CN111356770A - 使用双水相系统来分离、纯化和/或浓缩短链核酸片段的方法 - Google Patents
使用双水相系统来分离、纯化和/或浓缩短链核酸片段的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111356770A CN111356770A CN201880071741.5A CN201880071741A CN111356770A CN 111356770 A CN111356770 A CN 111356770A CN 201880071741 A CN201880071741 A CN 201880071741A CN 111356770 A CN111356770 A CN 111356770A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- phase
- acid fragments
- composition
- atps
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 147
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 title description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 79
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 61
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 59
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 62
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 58
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 25
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 claims description 16
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 14
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 12
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 10
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 9
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 9
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 claims description 9
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 9
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 8
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 8
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 7
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 7
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 6
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 6
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002432 poly(vinyl methyl ether) polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 6
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 6
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 6
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 claims description 6
- 229960002635 potassium citrate Drugs 0.000 claims description 6
- QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K potassium citrate (anhydrous) Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 235000011082 potassium citrates Nutrition 0.000 claims description 6
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 6
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 5
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 claims description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 125000005702 oxyalkylene group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical compound CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CBXCPBUEXACCNR-UHFFFAOYSA-N tetraethylammonium Chemical compound CC[N+](CC)(CC)CC CBXCPBUEXACCNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylammonium Chemical compound C[N+](C)(C)C QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OSBSFAARYOCBHB-UHFFFAOYSA-N tetrapropylammonium Chemical compound CCC[N+](CCC)(CCC)CCC OSBSFAARYOCBHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-O tributylazanium Chemical compound CCCC[NH+](CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 5
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O triethylammonium ion Chemical compound CC[NH+](CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 5
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N tripropylamine Chemical compound CCCN(CCC)CCC YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 4
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 37
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 16
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 195
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 125
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 33
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 31
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 7
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N Cyclopentane Chemical compound C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 ammonium acetate Chemical class 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol monoethoxylate Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCO)C=C1 JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000002637 fluid replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N heptamethylene Natural products C1CCCCCC1 DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002964 rayon Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229920002050 silicone resin Polymers 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及使用双水相系统(ATPS)分离、浓缩和/或纯化具有约或少于250碱基对(bp)的短链核酸片段的方法。在一个实施例中,本发明提供了用于从含有核酸的生物材料中纯化具有约或少于250个碱基对的短链核酸片段的组合物和试剂盒。在另一个实施例中,本发明提供了某些盐和/或聚合物在双相系统中的用途,所述双相系统用于从含有核酸的生物材料中纯化具有约或少于250个碱基对的短链核酸片段。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月18日提交的美国序列号62/560,180的优先权,该申请的全部内容和公开通过引用结合到本申请中。
技术领域
本发明涉及在双水相系统(ATPS)中分离、浓缩和/或纯化短链核酸片段的方法。特别地,本发明提供一种用于从生物材料中分离、浓缩和/或纯化短链核酸片段的方法、一种试剂盒、和ATPS组分。本申请引用了各种出版物,其全部内容通过引用结合到本申请中。
背景技术
自从1983年发现聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)或简称PCR以来,已经对全基因组进行了测序,使得在生命科学和关键医学发展的基础研究中的诸多发现成为可能。为了使PCR效率更高、有效性更强、成本更低,整个技术创新领域因此诞生。并且由于核酸既是PCR的输入又是输出,因此不懈的努力已经并且正在继续进行,以使其上游制备和下游分析更准确、更精确、更快速和更具成本效益。
效率的边际收益随着规模收益递减而达到稳定水平。当需要分离长度小于250碱基对(bp)的小片段核酸时,这个瓶颈尤为明显。需要对小片段核酸(NA)进行分离、纯化和浓缩的一个领域是最近出现的液体活检领域。液体活检是通过捕获和扩增无细胞DNA(cfDNA),特别是循环肿瘤DNA(ctDNA),从而对处于缓解中的患者进行肿瘤发生或癌症复发的早期诊断。循环肿瘤DNA(circulating tumor ctDNA)是一种衍生自肿瘤细胞的DNA片段,其大小在100-300个碱基对之间。这些肿瘤细胞释放的循环游离DNA(cfDNA)保留了原组织的特征。与常规活检相比,分析和研究cfDNA允许通过非侵入性过程对肿瘤进行遗传学表征。cfDNA分析是检测和监测整个疾病过程中基因组变化的一种非侵入性的快速替代方法。现有的技术允许从不同来源的细胞/组织中提取DNA。可以使用不同的方案,将其商业化为“试剂盒”,其可以用于从不同材料(生物流体、细胞培养物、新鲜或冷冻组织样品)中提取核酸。cfDNA浓度通常非常低,并且cfDNA高度片段化且具有短峰片段(例如小于250bp)。特别地,在尿液中常出现的约160-165bp的核酸,是用于液体活检的更理想的样品类型。因此,从生物样品中分离cfDNA的提取方法可以显著影响cfDNA的产量,这可能进一步影响不同测试的特征和临床验证的程度。
这里的挑战是针对生物基质的复杂背景分离、纯化和浓缩非常稀有和稀疏的核酸片段。通常,相关片段的产量很低,以至于随后的PCR结果可能没有足够的诊断敏感性和特异性。因此,迫切需要开发一种新的且更有效的分离、纯化和浓缩小于250bp的核酸片段的方法。
已经开发了多种不同的方法用于从生物样品中分离核酸,例如,涉及选择性吸附核酸到基质的方法,以及涉及从可溶性核酸中除去污染物的方法。目前可用的纯化方法基于苯酚/氯仿的使用、盐析、离液盐和硅树脂的使用、亲和树脂的使用、离子交换色谱、和如美国专利号5,057,426、4,923,978、EP专利0512767A1、EP 0515484B以及WO 95/13368、WO97/10331和WO 96/18731中所述的磁珠的使用。
还存在通过WO2004/106516中描述的双水相系统(ATPS)的已知方法来纯化质粒DNA和通过Journal of Chromatography A,1082(2005),176-184中的双水相提取和疏水相互作用色谱来纯化质粒DNA载体。这两种方法均公开了ATPS用于质粒DNA纯化的用途,但它们都没有被设计成用于分离长度为250bp或更短的核酸。不预期用于纯化大核酸分子的现有方法能够纯化具有足够的纯度的250bp或更短的短链核酸,以获得令人满意的下游应用表现。
制备专门用于分离、纯化和浓缩250bp或更小的核酸片段的生物样品的需要在研究和工业领域都是非常重要的,但是现有方法对这种需求基本上无法满足。尽管已经描述了使用不同化学制剂在水相系统中实现种类分离的各种方法,但是尚未成功地尝试将这种可能性用于以时间有效、成本有效、简单、快速的方式分离、纯化和浓缩250bp或更小的核酸片段并且提供优异的产量,而本发明已经证明已经实现了这一点。
发明内容
本发明涉及在双水相系统(ATPS)中分离、浓缩和/或纯化短链核酸片段。在一个实施例中,本发明提供一种使用ATPS分离、浓缩和/或纯化具有约或少于250个碱基对(bp)的短链核酸片段的方法。在一个实施例中,本发明提供一种用于从含有核酸的生物材料中纯化具有约或少于250个碱基对的短链核酸片段的组合物和试剂盒。在另一个实施例中,本发明提供一种在ATPS中使用特定的盐和/或聚合物以从含有核酸的生物材料中纯化具有约或少于250个碱基对的短链核酸片段的用途。
附图说明
图1A和1B示出了通过添加聚合物和盐诱导的相分离。图1A中的试管由两个分离的相组成,其中顶部/底部相体积比为1:1。图1B中的试管示出两个分离的相,其中顶部/底部相体积比为9:1。通过调节ATPS组分,顶部相与底部相的体积比可以从1:1变为9:1,并且可以进一步改变以将靶标分子浓缩到具有较小体积的相中。图1B示出出了典型的情况,其中靶标分子浓缩在底部相中(以较深的颜色示出)。
图2示出了通过本发明的一个实施例来纯化的DNA的凝胶电泳图像。
图3示出了根据本发明的一个实施例不同大小的核酸分配到两个不同相的凝胶电泳图像。
图4示出了根据本发明的一个实施例来提取的不同大小的DNA回收百分比(%)。
图5比较了通过本发明的一个实施例和通过QIAamp Blood DNA mini试剂盒提取的不同大小的DNA回收百分比(%)。
具体实施方式
在下面的描述中,描述了本发明的几个实施例。为解释起见,提出了具体的配置和细节,以便对实施例提供透彻的理解。此外,对于一个词的复数或单数形式,以及说明实施例的方向范围被描述为“顶部”、“底部”、“前面”、“后面”、“左”、“右”之类,这些字眼是帮助读者理解实施例,并不意味着要限制本发明。对于本领域的技术人员来说,本发明可以在没有具体细节的情况下被实施。以下的实施例让本发明更容易理解,但本领域技术人员将很容易明白,具体的例子只是为了说明目的,而不应限制本发明的范围;本发明的范围由后附的权利要求书限定。应当指出的是,与“含有”或“其特征在于”同义的连接词“包含”或“包括”是包含在内的或开放式的,并且不排除额外的丶未指出的元素或方法步骤。
在本发明中,已经对双水相系统(ATPS)进行适应性修改以用于从各种生物材料中分离、浓缩和/或纯化具有约或少于250个碱基对(bp)的短链核酸片段。
在一个实施例中,本发明提供一种使用双水相系统(ATPS)分离、浓缩和/或纯化具有约或少于250个碱基对(bp)的短链核酸片段的方法。在一个实施例中,该方法包括以下步骤
(a)提供ATPS组合物;和
(b)将所述ATPS组合物与包含短链核酸片段的样品溶液接触或混合,
(c)允许所述ATPS和样品溶液的混合物分离成第一相和第二相,
其中短链核酸片段分配到第一相溶液或第二相溶液中,从而分离和浓缩短链核酸片段。
在一个实施例中,本发明提供一种用于从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的组合物,该组合物包含第一相组分和第二相组分,当该组分在水溶液中溶解时能够形成双水相系统(ATPS)。在一个实施例中,第一相组分是聚合物、盐或胶束溶液中的一种或多种。在一个实施例中,第二相是聚合物、盐或胶束溶液中的一种或多种。在一个实施例中,第一相组分是聚合物,第二相是盐。在一个实施例中,250bp或更小的核酸片段浓缩在一个相中。
在一个实施例中,本发明提供一种从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的方法,该方法将本文所述的组合物与包含短链核酸片段的样品溶液混合,从而分离和浓缩短链核酸片段。
在一个实施例中,短链核酸片段是编码DNA、非编码DNA、信使RNA、核糖体RNA、微RNA或转移RNA。在一个实施例中,短链核酸片段是无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
ATPS(双水相系统)
类似于油-水系统,ATPS由两个不同的液相组成,其比例可以很容易地控制。悬浮在ATPS系统中的生物分子基于它们的物理化学性质(例如,亲水性和两相的界面张力)被分配到两个水相中的其中一个,藉此浓缩目标生物分子。
在一个实施例中,本发明提供一种两组分双水相系统(ATPS),用于从样品中分离/浓缩/纯化/回收一种或多种短链核酸片段或靶标分子(例如核酸分子)。由于它们的不同性质,混合物中的不同分子将在两相之间差异地分布,并且可以使用ATPS以最少的设置和人为干预来分离和浓缩靶标分子。在一个实施例中,不需要动力或设备来实现相分离,因为流体流动完全依赖于基于等温动力学原理的毛细管作用。
本发明的优点是可以简单的方式获得高纯度和浓度的靶标分子并且与下游应用兼容,包括但不限于扩增(例如通过PCR)、测序、标记或检测(例如通过杂交或侧流免疫测定(LFA)),且无需进一步纯化或浓缩步骤。
本发明提供的方法和设备是稳健、价格低廉、简单、易于处理、安全、用户友善和快捷的。本方法能够纯化和浓缩一个或多个短链核酸片段或靶标分子,从而确保使用纯化和浓缩的分子的下游应用的表现不会受到原样品中杂质的影响。
由于本文所述的独特功能,本发明可以方便和快捷地纯化和浓缩靶标分子,而无需使用复杂仪器,并且适用于含一个或多个量非常低或体积小的短链核酸片段或靶标分子的样品。此外,本方法易适用于自动化,包括高通量筛选系统。
使用ATPS(双水相系统)来分离和/或浓缩小的核酸片段
在一个实施例中,本发明用于从样品中分离、纯化、回收和浓缩一种或多种短链核酸片段或靶标分子。在一个实施例中,本发明能够将一种或多种短链核酸片段或靶标分子与非靶标分子分离,并同时浓缩靶标核酸分子。
在本发明的一个实施例中,短链核酸片段或靶标分子保留在嵌入ATPS的多孔材料上,而非靶标材料被留在液体系统中(即原始样品加上任何非ATPS组分)。在一个实施例中,非靶标材料保留在嵌入ATPS的多孔材料上,而短链核酸片段或靶标分子被留在液体系统中(即原始样品加上任何非ATPS组分)。
在本发明中,双水相系统(ATPS)已经适用于从各种生物材料中分离、浓缩和/或纯化具有约或少于250个碱基对的短链核酸片段。
在一个实施例中,本发明提供一种使用双水相系统(ATPS)分离、浓缩和/或纯化具有约或少于250个碱基对的短链核酸片段的方法。在一个实施例中,该方法包括以下步骤
(a)提供包含第一相溶液和第二相溶液的ATPS组合物;和
(b)使所述ATPS组合物与包含短链核酸片段的样品溶液接触;和
(c)允许短链核酸片段浓缩在第一相溶液或第二相溶液中,从而分离、浓缩和/或纯化短链核酸片段。
在一个实施例中,ATPS组合物是包含聚合物、盐和表面活性剂的ATPS组分的混合相溶液。在一个实施例中,组合物在与样品溶液接触后分离成第一相溶液和第二相溶液,从而引发相分离。
在一个实施例中,核酸是无细胞DNA(cfDNA)。在本文中,“无细胞DNA”(cfDNA)是存在于细胞外的DNA,例如存在于受试者的血液、血浆、血清或尿液中的DNA。在不受任何特定理论或机制的束缚下,相信cfDNA是释放自或源自细胞,例如通过细胞凋亡。如本文所用,“天然cfDNA”或“受试者的cfDNA”是指释放自或源自受试者的细胞(例如,非癌细胞)的无细胞DNA。如本文所用,“非天然cfDNA”或“cfDNA不是受试者天然的”是指来自非天然来源的无细胞DNA,其在序列方面不同于受试者的cfDNA,例如一个或多个包括但不限于本文所述的基因座的序列同一性差异。非天然DNA的实例包括但不限于移植供体DNA和癌症/肿瘤DNA。非天然cfDNA的实例包括但不限于移植供体cfDNA(在本文中也称为供体特异性cfDNA)和肿瘤cfDNA(在本文中也称为癌症特异性cfDNA)。非天然cfDNA的来源取决于受试者。作为另一个例子,非天然cfDNA包括细菌、真菌和病毒DNA。例如,如果受试者是移植受体,则可以从捐赠的移植器官(供体特异性cfDNA)中脱落非天然cfDNA,并且可以通过来自宿主/受试者(宿主cf-DNA)的细胞脱落天然cfDNA。如果受试者患有癌症,则可以例如通过肿瘤和/或转移(癌症特异性cf-DNA)脱落非天然cfDNA,并且可以例如通过受试者的非癌细胞脱落天然cf-DNA。
在一个实施例中,核酸是存在于癌症患者的血浆或血清中的循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在一个实施例中,本发明的短链核酸片段的大小等于或小于250bp。在另一个实施例中,短链核酸片段的大小为160-165bp。在另一个实施例中,短链核酸片段大小为约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250bp。
在一个实施例中,将短链核酸片段分配到第一相溶液中。在另一个实施例中,将短链核酸片段分配到第二相中。在另一个实施例中,将短链核酸片段分配到第一相溶液和第二相溶液的界面中。
在一个实施例中,样品溶液是含核酸的样品或含核酸的生物材料。本发明的重要性在于含核酸的样品和含核酸的生物材料的处理和制备,所述生物材料包括但不限于组织、血液、血浆、血清、脑脊髓液(CSF)、尿液、唾液、粪便物质及诸如泪液、痰液、鼻咽粘液、阴道分泌物、阴茎分泌物的分泌物。
在本发明中的各种实施例可以使用的各种ATPS系统包含但不限于聚合物-盐(如PEG-盐)、聚合物-聚合物(如PEG-右旋糖酐、PEG-聚丙烯酸酯)、胶束(如Triton X-114)、盐-胶束(如盐-Triton X-114)或聚合物-胶束(如PEG-Triton X-114)。
在一个实施例中,第一和/或第二相溶液包含聚合物。在一个实施例中,所述聚合物包含但不限于聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)如疏水改性的聚亚烷基二醇、聚(氧化烯)聚合物(poly(oxyalkylene)polymer)、聚(氧化烯)共聚物(poly(oxyalkylene)copolymer)如疏水改性的聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)(PVA)、聚乙烯基己内酰胺(polyvinyl caprolactam)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methylether)、烷氧基化表面活性剂(alkoxylated surfactant)、烷氧基化淀粉(alkoxylated starch)、烷氧基化纤维素(alkoxylated cellulose)、烷基羟烷基纤维素(alkyl hydroxyalkyl cellulose)、有机硅改性聚醚(silicone-modifiedpolyether)和聚N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide)及其共聚物。在另一个实施例中,第一聚合物包含聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇(polypropyleneglycol)、聚丙烯酸酯(polyacrylate)或右旋糖酐(dextran)。在一个实施例中,聚合物是UCONTM聚合物(Dow Chemical Company)或FicollTM聚合物(Sigma-Aldrich)。
在一个实施例中,第一相溶液或第二相溶液的聚合物浓度在大约0.01%到大约90%的范围内(w/w)(按水溶液的总重量)。在多个实施例中,聚合物溶液是选自约0.01%w/w、约0.05%w/w、约0.1%w/w、约0.15%w/w、约0.2%w/w、约0.25%w/w、约0.3%w/w、约0.35%w/w、约0.4%w/w、约0.45%w/w、约0.5%w/w、约0.55%w/w、约0.6%w/w、约0.65%w/w、约0.7%w/w、约0.75%w/w、约0.8%w/w、约0.85%w/w、约0.9%w/w、约0.95%w/w、或约1%w/w的聚合物溶液。在某些实施例中,聚合物溶液是选自约1%w/w、约2%w/w、约3%w/w、约4%w/w、约5%w/w、约6%w/w、约7%w/w、约8%w/w、约9%w/w、约10%w/w、约11%w/w、约12%w/w、约13%w/w、约14%w/w、约15%w/w、约16%w/w、约17%w/w、约18%w/w、约19%w/w、约20%w/w、约21%w/w、约22%w/w、约23%w/w、约24%w/w、约25%w/w、约26%w/w、约27%w/w、约28%w/w、约29%w/w、约30%w/w、约31%w/w、约32%w/w、约33%w/w、约34%w/w、约35%w/w、约36%w/w、约37%w/w、约38%w/w、约39%w/w、约40%w/w、约41%w/w、约42%w/w、约43%w/w、约44%w/w、约45%w/w、约46%w/w、约47%w/w、约48%w/w、约49%w/w、约50%w/w的聚合物溶液。在一个实施例中,聚合物浓度为大约0.01%至40%w/w。在一个实施例中,聚合物浓度为大约6%至35%w/w。在一个实施例中,聚合物浓度为大约10%至30%w/w。
在一个实施例中,第一和/或第二相溶液包含盐,从而形成盐溶液。在一个实施例中,本发明的盐包含但不限于亲液盐、离液盐和具有诸如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵或四丁基铵的阳离子和诸如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子或碳酸氢根的阴离子的无机盐。在另一实施例中,盐选自氯化钠(NaCl)、磷酸钠(Na3PO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸一氢钠(Na2HPO4)、磷酸钾(K3PO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸钠(Na2SO4)、硫酸氢钠(NaHSO4)、柠檬酸钾(potassium citrate)、硫酸铵((NH4)2SO4)、柠檬酸钠(sodium citrate)、醋酸钠(sodiumacetate)或其组合。也可以使用其他盐,例如醋酸铵。在一个实施例中,两种或多种盐用于调节pH值或改变相之间的界面张力。
在一个实施例中,盐总浓度在约0.01%至约90%的范围内。本领域的技术人员会明白,形成双水相系统所需的盐的量会受到聚合物分子量、浓度和物理状态的影响。
在各种实施例中,盐溶液为约0.001%到90%w/w。在各种实施例中,盐溶液为约0.01%w/w、约0.05%w/w、约0.1%w/w、约0.15%w/w、约0.2%w/w、约0.25%w/w、约0.3%w/w、约0.35%w/w、约0.4%w/w、约0.45%w/w、约0.5%w/w、约0.55%w/w、约0.6%w/w、约0.65%w/w、约0.7%w/w、约0.75%w/w、约0.8%w/w、约0.85%w/w、约0.9%w/w、约0.95%w/w、或约1%w/w。在某些实施例中,盐溶液为约1%w/w、约2%w/w、约3%w/w、约4%w/w、约5%w/w、约6%w/w、约7%w/w、约8%w/w、约9%w/w、约10%w/w、约11%w/w、约12%w/w、约13%w/w、约14%w/w、约15%w/w、约16%w/w、约17%w/w、约18%w/w、约19%w/w、约20%w/w、约21%w/w、约22%w/w、约23%w/w、约24%w/w、约25%w/w、约26%w/w、约27%w/w、约28%w/w、约29%w/w、约30%w/w、约31%w/w、约32%w/w、约33%w/w、约34%w/w、约35%w/w、约36%w/w、约37%w/w、约38%w/w、约39%w/w、约40%w/w、约41%w/w、约42%w/w、约43%w/w、约44%w/w、约45%w/w、约46%w/w、约47%w/w、约48%w/w、约49%w/w、约50%w/w。在一个实施例中,盐浓度为约2%到40%w/w。在一个实施例中,盐浓度为约3%到30%w/w。在一个实施例中,盐浓度为约5%到20%w/w。
在一个实施例中,第一相溶液和/或第二相溶液包含与水不相容的溶剂。在某些实施例中,溶剂包含非极性有机溶剂。在某些实施例中,溶剂包含油。在某些实施例中,溶剂可以是戊烷、环戊烷、苯、1,4-二恶烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿、甲苯或己烷。
在一个实施例中,第一相溶液和/或第二相溶液包含胶束溶液。在某些实施例中,胶束溶液包含非离子表面活性剂。在某些实施例中,胶束溶液包含洗涤剂。在某些实施例中,胶束溶液包含Triton-X。在某些实施例中,胶束溶液包含类似于Triton-X的聚合物,如Igepal CA-630和Nonidet P-40。在某些实施例中,胶束溶液主要由Triton-X组成。
在一个实施例中,第一相溶液包含胶束溶液,而第二相溶液包含聚合物。在一个实施例中,第二相溶液包含胶束溶液,而第一相溶液包含聚合物。在一个实施例中,第一相溶液包含胶束溶液,而第二相溶液包含盐。在一个实施例中,第二相溶液包含胶束溶液,而第一相溶液包含盐。在一个实施例中,胶束溶液为Triton-X溶液。在一个实施例中,第一相溶液包含第一聚合物,而第二相溶液包含第二聚合物。在一个实施例中,第一/第二聚合物选自聚乙二醇和右旋糖酐。在一个实施例中,第一相溶液包含聚合物,而第二相溶液包含盐。在一个实施例中,第二相溶液包含聚合物,而第一相溶液包含盐。在某些实施例中,第一相溶液包含聚乙二醇,而第二相溶液包含磷酸钾。在某些实施例中,第二相溶液包含聚乙二醇,而第一相溶液包含磷酸钾。在一个实施例中,第一相溶液包含盐,而第二相溶液包含盐。在一个实施例中,第一相溶液包含亲液盐,而第二相溶液包含离液盐。在某些实施例中,第二相溶液包含亲液盐,而第一相溶液包含离液盐。
在一个实施例中,第一相溶液与第二相溶液的比率在1:1到1:1000的范围内。在某些实施例中,第一相溶液与第二相溶液的比率可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10的比率。在某些实施例中,第一相溶液与第二相溶液的比率可以为约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90、约1:100的比率。在某些实施例中,第一相溶液与第二相溶液的比率为约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:600、约1:700、约1:800、约1:900、约1:1000。
在一个实施例中,第二相溶液与第一相溶液的比率为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、或约1:10。在某些实施例中,第二相溶液与第一相溶液的比率为约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90、或约1:100。在某些实施例中,第二相溶液与第一相溶液的比率为约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:600、约1:700、约1:800、约1:900、或约1:1000。
在ATPS的第一相溶液和第二相溶液是聚合物的一个实施例中,在ATPS和样品的混合物的相分离之后,第一相溶液或第二相溶液的聚合物浓度在约0.01%至约90%的范围内(w/w)(按水溶液的总重量)。在各种实施例中,该浓度是约0.01%w/w、约0.05%w/w、约0.1%w/w、约0.15%w/w、约0.2%w/w、约0.25%w/w、约0.3%w/w、约0.35%w/w、约0.4%w/w、约0.45%w/w、约0.5%w/w、约0.55%w/w、约0.6%w/w、约0.65%w/w、约0.7%w/w、约0.75%w/w、约0.8%w/w、约0.85%w/w、约0.9%w/w、约0.95%w/w、或约1%w/w。在某些实施例中,盐溶液选自聚合物溶液,所述聚合物溶液为约1%w/w、约2%w/w、约3%w/w、约4%w/w、约5%w/w、约6%w/w、约7%w/w、约8%w/w、约9%w/w、约10%w/w、约11%w/w、约12%w/w、约13%w/w、约14%w/w、约15%w/w、约16%w/w、约17%w/w、约18%w/w、约19%w/w、约20%w/w、约21%w/w、约22%w/w、约23%w/w、约24%w/w、约25%w/w、约26%w/w、约27%w/w、约28%w/w、约29%w/w、约30%w/w、约31%w/w、约32%w/w、约33%w/w、约34%w/w、约35%w/w、约36%w/w、约37%w/w、约38%w/w、约39%w/w、约40%w/w、约41%w/w、约42%w/w、约43%w/w、约44%w/w、约45%w/w、约46%w/w、约47%w/w、约48%w/w、约49%w/w、和约50%w/w。在一个实施例中,第一相溶液中的聚合物浓度为约10%至50%w/w、而第二相溶液中的浓度为约0.01%至6%w/w。在另一个实施例中,第一相溶液中的聚合物浓度为约22%至45%w/w、而另一相中的浓度为约0.01%至4%w/w。
在ATPS的第一相溶液和第二相溶液是盐的各种实施例中,在ATPS和样品的混合物的相分离之后,第一相溶液或第二相溶液的盐浓度在约0.001%至约90%的范围内(w/w)(按水溶液的总重量)。在各种实施例中,盐的浓度是约0.01%w/w、约0.05%w/w、约0.1%w/w、约0.15%w/w、约0.2%w/w、约0.25%w/w、约0.3%w/w、约0.35%w/w、约0.4%w/w、约0.45%w/w、约0.5%w/w、约0.55%w/w、约0.6%w/w、约0.65%w/w、约0.7%w/w、约0.75%w/w、约0.8%w/w、约0.85%w/w、约0.9%)w/w、约0.95%w/w、或约1%w/w。在某些实施例中,盐溶液选自聚合物溶液,所述聚合物溶液为约1%w/w、约2%w/w、约3%w/w、约4%w/w、约5%w/w、约6%w/w、约7%w/w、约8%w/w、约9%w/w、约10%w/w、约11%w/w、约12%w/w、约13%w/w、约14%w/w、约15%w/w、约16%w/w、约17%w/w、约18%w/w、约19%w/w、约20%w/w、约21%w/w、约22%w/w、约23%w/w、约24%w/w、约25%w/w、约26%w/w、约27%w/w、约28%w/w、约29%w/w、约30%w/w、约31%w/w、约32%w/w、约33%w/w、约34%w/w、约35%w/w、约36%w/w、约37%w/w、约38%w/w、约39%w/w、约40%w/w、约41%w/w、约42%w/w、约43%w/w、约44%w/w、约45%w/w、约46%w/w、约47%w/w、约48%w/w、约49%w/w、约50%w/w。在一个实施例中,第一相中的盐浓度为约0.01%至10%w/w,而第二相中的盐浓度为约20%至40%w/w。在另一个实施例中,第一相中的盐浓度为约0.01%至6%w/w,而第二相中的盐浓度为约22%至35%w/w。
在一个实施例中,本发明提供用于分离和/或浓缩短链核酸片段的组合物,该组合物包含能够形成双水相系统(ATPS)的组分。
在一个实施例中,本组合物包含混合相溶液,其包含第一相溶液和第二相溶液,包括在前面的描述中所描述的那些。
在一个实施例中,用于分离和/或浓缩短链核酸片段的本组合物包含聚乙二醇(PEG)6000和磷酸氢二钾(K2HPO4)。在一个实施例中,用于分离和/或浓缩短链核酸片段的本组合物包含约5-20%的聚乙二醇(PEG)6000和5-35%的K2HPO4。在另一个实施例中,用于分离和/或浓缩短链核酸片段的本组合物包含8%聚乙二醇(PEG)6000和22%K2HPO4。
在一个实施例中,用于分离和/或浓缩短链核酸片段的本组合物包含聚乙二醇(PEG)1000和K2HPO4。在一个实施例中,用于分离和/或浓缩短链核酸片段的本组合物包含约10-30%聚乙二醇(PEG)1000和5-20%的K2HPO4。在另一个实施例中,用于分离和/或浓缩短链核酸片段的本组合物包含15%聚乙二醇(PEG)1000和15%K2HPO4。
在一个实施例中,用于分离和/或浓缩短链核酸片段的本组合物包含聚乙二醇(PEG)1000和磷酸氢二钾(K2HPO4)和磷酸二氢钾(KH2PO4)的混合物。
调整浓缩系数
举例来说,在一些实施例中,例如,通过使用第一相溶液与第二相溶液的体积比为1:9,靶标短链核酸片段在第一相溶液中浓缩10倍。。
在一个实施例中,ATPS组分的相对量可以调整。对ATPS的两个组分的体积比进行了调控,使短链核酸片段或靶标分子在一个相中优先分离/纯化/浓缩/回收。
为了更好地量化与本发明相关的现象,开发了一种测定,以评估ATPS组分的相对量与达到的结果(例如,浓缩/分离/回收的效率)之间的关系。通过调整ATPS组分的相对量,可以选择和微调浓缩系数、分离效率、和回收率。
在一个实施例中,通过改变ATPS组分的浓度可以容易地控制ATPS中两相之间的比例。图1A-B示出了通过向溶液中加入不同的ATPS组分(例如聚合物和盐)诱导的相分离浓度。ATPS组分和样品以1:1混合。通过调节ATPS组分,混合物相分离并且靶标分子分配到两相之一。图1B示出靶标分子在底部相中以9:1的体积比浓缩。可以进一步改变顶部相与底部相的体积比以将靶标分子浓缩在具有较小体积的相中。
在另一个实施例中,通过调节ATPS组分(例如,向混合物中添加额外的相同或不同类型的ATPS组分,或在制备最终溶液时改变要添加到混合物中的ATPS组分的相对体积或浓度,或在制备最终溶液时调整要加入系统的样品溶液的体积)可以改变最终混合物中ATPS组分的相对体积或浓度。在一个实施例中,顶部相与底部相的体积比可以是从1:1变为9:1或更高的比率。可以利用这种现象来浓缩靶标分子而无需电力、设备或培训。在一种简单的介质中,如水或盐溶液,这点对再生产来说重要性不大;然而,考虑到具有高可变性和可能的其他干扰物质的复杂介质(例如唾液、血液、尿液、血浆、血清、脑脊髓液(CSF)、粪便物质和分泌物,例如泪液、痰液、鼻咽粘液、阴道分泌物和阴茎分泌物),更难以实现有用的体积比。从复杂介质中去除干扰物质可能会有所帮助。例如,柠檬酸可用于从尿液中除去尿素,或者在本发明的一些实施例中,三氯乙酸可用于从唾液中除去蛋白质。
嵌入ATPS的多孔材料的设计
在一个实施例中,本方法提供了一种嵌入ATPS组分的多孔材料。在一个实施例中,当样品经过嵌入ATPS组分的多孔材料时,可以分离和浓缩短链核酸片段。在一个实施例中,从多孔材料中直接收集分离和浓缩的短链核酸片段用于随后的分析或储存。
多孔材料可以由能够吸收和转移液体的任何合适的多孔材料制成。本发明适用的多孔材料包含但不限于玻纤纸、棉基纸、其他类型的纸张、聚合物泡沫、纤维素泡沫、其他类型的泡沫、人造丝织物、棉织物、其他类型的织物、木材、石材和任何其他能吸收和转移液体的材料。
在一个实施例中,ATPS包含混合相溶液,其包含第一相溶液和第二相溶液,其中第一相溶液的组分和第二相溶液的组分以当混合相溶液流过多孔材料时足够进行相分离的浓度或装载量被嵌入在所述多孔材料中。
在一个实施例中,ATPS组分以当混合相溶液流过多孔材料时足够进行相分离的浓度或装载量被嵌入在所述多孔材料中。
在一个实施例中,将一些ATPS组分嵌入在多孔材料中,然后在将含有靶标核酸片段的样品添加到所述多孔材料之前脱水。
在一个实施例中,一些ATPS组分嵌入多孔材料中然后脱水("预处理的多孔材料”),而剩余的ATPS组分先与含有靶标核酸片段的样品混合,然后通过预处理的多孔材料内的相分离进行随后的分离和浓缩。
在一个实施例中,首先将一些ATPS组分与含有短链核酸片段的样品混合,然后将所得混合物嵌入在多孔材料中;然后将剩余的ATPS组分加入到多孔材料中以通过多孔材料内的相分离进行随后的分离/浓缩。
在一个实施例中,短链核酸片段与ATPS组分混合物接触或与ATPS组分混合,并在其通过多孔材料时分配在第一相溶液中、第二相溶液中,或第一相溶液和第二相溶液之间的界面(或中间相)中。
在一个实施例中,提供了一种在多孔材料内的两组分ATPS(双水相系统),用于分离样品中的短链核酸片段和长链核酸分子。在一个实施例中,当ATPS在多孔材料内进行相分离时,短链核酸片段和长链核酸分子分配到ATPS的不同相中。
在一个实施例中,多孔材料和ATPS经过选择,以使第一相溶液以第一速度流经多孔基质以及第二相溶液以第二速度流经多孔基质,其中第一速度和第二速度不同。
在一个实施例中,多孔材料是商用的或由自行制造的。
在一个实施例中,为了将ATPS组分整合到多孔材料中,将ATPS组分溶解在水(或合适的缓冲液)中并以一定比例和/或浓度施加在多孔材料上。然后将多孔材料置于冻干机中以除去水,导致ATPS组分直接嵌入到多孔材料中。在将样品引入多孔材料后,ATPS组分立即进行补液,从而分离样品中的短链核酸片段或靶标分子。在一个实施例中,短链核酸片段在流体流动的前沿浓缩。在一个实施例中,没有外部电源或设备用于提供驱动力。
使用侧流免疫测定(LFA)的改善诊断
通过本方法获得的短链核酸片段可以使用横侧流免疫测定(LFA)进行检测或分析。
侧流免疫测定(LFA)方法和设备已经被广泛地描述了,参见例如,Gordon和Pugh,美国专利号4,956,302;H.Buck,等人,WO 90/06511;T.Wang,美国专利号6,764,825;W.Brown,等人,美国专利号5,008,080;Kuo和Meritt,US 6,183,972,EP00987551A3。这些测定包含检测和定量分析物物质,它是由配体和受体组成的特定结合对中的成员。受体与配体的关系在于受体特定地与配体结合,能够将特定的配体或多种配体从其他具有相似特征的样品成分区分开。涉及抗体和抗原之间的反应的免疫学测定是特定结合测定的一个例子。其他的例子包括DNA和RNA杂交反应以及牵涉激素和其他生物受体的结合反应。
在一个实施例中,本发明能够浓缩指示受试者中存在的疾病的短链核酸片段,将所获得的产物进行需要检测或定量短链核酸片段的下游诊断步骤。由于短链核酸片段的浓度增加,因此预期本发明可降低信噪比并增强侧流免疫测定(LFA)中的阳性信号。因此,也可以降低假阳性率和假阴性率。浓度可以提高,因此可以检测到因其低丰度或受样品中的杂质干扰而无法检测的分子。
如果短链核酸片段的浓度极低,则可能产生假阴性结果。在一个实施例中,由于短链核酸片段的浓度增加,LFA的检测极限提高。结果,增加了测试的再现性。
在一个实施例中,本发明提供用于从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的组合物,所述组合物包含第一相溶液和第二相溶液,当组分溶解在水溶液中时能够形成双水相系统(ATPS)。在一个实施例中,第一相溶液是以5-20重量%(wt%)的浓度溶解在第一相中的聚合物,第二相溶液是以5-35wt%的浓度溶解在第二相中的盐,并且当核酸片段与ATPS混合时,所述片段在两相中的一相中被浓缩。
在本组合物的一个实施例中,聚合物是聚亚烷基二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酸酯、右旋糖酐、UCONTM聚合物或FicollTM聚合物。
在本组合物的一个实施例中,盐是亲液盐、离液盐、具有三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵或四丁基铵的阳离子和磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子或碳酸氢根的阴离子的无机盐、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、柠檬酸钠、醋酸钠或醋酸铵。
在本组合物的一个实施例中,聚合物是分子量为100-10,000Da的聚乙二醇。
在本组合物的一个实施例中,盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸钠和磷酸钠中的一种或多种。
在本组合物的一个实施例中,当样品与组合物混合时,所得混合物进行相分离,并且250bp或更小的核酸片段浓缩在两相之一中。在一个实施例中,大于250bp的核酸片段和250bp或更小的片段浓缩在ATPS的不同相中。
在本组合物的一个实施例中,核酸片段是编码DNA、非编码DNA、信使RNA、核糖体RNA、微RNA或转移RNA。在一个实施例中,核酸片段是无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
在本组合物的一个实施例中,样品是血液、血浆、血清、脑脊髓液、尿液、唾液、粪便物质、泪液、痰液、鼻咽粘液、阴道分泌物和阴茎分泌物。
在一个实施例中,本发明提供一种用于从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的方法,所述方法包括:
a)制备本申请中描述的组合物;
b)将来自步骤a)的组合物与含有样品的水溶液混合,允许所得混合物分配成两个相,并且所述核酸片段浓缩在两相中的一相中;和
c)从两相中的其中一相中分离核酸片段。
在一个实施例中,本发明提供一种用于从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的方法,所述方法包括:
a)制备包含第一相组分和第二相组分的组合物,当组分溶解在水溶液中时能够形成双水相系统(ATPS),并且第一相组分是在第一相中以5-20wt%的浓度溶解的聚合物,并且第二相组分是在第二相中以15-25wt%的浓度溶解的盐;
b)将步骤a)的组合物与含有所述样品的水溶液混合,允许所得混合物分配成两个相,并将所述核酸片段浓缩在两相中的一相中;和
c)分离两相中浓缩有核酸片段的一相。
在本方法的一个实施例中,该方法还包括从步骤c)中的相中回收核酸片段。
在本方法的一个实施例中,聚合物是聚亚烷基二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酸酯、右旋糖酐、UCONTM聚合物或FicollTM聚合物。
在本方法的一个实施例中,盐是亲液盐、离液盐、具有三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵或四丁基铵的阳离子和磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子或碳酸氢根的阴离子的无机盐、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、柠檬酸钠、醋酸钠或醋酸铵。
在本方法的一个实施例中,聚合物是分子量为100-10,000Da的聚乙二醇。
在本方法的一个实施例中,盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸钠和磷酸钠中的一种或多种。
在本方法的一个实施例中,在步骤b)中,大于250bp的核酸片段和250bp或更小的片段浓缩在ATPS的不同相中。
在本方法的一个实施例中,核酸片段是编码DNA、非编码DNA、信使RNA、核糖体RNA、微RNA和转移RNA。在一个实施例中,核酸片段是无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
在本方法的一个实施例中,样品是血液、血浆、血清、脑脊髓液、尿液、唾液、粪便物质、泪液、痰液、鼻咽粘液、阴道分泌物和阴茎分泌物。
在本方法的一个实施例中,与样品相比,核酸片段浓缩至少10倍。
通过参考下面的实施例可以更好地理解本方明。然而,本领域技术人员将很容易理解,所提供的例子仅仅是为了说明目的,而不意味着限制本发明的范围。本发明由随后的权利要求界定。
应注意,在本申请中,与“包括”,“含有”或“其特征在于”同义的过渡术语“包含”是包含在内的或开放式的,并且不排除另外的,未列举的元素或方法步骤。
【实施例】
实施例1-使用双水相系统从PBS溶液中选择性分离和浓缩短链核酸片段(<250bp)
将DNA梯(GeneRuler 1kb plus DNA Ladder,Thermo Fisher Scientific)加入到1mL由11%(w/w)聚乙二醇(PEG)6000和20%(w/w)K2HPO4的PBS溶液组成的双水相系统中,使最终DNA浓度为1μg/mL。彻底涡旋后,将混合物在10000rcf下离心10秒以进行相分离。顶部相与底部相的体积比约为1:3。提取顶部相和底部相并分别转移到新试管中。对提取的相进行乙醇沉淀,并通过凝胶电泳分离沉淀物,以便显示每个相中的DNA大小分配,如图3所示。大多数大于250bp的核酸分配到底部相(右侧泳道),而小于250bp的核酸分配到顶部相(左侧泳道)。由于顶部相与底部相的体积比为约1:3,因此从较长的核酸片段中分离出较短的核酸片段,随后浓缩成较小体积的溶液。
从上述步骤获得的短链核酸片段通过LFA进一步分析,其中未经ATPS浓缩的DNA样品作为对照。使用ImageJ或Gelanalyzer测量测试线的强度,而结果总结在下表1中:
表1-测试线的强度
实施例2-使用双水相系统从血浆样品中选择性分离和浓缩短链核酸片段(<250bp)
将DNA梯(GeneRuler 1kb plus DNA Ladder,Thermo Fisher Scientific)加入到500ul血浆样品中。将加了标样的血浆样品加入到500μl由15%(w/w)聚乙二醇(PEG)1000和15%(w/w)K2HPO4的MilliQ水溶液组成的双水相系统中,使最终DNA浓度为1μg/mL。彻底涡旋后,将混合物在10000rcf下离心10秒以进行相分离。顶部相与底部相的体积比约为1:1。
提取底部相并加入另一种由11%(w/w)聚乙二醇(PEG)6000和20%(w/w)K2HPO4组成的ATPS溶液中。彻底涡旋后,将混合物在10000rcf下离心10秒以进行相分离。顶部相与底部相的体积比约为1:3。提取顶部相和底部相并分别转移到新试管中。对提取的相进行乙醇沉淀,并通过凝胶电泳分离沉淀物,以显示分配到每个区域中的DNA大小分布(如图3所示)。大于250bp的核酸分配到底部相(右侧泳道),而小于250bp的核酸分配到顶部相(左侧泳道),因此,从样品溶液中分离出较小大小的核酸并浓缩成较小体积的溶液。
如本实施例中所述,通过ATPS分离和浓缩后,预计不同大小的DNA分子量标准品的回收率(如图4所示,其中回收百分比=回收的DNA的绝对产量/样品中的标样的DNA量)。发现小于250bp的DNA以高百分比回收,而大于250bp的DNA显著减少。它证明了本发明是特定于捕获小于250bp的DNA。
实施例3-双水相系统与QIAamp Blood DNA mini试剂盒(Qiagen)的比较
将不同大小(250、200、150、100、75、50、25bp)的已消化的DNA质粒加入到血浆样品中,使最终DNA浓度为100ng/mL。将1mL所得的加了标样的血浆样品加入到1mL由15%(w/w)聚乙二醇(PEG)1000和15%(w/w)K2HPO4的MilliQ水溶液组成的双水相系统中。彻底涡旋后,将混合物在10000rcf下离心10秒以进行相分离。顶部相与底部相的体积比约为1:1。
提取底部相并加入另一种由8%(w/w)聚乙二醇(PEG)6000和22%(w/w)K2HPO4组成的ATPS溶液中。彻底涡旋后,将混合物在10000rcf下离心10秒以进行相分离。顶部相与底部相的体积比约为1:5。提取顶部相并转移至新试管中。
使用QIAamp Blood DNA mini试剂盒(Qiagen),用1mL加了标样的血浆样品进行另一次提取。通过用Agilent Bioanalyzer对分离所得的核酸进行的电泳测定,比较两种不同方法对核酸的分离效果。结果在图5中示出。如图5所示,当使用本发明时,超过50-80%的短于250bp(25-200bp)的核酸被提取,同时约80%的150-200bp的核酸被提取。相反,发现到QIAamp Blood DNA mini试剂盒不能提取任何25bp的DNA。因此,与QIAamp Blood DNA mini试剂盒相比,本发明表现出改进的性能。
Claims (22)
1.一种用于从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的组合物,包含第一相组分和第二相组分,当所述组分溶解在水溶液中时能够形成双水相系统(ATPS),其中第一相组分是在第一相中以5-20wt%的浓度溶解的聚合物,并且第二相组分是在第二相中以5-35wt%的浓度溶解的盐,其中当所述核酸片段与所述ATPS混合时,将所述片段浓缩在两相中的其中一相中。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酸酯、右旋糖酐、UCONTM聚合物和FicollTM聚合物组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述盐选自由亲液盐、离液盐、具有三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵或四丁基铵的阳离子和磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子或碳酸氢根的阴离子的无机盐、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、柠檬酸钠、醋酸钠和醋酸铵组成的组。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物,其中所述聚合物是分子量为100-10,000Da的聚乙二醇。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物,其中所述盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸钠和磷酸钠中的一种或多种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物,其中当样品与组合物混合时,所得混合物进行相分离,并且250bp或更小的核酸片段浓缩在两相之一中。
7.根据权利要求6所述的组合物,其中所述大于250bp的核酸片段和250bp或更小的片段浓缩在ATPS的不同相中。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物,其中所述核酸片段选自由编码DNA、非编码DNA、信使RNA、核糖体RNA、微RNA和转移RNA组成的组。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物,其中所述核酸片段是无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物,其中所述样品选自由血液、血浆、血清、脑脊髓液、尿液、唾液、粪便物质、泪液、痰液、鼻咽粘液、阴道分泌物和阴茎分泌物组成的组。
11.一种用于从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的方法,包括:
a)制备权利要求1-7中任一项的组合物;
b)将步骤a)的组合物与含有所述样品的水溶液混合,允许所得混合物分配成两个相,其中核酸片段浓缩在两相中的一相中;和
c)从两相中的其中一相中分离核酸片段。
12.一种用于从样品中分离和浓缩250bp或更小的核酸片段的方法,包括:
a)制备包含第一相组分和第二相组分的组合物,当组分溶解在水溶液中时能够形成双水相系统(ATPS),其中第一相组分是在第一相中以5-20wt%的浓度溶解的聚合物,并且第二相组分是在第二相中以15-25wt%的浓度溶解的盐;
b)将步骤a)的组合物与含有所述样品的水溶液混合,允许所得混合物分配成两个相,并将核酸片段浓缩在两相中的一相中;和
c)分离两相中浓缩有核酸片段的一相。
13.根据权利要求12所述的方法,进一步包括从步骤c)中的相中回收所述核酸片段。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酸酯右旋糖酐、UCONTM聚合物和FicollTM聚合物组成的组。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法,其中所述盐选自由亲液盐、离液盐、具有三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵或四丁基铵的阳离子和磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子或碳酸氢根的阴离子的无机盐、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、柠檬酸钠、醋酸钠和醋酸铵组成的组。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法,其中所述聚合物是分子量为100-10,000Da的聚乙二醇。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法,其中所述盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸钠和磷酸钠中的一种或多种。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法,其中在步骤b)中,大于250bp的核酸片段和250bp或更小的片段浓缩在ATPS的不同相中。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法,其中所述核酸片段选自编码DNA、非编码DNA、信使RNA、核糖体RNA、微RNA和转移RNA。
20.根据权利要求12-18中任一项所述的方法,其中所述核酸片段是无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
21.根据权利要求12-20中任一项所述的方法,其中所述样品选自由血液、血浆、血清、脑脊髓液、尿液、唾液、粪便物质、泪液、痰液、鼻咽粘液、阴道分泌物和阴茎分泌物组成的组。
22.根据权利要求12-21中任一项所述的方法,其中与样品相比,所述核酸片段得以浓缩至少10倍。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311427568.7A CN117448315A (zh) | 2017-09-18 | 2018-09-17 | 使用双水相系统来分离、纯化和/或浓缩短链核酸片段的方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762560180P | 2017-09-18 | 2017-09-18 | |
US62/560,180 | 2017-09-18 | ||
PCT/US2018/051354 WO2019055926A2 (en) | 2017-09-18 | 2018-09-17 | METHOD FOR USING A TWO-PHASE AQUEOUS SYSTEM FOR ISOLATING, PURIFYING AND / OR CONCENTRATING SHORT NUCLEIC ACID FRAGMENTS |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311427568.7A Division CN117448315A (zh) | 2017-09-18 | 2018-09-17 | 使用双水相系统来分离、纯化和/或浓缩短链核酸片段的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111356770A true CN111356770A (zh) | 2020-06-30 |
CN111356770B CN111356770B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=65723855
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311427568.7A Pending CN117448315A (zh) | 2017-09-18 | 2018-09-17 | 使用双水相系统来分离、纯化和/或浓缩短链核酸片段的方法 |
CN201880071741.5A Active CN111356770B (zh) | 2017-09-18 | 2018-09-17 | 使用双水相系统来分离、纯化和/或浓缩短链核酸片段的方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311427568.7A Pending CN117448315A (zh) | 2017-09-18 | 2018-09-17 | 使用双水相系统来分离、纯化和/或浓缩短链核酸片段的方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20200208137A1 (zh) |
EP (2) | EP3684948B1 (zh) |
JP (2) | JP7323532B2 (zh) |
CN (2) | CN117448315A (zh) |
ES (1) | ES2964100T3 (zh) |
TW (1) | TW201920957A (zh) |
WO (1) | WO2019055926A2 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110484514A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-11-22 | 大连理工大学 | 利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018183465A1 (en) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | Chiu Yin To | Method for accurate diagnosis of a disease targeting biomarkers in liquid biopsy |
SG11201909324WA (en) | 2017-06-01 | 2019-11-28 | Yin To Chiu | Phase separation behavior modifying agents for aqueous two-phase separation within porous material |
WO2019046563A1 (en) | 2017-09-01 | 2019-03-07 | Phase Diagnostics, Inc. | METHOD AND DEVICE FOR USING AQUEOUS BIPHASE SYSTEMS (ATPS) TO IMPROVE THE DIAGNOSIS OF SEXUALLY TRANSMITTED INFECTIONS |
US11332796B2 (en) | 2018-01-19 | 2022-05-17 | Phase Scientific International, Ltd. | Composition and method for concentration and enrichment of nucleic acids |
US11479765B2 (en) | 2018-01-19 | 2022-10-25 | Phase Scientific International, Ltd. | Method of isolating exosomes using encapsulation and aqueous micellar system |
EP3740588A4 (en) | 2018-01-19 | 2021-10-20 | Phase Scientific International, Ltd. | METHOD OF ISOLATION AND PURIFICATION OF NUCLEIC ACIDS USING A SOLID-LIQUID PHASE SYSTEM |
CA3150638A1 (en) * | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Phase Scientific International, Ltd. | Method, composition and kit for size selective enrichment of nucleic acids |
WO2021185336A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Phase Scientific International, Ltd. | Compositions and methods for ribonucleic acid extraction |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102046643A (zh) * | 2008-05-30 | 2011-05-04 | 恰根有限公司 | 分离核酸的方法 |
US20140228549A1 (en) * | 2011-04-01 | 2014-08-14 | Technische Universitaet Dortmund | Process for separation/purification of biomolecules |
WO2016198519A1 (en) * | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Biocartis N.V. | Automatable method for nucleic acid isolation |
WO2017041030A1 (en) * | 2015-09-04 | 2017-03-09 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for analyte collection, extraction, concentration, and detection for clinical applications |
CN106662582A (zh) * | 2014-03-07 | 2017-05-10 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于整合分析物提取、浓缩和检测的装置 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW203120B (zh) | 1985-10-04 | 1993-04-01 | Abbott Lab | |
DE3639949A1 (de) | 1986-11-22 | 1988-06-09 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren |
US4956302A (en) | 1987-09-11 | 1990-09-11 | Abbott Laboratories | Lateral flow chromatographic binding assay device |
US4923978A (en) | 1987-12-28 | 1990-05-08 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Process for purifying nucleic acids |
US5079174A (en) | 1988-12-08 | 1992-01-07 | Boehringer Mannheim Corporation | Apparatus for sequential determination of an analyte in a fluid sample |
GB9003253D0 (en) | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
CA2067711C (en) | 1991-05-03 | 2000-08-08 | Daniel Lee Woodard | Solid phase extraction purification of dna |
GB9323305D0 (en) | 1993-11-11 | 1994-01-05 | Medinnova Sf | Isoaltion of nucleic acid |
GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
US5783686A (en) | 1995-09-15 | 1998-07-21 | Beckman Instruments, Inc. | Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures |
US7626017B2 (en) * | 1997-10-31 | 2009-12-01 | Pressure Biosciences, Inc. | Pressure-enhanced extraction and purification |
US6183972B1 (en) | 1998-07-27 | 2001-02-06 | Bayer Corporation | Method for the determination of analyte concentration in a lateral flow sandwich immunoassay exhibiting high-dose hook effect |
US6764825B1 (en) | 2000-10-13 | 2004-07-20 | Tang J. Wang | Methods and device for detecting prostate specific antigen (PSA) |
EP1633868A1 (de) | 2003-05-28 | 2006-03-15 | Qiagen GmbH | Verfahren zur gewinnung von plasmid-dna mittels eines wässrigen 2-phasensystems |
-
2018
- 2018-09-17 CN CN202311427568.7A patent/CN117448315A/zh active Pending
- 2018-09-17 CN CN201880071741.5A patent/CN111356770B/zh active Active
- 2018-09-17 JP JP2020536924A patent/JP7323532B2/ja active Active
- 2018-09-17 EP EP18855327.5A patent/EP3684948B1/en active Active
- 2018-09-17 EP EP23195254.0A patent/EP4303311A3/en active Pending
- 2018-09-17 ES ES18855327T patent/ES2964100T3/es active Active
- 2018-09-17 WO PCT/US2018/051354 patent/WO2019055926A2/en unknown
- 2018-09-17 US US16/646,582 patent/US20200208137A1/en not_active Abandoned
- 2018-09-18 TW TW107132800A patent/TW201920957A/zh unknown
-
2023
- 2023-05-16 US US18/318,711 patent/US20230287385A1/en active Pending
- 2023-06-07 JP JP2023094046A patent/JP2023113864A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102046643A (zh) * | 2008-05-30 | 2011-05-04 | 恰根有限公司 | 分离核酸的方法 |
US20140228549A1 (en) * | 2011-04-01 | 2014-08-14 | Technische Universitaet Dortmund | Process for separation/purification of biomolecules |
CN106662582A (zh) * | 2014-03-07 | 2017-05-10 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于整合分析物提取、浓缩和检测的装置 |
WO2016198519A1 (en) * | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Biocartis N.V. | Automatable method for nucleic acid isolation |
WO2017041030A1 (en) * | 2015-09-04 | 2017-03-09 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for analyte collection, extraction, concentration, and detection for clinical applications |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
STEVEN B. ZIMMERMAN等: ""Excluded Volume Effects on the Partition of Macromolecules Between Two Liquid Phases"" * |
STEVEN B. ZIMMERMAN等: ""Excluded Volume Effects on the Partition of Single- and Double-Stranded Oligodeoxynucleotides Between Two Liquid Phases"" * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110484514A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-11-22 | 大连理工大学 | 利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3684948B1 (en) | 2023-09-06 |
CN111356770B (zh) | 2023-12-08 |
US20200208137A1 (en) | 2020-07-02 |
EP4303311A3 (en) | 2024-04-03 |
EP3684948A2 (en) | 2020-07-29 |
WO2019055926A3 (en) | 2020-03-26 |
CN117448315A (zh) | 2024-01-26 |
JP2020536579A (ja) | 2020-12-17 |
TW201920957A (zh) | 2019-06-01 |
EP4303311A2 (en) | 2024-01-10 |
WO2019055926A2 (en) | 2019-03-21 |
EP3684948C0 (en) | 2023-09-06 |
US20230287385A1 (en) | 2023-09-14 |
JP2023113864A (ja) | 2023-08-16 |
ES2964100T3 (es) | 2024-04-04 |
EP3684948A4 (en) | 2021-07-14 |
JP7323532B2 (ja) | 2023-08-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230287385A1 (en) | Method for Using Aqueous Two-Phase System for the Isolation, Purification and/or Concentration of Short Nucleic Acid Fragments | |
US9624252B2 (en) | Selective nucleic acid fragment recovery | |
US11643646B2 (en) | Method for isolating and purifying nucleic acids using a solid-liquid phase system | |
KR20210018150A (ko) | 일체형 분자 진단 장치 | |
KR101005924B1 (ko) | 핵산 추출 장치 | |
US11938419B2 (en) | Phase separation behavior modifying agents for aqueous two-phase separation within porous material | |
US11332796B2 (en) | Composition and method for concentration and enrichment of nucleic acids | |
US20090215124A1 (en) | Nucleic acid isolation methods and materials and devices thereof | |
JP2014132905A (ja) | 細胞および組織からのrna迅速抽出 | |
DK2607482T3 (en) | Solution for extraction of RNA | |
US20110117628A1 (en) | Method for concentrating and isolating biomolecules or viruses | |
TW201928055A (zh) | 使用嵌入atps的微流體裝置一步分離、濃縮和/或純化核酸 | |
JP2009542216A (ja) | サンプルから事前に抽出せずに高分子を修飾する方法 | |
US20200347379A1 (en) | Method for isolation of nucleic acids | |
US20240173648A1 (en) | Phase separation behavior modifying agents for aqueous two-phase separation within porous material | |
WO2024093522A1 (en) | Methods, compositions and kits for concentrating target analytes from a bulk fluid sample | |
WO2024093519A1 (en) | Methods for isolating target analytes from biological samples using atps and solid phase media |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: New territories, Hongkong, China Applicant after: Xiangda biotechnology International Co.,Ltd. Address before: 32 & 33 / F, gravitation, 29 Hing Yip Street, Kwun Tong, Kowloon, Hong Kong, China Applicant before: Xiangda biotechnology International Co.,Ltd. |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |