JP7323532B2 - 短い核酸断片の単離、精製及び／又は濃縮のために水性二相系を使用する方法 - Google Patents

短い核酸断片の単離、精製及び／又は濃縮のために水性二相系を使用する方法 Download PDF

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Description

本願は、２０１７年９月１８日に出願された米国出願第６２／５６０，１８０号の利益を主張している。前述の出願のすべての内容及び開示は、参照により本願に組み込まれている。
本発明は、水性二相系（ＡＴＰＳ）における短い核酸断片の単離、濃縮及び／又は精製方法に関する。特に、本発明は、生体材料から短い核酸断片を単離、濃縮及び／又は精製する方法、キット及びＡＴＰＳ成分を提供する。本願は、様々な刊行物を引用しており、それらのすべての内容は参照により本願に組み込まれている。
１９８３年にポリメラーゼ連鎖反応、又は単にＰＣＲが発見されて以来、全ゲノムの配列が決定されており、そのために生命科学の基本的な理解及び重要な医学の進歩における多くの発見が可能になっている。ＰＣＲをより効率的、効果的、低コストにするために、技術革新の分野全体が生まれている。また、核酸はＰＣＲの入力と出力の両方であるため、上流での調製及び下流での分析をより正確、精密、迅速、かつ費用対効果の高いものにするために、たゆまぬ努力がなされ、今も続いている。
効率の限界利得は、規模のリターンの減少に伴って停滞期に入っている。このボトルネックは、長さが２５０塩基対（ｂｐ）未満の小さな核酸断片を単離する必要がある場合に特に顕著である。小さな核酸（ＮＡ）断片を単離、精製及び濃縮する必要がある分野の出現は、リキッドバイオプシーの分野において最近である。リキッドバイオプシーは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、特に循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の捕捉と増幅に基づいているため、寛解期にある患者の腫瘍形成又は癌の再発の早期診断を行うことができる。循環腫瘍ＤＮＡ（循環腫瘍ｃｔＤＮＡ）は、腫瘍細胞に由来する、サイズが１００～３００塩基対のＤＮＡ断片の一種である。腫瘍細胞から放出される循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、起源の問題の特性を保持する。従来のバイオプシーに比べて、ｃｆＤＮＡの分析と研究は、非侵襲的プロセスによる腫瘍の遺伝的特性評価を可能にする。ｃｆＤＮＡ分析は、疾患の過程全体におけるゲノムの変化を検出し監視する非侵襲的かつ迅速な代替方法である。利用可能な技術は、異なる起源の細胞／組織からのＤＮＡ抽出を可能にする。様々なプロトコルを使用し、かつ様々な材料（生体液、細胞培養、新鮮又は凍結組織試料）から核酸を抽出するために使用できる「キット」として商品化することができる。ｃｆＤＮＡ濃度は通常非常に低く、ｃｆＤＮＡは短いピーク断片（例えば、２５０ｂｐ未満）で高度に断片化される。特に、約１６０～１６５ｂｐの核酸は通常尿中に出現し、これはリキッドバイオプシーにとってより望ましい試料タイプである。したがって、生体試料からｃｆＤＮＡを単離する抽出方法は、ｃｆＤＮＡの収量に大きな影響を与える可能性があり、それにより異なるテストの特性及び臨床検証の程度にさらに影響を与え得る。
本発明は、生体マトリックスの複雑な背景に対して、非常にまれでまばらな核酸断片を単離、精製、濃縮することを課題とする。多くの場合、関連する断片の収量は非常に低いため、後続のＰＣＲ結果には、十分な診断感度と特異性がない場合がある。したがって、２５０ｂｐ未満の核酸断片の単離、精製、濃縮のより効果的な新しい方法を開発することは緊急の課題である。
生体試料から核酸を単離する様々な異なる方法、例えば、基質への核酸の選択的吸着を含む方法、及び可溶性核酸からの汚染物質の除去を含む方法が開発されている。米国特許第５，０５７，４２６号、第４，９２３，９７８号、欧州特許出願公開第０５１２７６７号、欧州特許第０５１５４８４号明細書、国際公開第９５／１３３６８号、国際公開第９７／１０３３１号、及び国際公開第９６／１８７３１号に記載されているように、現在利用可能な精製方法は、フェノール／クロロホルムの使用、塩析、カオトロピック塩及びシリカ樹脂の使用、アフィニティー樹脂の使用、イオン交換クロマトグラフィー、及び磁気ビーズの使用に基づく方法である。
国際公開第２００４／１０６５１６号に記載された水性二相系（ＡＴＰＳ）によるプラスミドＤＮＡの精製プロセス、及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１０８２（２００５），１７６－１８４に記載された水性二相抽出及び疎水性相互作用クロマトグラフィーによるプラスミドＤＮＡベクターの精製のためのプロセスも知られている。いずれのプロセスも、プラスミドＤＮＡ精製のためにＡＴＰＳを使用することを開示しているが、それらはいずれも、長さが２５０ｂｐ以下の核酸を単離するために設計されたものではない。大きな核酸分子を精製する既存のプロセスは、下流の用途の満足できる性能のために十分な純度で２５０ｂｐ以下の短い核酸を精製できるとは考えられていない。
２５０ｂｐ以下の核酸断片を単離、精製、濃縮するための生体試料を調製する必要性は、研究及び産業のいずれの分野においても非常に重要であるが、この必要性は、既存の方法ではほとんど満たされていない。異なる化学製剤を使用して水系において種分離を達成する様々な方法が記載されているが、本発明が達成したことを実証しているように、時間効率が高く、費用対効果が高く、簡単、迅速かつ優れた収率を実現する方法で、２５０ｂｐ以下の核酸断片の単離、精製、濃縮を行う可能性を活用する試みは、一度も成功していない。
米国特許第５，０５７，４２６号 米国特許第４，９２３，９７８号 欧州特許出願公開第０５１２７６７号 欧州特許第０５１５４８４号明細書 国際公開第９５／１３３６８号 国際公開第９７／１０３３１号 国際公開第９６／１８７３１号 国際公開第２００４／１０６５１６号
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１０８２（２００５），１７６－１８４
本発明は、水性二相系（ＡＴＰＳ）における短い核酸断片の単離、濃縮及び／又は精製に関する。一実施形態では、本発明は、約２５０塩基対（ｂｐ）以下を有する短い核酸断片の単離、濃縮及び／又は精製のためにＡＴＰＳを使用する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、核酸含有生体材料から約２５０塩基対以下を有する短い核酸断片を精製する組成物及びキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、核酸含有生体材料から約２５０塩基対以下を有する短い核酸断片を精製するためのＡＴＰＳにおける特定の塩及び／又はポリマーの使用を提供する。
ポリマーと塩の添加により誘導される相分離を示す。図１Ａのチューブは、上相／下相の体積比が１：１の２つの分離した相で構成される。図１Ｂのチューブは、上相／下相の体積比が９：１の２つの分離した相を示す。ＡＴＰＳ成分を調整することにより、上相と下相の体積比は、１：１から９：１に変更することができ、さらに標的分子をより小さな体積の相に濃縮するように変更することができる。図１Ｂは、標的分子が下相（濃い色で示される）に濃縮される典型的なシナリオを示す。 ポリマーと塩の添加により誘導される相分離を示す。図１Ａのチューブは、上相／下相の体積比が１：１の２つの分離した相で構成される。図１Ｂのチューブは、上相／下相の体積比が９：１の２つの分離した相を示す。ＡＴＰＳ成分を調整することにより、上相と下相の体積比は、１：１から９：１に変更することができ、さらに標的分子をより小さな体積の相に濃縮するように変更することができる。図１Ｂは、標的分子が下相（濃い色で示される）に濃縮される典型的なシナリオを示す。 本発明の一実施形態により精製されたＤＮＡのゲル電気泳動画像を示す。 本発明の一実施形態に係る、２つの異なる相に分配された異なるサイズの核酸のゲル電気泳動画像を示す。 本発明の一実施形態に従って抽出された異なるサイズのＤＮＡの回収率を示す。 本発明の一実施形態とＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡミニキットによって抽出された異なるサイズのＤＮＡの回収率を比較する。
以下の説明では、本発明のいくつかの実施形態を説明する。説明の目的で、実施形態の完全な理解を提供するために、特定の構成及び詳細を示す。また、単語の複数形又は単数形に対して、及び実施形態の向きが「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」等として説明されている範囲において、これらの文言は、読者が実施形態を理解するのを助けるためのものであり、物理的に限定することを意図するものではない。当業者にとって、本発明が特定の詳細なしに実施され得ることは明らかである。本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるが、当業者であれば、特定の実施例が単に例示を目的としており、その後に続く特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定すべきではないことを容易に理解するであろう。「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義である移行語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」もしくは「によって特徴付けられる」は、包括的又は非限定的であり、追加の、引用されていない要素又は方法ステップを除外しないことに留意すべきである。
本発明においては、様々な生体材料からの約２５０塩基対（ｂｐ）以下を有する短い核酸断片の単離、濃縮及び／又は精製のために、水性二相系（ＡＴＰＳ）を適用する。
一実施形態では、本発明は、約２５０塩基対（ｂｐ）以下を有する短い核酸断片の単離、濃縮及び／又は精製のために水性二相系（ＡＴＰＳ）を使用する方法を提供する。一実施形態では、当該方法は
（ａ）ＡＴＰＳ組成物を提供するステップと、
（ｂ）前記ＡＴＰＳ組成物を、短い核酸断片を含む試料溶液と接触させる又は混合するステップと、
（ｃ）前記ＡＴＰＳと試料溶液との混合物を第１の相と第２の相に分離させるステップとを含み、
短い核酸断片を第１の相溶液又は第２の相溶液に分配することにより、短い核酸断片を単離及び濃縮する。
一実施形態では、本発明は、試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を単離及び濃縮するための組成物を提供し、組成物は、成分が水溶液に溶解するときに水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる第１の相成分と第２の相成分を含む。一実施形態では、第１の相成分はポリマー、塩又はミセル溶液の１つ以上である。一実施形態では、第２の相は、ポリマー、塩又はミセル溶液の１つ以上である。一実施形態では、第１の相成分はポリマーであり、第２の相は塩である。一実施形態では、２５０ｂｐ以下の核酸断片は一相に濃縮される。
一実施形態では、本発明は、試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を単離及び濃縮する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の組成物を短い核酸断片を含む試料溶液と混合することにより、短い核酸断片を単離及び濃縮する。
一実施形態では、短い核酸断片は、コードＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はトランスファーＲＮＡである。一実施形態では、短い核酸断片は、無細胞ＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡである。
ＡＴＰＳ（水性二相系）
油－水系と同様に、ＡＴＰＳは比を容易に制御できる２つの異なる液相で構成される。ＡＴＰＳ系に懸濁された生体分子は、物理化学的特性（例えば、２つの相の親水性と界面張力）に基づいて２つの水相の一方に分配されるため、目的の生体分子が濃縮される。
一実施形態では、本発明は、試料から１つ以上の短い核酸断片又は標的分子（例えば、核酸分子）を単離／濃縮／精製／回収する２成分水性二相系（ＡＴＰＳ）を提供する。混合物中の異なる分子は、それらの異なる特性により、２つの相の間で異なって分布し、最小限のセットアップと人間の介入でＡＴＰＳを使用して標的分子を分離し濃縮することが可能である。一実施形態では、流体の流れは等温動的原理に基づく毛細管作用のみに依存するため、相分離を引き起こすための電力又は機器は不要である。
本発明の利点は、高純度及び高濃度の標的分子を簡単な方法で得ることができ、かつ精製又は濃縮のステップを追加することなく、増幅（例えば、ＰＣＲ）、配列決定、標識又は検出（例えば、ハイブリダイゼーション又はラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ））を含むがこれらに限定されない下流の用途に適合することができることである。
本明細書で提供される方法及び装置は、堅牢で、安価で、シンプルで、扱いやすく、安全で、使いやすく、高速である。本方法は、１つ以上の短い核酸断片又は標的分子を精製し濃縮することができるため、精製及び濃縮された分子を使用する下流の用途の性能が、元の試料の不純物によって影響されないことを保証する。
本明細書に記載の独自の特徴により、本発明は、複雑な機器を使用せずに、標的分子を簡便かつ迅速に精製及び濃縮することができ、１つ以上の短い核酸断片又は標的分子を非常に少量又は小容量含む試料に適用することができる。さらに、本方法は、ハイスループットスクリーニングシステムを含む自動化に容易に適応可能である。
核酸の小さな断片を単離及び／又は濃縮するためのＡＴＰＳ（水性二相系）の使用
一実施形態では、本発明は、試料から１つ以上の短い核酸断片又は標的分子を単離、精製、回収、濃縮するために使用される。一実施形態では、本発明は、非標的分子から１つ以上の短い核酸断片又は標的分子を分離し、標的核酸分子を同時に濃縮することができる。
本発明の一実施形態では、短い核酸断片又は標的分子はＡＴＰＳ埋め込み多孔質材料に保持され、一方、非標的材料は液体系（例えば、元の試料と非ＡＴＰＳ成分）に残される。一実施形態では、非標的材料はＡＴＰＳ埋め込み多孔質材料に保持され、一方、短い核酸断片又は標的分子は液体系（例えば、元の試料と非ＡＴＰＳ成分）に残される。
本発明において、様々な生体材料から約２５０塩基対以下を有する短い核酸断片を単離、濃縮及び／又は精製するために、水性二相系（ＡＴＰＳ）を適用する。
一実施形態では、本発明は、約２５０塩基対以下を有する短い核酸断片を単離、濃縮及び／又は精製するために、水性二相系（ＡＴＰＳ）を使用する方法を提供する。一実施形態では、当該方法は、
（ａ）第１の相溶液と第２の相溶液を含むＡＴＰＳ組成物を提供するステップと、
（ｂ）上記ＡＴＰＳ組成物を短い核酸断片を含む試料溶液と接触させるステップと、
（ｃ）短い核酸断片を第１の相溶液又は第２の相溶液中で濃縮させるステップとを含み、それによって、短い核酸断片を単離、濃縮及び／又は精製する。
一実施形態では、ＡＴＰＳ組成物は、ポリマー、塩、及び界面活性剤を含むＡＴＰＳ成分の混合相溶液である。一実施形態では、組成物は、試料溶液と接触した後、第１の相溶液と第２相溶液に分離することにより、相分離を開始する。
一実施形態では、核酸は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。本明細書で使用される「無細胞ＤＮＡ」（ｃｆＤＮＡ）とは、細胞の外側に存在するＤＮＡ、例えば、被験者の血液、血漿、血清、又は尿に存在するＤＮＡである。特定の理論又はメカニズムに束縛されることなく、ｃｆＤＮＡは、例えば細胞のアポトーシスを介して細胞から放出されるか又はそれに由来すると考えられている。本明細書で使用される「天然型ｃｆＤＮＡ」又は「被験者のｃｆＤＮＡ」とは、被験者の細胞（例えば、非癌細胞）から放出されるか又はそれに由来する無細胞ＤＮＡを指す。本明細書で使用される「非天然型ｃｆＤＮＡ」又は「被験者に由来しないｃｆＤＮＡ」とは、配列、例えば、本明細書に記載のものを含むがこれらに限定されない１つ以上の遺伝子座における配列同一性に関して、被験者のｃｆＤＮＡとは異なる非天然源からの無細胞ＤＮＡを指す。非天然型ＤＮＡの例には、移植ドナーＤＮＡ及び癌／腫瘍ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。非天然型ｃｆＤＮＡの例には、移植ドナーｃｆＤＮＡ（本明細書ではドナー特異的ｃｆＤＮＡとも呼ばれる）及び腫瘍ｃｆＤＮＡ（本明細書では癌特異的ｃｆ－ＤＮＡとも呼ばれる）が含まれるが、これらに限定されない。非天然型ｃｆ－ＤＮＡの供給源は、被験者によって異なる。別の例として、非天然型ｃｆＤＮＡは、細菌、真菌及びウイルスのＤＮＡを含む。例えば、被験者が移植受容者である場合、非天然型ｃｆＤＮＡは、移植された移植臓器（ドナー固有のｃｆＤＮＡ）から放出され、天然型ｃｆＤＮＡは、宿主／被験者（宿主ｃｆ－ＤＮＡ）からの細胞によって放出される可能性がある。被験者が癌を有する場合、非天然型ｃｆ－ＤＮＡは、例えば腫瘍及び／又は転移（癌特異的ｃｆ－ＤＮＡ）によって放出され、天然型ｃｆ－ＤＮＡは、例えば、被験者の非癌細胞によって放出される可能性がある。
一実施形態では、核酸は、癌患者の血漿又は血清に存在する循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。
一実施形態では、本発明の対象となる短い核酸断片は、サイズが２５０ｂｐ以下である。別の実施形態では、短い核酸断片はサイズが１６０～１６５ｂｐである。別の実施形態では、短い核酸断片はサイズが約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ｂｐである。
一実施形態では、短い核酸断片は第１の相溶液に分配される。一実施形態では、短い核酸断片は第２の相溶液に分配される。別の実施形態では、短い核酸断片は、第１の相溶液と第２の相溶液の界面に分配される。
一実施形態では、試料溶液は、核酸含有試料又は核酸含有生体材料である。本発明の意義は、組織、血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、唾液、糞便、及び涙、痰、鼻咽頭粘液、膣分泌物、陰茎排出物などの分泌物を含むがこれらに限定されない核酸含有試料及び核酸含有生体材料の処理及び調製にある。
本発明の様々な実施形態で使用できる様々なＡＴＰＳ系は、ポリマー塩（例えば、ＰＥＧ塩）、ポリマー－ポリマー（例えば、ＰＥＧデキストラン、ＰＥＧポリアクリレート）、ミセル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４）、塩ミセル（例えば、塩Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４）又はポリマーミセル（例えば、ＰＥＧ－Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４）を含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、第１及び／又は第２の相溶液はポリマーを含む。一実施形態では、ポリマーは、疎水変性ポリアルキレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、疎水変性ポリ（オキシアルキレン）共重合体などのポリ（オキシアルキレン）共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコーン変性ポリエーテル、ポリＮ-イソプロピルアクリルアミド及びそれらの共重合体を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、第１のポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリレート又はデキストランを含む。一実施形態では、ポリマーは、ＵＣＯＮＴＭポリマー（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）又はＦｉｃｏｌｌＴＭポリマー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
一実施形態では、第１の相溶液又は第２の相溶液のポリマー濃度は、水溶液の総重量の約０．０１重量％～約９０重量％の範囲（ｗ／ｗ）である。様々な実施形態では、ポリマー溶液は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ又は約１％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。一実施形態では、ポリマーの濃度は約０．０１％～４０％ｗ／ｗである。一実施形態では、ポリマーの濃度は約６％～３５％ｗ／ｗである。一実施形態では、ポリマーの濃度は約１０％～３０％ｗ／ｗである。
一実施形態では、第１及び／又は第２の相溶液は塩を含み、それにより塩溶液を形成する。一実施形態では、本発明の対象となる塩は、コスモトロピック塩、カオトロピック塩、及び直鎖又は分岐トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムなどの陽イオンと、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸水素塩などの陰イオンとを有する無機塩を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ３ＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰ０４、ＫＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰ０４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＨＳＯ４、クエン酸カリウム、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム又はそれらの組み合わせであり得る。他の塩、例えば酢酸アンモニウムは使用されてよい。一実施形態では、ｐＨ値を調整するため又は相間の界面張力を変更するために２つ以上の塩が使用される。
一実施形態では、総塩濃度は約０．０１％～約９０％の範囲である。当業者であれば、水性二相系を形成するのに必要な塩の量が、ポリマーの分子量、濃度及び物理的状態によって影響されることを理解するであろう。
様々な実施形態では、塩溶液は約０．００１％～９０％ｗ／ｗである。様々な実施形態では、塩溶液は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ又は約１％ｗ／ｗである。いくつかの実施形態では、塩溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗである。一実施形態では、塩の濃度は約２％～４０％ｗ／ｗである。一実施形態では、塩の濃度は約３％～３０％ｗ／ｗである。一実施形態では、塩の濃度は約５％～２０％ｗ／ｗである。
一実施形態では、第１及び／又は第２の相溶液は、水と混合しない溶媒を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は非極性有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は油を含む。いくつかの実施形態では、溶媒はペンタン、シクロペンタン、ベンゼン、１，４－ジオキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン又はヘキサンであり得る。
一実施形態では、第１及び／又は第２の相溶液はミセル溶液を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液はＴｒｉｔｏｎ－Ｘを含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液はＩｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０及びＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０などのＴｒｉｔｏｎ－Ｘと同様のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、本質的にＴｒｉｔｏｎ－Ｘを含む。
一実施形態では、第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液はポリマーを含む。一実施形態では、第２の相溶液はミセル溶液を含み、第１の相溶液はポリマーを含む。一実施形態では、第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液は塩を含む。一実施形態では、第２の相溶液はミセル溶液を含み、第１の相溶液は塩を含む。一実施形態では、ミセル溶液はＴｒｉｔｏｎ－Ｘ溶液である。一実施形態では、第１の相溶液は第１のポリマーを含み、第２の相溶液は第２のポリマーを含む。一実施形態では、第１／第２のポリマーはポリエチレングリコール及びデキストランから選択される。一実施形態では、第１の相溶液はポリマーを含み、第２の相溶液は塩を含む。一実施形態では、第２の相溶液はポリマーを含み、第１の相溶液は塩を含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液はポリエチレングリコールを含み、第２の相溶液はリン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液はポリエチレングリコールを含み、第１の相溶液はリン酸カリウムを含む。一実施形態では、第１の相溶液は塩を含み、第２の相溶液は塩を含む。一実施形態では、第１の相溶液はコスモトロピック塩を含み、第２の相溶液はカオトロピック塩を含む。一実施形態では、第２の相溶液はコスモトロピック塩を含み、第１の相溶液はカオトロピック塩を含む。
一実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液の比は１：１～１：１０００の範囲である。いくつかの実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、及び約１：１０の比であり得る。いくつかの実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液の比は、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、及び約１：１００の比であり得る。いくつかの実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液の比は、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：５００、約１：６００、約１：７００、約１：８００、約１：９００、及び約１：１０００の比であり得る。
一実施形態では、第２の相溶液と第１の相溶液の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、又は約１：１０の比であり得る。いくつかの実施形態では、第２の相溶液と第１の相溶液の比は、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、又は約１：１００の比であり得る。いくつかの実施形態では、第２の相溶液と第１の相溶液の比は、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：５００、約１：６００、約１：７００、約１：８００、約１：９００、又は約１：１０００の比であり得る。
ＡＴＰＳの第１の相溶液及び第２の相溶液がポリマーである一実施形態では、ＡＴＰＳと試料の混合物の相分離後、第１の相溶液又は第２の相溶液のポリマー濃度は、水溶液の総重量の約０．０１重量％～約９０重量％の範囲（ｗ／ｗ）である。様々な実施形態では、濃度は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ又は約１％ｗ／ｗである。いくつかの実施形態では、塩溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。一実施形態では、第１の相溶液のポリマー濃度は、約１０％～５０％ｗ／ｗであり、第２の相溶液の濃度は、約０．０１％～６％ｗ／ｗである。別の実施形態では、第１の相溶液のポリマー濃度は、約２２％～４５％ｗ／ｗであり、他の相の濃度は、約０．０１％～４％ｗ／ｗである。
ＡＴＰＳの第１の相溶液及び第２の相溶液が塩である様々な実施形態では、ＡＴＰＳと試料の混合物の相分離後、第１の相溶液又は第２の相溶液の塩濃度は、約０．００１％～９０ｗ／ｗである。様々な実施形態では、塩濃度は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ又は約１％ｗ／ｗである。いくつかの実施形態では、塩溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。一実施形態では、第１の相中の塩の濃度は、約０．０１％～１０％ｗ／ｗであり、第２の相中の塩の濃度は、約２０％～４０％ｗ／ｗである。別の実施形態では、第１の相中の塩の濃度は、約０．０１％～６％ｗ／ｗであり、第２の相中の塩の濃度は、約２２％～３５％ｗ／ｗである。
一実施形態では、本発明は、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する組成物を提供し、この組成物は、水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる成分を含む。
一実施形態では、本組成物は、前述の説明に記載されたものを含む、第１の相溶液及び第２の相溶液を含む混合相溶液を含む。
一実施形態では、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する本組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００及び二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を含む。一実施形態では、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する本組成物は、約５～２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００及び５～３５％のＫ２ＨＰＯ４を含む。別の実施形態では、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する本組成物は、８％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００及び２２％のＫ２ＨＰＯ４を含む。
一実施形態では、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する本組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００及びＫ２ＨＰＯ４を含む。一実施形態では、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する本組成物は、約１０～３０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００及び５～２０％のＫ２ＨＰＯ４を含む。別の実施形態では、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する本組成物は、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００及び１５％のＫ２ＨＰＯ４を含む。
一実施形態では、短い核酸断片を単離及び／又は濃縮する本組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００、及び二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）と一塩基性リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の混合物を含む。
濃度係数の調整
例として、いくつかの実施形態では、標的の短い核酸断片は、例えば、第１の相溶液と第２の相溶液の体積比１：９を使用することにより、第１の相溶液中で１０倍濃縮される。
一実施形態では、ＡＴＰＳ成分の相対量は変更することができる。ＡＴＰＳの２つの成分の体積比は、短い核酸断片又は標的分子を優先的に１相で単離／精製／濃縮／回収するように制御される。
本発明に関連する現象をより定量化するために、ＡＴＰＳ成分の相対量と達成された結果（例えば、濃縮／単離／回収の効率）との間の相関を評価するアッセイを開発する。これにより、ＡＴＰＳ成分の相対量を調整することにより、濃縮係数、単離効率、回収率を選択し、微調整することができる。
一実施形態では、ＡＴＰＳの２つの相の間の比は、ＡＴＰＳ成分の濃度を変化させることにより容易に制御することができる。図１Ａ～Ｂは、溶液に対して異なるＡＴＰＳ成分（例えば、ポリマー及び塩）を添加することにより誘導された相分離濃度を示す。ＡＴＰＳ成分と試料は１：１で混合されている。ＡＴＰＳ成分を調整することにより、混合相は分離し、標的分子は２つの相の一方に分配される。図１Ｂは、標的分子が体積比９：１で下相に濃縮されたことを示す。上相と下相の体積比をさらに変更して、より小さな体積の相に標的分子を濃縮することができる。
別の実施形態では、ＡＴＰＳ成分を調整する（例えば、同じ又は異なる種類の追加のＡＴＰＳ成分を混合物に添加するか、又は最終溶液を調製するときに混合物に追加されるＡＴＰＳ成分の相対体積又は濃度を変更するか、又は最終溶液を調製するときに系に追加される試料溶液の体積を調整する）ことにより、最終混合物中のＡＴＰＳ成分の相対体積又は濃度を変更することができる。一実施形態では、上相と下相の体積比は、１：１から９：１又はそれ以上の比に変更することができる。この現象は、電力、機器又はトレーニングを必要とせずに標的分子を濃縮するために活用できる。水又は生理食塩水などの単純な培地では、これを再現するのは簡単であるが、変動性が高く、潜在的に他の干渉物質を含む複雑な培地（例えば、唾液、血液、尿、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、涙、痰、鼻咽頭粘液、膣分泌物、陰茎分泌物）の場合、有用な体積比を達成することはより困難である。複雑な培地から干渉物質を除去すると役立つ場合がある。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、クエン酸を使用して尿から尿素を除去してよく、或いは、トリクロロ酢酸を使用して唾液からタンパク質を除去してもよい。
ＡＴＰＳ埋め込み多孔質材料の設計
一実施形態では、本方法は、ＡＴＰＳ成分が埋め込まれた多孔質材料を提供する。一実施形態では、ＡＴＰＳ成分が埋め込まれた多孔質材料を試料が通過するときに、短い核酸断片を単離及び濃縮することができる。一実施形態では、単離及び濃縮された短い核酸断片は、後続の分析又は保存のために多孔質材料から直接収集される。
多孔質材料は、液体を吸収し移送することができる任意の適切な多孔質材料で作られてよい。本発明に適した多孔質材料は、ガラス繊維紙、綿ベース紙、他の種類の紙、ポリマー発泡体、セルロース発泡体、他の種類の発泡体、レーヨン織物、綿織物、他の種類の織物、木材、石、及び液体を吸収し移送することができる他の材料を含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＡＴＰＳは、第１の相溶液と第２の相溶液を含む混合相溶液を含み、第１の相溶液の成分と第２の相溶液の成分は、混合相溶液が多孔質材料を通って流れるときに相分離を受けるのに十分な濃度又は負荷で、多孔質材料に埋め込まれる。
一実施形態では、ＡＴＰＳは、混合相溶液が多孔質材料を通って流れるときに相分離を受けるのに十分な濃度又は負荷で、多孔質材料に埋め込まれる。
一実施形態では、一部かのＡＴＰＳ成分は、多孔質材料に埋め込まれ、次いで、標的核酸断片を含む試料を前記多孔質材料に添加する前に脱水される。
一実施形態では、一部のＡＴＰＳ成分は多孔質材料に埋め込まれ、次いで脱水され（「前処理された多孔質材料」）、残りのＡＴＰＳ成分は最初に標的核酸断片を含む試料と混合され、その後に前処理された多孔質材料内の相分離により後続の単離及び濃縮が行われる。
一実施形態では、一部のＡＴＰＳ成分は、最初に短い核酸断片を含む試料と混合され、その後、得られた混合物は多孔質材料に埋め込まれ、残りのＡＴＰＳ成分は、多孔質材料内の相分離による後続の単離及び濃縮のために多孔質材料に追加される。
一実施形態では、短い核酸断片は、ＡＴＰＳ成分の混合物と接触するか、ＡＴＰＳ成分と混合され、多孔質材料を通過するときに第１の相溶液、第２の相溶液又は第１の相溶液と第２の相溶液との界面（又は中間相）に分配される。
一実施形態では、試料中の短い核酸断片と長い核酸分子を分離するための多孔質材料内の２成分ＡＴＰＳ（水性二相系）が提供されている。一実施形態では、短い核酸断片と長い核酸分子は、ＡＴＰＳが多孔質材料内で相分離を受けるにつれて、ＡＴＰＳの異なる相に分配される。
一実施形態では、多孔質材料とＡＴＰＳは、第１の相溶液が多孔質マトリックスを第１の速度で流れ、第２の相溶液が多孔質マトリックスを第２の速度で流れるように選択され、第１の速度と第２の速度は異なる。
一実施形態では、多孔質材料は、市販されているか、又は社内で製造されている。
一実施形態では、ＡＴＰＳ成分を多孔質材料に組み込むために、ＡＴＰＳ成分は水（又は適切な緩衝液）に可溶化され、特定の比及び／又は濃度で多孔質材料に適用される。次に、多孔質材料を凍結乾燥機に入れて水を除去すると、多孔質材料に直接ＡＴＰＳ成分が埋め込まれる。試料を多孔質材料に導入する際に、ＡＴＰＳ成分は直ちに再水和され、それにより試料中の短い核酸断片又は標的分子が分離される。一実施形態では、短い核酸断片は、流体の流れの前面に濃縮される。一実施形態では、駆動力を提供するための外部電力又は機器は使用されない。
ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）を用いる診断の改善
本方法により得られる短い核酸断片は、ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）を用いる検出又は分析に供することができる。
ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）方法と装置は幅広く記載されている。例えば、Ｇｏｒｄｏｎ；Ｐｕｇｈ、米国特許第４，９５６，３０２号、Ｈ．Ｂｕｃｋら、ＷＯ９０／０６５１１、Ｔ．Ｗａｎｇ、米国特許第６，７６４，８２５号、Ｗ．Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，００８，０８０号、Ｋｕｏ；Ｍｅｒｉｔｔ、ＵＳ６，１８３，９７２、欧州特許出願公開第００９８７５５１号サーチレポートを参照されたい。このようなアッセイは、リガンドと受容体からなる特異的結合対のメンバーである検体物質の検出と決定に関与する。リガンドと受容体は、受容体がリガンドに特異的に結合し、特定の１つ又は複数のリガンドを、類似した特徴を有する他の試料成分から区別できるという点で関連している。抗体と抗原間の反応に関与する免疫学的アッセイは、特異的結合アッセイのそのような例の１つである。他の例は、ＤＮＡやＲＮＡのハイブリダイゼーション反応と、ホルモン及び他の生体受容体が関与する結合反応とを含む。
一実施形態では、本発明は、被験者に存在する疾患を示す短い核酸断片を濃縮することができ、得られた生成物は、短い核酸断片の検出又は定量を必要とする下流の診断手順の対象となる。本発明は、短い核酸断片の濃度が増加しているため、ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）において、信号対雑音比を低減し、陽性シグナルを増強することができることも期待される。その結果、偽陽性率と偽陰性率も低下する可能性がある。濃度を改善することができるため、存在量の少なさ又は試料中の不純物の干渉に起因して検出できなかった分子を検出することができる。
短い核酸断片の濃度が極端に低い場合、偽陰性の結果が生じる可能性がある。一実施形態では、短い核酸断片の濃度の増加により、ＬＦＡの検出限界が改善される。その結果、テストの再現性が向上する。
一実施形態では、本発明は、試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を単離及び濃縮するための組成物を提供し、当該組成物は、成分が水溶液に溶解するときに水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる第１の相成分と第２の相成分を含む。一実施形態では、第１の相成分は５～２０重量％の濃度で第１の相に溶解するポリマーであり、第２の相成分は５～３５重量％の濃度で第２の相に溶解する塩であり、核酸断片がＡＴＰＳと混合されると、断片は２つの相の一方に濃縮される。
本組成物の一実施形態では、当該ポリマーは、ポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、ポリ（オキシアルキレン）共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコーン変性ポリエーテル、ポリＮ-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリレート、デキストラン、ＵＣＯＮＴＭポリマー及びＦｉｃｏｌｌＴＭポリマーである。
本組成物の一実施形態では、当該塩は、コスモトロピック塩、カオトロピック塩、及びトリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム又はテトラブチルアンモニウムの陽イオンと、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物又は炭酸水素塩の陰イオンとを有する無機塩、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸カリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム又は酢酸アンモニウムである。
本組成物の一実施形態では、ポリマーは１００～１００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリエチレングリコールである。
本組成物の一実施形態では、塩は二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、及びリン酸ナトリウムのうちの１つ以上である。
本組成物の一実施形態では、試料が組成物と混合されると、得られた混合物は相分離し、２５０ｂｐ以下の核酸断片が２つの相の一方に濃縮される。一実施形態では、２５０ｂｐより大きい核酸断片と２５０ｂｐ以下の断片はＡＴＰＳの異なる相に濃縮される。
本組成物の一実施形態では、核酸断片は、コードＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はトランスファーＲＮＡである。一実施形態では、核酸断片は、無細胞ＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡである。
本組成物の一実施形態では、試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、糞便、涙、痰、鼻咽頭粘液、膣分泌物及び陰茎排出物である。
一実施形態では、本発明は、試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を単離及び濃縮する方法を提供し、方法は、
ａ）本願に記載された組成物を調製することと、
ｂ）ステップａ）からの組成物を、試料を含む水溶液と混合し、得られた混合物を２相に分配し、核酸断片をその２相の一方に濃縮することと、
ｃ）２つの相の一方から核酸断片を単離することとを含む。
一実施形態では、本発明は、試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を単離及び濃縮する方法を提供し、方法は、
ａ）成分が水溶液に溶解するときに水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる、５～２０重量％の濃度で第１の相に溶解するポリマーである第１の相成分と、１５～２５重量％の濃度で第２の相に溶解する塩である第２の相成分とを含む組成物を調製することと、
ｂ）ステップａ）からの組成物を、試料を含む水溶液と混合し、得られた混合物を２相に分配し、核酸断片をその２相の一方に濃縮することと、
ｃ）核酸断片が濃縮した２つの相の一方を単離することと、を含む。
本方法の一実施形態では、方法は、ステップｃ）における相から核酸断片を回収することをさらに含む。
本方法の一実施形態では、ポリマーは、ポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、ポリ（オキシアルキレン）共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、シリコーン変性ポリエーテル、ポリＮ-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリレート、デキストラン、ＵＣＯＮＴＭポリマー及びＦｉｃｏｌｌＴＭポリマーである。
本方法の一実施形態では、塩は、コスモトロピック塩、カオトロピック塩、及びトリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム又はテトラブチルアンモニウムの陽イオンと、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物又は炭酸水素塩の陰イオンとを有する無機塩、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸カリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム又は酢酸アンモニウムである。
本方法の一実施形態では、ポリマーは１００～１００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリエチレングリコールである。
本方法の一実施形態では、塩は二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、及びリン酸ナトリウムのうちの１つ以上である。
本方法の一実施形態では、２５０ｂｐより大きい核酸断片と２５０ｂｐ以下の断片は、ステップｂ）においてＡＴＰＳの異なる相に濃縮される。
本方法の一実施形態では、核酸断片は、コードＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はトランスファーＲＮＡである。一実施形態では、核酸断片は、無細胞ＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡである。
本方法の一実施形態では、試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、糞便、涙、痰、鼻咽頭粘液、膣分泌物及び陰茎排出物である。
本方法の一実施形態では、核酸断片は、試料と比較して少なくとも１０倍濃縮される。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、提供された実施例が単に例示を目的としており、その後の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意味しないことを容易に理解するであろう。
本願を通して、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義である移行語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」もしくは「によって特徴付けられる」は、包括的又は非限定的であり、追加の、引用されていない要素又は方法ステップを除外しないことに留意すべきである。
水性二相系を用いるＰＢＳ溶液からの短い核酸断片（＜２５０ｂｐ）の選択的単離と濃縮
ＤＮＡラダー（ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ＋ＤＮＡラダー、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を、ＰＢＳ溶液中の１１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００及び２０％（ｗ／ｗ）のＫ２ＨＰＯ４からなる水性二相系１ｍｌにスパイクして、最終ＤＮＡ濃度を１μｇ／ｍｌとした。徹底的にボルテックスした後、相分離のために混合物を１００００ｒｃｆで１０秒間遠心分離した。上相と下相の体積比は、約１：３であった。上相と下相を抽出し、それぞれ新しいチューブに移した。抽出した相をエタノール沈殿にかけ、沈殿物をゲル電気泳動により分離して、図３に示すように、各相のＤＮＡサイズの分配を視覚化した。２５０ｂｐより大きい核酸のほとんどは下相（右レーン）に分配され、２５０ｂｐより小さい核酸は上相（左レーン）に分配された。上相と下相の体積比は、約１：３であったため、短い核酸断片は長い核酸断片から単離され、その後、より少量の溶液に濃縮された。
上記手順から得られた短い核酸断片を、対照としてＡＴＰＳによる濃縮をされていないＤＮＡ試料を用いて、ＬＦＡによってさらに分析した。ＩｍａｇｅＪ又はＧｅｌａｎａｌｙｚｅｒを使用してテストラインの強度を測定し、結果を以下の表1にまとめた。
Figure 0007323532000001
水性二相系を用いる血漿試料からの短い核酸断片（＜２５０ｂｐ）の選択的単離と濃縮
ＤＮＡラダー（ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡラダー、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を、血漿試料５００μｌにスパイクした。スパイクした血漿試料を、ＭｉｌｌｉＱ水の１５％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００及び１５％（ｗ／ｗ）Ｋ２ＨＰＯ４からなる水性二相系５００μｌに添加して、最終ＤＮＡ濃度を１μｇ／ｍｌとした。徹底的にボルテックスした後、相分離のために混合物を１００００ｒｃｆで１０秒間遠心分離した。上相と下相の体積比は、約１：１であった。
下相を抽出し、１１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００及び２０％（ｗ／ｗ）Ｋ２ＨＰＯ４からなる別のＡＴＰＳ溶液に添加した。徹底的にボルテックスした後、相分離のために混合物を１００００ｒｃｆで１０秒間遠心分離した。上相と下相の体積比は、約１：３であった。上相と下相を抽出し、それぞれ新しいチューブに移した。抽出された相をエタノール沈殿にかけ、沈殿物をゲル電気泳動により分離して、各セクションのＤＮＡサイズの分配を視覚化した（図３）。２５０ｂｐより大きい核酸は下相（右レーン）に分配され、２５０ｂｐより小さい核酸は上相（左レーン）に分配されたため、試料溶液から小さなサイズの核酸が単離され、少量の溶液に濃縮された。
この実施例で説明したように、ＡＴＰＳによって単離及び濃縮した後、異なるサイズのＤＮＡラダーの回収率を推定した（図４において、回収率＝回収されたＤＮＡの絶対収量／試料にスパイクされたＤＮＡの量）。２５０ｂｐより小さいＤＮＡは高い割合で回収されたが、２５０ｂｐより大きいＤＮＡは大幅に減少したことが明らかになった。これは、本発明が２５０ｂｐより小さいＤＮＡを捕捉することに特異的であることを示している。
水性二相系とＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）との比較
異なるサイズ（２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５ｂｐ）の消化されたＤＮＡプラスミドを血漿試料にスパイクして、最終ＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／ｍＬとした。得られたスパイク血漿試料１ｍＬを、ＭｉｌｌｉＱ水の１５％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００及び１５％（ｗ／ｗ）Ｋ２ＨＰＯ４からなる水性二相系１ｍＬに添加した。徹底的にボルテックスした後、相分離のために混合物を１００００ｒｃｆで１０秒間遠心分離した。上相と下相の体積比は、約１：１であった。
下相を抽出し、８％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００及び２２％（ｗ／ｗ）Ｋ２ＨＰＯ４からなる別のＡＴＰＳ溶液に添加した。徹底的にボルテックスした後、相分離のために混合物を１００００ｒｃｆで１０秒間遠心分離した。上相と下相の体積比は、約１：５であった。上相を抽出し、新しいチューブに移した。
ＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、スパイクした血漿試料１ｍＬで別の抽出を行った。２つの異なる方法の使用による核酸の単離効果を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで単離された核酸の電気泳動アッセイにより比較した。結果を図５に示す。図５に示すように、本発明を使用すると、２５０ｂｐよりも短い（２５～２００ｂｐ）核酸の５０～８０％を抽出し、１５０～２００ｂｐの核酸の約８０％を抽出した。これに対して、ＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡミニキットは２５ｂｐのＤＮＡを抽出できないことが判明した。したがって、本発明は、ＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡミニキットと比べて改善された性能を示している。

Claims (19)

  1. 試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を選択的に単離及び濃縮するための組成物であって、水溶液に溶解するときに水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる第１の相成分と第２の相成分とを含み、
    第１の相成分は８～１１重量％の濃度で第１の相に溶解するポリマーであり、
    第２の相成分は２０～２２重量％の濃度で第２の相に溶解する塩であり、
    前記ポリマーはポリエチレングリコール６０００であり、前記塩は二塩基性リン酸カリウムであり、
    前記核酸断片が前記ＡＴＰＳと混合されると、前記断片は上相に濃縮される、組成物。
  2. 前記ポリマーの濃度が１１重量％であり、前記塩の濃度が２０重量％である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ポリマーの濃度が８重量％であり、前記塩の濃度が２２重量％である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記核酸断片は、コードＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びトランスファーＲＮＡからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記核酸断片は、無細胞ＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡである、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、糞便、涙、痰、鼻咽頭粘液、膣分泌物及び陰茎排出物からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を選択的に単離及び濃縮する方法であって、
    ａ）請求項１～６のいずれかの組成物を調製することと、
    ｂ）ステップａ）からの組成物を、前記試料を含む水溶液と混合し、得られた混合物を２相に分配し、前記核酸断片を上相に濃縮することと、
    ｃ）前記上相から前記核酸断片を単離することとを含む、方法。
  8. 試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を選択的に単離及び濃縮する方法であって、
    ａ）成分が水溶液に溶解するときに水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる、８～１１重量％の濃度で第１の相に溶解するポリマーである第１の相成分と、２０～２２重量％の濃度で第２の相に溶解する塩である第２の相成分とを含む組成物を調製することと、
    ここで、前記ポリマーはポリエチレングリコール６０００であり、前記塩は二塩基性リン酸カリウムであり、
    ｂ）ステップａ）からの組成物を、前記試料を含む水溶液と混合し、得られた混合物を２相に分配し、前記核酸断片を上相に濃縮することと、
    ｃ）前記核酸断片が濃縮された上相を単離することと、を含む方法。
  9. ステップｃ）における相から前記核酸断片を回収することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ポリマーの濃度が１１重量％であり、前記塩の濃度が２０重量％である、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記ポリマーの濃度が８重量％であり、前記塩の濃度が２２重量％である、請求項８または９に記載の方法。
  12. ステップｂ）の前に、
    ｉ）水溶液に溶解するときに水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる第１の相成分と第２の相成分とを含む組成物を調製することと、
    ここで第１の相成分は１５重量％の濃度で第１の相に溶解するポリマーを含み、第２の相成分は１５重量％の濃度で第２の相に溶解する塩を含み、
    前記ポリマーはポリエチレングリコール１０００であり、前記塩は二塩基性リン酸カリウムであり、
    ii）ステップｉ）からの組成物を、前記試料を含む水溶液と混合し、得られた混合物を２ 相に分配することと、
    ここで前記核酸断片は下相に濃縮され、
    iii）前記下相をステップｂ）の試料として単離することと、
    をさらに含む、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記核酸断片は、コードＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びトランスファーＲＮＡからなる群から選択される、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記核酸断片は、無細胞ＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡである、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、糞便、涙、痰、鼻咽頭粘液、膣分泌物及び陰茎排出物からなる群から選択される、請求項８～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記核酸断片は、前記試料と比較して少なくとも１０倍濃縮される、請求項８～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. （ａ）水溶液に溶解するときに第１の水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる第１の相成分と第２の相成分とを含む、第１の組成物と、
    ここで、第１の相成分は１５重量％の濃度で第１の相に溶解するポリエチレングリコール１０００であり、第２の相成分は１５重量％の濃度で第２の相に溶解する二塩基性リン酸カリウムである、
    （ｂ）水溶液に溶解するときに第２の水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成できる第３の相成分と第４の相成分とを含む、第２の組成物と、
    ここで、第３の相成分は８～１１重量％の濃度で第３の相に溶解するポリエチレングリコール６０００であり、第４の相成分は２０～２２重量％の濃度で第４の相に溶解する二塩基性リン酸カリウムである、
    を含む、
    試料から２５０ｂｐ以下の核酸断片を選択的に単離及び濃縮するためのキット。
  18. 前記ポリエチレングリコール６０００の濃度が１１重量％であり、前記二塩基性リン酸カリウムの濃度が２０重量％である、請求項１７に記載のキット。
  19. 前記ポリエチレングリコール６０００の濃度が８重量％であり、前記二塩基性リン酸カリウムの濃度が２２重量％である、請求項１７に記載のキット。
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