 1;

87,2% av en 1 ug prøve av DNA ble utvunnet.

Eksempel 6

Fjerning av alkalisk fosfatase fra defosforyleringsreaksjonsblandinger

Linearisert DNA (pBR322-DNA oppløst med PST res-triks jonsenzym) ble oppløst i 80 ul defosforyleringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,2), og 1 pl (0,5 enheter) alkalisk fosfatase fra kalvetarm ble tilsatt. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 30 minutter. En 40 pl aliquot av reaksjonsblandingen ble fjernet, og 7,6 pl 0,25 M HCl ble tilsatt til aliquoten ved å regulere pH til 6,0. Den nøy-traliserte aliquot ble så sentrifugert gjennom en 40 mg kolonne av rehydratisert silicagel, fremstilt som i eksempel 2, som tidligere var blitt pakket og fuktet med defosforyleringsbuffer (pH 6,0).

Den utvundne kolonneeffluent ble så analysert med hensyn på aktiv alkalisk fosfatsese i en enzymanalyse: Til kolonneeffluenten ble det tilsatt .10 pl IM Tris.HCl (pH 8,0) for å regulere pH til 7,8. Aliquoten ble så tilsatt til 100 pl analysebuffer inneholdende 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl,. 50 mM MgCl og 0,22 ug/ml BCIP, et fargeløst sub-strat for enzymet alkalisk fosfatase, som omdannes ved hjelp av enzymet til et farget produkt. Analysereaksjonen fikk forløpe i 2 timer, og så ble det uoppløselige, fargede produkt samlet opp på filtere med 2 mm i diameter.

Kontrollreaksjonsblandinger som inneholdt 0,25 enheter aktiv alkalisk fosfatase, ga svært sterke blåfarger. Fortynninger på 0,0025 og 0,00025 enheter alkalisk fosfatase ga også blåfarger. Ingen blå utfelling var synlig fra kolonneeffluenten som opprinnelig inneholdt 0,25 enheter før passering gjennom kolonnen, noe som tyder på at kolonnen fjernet minst 99,99% av den alkaliske fosfatase fra prøven etter hvert som den passerte gjennom kolonnen. For å sikre fullstendig fjerning av enzymet er det nødvendig å surgjøre defosforyleringsblandingen med alkalisk fosfatase før den sendes gjennom kolonnen. Ved pH 8,2 ble bare 99,9% av enzymet fjernet.

Ved et lignende forsøk ble opptil 5 enheter alkalisk fosfatase fjernet med >99,99% effektivitet under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet ovenfor.

Eksempel 7

Rensing av bakterie- DNA fra helblod

Helblod fra menneske samlet opp fra friske givere, ble tilsatt E. coli-bakterier med DNA som inneholdt et inn-skudd av DNA fra herpes simplex-virus (5 ug, New England Nuclear Corp., Billerica, MA). Denne blodprøven (10 ml) ble ly sert i et " Isolator11 -rør (Du Pont) for å bryte opp de røde blodlegemene. Intakte bakterier ble så isolert ved å sentrifugere "Isolator"-røret i en sentrifuge, hvorved det ble dannet et 1,5 ml lag av bakteriesediment på bunnen av røret, og fjerning av supernatanten. Bakteriene ble så lysert i 2% natriumdodecylsulfat (SDS) i 30 minutter ved 65°C. Bakteriene fra blodprøven ble varme«b-opp til 100°C i 10 minutter for å koagulere mesteparten av det proteinholdige materiale. Koagulatet ble så sedimentert i en sentrifuge i 10 minutter, og supernatanten ble fjernet. Den koagulerte masse ble så brutt opp i destillert vann (1 ml) for å vaske eventuell DNA ut fra massen, og etter sentrifugering ble supernatanten fjernet og tilsatt til den opprinnelige super--natant. Denne fremgangsmåten ble så gjentatt.

På dette punkt var den frigjorte bakterie-DNA blitt isolert i 4 ml væske som fortsatt inneholdt en vesentlig mengde protein (>10 mg/ml) som det fremgikk av den rustrøde farge som prøven fikk av de gjenværende hemproteiner (blant andre). For å fjerne dette restprotein ble prøven plassert på toppen av en spinnkolonne pakket med rehydratisert silicagel (fremstilt som i eksempel 2) som tidligere var blitt fuktet med 4 ml TE (pH 6,75) buffer. Prøven fikk renne inn i kolonnelaget ved sentrifugering ved lav hastighet, og så ble sentrifugen skrudd på høy hastighet for å tvinge DNA-en ut av kolonnen. Etter at effluenten var blitt samlet opp (10 minutter), ble kolonnen vasket med 1 ml TE (pH 6,75) buffer, og vaskevæsken ble tilsatt til kolonneeffluenten. Den rensede DNA-prøve ble redusert til tørrhet under vakuum og så analysert i en standard hybridiserings-filteranalyse. 12 pl av hver av 1 M NaOH og 3 M NaCl ble tilsatt til den tørkede DNA-prøve oppløst i 100 ml TE (pH 6,75) buffer. Prøven ble varmet opp ved 95°C i 5 minutter for å denaturere DNA-en, avkjølt og lagret på is for å forhindre rehybridisering.

Aliquoter av den denaturerte prøve ble dryppet på "GeneScreen Plus" (New England Nuclear) som tidligere var blitt montert i en "Hybridot Manifold" (Bethesda Research Laboratory) og fuktet med 5X SSC-buffer (0,75 M NaCl,

0,075 natriumcitrat, pH 7,0). Prøvene ble sakte trukket gjennom filteret ved å påsette et vakuum, og så ble de ut-

dryppede prøver vasket ved å trekke 100 ul 3 M ammonium-acetat gjennom prøveflekkene. Filteret som inneholdt de utdryppede prøver, ble fjernet fra manifolden og prehybrid-isert i 30 minutter ved 50°C i 1-Mnl 0,5 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 2 mg/ml sonikert laksesperm-

DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) og 1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat (SDS) (Sigma Chemical Co.).

En <32>P-merket pHSV106-DNA-probe (200 ul, 0,15 ug, Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) som var komplementær med HSV-DNA-innskuddet i E. coli-DNA-en, ble tilsatt til hybrid-iseringsblandingen. Filteret ble varmet opp ved 60°C i 30 minutter og vasket ved 60°C med to 50 ml aliquoter av 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 1%

(vekt/volum) SDS for å fjerne eventuell ikke-hybridisert DNA-probe. Filteret ble lufttørket ved værelsetemperatur og så autoradiografert over natten med Kodak RP-film.

Resultatene av dette forsøket og et analogt forsøk under anvendelse av en standard fenolekstraksjonsfremgangs-måte indikerer at intakt, hybridiserbar DNA ble utvunnet fra spinnkolonnen med omtrent den samme effektivitet som fra en fenolekstraksjon. Dessuten ga blind-blodprøver (dvs.

ikke tilsatt E. coli-DNA) som ble sendt gjennom spinn-kolonner, ikke flekker i hybridiseringsanalysen, noe som tyder på at den rehydratiserte silicagel i spinnkolonnene ikke innførte forstyrrelser eller forurensninger i prøven.

Utvinning av DNA fra forskjellige silicagelprøver

Tabellen viser mengden av DNA utvunnet fra ni rehydratiserte silicagelprøver (prøvene A-I), fire ubehandlede, kommersielt tilgjengelige silicageler (prøvene J-N) og to rehydratiserte silicageler (prøvene 0-P) som med vilje var forurenset med forskjellige metaller.

Claims

Fremgangsmåte for separasjon av proteinholdige materialer fra nukleinsyrer,

karakterisert ved at a) en oppløsning inneholdende proteinholdige materialer og nukleinsyrer bringes i kontakt med en rehydratisert silicagel som er et partikkelmateriale som i det vesentlige er fritt for flerverdige kationer på overflaten og har overflate-hydroxylgrupper i en minimumskonsentrasjon på 0,1 umol/m<2> ved en pKa mellom 6 og 10, idet den rehydratiserte silicagel med et spesifikt overflateareal på minst 50 m<2>/g og porer gjennom det hele med en effektiv diameter som er større enn 6 nm, er i stand til å binde proteinholdige materialer slik at det blir tilbake en ubundet fraksjon som inneholder nukleinsyrene, og b) den ubundne fraksjon isoleres.