FI95270C - Menetelmä nukleiinihappojen puhdistamiseksi - Google Patents

Description

95270

Menetelmä nukleiinihappojen puhdistamiseksi

Keksinnön tausta Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää kiinteää faasia olevien uuttoaineiden käyttämiseksi nukleiinihapponäytteiden puhdistamiseen, joissa on epäpuhtautena proteiinimais-ta ainetta.

Tausta 10 T. Maniatis et ai. [Molecular Cloning - A Labora tory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), ss. 458 - 460] kuvaavat menetelmän nukleiinihappojen puhdistamiseksi, joka perustuu menetelmiin, joita ovat kuvanneet K.S. Kirby [Biochim. J. 66 (1957) 494 - 504] ja 15 J. Marmur [J. Mol. Biol., 3 (1961) 208 - 218]. Tässä menetelmässä käytetään fenolia neste/nesteuuttomenettelyssä, jonka avulla vesipitoisessa nukleiinihapponäytteessä epäpuhtautena oleva proteiini uutetaan fenolifaasiin, jolloin nukleiinihappo jää vesifaasiin. Tämä nukleiinihappojen 20 puhdistusmenetelmä voi itse asiassa käsittää sarjan nes-te/nesteuuttoja, jossa vesipitoisen nukleiinihapponäyte-liuoksen tilavuusmäärää uutetaan peräkkäin yhtä suurilla tilavuuksilla nesteytettyä fenolia, fenoli/kloroformi/iso-amyylialkoholia (50/48/2) ja kloroformi/isoamyylialkoholia ’ 25 (96/4). Kunkin uuton jälkeen proteiinin (ja jonkin verran nukleiinihappoa) sisältävää orgaanista faasia takaisin-uutetaan vesipitoisella puskuriliuoksella kaiken orgaaniseen faasiin uuttuneen nukleiinihapon saamiseksi takaisin. Vesipitoista nukleiinihapponäytettä täytyy sitten uuttaa 30 perusteellisesti dietyylieetterillä kaiken jäljellä olevan ; fenolin, kloroformin tai isoamyylialkoholin poistamiseksi.

Lopuksi jäljellä oleva dietyylieetteri poistetaan joko alennetussa paineessa tai puhaltamalla typpeä näytteen yli kymmenen minuutin ajan. Orgaanisten liuottimien jäänteiden 35 poistaminen on erittäin tärkeää, koska ne muuten häiritse-

II

95270 2 vät myöhemmin kloonaus- tai hybridisaatiomenetelmää, joissa nukleiinihappoa voitaisiin käyttää.

Vaikka fenoliuutto on hyvin tehokas menetelmä nuk-leiinihapponäytteiden puhdistamiseksi ja sitä käytetään 5 hyvin laajasti, menetelmä on myös työteliäs ja aikaa vievä. Tämän tekniikan muita haittoja ovat vaarat (kemiallinen ärsyke, karsinogeeni, löyhkä ja tulenarkuus), jotka liittyvät orgaanisten liuottimien (fenoli, kloroformi, isoamyylialkoholi ja dietyylieetteri) käyttöön.

10 Toinen menetelmä nukleiinihappojen puhdistamiseksi perustuu nukleiinihappojen valikoivaan adsorptioon käyttäen NENSORB 20™ -nukleiinihappojen puhdistuspakkauksia (DuPont). Proteiinipitoisen DNA-näytteen annetaan kulkea jossa on NENSORB™-hiukkasia sisältävän pylvään lävitse, 15 jolloin DNA sitoutuu hiukkasiin ja suurin osa proteiini-maisesta aineesta huuhtoutuu pylväästä vesipitoisella puskuriliuoksella. Sitoutunut nukleiinihappo desorboidaan sitten hiukkasista johtamalla 20-%:ista etyylialkoholin vesiliuosta (tai 50-%:sta metyylialkoholin vesiliuosta) 20 pylvään lävitse, ja DNA kootaan pylvään effluentista. Ennen DNA:n käyttöä kloonauksessa tai hybridisaatiossa alkoholi täytyy poistaa DNA-liuoksesta vetämällä tyhjöä näytteen ylle useiden tuntien ajan.

NENSORB™:in käytöllä on muita rajoituksia. Sen li-25 säksi että NENSORB™-aine sitoo nukleiinihappoa, se sitoo myös proteiinia vaihtelevassa määrin. Tämä ei ainoastaan rajoita kykyä sitoa nukleiinihappo kvantitatiivisesti näytteestä, jossa on runsaasti proteiinimaista ainetta epäpuhtautena (esim. veren seerumi, kudoshomogenaatti), 30 vaan sen johdosta on myös mahdollista, että jonkin verran ; heikosti sitoutunutta proteiinia voi eluoitua nukleiiniha pon kanssa, kun viimeksi mainittu desorboidaan NENSORB™:ista käyttäen vedellä laimennettua alkoholia.

Tarvitaan kolme erilaista liuotinta NENSORB™-pylvään akti-35 voimiseksi, sitoutumattoman proteiinin pesemiseksi pyi- 95270 3 väästä ja sitten nukleiinihapon eluoimiseksi pylväästä. Nukleiinihappo eluoidaan pylväästä liuottimessa (20-%:inen etyylialkoholi tai 50-%:inen metyylialkoholi), joka on yhteensopimaton nukleiinihapon myöhempien käyttöjen ohjel-5 missä (esim. kloonaus, hybridisaatiokokeet jne.). Puhdistusmenetelmä käyttäen NENSORB™:ia voi olla aikaa vievä vaatien tunnin tai kauemmin yhden ainoan nukleiinihappo-näytteen puhdistamiseen.

C.A. Thomas et ai., Analytical Biochemistry 93 10 (1979) 158 - 166, esittelevät lasikuitusuodattimien käytön « proteiinin ja proteiini-DNA-kompleksien adsorboimiseksi vesipitoisista DNA-näytteistä. Tämä menetelmä kärsii seu-raavista haitoista: 1) DNA:n vesipitoisen näytteen täytyy sisältää vähintään 300 mM NaCl:a, jotta proteiini sitou-15 tuisi tehokkaasti lasikuitusuodattimeen. Tämä suhteellisen suuri suolapitoisuus pitäisi pienentää poistamalla suola DNA-näytteestä (tai laimentamalla liuos) ennen DNA:n jatkokäyttöä biologisissa reaktioissa, kuten DNA:n pilkkomisessa restriktioentsyymin avulla. 2) DNA:n takaisinsaanti -20 nen suodattimelta on hyvä vain, jos suodatin pestään perusteellisesti vesipitoisella puskuriliuoksella. 3) Lasikuitujen pieni ominaispinta-ala (noin 2 m2/g) johtaa lasi-kuitusuodattimen vähäiseen proteiinin sidontakapasiteet-tiin. Proteiinin maksimisidontakapasiteetin arvioidaan 25 olevan 8,5 mg naudan seerumin albumiinia (BSA) grammaa kohti lasikuitusuodatinta.

B. Vogelstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 26(2) (1979) 615 - 619, esittelevät menetelmän DNA:n erottamiseksi agaroosista sitomalla DNA lasiin, edullisesti 30 lasijauheeseen, Nai:n läsnä ollessa. DNA poistetaan lasis-; ta eluoimalla liuoksella Tris*HCl, pH 7,2/0,2 M NaCO/2 mM

EDTA. Esitetään myös, että silikageeli ja huokoiset lasi-helmet ovat DNA:n puhdistamiseen sopimattomia.

J. Kirkland, J. Chromatographic Sei. 9 (1971) 206 -35 214, esittelee muunnetun pinnan omaavien silikageelien 11 95270 4 valmistuksen antamalla silaanireagenssien reagoida Zipax™-kontrolloidun pinnan omaavan kromatografiakantajan huokoisen kuoren pinnan kanssa.

J. Kohler et ai., J. Chromatography 385 (1987) 5 125 - 150, esittelevät hydroksyloidun, kalsinoidun piidi oksidin valmistamisen liuottamalla ja uudelleensaostamal-la piihappoa.

T. Watanabe et ai., J. Solid-Phase Biochem. 3 (1978) 161 - 173, esittelevät immobilisoitujen tanniinien 10 valmistuksen proteiinien adsorptiota varten.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota parannettu kiinteää faasia käyttävä uuttomenetelmä proteiinimaisten epäpuhtauksien poistamiseksi nukleiinihapponäytteistä. Menetelmän pitäisi kyetä poistamaan suuria proteiiniosuuksia 15 hyvin pienistä määristä nukleiinihappoa ja saamaan viimeksi mainittu takaisin biologisesti aktiivisessa tilassa. Menetelmän pitäisi myös olla nopea ja helppo ja tarjota nukleiinihapon kvantitatiivinen takaisinsaanti sekä minimoida vaarallisten aineiden käyttö. Sen ei pitäisi myös-20 kään lisätä nukleiinihapponäytteeseen saasteita tai epäpuhtauksia, jotka voivat häiritä nukleiinihapon myöhemmissä käytöissä.

Keksinnön yhteenveto

Menetelmässä proteiinimaisten aineiden erottamisek-25 si nukleiinihapoista liuos, joka sisältää proteiinimaista materiaalia ja nukleiinihappoa, saatetaan kosketukseen kiinteää faasia olevan uuttoaineen kanssa, joka kykenee sitomaan proteiineja, jolloin muodostuu sitoutunut ja sitoutumaton fraktio, ja eristetään sitten nukleiinihapot 30 sisältävä sitoutumaton fraktio.

!. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Kiinteää faasia olevat uuttoaineet, jotka ovat hyödyllisiä vaatimusten kohteena olevassa menetelmässä proteiinien ja nukleiinihappojen erottamiseksi, ovat hiukkas-35 maisia kiinteitä aineita, joilla on hyvin suuri affini- 95270 5 teetti proteiinimaisia aineita kohtaan ja hyvin pieni affiniteetti nukleiinihappoja kohtaan. Kiinteää faasia oleville uuttoaineille ovat tunnusomaisia suuret ominaispin-ta-alat, joissa on suuria lievästi happamien pinta-hydrok-5 syyliryhmien pitoisuuksia ja alhaisia monivalenssisten kationilajien pitoisuuksia pinnassa.

Kiinteää faasia olevat uuttoaineet, jolla on suuret ominaispinta-alat, ovat edullisia, koska niillä on kyky poistaa suuria määriä proteiineja. Edullisesti uuttoaineen 10 ominaispinta-ala on vähintään 50 m2/g; edullisemmin se on vähintään 100 m2/g. Nämä suuret pinta-alat johtuvat huokosten läsnä olosta kaikilla hiukkasmaisessa aineessa. Huokosten tulisi olla keskiläpimitaltaan > 6 nm (60 A), ja vaikka huokosten läpimitalla ei ole ylärajaa, kohtuullista 15 rajaa 50 nm (500 A) pidetään edullisena suuren ominaispin-ta-alan säilyttämiseksi. Edullisimpana pidetty alue on 6 -15 nm (60 A - 150 A).

Lievästi happamien hydroksyyliryhmien suuret pitoisuudet uuttoaineen pinnalla auttavat sekä suurentamaan 20 uuttoaineen affiniteettia proteiinimaisia yhdisteitä kohtaan että vähentämään sen affiniteettia polyanioneja, kuten nukleiinihappoja, kohtaan. Lievästi happamien hydroksyyliryhmien pienin tehokas pitoisuus on 0,1 pmol/m2. Edullisesti lievästi happamien hydroksyyliryhmien pitoisuus on 25 1-8 pmol/m2; edullisemmin se on 8 pmol/m2.

Pinnan hydroksyyliryhmien pK on edullisesti 6:n ja 10:n väliltä.

Monivalenssisten kationilajien pitoisuus kiinteää faasia olevan uuttoaineen pinnalla tulisi minimoida, jotta 30 ehkäistäisiin pinnan kationilajeja sitomasta anionisia !, nukleiinihappoja komplekseiksi. Kolmivalenssiset metallit, kuten rauta ja alumiini, ovat erityisen vahingollisia uut-toaineiden suorituskyvylle.

Kiinteää faasia olevia uuttoaineita, joilla on yllä 35 tarkastellut toivottavat ominaisuudet, voidaan valmistaa 11 95270 6 monilla tavoilla käyttäen joka homogeenista hiukkasmaista ainetta tai ydinhiukkasainetta, jonka pinnalle halutut funktionaaliset osat lisätään kemiallisten reaktioiden avulla. Ensin mainittua tapausta varten uudelleenhydratoi-5 tuneen silikageelin on todettu omaavan halutut ominaisuudet. Silikageeli omaa luonnostaan suuren pintapopulaation (8 pmol/m2) lievästi happamia (6 < pKa < 10) hydroksyyli-ryhmiä ja täyttää siten yllä esitetyt päävaatimukset. Se on myös hyvin tehokas adsorboimaan proteiinimaista ainet-10 ta. Silikageelin pinta täytyy kuitenkin vapauttaa moniva-lenssisista kationilajeista, jos on tarkoitus estää nukleiinihappoja adsorboitumasta piidioksidihiukkasten pinnalle. Tämä voidaan suorittaa useilla tavoilla.

Edullisin menetelmä käsittää piidioksidihiukkasen 15 pintakerroksen uudelleenhydroksyloinnin ja puhdistamisen liuottamalla ja uudelleen saostamalla hiukkasten pintakerros Kohlerin et ai. mukaan, J. Chromatography, 385 (1987) 125 - 150. Tässä menetelmässä piidioksidihiukkasten ulkopinta liuotetaan laimeassa fluorivetyhappoliuoksessa koho-20 tetussa lämpötilassa. Liuennut piidioksidi seostetaan sitten uudelleen kunkin hiukkasen pinnalle antamalla liuenneen piidioksidin sisältävän liuoksen jäähtyä huoneenlämpötilaan, jossa liukoisuus vesipitoisiin väliaineisiin on vähäisempi. Kerrosten uudelleensaostuessa piidioksidin 25 liuotetussa ulkokerroksessa läsnä olleet epäpuhtaudet jäävät liuokseen, ja oleellisesti puhdas piidioksidikerros muodostuu ydinhiukkasen ympärille.

Vaihtoehtoisesti monivalenssisia metalliepäpuhtauk-sia voidaan uuttaa piidioksidista käsittelemällä sitä pe-30 räkkäin kohtalaisen väkevällä kloorivety- ja typpihapolla 1 kohotetuissa lämpötiloissa. Tämä menetelmä liuottaa ja uuttaa silikageelihiukkasten pinnalla olevia metalliepä-puhtauksia jättäen pinnan, joka on oleellisesti puhdasta piidioksidia.

35 Kolmas menetelmä kiinteää faasia olevan uuttoaineen valmistamiseksi on polymeroida paksu kerros orgaanista 95270 7 ainetta, joka sisältää suuren määrän lievästi happamia hydroksyyliryhmiä, huokoisen tukiaineen pinnalle. Tämä voidaan tehdä antamalla orgaanisen silaanin, joka sisältää halutun kemiallisen funktionaalisuuden, reagoida piidiok-5 sidin kanssa, jolloin silaani ristikytkeytyy itsensä ja piidioksidihiukkasten kanssa muodostaen paksun, liikkumattomaksi kiinnitetyn kerroksen orgaanista polymeeriä [J. Kirkland et ai., J. Chromatographic Sei., 9 (1971) 206 -214], joka sisältää halutun joukon lievästi happamia hyd-10 roksyyliryhmiä. Samalla kun hydroksyyliryhmät antavat pinnalle kyvyn adsorboida suuria määriä proteiinimaista ainetta, ne myös suojaavat nukleiinihappoja kaikilta ydin-hiukkasessa orgaanisen polymeerikerroksen alla olevilta monivalenssisilta kationilajeilta ja siten estävät nuk-15 leiinihappoa sitoutumasta kiinteää faasia olevaan uuttoai-neeseen. Lukuisia orgaanisia silaaneja voitaisiin käyttää tässä reaktiossa. Esimerkiksi silaanien käyttö fenolin (pKa = 9,9), beeta-naftolin (pKa 9,6) tai tanniinin (po-lyhydroksikarboksyylihappoja) immobilisoimiseksi tukihiuk-20 kasten pinnalle tarjoaisi hyödyllisiä kiinteää faasia olevia uuttoaineita. Hyödyllisiä tukiaineita voivat olla piidioksidi, selluloosa, agaroosi ja muut aineet, jotka omaavat suuren määrän aktiivisia pintaryhmiä.

Käytettiinpä mitä tahansa menetelmää kiinteää faa-25 siä olevan uuttoaineen valmistamiseksi, voidaan soveltaa vähintään kahta ohjelmaa sen käyttämiseksi proteiinimaisen kontaminaation poistamisessa nukleiinihapponäytteistä. Ensimmäisen ohjelman mukaan tietty määrä hiukkasmaista, kiinteää faasia olevaa uuttoainetta lisätään näytetilavuu-30 teen, josta on tarkoitus poistaa proteiini. Seosta sekoi-! tetaan varovasti hiukkasmaisen aineen pitämiseksi suspen- t siossa. Kiinteää faasia olevan uuttoaineen pienen koon ja suuren pinta-alan johdosta proteiinimaisen aineen diffuusio ja adsorptio kiinteää faasia olevaan uuttoaineeseen on 35 nopea (minuuttien luokkaa). Adsorboituneen proteiinin sisältävä hiukkasmainen aine erotetaan sitten nukleiinihap-

II

Γ Γ / 70 8 ponäytteen vesiliuoksesta käyttäen mitä tahansa sopivaa keinoa, esim. sentrifugointia tai suodatusta. Tämä ohjelma on erittäin tehokas, kun suuri tilavuusmäärä (> 1 ml) näytettä sisältää pieniä määriä proteiinia, ja siten vaadi-5 taan ainoastaan pieni määrä hiukkasia (esim. < 10 mg) proteiinin poistamiseksi kvantitatiivisesti.

Toisessa ohjelmassa kiinteää faasia oleva uuttoaine pakataan kolonniin, ja näytteen vesiliuoksen annetaan kulkea kolonnin lävitse. Tämän toteuttamiseksi tietty määrä 10 hiukkasia punnitaan pyörityskolonniin ja pakataan kopaut-telemalla kolonnin suljettua päätä työpöydän pintaan. Kolonnia voidaan myös pyörittää suurella nopeudella sentri-fugissa; keskipakovoima pakkaa hiukkaset tiukasti kolonnin pohjalle. Kolonni kostutetaan sitten pipetoimalla tietty 15 määrä sopivaa puksuriliuosta (tilavuusmäärä, joka on vähintään yhtä suuri kuin kolonnissa olevien hiukkasten tilavuus) kolonnin yläpäähän, ja puskuriliuoksen annetaan sitten vajota kolonnin täytteeseen. Ylimääräinen puskuri-liuos poistetaan sitten kolonnin täytteestä pyörittämällä 20 kolonnia suurella nopeudella sentrifugissa noin 30 sekunnin ajan. Kaikki kolonnin täytteestä eluoitunut puskuri-liuos heitetään pois. Kolonni on nyt valmis vastaanottamaan nukleiinihapponäytteen, josta on tarkoitus poistaa proteiini; näyte pipetoidaan kolonnin päähän ja sen anne-25 taan valua kolonnin täytteeseen, jossa proteiinimainen aine sitoutuu hiukkasiin ja nukleiinihapot jäävät liuokseen. Kolonnia pyöritetään seuraavaksi suurella nopeudella sentrifugissa nukleiinihapot sisältävät vesifaasin eluoi-miseksi keräysputkeen. Nukleiinihapon takaisinsaanti ko-30 lonnista on tyypillisesti > 80 % kolonniin lisätystä mää-’ rästä. Takaisinsaantia voidaan parantaa noin 95-%:iseksi, jos pieni tilavuusmäärä (tyypillisesti 1/3 - 1/2 siitä näytteen tilavuudesta, joka alunperin lisättiin kolonniin) sopivaa puskuriliuosta pipetoidaan kolonnin päähän ja aje-35 taan läpi pyörittämällä suurella nopeudella sentrifugissa.

Tämä huuhtoo mahdollisen loukkuun jääneen nukleiinihapon 95270 9 kolonnin täytteen lävitse, ja tämä pesuliuos tulisi lisätä kolonnin effluenttiin, joka sisältää suurimman osan nukleiinihaposta. Tämä ohjelma on käyttökelpoisin sellaisia näytteitä varten, jossa on epäpuhtautena runsaasti pro-5 teiinimaista ainetta, jolloin on välttämätöntä käyttää suurta määrää hiukkasia (suhteessa näytteen tilavuuteen). Tämä ohjelma on myös hyödyllinen, kun hyvin pienestä tila-vuusmäärästä näytettä (esim. 50 μΐ) täytyy poistaa proteiini ja edullisen menetelmän suorittaminen olisi hanka-10 laa.

Voidaan asettaa useita rajoituksia niiden puskuri-liuosten luonteelle, joita käytetään aikaisemmin pääpiirteittäin esitetyissä kolonninkostutusvaiheessa ja kolonnin pesuvaiheessa. Puskuriliuoksen kemiallinen luonne ei näytä 15 olevan merkitsevä, vaikka monivalenssisten metallikatio- nien, esim. Ai:n, Fe:n, Ti:n jne., suolojen käyttöä tulisi välttää. Yleiset biokemialliset puskuriliuokset, kuten TE (10 mM Tris^HCl, 1 EDTA, pH 6,75), STE (10 mM Tris*HCl, 100 Mm NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,0) tai PBS (120 mM NaCl, 20 2,7 mM KC1, 10 mM fosfaatti, pH 7,4) ovat hyvin käyttökel poisia. Yleensä puskuriliuoksen pH-arvon tulisi olla väliltä 6 - 7,5; alemmilla pH-arvoilla nukleiinihappo voi sitoutua kiinteää faasia olevaan uuttoaineeseen, mikä johtaa vähentyneisiin takaisinsaamisiin, kun taas korkeammil-25 la pH-arvoilla tukiaine voi liueta, koska silikageelin liukenevuus emäksisiin liuoksiin on merkittävä. Lisäksi jos nukleiinihapponäytteen pH on yllä olevan alueen ulkopuolelta, se täytyy neutraloida pH-arvoon 6-7,5 ennen sen lisäämistä kolonniin proteiinin poistamista varten.

30 Kaikkien puskuriliuosten ja näytteiden edullisimpana pi-; detty pH-alue olisi väliltä 6,5 - 7,0.

Kiinteää faasia olevan uuttoaineen huokosten läpimitan tulisi olla riittävän suuri salliakseen proteiinien sisääntulon, niin että ne voivat adsorboitua sisähuokosten 35 pinnalle. Tämä maksimoi tukiaineen kapasiteetin poistaa proteiinia näytteistä. Huokosten täytyy myös olla riittä- li 95270 10 vän suuria, niin että estetään nukleiinihapon jääminen loukkuun huokostilavuuteen. On todettu, että huokosten minimiläpimitat, jotka ovat suunnilleen 6 - 15 nm (60 -150 A), tarjoavat vaaditut ominaisuudet. Huokosen läpimi-5 talle ei ole kriittistä ylärajaa, vaikka hiukkasen huokosten läpimitan suurentuessa ominaispinta-ala pienenee. Siten voidaan määritellä kohtuullinen yläraja 30 - 50 nm (300 - 500 A). Hiukkasilla, joiden huokosten läpimitat ovat suurempia kuin tämä raja, on pienentynyt pinta-ala ja 10 sen johdosta pienentynyt proteiinin sitomiskapasiteetti.

Kiinteää faasia oleva uuttoaine on hyödyllinen proteiinista koostuneiden epäpuhtauksien poistamiseksi laajasta valikoimasta nukleiinihapponäytteitä. Osoitettuja käyttöjä ovat entsyymien poistaminen restriktiopilkonta-15 seoksista, alkalisen fosfataasin poistaminen defosfory-lointireaktioseoksista ja kinaasi-entsyymien poistaminen merkitsemisreaktioseoksista. Odotetaan, että muita tavallisia entsyymejä, kuten käänteiskopioija, DNA-polymeraasi, DNA-ligaasi ja terminaalinen transferaasi, joita käytetään 20 yleisesti molekyylibiologiassa, voitaisiin myös poistaa nukleiinihapponäytteistä sopivissa koeolosuhteissa.

Lisäksi kiinteää faasia oleva uuttoaine on hyödyllinen nukleiinihappojen eristämiseksi ja puhdistamiseksi lukuisista biologisista näytteistä. Aineen on osoitettu 25 sopivan DNA:n puhdistamiseen kokoverinäytteissä olevista organismeista; odotetaan, että samankaltaiset eristykset muista kliinisesti kiinnostavista näytteistä, kuten ysköksestä, virtsasta, ulosteista ja kudoksesta, olisivat mahdollisia, sen jälkeen kun sopiva puhdistamisohjelma on 30 kehitetty. Tällaisia puhdistettuja nukleiinihapponäytteitä λ pitäisi voida suoraan käyttää kliinisissä hybridisaatioko- keissa. Lisäksi kiinteää faasia olevan uuttoaineen pitäisi olla hyödyllinen nukleiinihappojen eristämisessä ja puhdistamisessa organismeista, joita on kasvatettu viljelyai-35 neissa nimenomaan DNA:n tuottamiseksi kloonaustarkoituksia tai muita geeniteknologian käyttöjä varten.

95270 11

Kiinteää faasia oleva uuttoaine on hyödyllinen proteiinista koostuneiden epäpuhtauksien poistamiseksi laajasta valikoimasta nukleiinihappoja. Esimerkiksi ainetta voidaan käyttää sellaisten kinaasi-entsyymien poistami-5 seen, joita käytetään mononukleotidien, kuten dATP:n, dCTP:n jne., radioaktiivisuudella merkitsemiseen. Ainetta on myös käytetty alkalisen fosfataasin poistamiseen seoksesta, jossa on DNA:ta, jonka pituus vaihtelee 125 emäspa-rin (bp) ja 21 226 emäsparin väliltä. Ainetta on käytetty 10 laajasti pBR322-DNA:n (4 362 emäsparia) yhteydessä. Lisäksi ainetta on käytetty ehyen lambda-DNA:n (49 000 emäsparia) yhteydessä, eikä tämän DNA:n pilkkoutumista mekaanisen leikkaamisen vaikutuksesta havaittu. Suuremmat DNA-säikeet voivat olla alttiita pilkkoutumiselle leikkausvoi-15 mien vaikutuksesta niiden kulkeutuessa faasia olevaa uut-toainetta sisältävän kolonnin lävitse, vaikka tätä ei tiedetä varmasti. Tämä ongelma voitaisiin minimoida käyttämällä suurempaa hiukkaskokoa kiinteää faasia olevan uutto-aineen valmistamiseen vähentäen siten leikkausvoimia ko-20 lonneissa, jotka on pakattu tällaisilla hiukkasilla.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä proteiinien poistamiseksi nukleiinihappoja sisältävistä näytteistä on seuraavat edut verrattuna nykyään käytettäviin menetelmiin: 25 1. Koska kiinteää faasia oleva uuttoaine on sopi viin vesipuskuriliuoksiin oleellisesti liukenematonta, se ei liukene nukleiinihapponäytteeseen, ja siten myöhempiä menettelyjä (esim. uuttoja) sen poistamiseksi ei tarvita kuten fenoli/kloroformiuutoissa.

30 2. Nukleiinihappo eluoidaan vesiväliaineessa, joka 1/ on oleellisesti identtinen (proteiinien poistoa lukuunot tamatta) sen väliaineen kanssa, jossa se lisättiin pylvääseen. Siten nukleiinihappo on liuottimessa, joka sopii yhteen myöhempien biologisten menetelmien kanssa, joissa 35 sitä käytetään. Mitään epäpuhtauksia (s.o. fenolia, kloroformia, etanolia jne.) ei ole läsnä, jotka inhiboisivat

II

95270 12 tai deaktivoisivat entsyymejä, joita käytetään myöhemmissä biologisissa menetelmissä.

3. Puhdistamisohjelman suorittaminen käyttäen tätä ainetta vaatiin 5-10 minuuttia yhtä näytettä varten, kun 5 taas menetelmät, jotka perustuvat fenoli/kloroformiuuttoi-hin tai NENSORB™:iin, voivat vaatia yhden tunnin tai enemmän. Lisäksi lisänäytteiden käsittely vaatii kaksi minuuttia näytettä kohti.

4. Tämä menetelmän suorittamiseen ei vaadita mitään 10 erikoisia reagensseja. TE (pH 6,75) on hyväksyttävä puskuriliuos kolonnin kostuttamista ja pesua varten, ja tätä puskuria on saatavissa kaikissa laboratorioissa, joissa työskennellään nukleiinihappojen kanssa. Lisäksi vältetään myrkyllisten tai vaarallisten reagenssien tarve.

15 5. Nukleiinihappojen takaisin saaminen on hyvä, tyypillisesti 80 - 95 %.

6. Toisin kuin puhdistusmenetelmät, jotka perustuvat DNA:n adsorptioon tukiaineeseen, tämä menetelmä ei leikkaa suuria DNA-palasia. Siten säilytetään näytteen 20 eheys. DNA:n leikkautuminen on mahdollista menetelmissä, jotka perustuvat nukleiinihapon adsorptioon kiinteää faasia olevaan aineeseen, koska pitkien DNA-palasten tapauksessa (esim. 10 kiloemäsparia tai enemmän) DNA-säikeen kaksi päätä voivat adsorboitua kahteen eri hiukkaseen sa-25 manaikaisesti, ja kun sekoitetaan, kyseiset kaksi hiukkasta liikkuvat eri suuntiin ja vetävät DNA-säikeen kahdeksi pienemmäksi palaseksi. Koska tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä DNA ei adsorboidu kiinteään faasiin (sen sijaan proteiini adsorboituu), tämä DNA:n pilkkoutuminen ei 30 ole mahdollista.

I Seuraavien esimerkkien on tarkoitus valaista kek- sintöä.

Es imerkkejä

Yleisiä menetelmiä ja reagensseja 35 pBR322-DNA ja PST-restriktioentsyymi hankittiin toiminimeltä Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J. 10X PST- 95270 13 restriktiopilkontapuskuriliuos sisältää 500 mM NaCl:a, 100 mM Tris*HCl:a pH 7,5, 100 mM MgCl2:a ja 10 mM ditio-treitolia. Vasikan suolen alkalinen fosfataasi hankittiin toiminimeltä Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapo-5 lis, IN. BCIP (5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti) hankittiin laboratoriolta Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD.

Esimerkki 1

Silaanilla käsitellyn silikageelin valmistus ja 10 käyttö A. Piidioksidikantaja-aineen valmistus

Fractosil 500 (20,5 g, E. Merck, Darmstadt, Länsi-Saksa) pestiin kolmella 100 ml:n erällä 25-%:ista (tila-vuus/tilavuus) typpihappoa huoneenlämpötilassa suspendoi-15 maila piidioksidihiukkasia 10 minuutin ajan hapon vesi-liuokseen ja dekantoimalla sitten hapon ylimäärä sen jälkeen, kun hiukkaset olivat laskeutuneet dekantterilasin pohjalla. Hapolla käsiteltyjä hiukkasia huuhdeltiin perusteellisesti tislatulla, deionisoidulla vedellä, kunnes 20 supernatantti oli saavuttanut pH-arvon 5,5. Hiukkaset siirrettiin sitten biichnersuppiloon, johon oli sijoitettu keskinkertaisen huokoisuuden omaava suodatinpaperi, huuhdottiin erittäin puhtaalla metanolilla (3 X 100 ml) ja kuivattiin yhden tunnin ajan 80 eC:ssa (630 mm Hg).

25 B. Aminofenyylitrimetoksisilaanin polymerointi pii- dioksdikantaja-aineen pinnalle.

Aminofenyylitrimetoksisilaani (4,0 ml, Petrarch Systems, Inc., Bristol, PA) lisättiin tislattuun, deioni-soituun veteen (24 ml) ja isopropyylialkoholiin (12 ml) 30 pyörökolvissa, joka oli varustettu palautusjäähdyttäjällä ! ja magneettisekoitussauvalla. Tulokseksi saatua seosta sekoitettiin, kunnes silaani oli täysin liuennut. Hapolla pestyt piidioksidihiukkaset (6,1 g) lisättiin silaani-liuokseen, ja seosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 35 kahden tunnin ajan 81 °C:ssa. Jääetikkaa (3,5 ml) lisättiin kolviin, ja seosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen

II

95270 14 vielä tunnin ajan. Suspension annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, jonka jälkeen piidioksidihiukkaset olivat laskeutuneet kolvin pohjalle. Musta supernatantti dekan-toitiin pois, ja hiukkasia pestiin perusteellisesti kor-5 kealaatuisella metanolilla, kunnes pesuneste oli väritöntä. Aminofenyylillä derivatisoidut piidioksidihiukkaset koottiin sitten biichnersuppiloon, ja ilmaa vedettiin hiuk-kaskerroksen lävitse jäljellä olevan alkoholin poistamiseksi. Hiukkasia kuivattiin lisäksi keskivoimakkaan lampun 10 alla. Hiukkasten hiili- ja typpianalyysi osoitti, että paksu kerros hiilipitoista ainetta oli polymeroitunut pii-dioksidihiukkasten pinnalle (6,27 % C, 1,13 % N).

C. Silaanilla käsitellyn kantaja-aineen diatsotoin-ti 15 Aminofenyylillä derivatisoitu silikageeli (6,90 g) lisättiin jääkylmään liuokseen, jossa oli vettä (10,0 ml) ja väkevää rikkihappoa (7,0 g), ja hiukkaset suspendoitiin tähän liuokseen magneettisekoituksen avulla. Lopuksi murskattua jäätä (noin 17 g) lisättiin yllä olevaan seokseen, 20 ja sitten liuos, jossa oli natriumnitriittiä (2,24 g) vedessä (5,33 g), lisättiin tipoittain 8-10 minuutin ajan. Seoksen lämpötila pidettiin välillä 0 - 5 °C tänä aikana. Hiukkasten annettiin laskeutua ja sitten supernatantti dekantoitiin seoksesta. Hiukkaset pestiin sitten kolme • 25 kertaa suspendoimalla ne 100 ml:aan kylmää vettä, antamal la hiukkasten laskeutua ja dekantoimalla supernatantti. Tulokseksi saatuja hiukkasia, joissa pinnan amiinit on muutettu vastaaviksi diatsoniumsuoloiksi, käytettiin alla kuvatussa hydrolyysireaktiossa.

30 D. Diatsoniumsuolan hydrolyysi Väkevää rikkihappoa (32 ml) lisättiin veteen (24 ml), ja tämä seos kuumennettiin kiehuvaksi (noin 160 °C). Diatsoniumsuoloja sisältävät hiukkaset lisättiin hitaasti happoon ylläpitäen kiehumista, johon liittyi hil-35 littyä kuohumista diatsoniumsuolan hajoamisesta kehittyneen typpikaasun johdosta. Seosta keitettiin noin 5 mi- 95270 15 nuutin ajan, ja se pantiin sitten jäähauteeseen jäähtymisen nopeuttamiseksi. Hapan supernatantti dekantoitiin hiukkasilta, joita pestiin sitten tislatulla, deionisoi-dulla vedellä (5 x 200 ml). Hiukkaset koottiin biichnersup-5 piloon, joka oli varustettu keskinkertaisen huokoisuuden omaavalla suodatinpaperilla, ja huuhdottiin metanolilla (200 ml). Ilmaa vedettiin hiukkaskerroksen lävitse jäljellä olevan metanolin poistamiseksi, ja hiukkaset kuivattiin keskivoimakkaan infrapunalampun alla. Alkuaineanalyysi 10 paljasti, että hiukkaset sisälsivät 0,55 paino-% hiiltä ja vähemmän kuin 0,01 paino-% typpeä.

E. Proteiinin poistaminen käyttäen silaanilla käsiteltyä silikageeliä

Testattiin yllä osassa D kuvatun silaanilla käsi-15 tellyn silikageelin tehokkuus malliproteiinin (naudan seerumin albumiin, BSA) poistamisessa liuoksesta samoin kuin sen DNA:n (lohen maidin DNA) sitomatta jättäminen. BSA-näytteitä pantiin erilaisiin fosfaattipuskuriliuoksiin (pH = 5,0 - 7,0), näytteet sekoitettiin 250 mg:n kanssa 20 silaanilla käsiteltyä silikageeliä, ja sitten liuokset erotettiin silikageelistä pelletoimalla piidioksidihiukka-set sentrifugissa. Alkuperäinen puskuroitu proteiiniliuos ja suodos analysoitiin UV-absorbanssin avulla (200 -480 nm). UV-spektrien vertailu osoitti, että proteiinin • 25 poistaminen oli aina > 90-%:ista. Samanlainen testaus käyttäen lohen maidin DNA-näytteitä osoitti, että DNA:n takaisin saaminen oli aina > 85-%:ista.

Esimerkki 2

Nukleiinihappojen puhdistus käyttäen fluorivetyha-30 polla käsiteltyä silikageeliä v A. Uudelleenhydratoituneen silikageelin valmistus

Silikageeliä (14 g, PSM300 Zorbax, erä 9, DuPont) kuumennettiin kvartsiupokkaassa 975 °C:ssa kahden tunnin ajan muhveliuunissa, ja sitten 15 g jäähtynyttä silikagee-35 liä pantiin pyörökolviin, joka oli varustettu palautus-jäähdyttimellä. Tislattua, deionisoitua vettä (150 ml), 95270 16 joka sisälsi 75 miljoonasosaa HF:a, lisättiin kolviin ja seosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 110 °C:ssa 72 tunnin ajan. Seoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, ja sitten silikageeli pestiin 1 litralla tislattua, deio-5 nisoitua vettä. Silikageeliä keitettiin yön ajan vedessä (150 ml), pestiin peräkkäin vedellä (500 ml) ja asetonilla (300 ml) ja lopuksi kuvattiin 110 °C:ssa viiden tunnin ajan.

B. Uudelleenhydratoituneen silikageelin käyttö 10 Putkeen A lisättiin 1 pg (15 μΐ) pBR322-DNA:ta, 32 yksikköä (2 μΐ) PST-restriktioentsyymiä, 6 μΐ 10 x PST-restriktiopilkontapuskuriliuosta (alhaisen vahvuuden res-triktiopuskuriliuos) ja 37 μΐ vettä. Tämän putken sisältö sekoitettiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 1,25 tunnin ajan.

15 Putkeen B lisättiin täysin samat reagenssit kuin putkeen A. Kuitenkin välittömästi sekoittamisen jälkeen tämän putken sisältö pipetoitiin 60 mg fluorivetyhapolla käsiteltyä silikageeliä sisältävän pyörityskolonnin yläpäähän. Kolon-ni oli pakattu ja kostutettu 1 x PST-restriktiopuskuri-20 liuoksella välittömästi ennen näytteen lisäämistä. Näytteen annettiin vajota kolonnin täytteeseen, ja kolonnia pyöritettiin viiden minuutin ajan Eppendorf-sentrifugissa (malli 5412) ja effluentti koottiin. Näyte kolonnin eff-luentista poistettiin kolmanteen reaktioputkeen (putki C) 25 ja 1 μΐ (16 yksikköä) PST-restriktioentsyymiä lisättiin. Tämän putken sisältö sekoitettiin ja inkuboitiin 1,25 tunnin ajan 37 °C:ssa. Näytteet putkista A - C sekoitettiin sitten agaroosigeelin syöttöpuskuriliuokseen (0,25 % bro-mifenoli-sinistä, 0,25 % ksyleenisyanolia ja 30 % glysero-30 lia vedessä), ja osa kustakin lisättiin 0,7-%:iseen aga-roosielektroforeesigeeliin (0,105 g agaroosia, 14,8 ml TBE-puskuriliuosta, joka sisälsi 0,5 pg/ml etidiumbromi-dia) BioRad Mini-Cell Submarine -elekroforeesilaitteessa. Geelin ajo suoritettiin käyttäen 100 V:n jännitettä noin 35 neljän tunnin ajan 0,5X TPE-puskuriliuoksessa (0,5X TBE = 95270 17 0,0445 M Tris-boraatti, 0,0445 M boorihappo, 0,001 M EDTA, pH 8,0). Geelistä otettiin valokuvia käyttäen läpivalaisua 254 nm:n UV-valolla.

Linearisoitu DNA-palanen, jonka pituus vastasi li-5 nearisoitua pBR322-standardia, saatiin putkesta A, mikä osoittaa, että PST-restriktioentsyymi katkaisi rengasmaisen pBR322:n yhdestä kohtaa. Putkesta B saatu DNA kulkeutui rengasmaisena DNA:na; DNA-vyöhykettä ei havaittu geelin kohdassa, joka vastasi linerisoitua pBR322:ta, mikä 10 osoittaa, ettei entsyymi ollut katkaissut DNArta s.o. entsyymi oli poistettu kolonnin läpi johtamisen avulla. Linearisoitu DNA-palanen, jonka pituus vastasi linearisoi-dun pBR322-standardin pituutta, saatiin myös putkesta C, mikä osoittaa, että restriktioentsyymi kykeni katkaisemaan 15 DNA:n ja ettei DNA:n kulkeutuminen kolonnin lävitse muuttanut DNA:n biologista aktiivisuutta tai poistanut mitään välttämättömistä puskuriliuoksen komponenteista (esim. MgCl2); se poisti ainoastaan PST-restriktioentsyymin.

Tämä esimerkki osoittaa, että DNA:ta ja proteiineja 20 sisältävän näytteen kulkeminen uudelleenhydratoitunutta silikageeliä sisältävän pyörityskolonnin lävitse poistaa tehokkaasti nuo proteiinit, esim. PST-restriktioentsyymin, näytteestä. Se osoittaa myös, että DNA, joka on koottu kolonnista tullessaan effluentissa, on biologisesti aktii-·: 25 vista ja että kolonni ei lisää DNArhan epäpuhtauksia, jot ka inhiboisivat DNA:n muuntamiseen myöhemmin biologisissa reaktioissa käytettyjä entsyymejä.

Esimerkki 3

Eco Rl -restriktioentsyymin poistaminen 30 Esimerkissä 2 kuvattu menetelmä toistettiin käyttä- ·’ en Eco Rl -restriktioentsyymiä ja -puskuriliuosta (keski vahva puskuriliuos) PST-restriktioentsyymin ja -puskuri-liuoksen asemesta. Ainoastaan rengasmaista pBR322-DNA:ta havaittiin putkesta B saadussa kolonnin effluentissa, mikä 35 osoittaa, että seoksen kulkeminen kolonnin lävitse oli 95270 18 poistanut kaiken ECO Rl -restriktioentsyymin, ennen kuin se voi katkoa DNA:ta.

Esimerkki 4

Sal I -restriktioentsyymin poistaminen 5 Esimerkissä 2 kuvattu menetelmä toistettiin käyt täen Sal I -restriktioentsyymiä ja -puskuriliuosta (hyvin vahva puskuriliuos) PST-restriktioentsyymin ja -puskuri-liuoksen asemesta. Ainoastaan rengasmaista pBR322-DNA:ta havaittiin putkesta B saadussa kolonnin effluentissa, mikä 10 osoittaa, että seoksen kulkeminen kolonnin lävitse oli poistanut kaiken Sal I -restriktioentsyymin, ennen kuin se voi katkoa DNA:ta.

Esimerkki 5

Uudellenhydratoituneen silikageelin valmistus käyt-15 täen kloorivety- ja typpihappoa

Silikageeliä (PSM300 Zorbax, DuPont) kuumennettiin ensin 300 eC:ssa kahden tunnin ajan ja sitten 540 °C:ssa 21 tunnin ajan kvartsiupokkaassa muhveliuunissa. Kaksikymmentä grammaa tätä silikageeliä pantiin sitten peitettyyn 20 Teflon™-dekantterilasiin, joka sisälsi 500 ml 10-%:ista (tilavuus/tilavuus) kloorivetyhappoa, ja seosta kuumennettiin 100 °C:ssa neljän tunnin ajan. Seoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan useiden tuntien ajan, minkä jälkeen se suodatettiin. Silikageeli pestiin yhdellä lit-25 ralla tislattua, deionisoitua vettä ja siirrettiin sitten Teflon™-dekantterilasiin, joka sisälsi 500 ml 10-%:ista (tilavuus/tilavuus) typpihappoa. Seosta kuumennettiin 100 °C:ssa neljän tunnin ajan, sen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan ja sitten suodatettiin. Silikageeli pes-30 tiin yhdellä litralla vettä, ja sitten kloorivetyhappo- ja *, typpihappopesut toistettiin. Lopuksi silikageeliä kuumen nettiin tislatussa, deionisoidussa vedessä (500 ml) neljän tunnin ajan 100 eC:ssa, sen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, suodatettiin, pestiin tislatulla, deionisoidulla 35 vedellä (1,5 1), huuhdottiin asetonilla (300 ml) ja kuvattiin 110 °C:ssa.

95270 19

Osa tästä uudelleenhydratoituneesta silikageelistä testattiin DNA:n takaisin saamisen suhteen kuten on kuvattu esimerkissä 1; 87,2 % 1 pg:n DNA-näytteestä saatiin takaisin.

5 Esimerkki 6

Alkalisen fosfataasin poistaminen defosforylointi- reaktioseoksista

Linerisoitua DNA:ta (pBR322-DNA, jota oli pilkottu PST-restriktioentsyymillä) liuotettiin 80 pl:aan defosfo-10 rylointipuskuriliuosta (50 mM Tris*HCl, 1 mM EDTA, pH 8,2) ja 1 μΐ (0,5 yksikköä) vasikan suolen alkalista fosfataa-sia lisättiin. Seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Poistettiin 40 μ1:η näyte reaktioseoksesta, ja 7,6 μΐ 0,25 M HCl:a lisättiin näytteeseen pH-arvon säätä-15 miseksi 6,0:ksi. Neutraloitu näyte ajettiin sitten pyörittämällä 40 mg:n kolonnin läpi, jossa oli uudellenhydratoi-tunutta silikageeliä, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 2, ja joka oli ennalta pakattu ja kostutettu defos-forylointipuskuriliuoksella (pH 6,0).

20 Talteen saatu kolonnin effluentti analysoitiin sit ten aktiivisen alkalisen fosfataasin suhteen entsyymimää-rityksessä. Kolonnin effluenttiin lisättiin 10 μΐ 1 M Tris*HCl:a (pH 8,0) pH-arvon säätämiseksi 7,8:ksi. Näyte lisättiin sitten 100 pl:aan koepuskuriliuosta, joka sisäl-v 25 si 0,1 M Tris*HCl:a, pH 9,5, 0,1 M NaCl:a, 50 mM MgCl2:a ja 0,22 pg/ml BCIP:tä, joka on alkalinen fosfataasi -entsyymin väritön substraatti, jonka entsyymi muuttaa värilliseksi tuotteeksi. Määritysreaktion annettiin tapahtua kahden tunnin ajan, ja sitten liukenematon värillinen tuote 30 koottiin läpimitaltaan 2 mm oleville suodattimille.

*. Kontrollireaktioissa, jotka sisälsivät 0,25 yksik köä aktiivista alkalista fosfataasia, saatiin hyvin voimakkaita sinisiä värejä. Laimennokset, joissa oli 0,0025 ja 0,00025 yksikköä alkalista fosfataasia, tuottivat myös 35 siniset värit. Sinistä saostumaa ei tuottanut näkyviin kolonnin effluentti, joka alunperin ennen kolonnin läpi 95270 20 kulkemista sisälsi 0,25 yksikköä, mikä osoittaa, että ko-lonni poisti vähintään 99,99 % alkalisesta fosfataasista näytteestä sen kulkiessa pylvään lävitse. Entsyymin täydellisen poistumisen varmistamiseksi on tarpeellista tehdä 5 alkalisen fosfataasin defosforylointiseos happamaksi ennen sen kulkemista kolonnin lävitse. pH-arvossa 8,2 ainoastaan 99,9 % entsyymistä poistui.

Samanlaisessa kokeessa viiteen yksikköön saakka alkalista fosfataasia poistettiin > 99,9 %:n tehokkuudella 10 käyttämällä yllä kuvattua menetelmää.

Esimerkki 7

Bakteeri-DNA:n puhdistaminen kokoverestä

Ihmisen kokovereen, joka oli koottu terveiltä luovuttajilta, lisättiin E. coli -bakteereja, joiden DNA si-15 sälsi herpes simplex -virus-DNA-insertin (5 pg, New

England Nuclear Corp, Billerica, MA). Lisäyksen sisältävälle verinäytteelle (10 ml) suoritettiin lyysi Isolator™-putkessa (DuPont) veren punasolujen rikkomiseksi. Ehyet bakteerit eristettiin sitten kierrättämällä Isolator™-20 putkea sentrifugissa, jolloin muodostui 1,5 ml:n kerros bakteerisedimenttiä putken pohjalle, ja poistamalla super-natantti. Bakteerit hajoitettiin sitten 2-%:isessa nat-riumdodekyylisulfaatissa (SDS) 30 minuutin ajan 65 eC:ssa. Verinäytteestä saatuja bakteereja kuumennettiin 100 eC:ssa 25 10 minuutin ajan pääosan proteiinimaisesta aineesta koagu- loimiseksi. Koagulaattia laskeutettiin sitten sentrifugissa 10 minuutin ajan, ja supernatantti otettiin talteen. Koaguloitunut massa hajotettiin sitten tislatussa vedessä (1 ml) kaiken DNA:n pesemiseksi massasta, ja sentrifugoin-30 nin jälkeen supernatantti otettiin talteen ja lisättiin alkuperäiseen supernatanttiin. Tämä menettely toistettiin sitten.

Tässä vaiheessa vapautettu bakteeri-DNA oli eristetty 4 ml:aan nestettä, joka sisälsi vielä huomattavan 35 määrän proteiinia (> 10 mg/ml), mitä osoitti ruosteenpunainen väri, jonka antoivat näytteelle jäljellä olevat 95270 21 hemiproteiinit (muiden muassa). Tämä jäljellä olevan proteiinin poistamiseksi näyte pantiin sellaisen pyöritysko-lonnin yläpäähän, joka oli pakattu uudelleenhydratoitu-neella silikageelillä (valmistettu kuten esimerkissä 2),

5 joka oli ennalta kostutettu 4 ml:11a TE -puskuriliuosta (pH 6,75). Näyte pantiin virtaamaan kolonnin täytteeseen alhaisen nopeuden sentrifugoinnin avulla, ja sitten sen-trifugi säädettiin suurelle nopeudelle DNA:n pakottamiseksi ulos kolonnista. Sen jälkeen kun effluentti oli koottu 10 (10 min), kolonni pestiin 1 ml:11a TE -puskuriliuosta (pH

6,75), ja pesuliuos lisättiin kolonnin effluenttiin. Puhdistettu DNA-näyte kuivattiin tyhjössä ja tutkittiin sitten standardihybridisaatiosuodatinkokeessa.

12 μΐ kumpaakin liuoksista 1 M NaOH ja 3 M NaCl 15 lisättiin kuivattuun DNA-näytteeseen, joka oli liuotettu 100 ml:aan TE -puskuriliuosta (pH 6,75). Näytettä kuumennettiin 95 °C:ssa 5 minuutin ajan DNA:n denaturoimiseksi, se jäähdytettiin ja sitä säilytettiin jään päällä uudel-leenhybridisoitumisen estämiseksi.

20 Osia denaturoidusta näytteestä sijoitettiin täplik si GeneScreen Plus™:lie (New England Nuclear), joka oli ennalta asennettu laitteeseen Hybridot Manifold (Bethesda Research Laboratory) ja kostutettu 5X SSC -puskuriliuoksella (0,75 M NaCl, 0,075 M natriumsitraatti, pH 7,0).

25 Näytteet vedettiin hitaasti suodattimen läpi käyttämällä tyhjöä, ja sitten näytetäpliä pestiin vetämällä 100 μΐ 3 M ammoniumasetaattia näytetäplien lävitse. Näytetäplät sisältävä suodatin poistettiin täplityslaitteesta ja esihyd-ridisoitiin 30 minuutin ajan 50 °C:ssa 1 ml:ssa 0,5 M nat-30 riumfosfaattipuskuriliuosta (pH 7,0), joka sisälsi 2 mg/ml ·. sonikoitua lohen maidin DNA:a (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO) ja 1 % (paino/tilavuus) natriumdodekyylisul-faattia (SDS) (Sigma Chemical CO.): 32P:lla merkittyä pHSV106-DNA-koetinta (200 μΐ, 35 0,15 pg, Oncor, Inc., Gaithersburg, MD), joka oli komple mentaarinen E. coli -DNA:ssa olevalle HSV-DNA-insertille,

II

95270 22 lisättiin hybridisaatioseokseen. Suodatinta kuumennettiin 60 °C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin 60 °C:ssa kahdella 50 ml:n annoksella 0,1 M natriumfosfaattipuskuriliuosta (pH 7,0), joka sisälsi 1 % (paino/tilavuus) SDS:ää, kaiken 5 hybridi soi tumat toman DNA-koettimen poistamiseksi. Suodatin kuivattiin ilmassa huoneenlämpötilassa ja autoradiografoi-tiin yön ajan käyttäen Kodak RP -filmiä.

Tämän kokeen ja vastaavan kokeen, jossa käytettiin standardifenoliuuttomenetelmää, tulokset osoittavat, että 10 ehyttä, hybridisoituvaa DNA:a saatiin talteen pyöritysko-lonnista suurin piirtein samalla tehokkuudella kuin feno-liuutosta. Lisäksi nollakoeverinäytteistä (s.o., joihin ei ollut lisätty E. coli -DNA:ta), joiden annettiin kulkea pyörityskolonnien lävitse, ei saatu täpliä hybridisaatio-15 kokeessa, mikä osoittaa, ettei pyörityskolonneissa oleva uudelleenhydratoitunut silikageeli lisännyt häiriöitä tai epäpuhtauksia näytteeseen.

DNA:n takaisin saaminen erilaisista silikageeli-näytteistä 20 Taulukko osoittaa DNA-määrän, joka on saatu takai sin yhdeksän uudelleenhydratoituneen silikageelin näytteestä (näytteet A - I), neljästä käsittelemättömästä, kaupallisesti saatavissa olevasta silikageelistä (näytteet J - N) ja kahdesta uudelleenhydratoituneesta silikageelis-; 25 tä (näytteet 0 - P), joihin oli tarkoituksellisesti lisät ty epäpuhtauksiksi erilaisia metalleja.

23 95270

Taulukko

Kvartsi Takaisinsaatu DNA:n prosenttimäärä A 90,7 5 B 89,9 C 92,5 D 76,1 E 87,7 F 91,5 10 G 92,9 H 89,4 I 91,8 J 22,4 K 61,2 15 L 66,3 M 26,8 N 41,3 0 26,6 P 18,4 20 Näyte A = Zorbax™-piidioksidi (PSM2000, Du Pont), huokoskoko 20 nm (200 A), valmistettu esimerkin 2A mukaan.

B = Zorbax™-piidioksidi (PSM1000, Du Pont), huokoskoko 25 100 nm (1000 A), valmistettu esimerkin 2A mukaan.

C = Zorbax™-piidioksidi (PSM300, Du Pont), huokoskoko 30 nm (300 A), kuumennettu 925 °C:seen, sitten valmistettu esimerkin 2A mukaan.

D = Zorbax™-piidioksidi (PSM300, Du Pont), huokoskoko 30 30 nm (300 A) kuumennettiin 850 °C:seen, sitten valmistettu esimerkin 2A mukaan.

E, F = Zorbax™-piidioksidi (PSM300 Du Pont), huokoskoko 30 nm (300 A) kuumennettiin 975 °C:seen, sitten valmistettiin esimerkin 2A mukaan.

35 G = Huokoskokoon 30 nm (300 A) omaava piidioksidi, joka on valmistettu tetraetyyliortosilikaatista.

li 95270 24 H, I * Fractosil™ 500 (E. Merck), käsitelty HCl/HN03:lla kuten on kuvattu esimerkissä IA.

j = Zorbax™-piidioksidi (PSM150, Du Pont), huokoskoko 15 nm (150 A) käsittelemätön 5 K = Vydac™-piidioksidi (erä 3 700, The Sep/a/ra/tions

Group, Hesperia, CA).

L = Fractosil™ 500 (E. Merck), käsittelemätön.

M = Nucleosil-100-S (Machery-Nagel, Länsi-Saksa), käsittelemätön .

10 N = Nucleosil-300 (Machery-Nagel, Länsi-Saksa), käsit telemätön.

0 = Näyte F, johon on tavallisesti lisätty epäpuhtauksiksi metalleja Fe, Mg ja Na 500 miljoonasosaa kutakin.

15 P = Näyte F, johon on tahallisesti lisätty epäpuhtau deksi 500 miljoonasosaa Ai:a.

I

Claims (4)

1. Menetelmä proteiinimaisten aineiden erottamiseksi nukleiinihaposta, tunnettu siitä, että 5 a. liuos, joka sisältää proteiinista koostuneita aineita ja nukleiinihappoja, saatetaan kosketukseen uudelleenhydratoituneen silikageelin kanssa, jonka omi-naispinta-ala on vähintään 50 m2/g ja joka on läpikotaisin täynnä huokosia, joiden keskiläpimitta on suurempi kuin 6 10 nm, ja joka kykenee sitomaan proteiinimaisia aineita, jolloin jäljelle jää nukleiinihapot sisältävä sitoutumaton fraktio, ja b. eristetään sitoutumaton fraktio.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-15 n e t t u siitä, että uudelleenhydratoitunut silikageeli on hiukkasmainen aine, jonka pinnalta oleellisesti puuttuvat monivalenssiset kationit ja jossa on pintahydroksyyli-ryhmiä, joiden vähimmäispitoisuus on 0,1 pmol/m2 ja joiden pKa on väliltä 6-10.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainitut nukleiinihapot sisältävät DNA:ta.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut nukleiinihapot sisältävät 25 DNA:ta. 26 95270