JPH04503942A - 核酸を精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固相の抽出物質を使用してタンパク質性物質で汚染された核酸試料を 精製する方法に関する。

背景 Ｔ、　マ＝アチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、［分子クローニング：実 験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ− （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ）　、１９８２）　、ｐｐ４５８−４６０コは、Ｋ、Ｓ、カービー（Ｋｉｒ ｂｙ）［バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）、Ｖｏｌ、６６ ．４９４−５０４　（１９５７）］およびＪ、フルムル（Ｍａｒｍａｒ）［ジャ ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｌ　Ｖｏｌ、３　、２０８−２１８　（１９６１）　コ　 に記載されている手順に基づく核酸を精製する方法を記載している。この方法は 液体／液体抽出手順においてフェノールを使用し、これにより水性核酸試料を汚 染するタンパク質をフェノール相の中に抽出し、水性相の中に核酸を残す。この 核酸の精製手順は実際に１系列の液体／液体の抽出を含むことができ、ここで核 酸試料の水性体積を順次に等しい体積の液化フェノール、フェノール／クロロホ ルム／イソアミルアルコール（５０／４８／２）　、およびクロロホルム／イソ アミルアルコール（９６／４）で抽出する。各抽出後、タンパク質（多少の核酸 ）を含有する有機相を水性緩衝液で逆抽出して、有機相の中に抽出された核酸を 回収する。次いで、水性核酸試料をジエチルエーテルで抽出し尽くして残留する フェノール、クロロホルムまたはイソアミルアルコールを除去しなくてはならな い。最後に、残留するジエチルエーテルを減圧下にまたは窒素を試料の上に１０ 分間ブローウィングすることによって除去する。

残留する有機溶媒の除去はきわめて重要である。なぜなら、それらはそうでなけ れば、核酸を使用することができる引き続くクローニングまたはハイブリダイゼ ーションの手順を妨害するからである。

フェノールの抽出は核酸試料の精製に非常に有効な方法であり、そして非常に広 く使用されているが、この手順はまた労力を要しそして時間を消費する。この技 術の他の欠点は、有機溶媒（フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール およびジエチルエーテル）の使用に関連する危険（化学物質の刺激、発癌物質、 悪臭および燃焼性）を包含する。

核酸の精製の第２の方法は、ネンソーブ（ＮＥＮＳＯＲＢ”）核酸精製カートリ ッジ（デュポン社）を使用する、核酸の優先的吸着に基づく。

タンパク質性ＤＮＡ試料をネンソーブ（ＮＥＮＳＯＲＢ”）粒子のカラムに通過 させ、ＤＮＡを粒子に結合させ、そしてタンパク質性物質の大部分をカラムから 水性緩衝液で洗浄除去する。次いで、結合した核酸を粒子から２０％の水性エチ ルアルコール（または５０％の水性メチルアルコール）をカラムに通過させ、そ してＤＮＡをカラムの流出液の中に集める。クローニングまたはハイブリダイゼ ーションにおいてＤＮＡを使用する前に、アルコールをＤＮＡ溶液から試料を数 時間減圧にすることによって除去しなくてはならない。

ネンソーブ（ＮＥＮＳＯＲＢ”）の使用は他の制限を有する。ネンソーブ（ＮＥ ＮＳＯＲＢＩ′）物質、核酸を結合する外に、タンパク質を種々の程度に結合す る。これはタンパク質性物質で高度に汚染された試料（血清、組織のホモジネー ト）から核酸を定量的に結合する容量を制限ばかりでなく、かつまた核酸を水性 アルコールの使用によりネンソーブ（ＮＥＮＳＯＲＢＲ）から脱着するとき、多 少のゆるく結合したタンパク質が核酸とともに溶離される可能性を与える。ネン ソーブ（ＮＥＮＳＯＲＢ”）カラムを活性化し、カラムから結合しないタンパク 質を洗浄し、次いでカラムから核酸を溶離するために、３つの異なる溶媒を必要 とする。核酸はカラムから溶媒（２０％のエチルアルコールまたは５０％のメチ ルアルコール）の中に溶離され、この溶媒は引き続（核酸の使用のプロトコル（ 例えば、クローニング、ハイブリダイゼーションアッセイなど）において不適合 性である。ネンソーブ（ＮＥＮＳＯＲＢＲ）を使用する精製手順は時間を消費し 、核酸の単一の試料の精製に１時間またはそれ以上を必要とする。

”　Ｃ，Ａ、トマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー （Ａｎａｌｙｔｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｖｏｌ。

９３．１５８−１．６６　（１９７９）は、水性ＤＮＡ試料からタンパク質およ びタンパク質−ＤＮＡ複合体を吸着するためにガラス繊維のフィルターを使用す ることを開示している。この方法は次の欠点に悩まされる：　１）ＤＮＡの水性 試料は、タンパク質がガラス繊維のフィルターに効果的に結合するために少なく とも３００ミリモルのＮａＣｌを含有しな（ではならない。この比較的高い塩の 濃度は、生物学的反応においてＤＮＡのさらに使用する、例えば、ＤＮＡを制限 酵素で消化する前に、ＤＮＡの試料から塩を除去する（か、あるいは溶液を希釈 する）ことによって低下しな（ではならないであろう。２）フィルターを水性緩 衝液で広範に洗浄する場合にのみ、フィルターからのＤＮＡの回収は高い。３） ガラスフィルターの低い表面積（はぼｍ２／ｇ）はガラス繊維のフィルターのタ ンパク質結合容量を低くする。最大のタンパク質結合容量は、８．５ｍｇのウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ）／ｇのガラス繊維のフィルターであると推定される。

Ｂ、ポウゲルスティン（Ｂｏｇｅ　ｌ　ｓ　ｔｅ　ｉｎ）ら、プロン−ディンゲ ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、Ｖｏ　１．２６、Ｎｏ、２．６ １５−６１９　（１９７９）は、ＮａＩの存在下に、ガラス、好マシくはガラス 粉末にＤＮＡを結合することによって、アガロースからＤＮＡを分離する方法を 開示している。ＤＮＡはガラスからトリスＨＣＬｐＨ７、２１０，２モルのＮａ Ｃ１／２ミリモルのＥＤＴＡで溶離することによって除去する。また、シリカゲ ルおよび多孔質のガラスピーズはＤＮＡの精製に不適当であることが開示されて いる。

Ｊ、カークランド（Ｋｉ　ｒｋＩ　ａｎｄ）　、ジャーナル・オブ・クロマトグ ラフィーク・サイエンス（Ｊ、Ｃｈｒｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｓｃｉ、）、Ｖ ｏｌ、９．２０６−２１４　（１９７１）は、シラン試薬をシパックス（Ｚｉｐ ａｘＲ）コントロールされた表面のクロマトグラフィーの支持体の多孔質外殻の 表面と反応させることによって、表面変更したシリカゲルの調製を開示している 。

Ｊ、コーラ−（Ｋｏｈ　Ｉ　ｅ　ｒ）ら、ジャーナル・オブ・クロマｉ・フラフ ィ−（Ｊ、Ｃｈｒｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　、Ｖｏｌ、３８５．１２５−１５０ 　（１９８７）は、ケイ酸の溶解および再沈澱により、完全にヒドロキシル化し た焼成したシリカの調製を開示している。

Ｔ、ワタナベら、Ｊ、５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、３ ．１６１−１７３　（１９７８）は、タンパク質の吸着のための固定化されたタ ンニンの調製を開示している。

本発明の目的は、核酸試料からタンパク質性汚染物質を除去する改良された固相 抽出手順を提供することである。この方法は、少量の核酸から大きい比率のタン パク質を除去し、そして核酸を生物学的に活性な状態で回収することができる。

この方法は、また、急速であり、便利であり、核酸の定量的回収を提供し、そし て危険な物質の使用を最小とするであろう。それは、また、核酸の引き続く使用 を妨害することがある汚染物質または不純物を核酸試料の中に導入しないであろ う。

発明の要約 タンパク質性物質を核酸から分離する方法は、タンパク質性物質および核酸を含 有する溶液を、タンパク質性物質を結合することができる固相の抽出物質と接触 させて、結合した分画および結合しない分画を形成し、次いで核酸を含有する結 合しない分画を分離することからなる。

発明の詳細な説明 タンパク質および核酸を分離する請求の範囲の方法において有用な固相の抽出物 質は、タンパク質性物質に対する高い親和性および核酸に対する非常に低い親和 性をもつ粒状固体物質である。固相の抽出物質は、大きい比表面積を有し、高い 濃度の中程度の酸性表面のヒドロキシル化および低い表面濃度の多価のカチオン 種をもつことによって特徴づけられる。

大きい表面積をもつ固相の抽出物質は、大量のタンパク質を除去する容量をもつ ために好ましい。好ましくは、抽出物質の比表面積は少なくとも５０ｍ２／ｇで ある；より好ましくは、それは少なくとも１００ｍ２／ｇである。これらの高い 表面積は粒状物質を通る孔の存在のためである。孔は〉６０人の有効直径である べきであるが、孔の直径には上限は存在せず、５００人の合理的な限界は高い表 面積を維持するために好ましい。好ましい範囲は６０人〜１５０人である。

高い濃度の抽出物質上の適度に酸性のヒドロキシル基は、タンパク質性化合物に 対する抽出、物質の親和性を増加し、かつポリアニオン、例えば、核酸に対する その親和性を減少するという両者の働きをする。適度に酸性のヒドロキシル基の 最小有効濃度は０．１μモル／ｍ２である。

好ましくは、適度に酸性ヒドロキシル基の濃度は１〜８μモル／ｍ２である：よ り好ましくは、それは８μモル／ｍ２である。

好ましくは、表面のヒドロキシル基のｐＫ、は６〜１０である。

固相の抽出物質の表面上の多価のカチオンの濃度は、カチオンの表面の種による アニオン性核酸の複合化を防止するために最小であるべきである。３価の金属、 例えば、鉄およびアルミニウムは、抽出物質に対してとくに悪影響を及ぼす。

前述の所望の性質をもつ固相の抽出物質は、ある数の方法において、均質な粒状 物質を使用するか、あるいはその表面上の所望の機能的部分が化学反応を経て導 入されたコアの粒状物質を使用して、調製することができる。前者の場合につい て、再水和シリカゲルは所望の性質を有することが発見された。シリカゲルは、 本来、大きい表面の集団（８μモル／ｍりの適度に酸性の（６＜ｐＫ、＜１０） ヒドロキシル基を有し、こうして上の主な要件を満足する。それは、また、吸着 性タンパク質性物質において非常に有効である。しかしながら、核酸がシリカ粒 子の表面上に吸着されるのを防止すべき場合、シリカゲルの表面は多価のカチオ ン種を含有してはならない。これはい（つかの方法で達成することができる。

好ましい方法は、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・り０７トフ ラフイー（Ｊ、Ｃｈｒｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、Ｖｏｌ、３８５．１２５−１５ ０　（１９８７）に従う粒子の表面層の溶解および再沈澱により、シリカ粒子の 表面層の再ヒドロキシル化および精製を包含する。この手順において、シリカ粒 子の外側表面を高温においてフッ化水素酸中に溶解する。次いで、溶解したシリ カを、溶解したシリカを含有する溶液を、シリカが水性媒質中でより低い溶解度 を有する室温に冷却させることによって、各粒子の表面上に再沈澱させる。層が 再沈澱するとき、溶解したシリカの外側層の中に存在する汚染物質は溶液の中に 止まり、そしてシリカの本質的に純粋な層はコア粒子の回りに形成する。

−あるいは、多価金属の汚染物質は、シリカを順次に高温において中程度の濃度 の塩酸および硝酸で処理することによって、シリカから浸出することができる。

この方法は、シリカゲル粒子の表面上に金属不純物を可溶化しかつ抽出して、本 質的に純粋な表面を残す。

固相の抽出物質を調製する第３方法は、多孔質支持体の表面の回りに大きい集団 の適度に酸性のヒドロキシル基を含有する有機物質の厚い層を重合することであ る。これは所望の化学的官能性を含有する有機シランをシリカと反応させること によって実施することができ、ここでシランはそれ自体とおよびシリカ粒子と架 橋して、所望の集団の適度に酸性のヒドロキシル基を含有する厚い固定化された 有機ポリマーの層を形成する［Ｊ、　カークランド（Ｋｉ　ｒｋｌａｎｄ）　、 ジャーナル・オブ・クロ７トフラフイソク・サイエンス（Ｊ、Ｃｈｒｍａｔｏｇ ｒａｐｈｉｃＳｃｉ、Ｌ　Ｖｏｌ、９．２０６−２１４　（１９７１）］。ヒヒ ドロキシルは大量のタンパク質性物質を吸着する能力をもつ表面を付与するが、 また、有機ポリマーの層より下にコア粒子中の多価のカチオン種から核酸をシー ルドし、こうして核酸が固相の抽出物質へ結合するのを防止する。多数の有機シ ランをこの反応に使用することができる。例えば、７ランを使用してフェノール （ｐＫ、＝９．９）　、ベーターナフトール（ｐＫ、＝９．６）またはタンニン （ポリヒドロキシカルボン酸）を支持体粒子の表面上に固定化すると、有用な固 相の抽出物質が得られる。

有用な支持体物質は、シリカ、セルロース、アガロースおよび大きい集団の活性 な表面の基を有する他の物質を包含することができる。

固相の抽出物質の調製のいかなる方法によっても、少なくとも２つのプロトコル は核酸の試料から有機タンパク質性汚染物質を除去するときその使用のために利 用することができる。第１粒子に従い、ある量の粒状固相の抽出物質を脱タンパ ク質すべき体積の試料に添加する。この混合物をおだやかに撹拌して粒状物質を 懸濁して保持する。固相の抽出物質の小さい大きさおよび大きい表面積のために 、固相の抽出物質への有機タンパク質性物質の拡散および吸着は急速である（数 分の程度）。次いで、吸着したタンパク質を含有する粒状物質を水性核酸試料か ら便利な手段、例えば、遠心または濾過により分離する。このプロトコルは、大 きい体積（＞１ｍ１）の試料が小さい量のタンパク質を含有し、こうして小さい ｆｆ１（例えば、＜１０ｍｇ）の粒子がタンパク質の定Ｉ的除去に要求されると き、最も有効である。

第２プロトコルにおいて、固相の抽出物質をカラムの中に充填し、そして水性試 料をカラムに通過させる。これを達成するために、ある量の粒子を秤量して回転 カラムの中に入れ、そしてカラムの密閉した末端をヘンチトツブに軽く打つこと によって詰める。カラムは、また、遠心機により高速度で回転することができる ；遠心力は粒子をカラムの底において緊塞に詰める。次いで、カラムをある体積 の適当な緩衝液（カラム中の粒子の体積に少なくとも等しい体積）をカラムの」 二にピペッティングすることによって湿潤させ、次いでカラムの底の中に滲出さ せる。次いで、カラムを高速度で遠心機内で約３０秒間回転することによって過 剰の緩衝液をカラムの床から除去する。カラムの床から溶離された緩衝液を廃棄 する。ここでカラムは脱タンパク質すべき核酸の試料を受け取る状態となる；試 料をカラムの頭部上にピペッティングし、そしてカラムの床の中に滲出下降させ 、ここで有機タンパク質性物質は粒子に結合し、そして核酸は溶液の中に止まる 。次にカラムを遠心機内で高速度で回転させて、核酸を含有する水性相を収集管 の中に溶離する。カラムからの核酸の回収は、典型的には、カラムに適用した量 の〉８０％である。

小さい体積（典型的にはカラムに本来適用した試料の体積の１／３〜１／２）の 適当な緩衝液をカラムの頭部上にピペッティングし、そして遠心機内で高速度で 回転する場合、回収は約９５％に改良することができる。これは捕捉された核酸 をカラムの床を通して洗浄し、そしてこの洗浄液を核酸の大部分を含有するカラ ムの流出液に添加すべきである。大量の粒子（試料の体積に関して）を使用する ことが必要であるとき、このプロトコルは有機タンパク質性物質で高度に汚染さ れた試料について最もよく働（。また、非常に小さい体積の試料（例えば、５０ μｌ）を脱タンパク質し、そして前の方法の利用が面倒であるとき、このプロト コルは有用である。

前に概説したカラムの湿潤工程およびカラムの洗浄工程において使用する緩衝液 の性質に、いくつかの拘束を加えることができる。化学的性質は有意であると思 われないが、多価金属のカチオン（例えば、Ａ１、Ｆｅ、Ｔｉなど）の塩の使用 は回避すべきである。標準の生化学的緩衝液、例えば、ＴＥ（１０ミリモルのト リス・ＨＣＬＩミリモルのＥＤＴＡＳｐＨ７，６）　、ＳＴＥ　（１０ミリモル のトリス・ＨＣＩ、１００ミリモルのＮａＣＬ　１ミリモルのＥＤＴＡｌｐ）（ ’７．０）またはＰＢＳ（１２０ミリモルのＮａＣ１，２，７ミリモルのＫＣＩ 、１０ミリモルのホスフェ−）ｐＨ７，４）は非常によく働く。一般に、緩衝液 のｐＨは６〜７．５の範囲であるべきである；より低いｐＨ値において、核酸は 固相の抽出物質に結合し、回収を減少することがあるが、高いｐＨにおいて、シ リカゲルがアルカリ性溶液中で有意な溶解度を有するので、支持体は溶解するこ とがある。同一の理由で、核酸の試料が上の範囲の外側のｐＨを有する場合、そ れをタンパク質除去のカラムに適用する前に、それをｐＨ６〜７．５に中和しな くてはならない。すべての緩衝液および試料について好ましいｐＨは６．５〜７ ．０の範囲であろう。

固相の抽出物質の孔の直径はタンパク質が入るために十分に大きく、こうしてタ ンパク質が内部の孔の表面上に吸着することができるようにする。これは試料か らタンパク質を除去するための支持体の容量を最大にするであろう。孔は、また 、核酸が孔の体積の中に捕捉されるようになるのを防止するために十分に大きく な（ではならない。６０〜１５０人の範囲の最小の孔の直径は要求される特性を 提供することが発見された。孔の直径に臨界的上限は存在しないが、粒子の孔の 直径が増加するにつれて、比表面積は減少する。こうして、３００〜５００人の 合理的な上限を定めることができる。この限界より大きい孔直径をもつ粒子は減 少した表面積を有し、結局、減少したタンパク質結合容量を有する。

固相の抽出物質は、広い範囲の核酸試料から有機タンパク質性物質を除去するた めに有用である。実証された用途は、制限消化からの酵素の除去、脱リン酸化反 応混合物からのアルカリ性ホスファターゼの除去および標識つけ反応混合物から のキナーゼ酵素の除去を包含する。他の普通の酵素、例えば、逆トランスクリブ ターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、および末端トランスフェラーゼ 、これらは分子生物学において普通に使用されている、を、また、適当な実験的 条件下に除去することができることが予測される。

さらに、固相の抽出物質は、多数の生物学的試料からの核酸の分離および精製に ついて実用性を有する。この物質は全血の試料中の有機体か”　らのＤＮＡの精 製について実証された；臨床的に興味ある他の試料、例えば、痰、尿、糞便およ び組織からの同様な分離は、いうたん適当な精製のプロトコルが開発されると、 可能であることが予測される。このような精製された核酸試料は臨床的ハイブリ ダイゼーションアッセイにおいて直接使用されるであろう。さらに、固相の抽出 物質は、とくにクローニングまたは他の遺伝子工学の用途のためのＤＮＡを産生 ずる目的で、培地中で生長させた有機体からの核酸の分離および精製のための実 用性を有するであろう。

固相の抽出物質は、広い範囲の核酸から有機タンパク質性不純物を除去するため に有用である。例えば、この物質を使用して、モノｍｕｔ。

例えば、ｄＡＴＰＳｄＣＴＰなどの放射線標識において使用されるキナーゼ酵素 を除去することができる。この物質は、また、１２５塩基対（ｂ　ｐ）〜２１． ２２６ｂｐの範囲のＤＮＡの混合物からアルカリ性ホスファターゼを除去するた めに使用された。この物質はもっばらｐＢＲ３２２（４３６２ｂｐ）とともに使 用された。さらに、この物質は完全なラムダＤＮＡ　（４９，０００ｂｐ）とと もに使用され、そして機械的剪断によるおのＤＮＡの分解は観測されなかった。

ＤＮＡのより大きい鎖は、固相の抽出物質のカラムを通過するとき、剪断力によ り分解されやすいことがあるが、これは確実には知られていない。この問題は、 固相の抽出物質の製造により大きい粒子を使用し、これによりこのような粒子を 詰めたカラム中の剪断力を減少することによって、最小とすることができる。

核酸を含有する試料の脱タンパク質の本発明の方法は、現在使用されている方法 を越えた次の利点を有する：１、固相の抽出物質は適当な水性緩衝液の中に本質 的に不溶性であるので、核酸試料の中に溶解せず、こうしてそれを除去するため の引き続く手順（例えば、抽出）はフェノール／クロロホルムの抽出におけるよ うに必要ではない。

２、核酸をカラムに適用するときの媒質と本質的に同一である（タンパク質の除 去を除外する）水性媒質の中に核酸は溶離される。こうして、核酸を使用すると きの引き続く生物学的プロトコルと適合性である溶媒の中に核酸は存在する。引 き続く生物学的手順において使用する酵素を阻害または不活性化する汚染物質（ すなわち、フェノール、クロロホルム、エタノールなど）は存在しない。

３、この物質を使用する精製のプロトコルは１つの試料について実施するために ５〜１０分を必要とするが、フェノール／クロロホルムまたはネンソーブ（ＮＥ ＮＳＯＲＢＲ）に基づく手順は１時間またはそれ以上を必要とすることがある。

さらに、追加の試料のプロセシングは１０分／試料を必要とする。

４、この手順の実施に特別の試薬を必要としない。ＴＥ（ｐＨ６，７５）はカラ ムの湿潤および洗浄のために許容されうる緩衝液であり、そしてこの緩衝液は核 酸を使用するすべての実験室において入手可能である。さらに、毒性または危険 な試薬は排除される。

５、核酸の回収は高く、典型的には８０〜９５％である。

６、支持体へのＤＮＡの吸着に基づく精製方法と異なり、この方法は大きいＤＮ Ａ断片を剪断しない。こうして、試料の一体性は維持される。

ＤＮＡの剪断は固相への核酸の吸着に基づく方法において起こり得る。

なぜなら、長いＤＮＡ断片（例えば、１０キロ塩基対またはそれ以上）では、Ｄ ＮＡの鎖の２つの末端が２つの異なる粒子に同時に吸着されそして、撹拌すると き、２つの粒子は異なる方向に動き、そしてＤＮＡの鎖を引っ張って２つのより 小さいＤＮＡ断片にするからである。本発明の手順において、ＤＮＡは固相は吸 着されず（その代わりタンパク質が吸着）されるので、このＤＮＡの分解は不可 能である）。

次の実施例によって、本発明を説明する。

実施例 一般の方法および試薬 ｐＢＲ３２２ＤＮＡおよびＰＳＴ制限酵素は、ファーマンア・インコーホレーテ ッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ）、＝ニージャーシイ州ビス力タウエイ、か ら入手した。ｌ０ＸＰＳＴ制限消化緩衝液は、５００ミリモルのＮａＣＬ　１０ ０ミリモルのトリスＨＣ１，ｐＨ７，５，１００ミリモルのＭｇＣ＋２および１ ０ミリモルのジチオスレイトールを含有する。子ウシ腸アルカリ性ホスファター ゼは、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ ａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インジアナ州インディアナポリス から入手した。ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー ト）は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｓ）、マリイランド州ガイサースバーグ、かシラン処理したシリカ ゲルの調製および使用Ａ１シリカ支持体の調製 フラクトシル（Ｆｒａｃｔｏｓｉｌ）５００　［２０，５ｇ５Ｅ、メルク（Ｍｅ ｒｃｋ）、ドイツ国ダーマシュタット〕を１００μｍのアリコ−１−の２５％（ ｖ／ｖ）の核酸で室温において、シリカ粒子を水性酸の中に懸濁させ、次いでい ったん粒子がビーカーの底に沈降したとき、過剰の酸をデカンテーションするこ とによって、３回洗浄した。この酸処理した粒子を蒸留、脱イオン水で、上澄み 液がｐＨ５，５を獲得するまで、よくすすいだ。次いで、粒子を中程度の多孔度 の濾紙を装備したブフナー漏斗に移し、高い純度のメタノール（３Ｘ１．００ｍ １）ですすぎ、そして８０℃（６３０ｍｍＨｇ）において１時間乾燥した。

Ｂ、シリカ支持体上へのアミノフェニルトリメトキソシランの重合アミノフェニ ルトリメトキシシラン［４，０ｍＬペトラーチ・システムス・インコーポレーテ ヅド（Ｐｅｔｒａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｉｎｃ、）、ペンシルベニア州ブリストル］を、還流冷却器および磁気撹拌機を 装備した丸底フラスコ内の蒸留、脱イオン水（２４ｍｌ）およびイソプロピルア ルコール（１２ｍ　ｌ　）に添加した。生ずる混合物を、シランが完全に溶解す るまで、撹拌した。酸洗浄したシリカ粒子（６゜１ｇ）をシラン溶液に添加し、 そしてこの混合物を８１℃において１時間還流した。氷酢酸（３，５ｍ１）をフ ラスコに添加し、そしてこの混合物をさらに１時間撹拌した。この懸濁液を室温 に冷却し、次いでシリカ粒子はフラスコの底に沈降した。黒色の上澄み液をデカ ンテーションし、そして粒子を洗浄液体が無色となるまで高い品質のメタノール でよく洗浄した。次いで、アミノフェニル誘導化シリカ粒子をブフナー漏斗上に 集め、そして粒子のベッドを通して空気を吸引して残留アルコールを除去した。

粒子を中程度の強さのランプの下でさらに乾燥した。粒子の炭素および窒素の分 析は、炭素質物質の厚い層がシリカ粒子の表面上“　で重合したことを示した（ ６．２７％のＣ，１，１３％のＮ）。

Ｃ１アミノフェニル誘導化シリカゲル（６，９０ｇ）を水（１０，０ｍ１）およ び濃硫酸（７，０ｇ）の水冷溶液に添加し、そして粒子を磁気撹拌によりこの溶 液の中に懸濁した。最後に、砕いた氷（はぼ１７ｇ）を上の混合物に添加し、次 いで水（５，３３ｇ）中の亜硝酸ナトリウム（２，２４ｇ）の溶液を８〜１０分 にわたって滴々添加した。この混合物の温度をこの時間の間Ｏ〜５℃に維持した 。粒子を沈降させ、次いで上澄み液をこの混合物からデカンテーションした。次 いで、粒子を１０Ｑｍｌの冷水の中に懸濁させ、粒子を沈降させ、そして上澄み 液をデカンテーションすることによって３回洗浄した。表面のアミンが対応する ジアゾニウム塩に転化した、生ずる粒子を、下に記載する加水分解反応において 使用した。

Ｄ、ジアゾニウム塩の加水分解 濃硫酸（３２ｍｌ）を水（２４ｍ　ｌ　）に添加し、そしてこの混合物を加熱沸 騰させた（はぼ１６０℃）。ジアゾニウムを含有する粒子を熱い酸にゆっくり添 加し、その間沸騰を維持し、ジアゾニウム塩の分解から発生した窒素ガスからの 泡立ちは和らいだ。この混合物をほぼ５分間沸騰させ、次いで水浴の中に入れて 冷却を速めた。酸性上澄み液を粒子からデカンテーションし、次いで粒子を蒸留 、脱イオン水（５ｘ２００ｍＩ）で洗浄した。粒子を中程度の多孔度の濾紙を装 備したブフナー漏斗上に集め、そしてメタノール（２００ミリ）ですすいだ。粒 子のベッドを通して空気を吸引して残留アルコールを除去し、そして粒子を中程 度の強さのランプの下でさらに乾燥した。元素分析は、粒子が０．５５重量％の 炭素および０．０１重量％より少ない窒素を含有することを明らかにした。

Ｅ１上の部りに記載したシラン処理したシリカゲルを、溶液からモデルのタンパ ク質（ウソ血清アルブミン、ＢＳＡ）を除去するときのその有効性、ならびにＤ ＮＡ　（サケ精子ＤＮＡ）へのその結合の欠如について試験した。Ｂ　Ｓ　Ａの アリコートを種々のリン酸塩緩衝液（ｐＨ−５，０〜７．０）の中に入れ、試料 を２５０ｍｇのシラン処理したシリカゲルと混合し、次いで溶液をシリカゲルか ら、シリカ粒子を遠心機で沈澱させることによって分離した。初期の緩衝化タン パク質溶液および濾液を紫外線吸収（２００〜４８０ｎｍ）により分析した。紫 外線スペクトルを比較すると、タンパク質の除去は常に〉９０％であることが示 された。

サケ精子ＤＮＡのアリコートを使用する同様な試験は、ＤＮＡの回収が常に〉８ ５％であった。

実施例２ フッ化水素酸処理したシリカゲルを使用する核酸の精製Ａ１再水和シリカゲルの 調製 シリカゲル［１４０ｇ、ＰＳＭ３００ゾルパックス（Ｚｏｒｂａｘ）、ロット９ 、デュポン社］を石英るつぼの中で９７５℃に２時間マツフル炉内で加熱し、次 いで１５ｇの冷却したシリカゲルを還流冷却器を装備した丸底フラスコの中に配 置した。７５ｐｐｍのＨＦを含有する蒸留、脱イオン水（１５０ミリ）をフラス コに添加し、そしてこの混合物を１１０℃において７２時間還流した。この混合 物を室温に冷却し、次いでシリカゲルを１１の蒸留、脱イオン水で洗浄する。シ リカゲルを水（１５０ミリ）中で一夜沸騰し、順次に水（５００ｍ　ｌ　）およ びアセトン（３００ミリ）で洗浄し、そして最後に１１０℃において５時間乾燥 した。

Ｂ１管Ａに１ｇｇ（１５μｍ）のｐＢＲ３２２ＤＮＡ、３２ユニツト（２μＩ） のＰＳＴ制限酵素、６μｌのｌ０ＸＰＳＴ制限消化緩衝液（低い強度の制限緩衝 液）および３７μｍの水を添加した。この管の内容物を混合し、そして３７℃に おいて１．２５時間インキュベーションした。

管Ｂに管へにおいてものと同一の試薬を添加した。しかしながら、混合直後に、 この管の内容物を６０ｍｇのフッ化水素酸処理したシリカゲルを含有する回転カ ラムの頭部上にピペッティングした。このカラムを充填し、そして試料の添加直 前に、１ＸＰＳＴ制限緩衝液で湿潤した。試料をカラムのベッドの中に浸透下降 させ、モしてカラムをエツペンドル７　（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機（５４１ ２型）内で５分間回転し、そして流出液を集めた。カラムの流出液のアリコート を第３反応管（管Ｃ）に取り出し、そして１μｍ　（１６ユニツト）のＰＳＴ制 限酵素を添加した。この管の内容物を混合し、そして３７℃において１．２５時 間インキュベーションした。次いで、すべきＡ−Ｃのアリコートをアガロースゲ ルを負荷した緩衝液（水中の０２５％のブロモフェノールブルー、０．２５％の キンレンシアノール、および３０％のグリセロール）と混合し、そして各々の一 部分をバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）ミニ−セル・スブマリ：、ｚ：Ｍｉｎｉ−Ｃ ｅｌ　Ｉ　Ｓｕｂｍａｉｎｅ）電気泳動装置中の０．７％のアガロース電気泳動 ゲル（０，１０５ｇのアガロース、１４．８ｍｌの０５μｇ／ｍｌの臭化エチジ ウムを含有するＴＢＥ緩衝液）に適用する。ゲルを１００Ｖの印加電位において 約４時間０．５×緩衝液（０，５ＸＴＢＥ＝トリス−ポレート、０．０４４５モ ルのホウ酸、０．００１モルのＥＤＴＡ、、ｐＨ８，０）中で展開した。ゲルを ２５４ｎｍの紫外線中でトランスイルミネーションを経て写真撮影した。

直線化ｐＢＲ３２２標準に等しい長さの直線化ＤＮＡ断片が管Ａから得られ、Ｐ ＳＴ制限酵素が円形ｐＢＲ３２２を１か所で切断したことを示した。管Ｂからの ＤＮＡは円形ＤＮＡとして展開する：直線化ｐＢＲ３２２対応するゲル上の位置 においてＤＮＡのバンドは観測されず、ＤＮＡが酵素により切断されなかったこ と、すなわち、酵素がカラムの通過により除去されたことを示した。直線化ｐＢ Ｒ３２２標準に等しい長さの直線化ＤＮＡ断片は、また、管Ｃから得られ、ＤＮ Ａを制限酵素により切断できたこと、そしてＤＮＡをカラムに通過することはＤ ＮＡの生物学的活性を変更しないか、あるいは必要な緩衝液の成分（例えば、Ｍ ｇＣ１２）を除去しないことを示した：それは陽性制限酵素のみを除去した。

この実施例が実証するように、再水和シリカゲルを含有する回転カラムにＤＮＡ およびタンパク質を含有する試料を通過すると、試料から、タンパク質、例えば 、ＰＳＴ制限酵素は効果的に除去される。また、カラムからの流出液の中に集め られたＤＮＡは生物学的に活性であること、モしてカラムは引き続く生物学的反 応においてＤＮＡを修飾するために使用する酵素を阻害する不純物をＤＮＡに添 加しないことが示される。

実施例２に記載する手順を、ＰＳＴ制限酵素および緩衝液の代わりに、ＥｃｏＲ Ｉ制限酵素および緩衝液（中程度の強度の緩衝液）を使用して反復した。円形の ＰＳＴ制限酵素のみが管Ｂからのカラムの流出液において観測され、混合物のカ ラムの通過は、Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ，ＩがＤＮＡを切断することができる前に、Ｅｃ ｏＲＩ制限酵素のすべてを除去したことを示”す。

実施例２に記載する手順を、ＰＳＴ制限酵素および緩衝液の代わりに、５ａｉｌ 制限酵素および緩衝液（高い強度の緩衝液）を使用して反復した。円形のＰＳＴ 制限酵素のみが管Ｂからのカラムの流出液において観測され、混合物のカラムの 通過は、５ａｌｌがＤＮＡを切断することができる前に、５ａｌｌ制限酵素のす べてを除去したことを示す。

塩酸および硝酸を使用する再水和シリカゲルの調製シリカケル［ＰＳＭ３００、 シーパックス（Ｚｏｒｂａｘ）、デュポン社］を、マンフル炉内で石英るつぼ中 でまず３００℃に２時間加熱し、次いて５４０℃に２１時間加熱した。次いで、 ２０ｇのこのシリカゲルを、５００ｍ１の１０％（ｖ／ｖ）の塩酸を含有する蓋 つきテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ″）ビーカーの中に入れ、そしてこの混合物を１０ ０℃に４時間加熱した。この混合物を室温に数時間冷却し、次いで濾過した。シ リカゲルを１１の蒸留、蒸留水で洗浄し、次いで５００ｍ１の１０％（Ｖ／Ｖ） の硝酸を含有するテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ’）ビーカーに移した。

この混合物を１００℃に４時間加熱し、室温に冷却し、次いで濾過した。

シリカゲルを１１の水で洗浄し、次いで塩酸および硝酸の洗浄を反復した。最後 に、シリカゲルを蒸留、脱イオン水（５００ｍｌ）中で１００℃に４時間加熱し 、室温に冷却し、濾過し、蒸留、脱イオン水（１，５１）で洗浄し、アセトン（ ３００ｍｌ）ですすぎ、そして１１０℃において乾燥した。

この再水和シリカゲルの一部分を、実施例１に記載するようにＤＮＡの回収につ いて試験した。ＤＮＡの１μｇの試料の８７．２％を回収した。

実施例６ 脱リン酸化反応混合物からのアルカリ性ホスファターゼの除去直線化ＤＮＡ　（ ＰＳＴ制限酵素で消化したｐＢＲ３２２ＤＮＡ）を、８０μｌの脱リン酸化緩衝 液（５０ミリモルのトリスＨＣＩ、１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ８，２）中に溶 解し、そして１μｌ　（０，５ユニツト）の子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ を添加した。この混合物を３７°Ｃにおいて３０分間インキュベーションした。

反応混合物の４０　ｔｔ　１のアリコートを取り出し、そして７，６μＩの０． ２５μｌのＨＣＩをこのアリコートに添加して、ｐＨ６，０を調節した。次いで 、中和したアリコートを４０ｍｇの実施例２におけるように調製した再水和ンリ 力ゲル力ラム、これは前以て充填しそして脱リン酸化緩衝液（ｐＨ６，０）で湿 潤させた、を通して回転した。

次いで、回収したカラムの流出液を、酵素アッセイにおいて活性アルカリ性ホス ファターゼについて分析した二カラムの流出液に、１０μｌの１モルのトリスＨ ＣＩ　（ｐＨ８，０）を添加して、ｐＨを７．８に調節した。次いで、アリコー トを１００μｌのアッセイ緩衝液に添加し、このアッセイ緩衝液は０．　１モル のトリスＨＣｌ１ｐＨ９゜５．０，１モルのＮａＣＬ　５０ミリモルのＭｇＣ！ および０．２２μｇ／ｍｌの反応を２時間進行させ、次いで不溶性の着色した産 生物を２ｍｍの直径のフィルター上に集めた。

０．２５ユニツトの活性アルカリ性ホスファターゼを含有する対照反応は、非常 に強いブルーの色を生じた。０．００２５および００００２５ユニツトのアルカ リ性ホスファターゼの希釈物は、また、ブルーの色を生成した。カラムの通過の 前に、本来０．２５ユニツトを含有するカラムの流出液からブルーの沈澱は見る ことができず、カラムは試料ががそれを通過するとき試料からアルカリ性ホスフ ァターゼの少な（とも９９．９９％を除去したことを示す。酵素の完全な除去を 保証するために、アルカリ性ホスファターゼ脱リン酸化混合物を酸性化した後、 それをカラムに通過させることが必要である。ｐＨ８，２において、酵素の９９ ．９％のみが除去された。

同様な実験において、５ユニツトまでのアルカリ性ホスファターゼを前述の手順 を使用して＞９９．９９％の効率で除去された。

健康なドナーから集めたヒトの血液を、そのＤＮＡが単純ヘルペスウィルスのＤ ＮＡのインサートを含有するＥ、ｃｏｌｉバクテリア［５μｇ１ニ二一・イング ランド・ニュークリアー・コーポレーション（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ ｌｅａｒ　Ｃｏｒｐ、）、マサチュセッツ州ビレリカ］でスパイキングした。こ のスパイクト血液試料（１０ｍｌ）をイソラトール（ＩｓｏｌａｔｏｒＩ＋）管 （デュポン社）の中で溶解して、赤血球を崩壊した。次いで、遠心機内でイソラ トール（ＩｓｏｌａｔｏｒＲ）管を回転して、管の底に１．５ｍｌのバクテリア の沈澱層を形成し、そして上澄み液を除去することによって、完全なバクテリア を分離した。次いで、バクテリアを２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中 で３０分間６５℃において溶解した。血液試料からのバクテリアを１００℃に１ ０分間加熱して、有機タンパク質性物質の大部分を凝固させた。次いで、凝固物 を遠心機内で１０分間沈澱させ、そして上澄み液を回収した。次いで、凝固した 塊を蒸留水（１ｍｌ）中で破壊してＤＮＡを塊から洗浄除去し、そして遠心後、 上澄み液を回収し、そしてもとの上澄み液に添加した。次いで、このプロセスを 反復した。

この時点において、遊離のバクテリアのＤＮＡは４ｍｌの液体の中に分離され、 これはなお実質的な量のタンパク質（＞１０ｍｇ／ｍＩ）を含有し、これは残留 するヘムタンパク質（なかでも）により試料に付与された錆びた赤色により照明 された。この残留タンパク質を除去するために、４ｍｌのＴＥ　（ｐＨ６，７５ ）緩衝液で前以て湿潤した、再水和シリカゲル（実施例２におけるように調製し た）を充填した回転カラムの頭部に試料を配置した。低速度の遠心によりカラム の頭部の中に試料を流入させ、次いで遠心機を高速度で回転させてＤＮＡを強制 的にカラムの中から外に出した。流出液を集めたｖｉ（１０分）、カラムを１ｍ ｌのＴＥ　（ｐＨ６，７５）緩衝液で洗浄し、そして洗浄液をカラムの流出液に 乎加した。精製したＤＮＡの試料を真空下に乾燥して小さい体積にし、次いで標 準の７ゾブリダイゼーシヨンの濾過アッセイにおいてアッセイした。

１２μｌの各々の１モルのＮａＯＨおよび３モルのＮａＣ１を、１゜ＯｍｌのＴ Ｅ　（ｐＨ６，７５）緩衝液中に溶解した乾燥したＤＮＡの試料に添加した。試 料を９５℃に５分間加熱して、ＤＮＡを変性し、冷却し、そして氷上で再ハイブ リダイゼーションを防止した。

゛　前以てハイブリドツト・マニホールド（Ｈｙｂｒｉｄｏｔ　Ｍｎ１ｆｏ１ｄ ）［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）］の中にアセンブリングしそして５×ＳＳＣ緩衝液 （０，７５モルのＮａＣｌ５ｏ、０７５クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）で湿 潤した、シーンスクリーン・プラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ”）［ニ ュ＋拳イングランドΦニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒ）］上に、変性した試料のアリコートをスポツティングした。試料をフィルタ ーを通して真空にすることによってゆっくり吸引し、次いでスポツティングした 試料を１００μｍの３モルの酢酸アンモニウムを試料のスポットを通して吸引す ることによって洗浄した。スポツティングした試料をを含有するフィルターをマ ニホールドから取り出し、そして５０℃において１ｍ１の２ｍｇ／ｍｌのサケ精 子ＤＮＡ　［シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、）、ミゾリー州セントルイス］および１％（Ｗ／Ｖ）　ドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）［シグマ・ケミカル・カンパ−−−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、）］を含有する０、５モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７， ０）中で３０分間インキュベーションした。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ中のＨ３Ｖ　ＤＮＡ挿入に対して相補的な３２ｐ標識した ｐＨ８Ｖ１０６　ＤＮＡプローブ［２００μ！、０．１５μｇ１オンコール・イ ンコーホレーテッド（Ｏｎｃｏ乙　Ｉｎｃ、）、マリイランド州カイサースバー グ］を、ハイブリダイゼーション混合物に添加した。フィルターを６０℃におい て３０分間インキュベーションし、そして６０℃において１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤ Ｓを含有する０、１モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）の２つの５０ ｍ１のアリコートで洗浄して、ハイブリダイゼーションしないＤＮＡのプローブ を除去した。

フィルターを室温において空気乾燥し、次いでコダック（Ｋｏｄａ、ｋ）ＲＰフ ィルムで一伎オートラジオグラフィーにかけた。

この実験および標準のフェノールの抽出手順を使用する類似の実験の結果は、完 全なハイブリダイゼーション可能なりＮＡが回転カラムから、フェノールからと ほぼ同一の効率で、回収されたことを示す。そのうえ、回転カラムを通過させた 、ブランクの血液試料（すなわち、をエンコードするＤＮＡでスパイキングしな かった）は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてドツトを生じず、回転カ ラム中の再水和シリカゲルが試料の中に妨害または汚染を導入しなかったことを 示す。

種々のシリカゲルの試料からのＤＮＡの回収表は、９つの再水和シリカゲルの試 料（試料Ａ−ｒ）、４つの未処理の商業的に入手可能なシリカゲル（試料Ｊ−Ｎ ）および意図的に種々の金属で汚染した２つの再水和シリカゲル（試料０−Ｐ） から回収されたＤＮＡの量を示す。

８　８９、９ Ｉ　９１．８ Ｎ　４１．３ ０　２６、６ 試料 Ａ＝ゾルバックスンリカ（ＺＯｒｂａｘ″）シリカ（Ｐ　３Ｍ２０００、デュポ ン社）孔サイズ２０００人、実施例２Ａに従い調製した。

Ｂ＝ゾルパックス（ＺｏｒｂａｘＲ）シリカ（ＰＳＭｌｏｏＯ、デュポン社）孔 サイズ１０００人、実施例２Ａに従い調製した。

Ｃ＝ゾルパックス（ＺｏｒｂａｘＲ）　ノリ力（ＰＳＭ３００、デュポン社）孔 サイズ３００人、９２５℃に加熱し、次いで実施例２Ａに従い調製した。

Ｄ＝ゾルパックス（ＺｏｒｂａｘＲ）シリカ（Ｐ　８Ｍ３００、デュポン社）孔 サイズ３００人、８５０℃に加熱し、次いで実施例２Ａに従い調製した。

ＥＳＦ−ゾルパックス（Ｚｏｒｂａｘ”）シリカ（Ｐ　８Ｍ３００、デュポン社 ）孔サイズ３００人、９７５℃に加熱し、次いで実施例２Ａに従い調製した。

Ｇ−テトラエチルオルトシリケートから調製した３００人の孔サイズのシリカ。

Ｈ，Ｉ＝実施例ＩＡに記載するようにＨＣＩ／ＨＮＯ３で処理したフラクトシル （ＦｒａｃｔｏｓｉｌＲ）５００　［Ｅ、　メルク（Ｍｅｒｃｋ）］。

Ｊ＝ゾルパックス（ＺｏｒｂａｘＲ）シリカ（ＰＳＭ１５０、デュポン社）孔サ イズ１５０人、未処理。

Ｋ−バイダック（ＶｙｄａＣＩ＋）ノリ力（ロット３７００、Ｓｅｐ／ａ／ｒａ ／チオンズ・グループ（ｔ　１ｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ）　、カリフォルニア州へス ペリア］。

Ｌ＝フラクトシル（Ｆｒａｃ　ｔｏｓ　ｉ　ＩＲ）５００　［Ｅ、メルク（Ｍｅ ｒｃｋ）コ、未処理。

Ｍ＝ヌクレオンル（Ｎｕｃ　Ｉ　ｅｏｓ　ｉ　Ｉ）−１００−３［７テリーーネ イゲル（Ｍａｃｈｅ　ｒｙ−Ｎａｇｅ　Ｉ、ドイツ国］、未処理。

Ｎ＝ヌクレオンル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−３００［７テリーーネイゲル（Ｍａ ｃｈｅ　ｒｙ−Ｎａｇｅ　ｌ、　ドイツ国］、未処理。

０＝試料Ｆ、５００ｐｐｍの各Ｆｅ５ＭｇおよびＮａで意図的に汚染した。

Ｒ＝試料Ｆ、５００ｐｐｍの各ＡＩで意図的に汚染した。

補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年９月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ、タンパク質性物質および核酸を含有する溶液を、タンパク質性物質を桔 合することができる固相の抽出物質と接触させて、核酸を含有する結合しない分 画を残し、そして ｂ、結合しない分画を分離する、 ことからなる、タンパク質性物質を核酸から分離する方法。 ２、前記固相の抽出物質は少なくとも５０ｍ２／ｇの比表面積および６０Åより 大きい有効直径の貫通孔を有する、上記第１項記載の方法。 ３、前記固相の抽出物質は、その表藤に多価のカチオンを実質的に含まず、そし て０．１μモル／ｍ２の最小濃度およびｐＫａ６〜１０において表面のヒドロキ シル基を有する粒状物質である、上記第２項記載の方法。 ４、前記固相の抽出物質は再水和シリカゲルである、上記第３項記載の方法。 ５、前記核酸はＤＮＡを含有する、上記第１項記載の方法。 ６、前記核酸はＤＮＡを含有する、上記第２項記載の方法。 ７、前記核酸はＤＮＡを含有する、上記第３項記載の方法。 ８、前記核酸はＤＮＡを含有する、上記第４項記載の方法。