DK162966B

DK162966B - Fremgangsmaade til inaktivering af formeringsdygtige, filtrerbare sygdomsvaekkere i blodprodukter samt fremgangsmaade til fremstilling af blodprodukter under anvendelse af denne fremgangsmaade

Info

Publication number: DK162966B
Application number: DK107185A
Authority: DK
Inventors: Johann Eibl; Otto Schwarz; Fritz Elsinger; Guenter Woeber; Anton Philapitsch; Yendra Linnau; Friedrich Dorner; Karl Trambauer; Wolfgang Frechinger
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1985-03-08
Publication date: 1992-01-06
Also published as: FI850940L; DE3569473D1; DK107185A; DK107185D0; DK162966C; CA1239583A; FI81720B; FI850940A0; AT389815B; EP0159311A1; ATA323784A; US4640834A; FI81720C; ATE42205T1; JPS60215628A; EP0159311B1; JPH0739348B2; ES540919A0; ES8802273A1

Description

i

DK 162966 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til inaktivering af formeringsdygtige, filtrerbare sygdomsvækkere i blodprodukter under anvendelse af forhøjet temperatur. Som eksempel på sådanne sygdomsvækkere kan især nævnes hepatitis-vi-5 ra og ukendte sygdomsvækkere, der eventuelt kan overføre AIDS (aquired immune deficiency syndrome), samt en fremgangsmåde til fremstilling af blodprodukter under anvendelse af denne fremgangsmåde.

10 Ved blodprodukter forstås produkter af menneskeligt blod eller plasma# der er bestemt til terapeutisk, profylaktisk eller diagnostisk anvendelse. Sådanne produkter kan indeholde enzymer, proenzymer indbefattet koaguleringsfaktorer, enzyminhibitorer, immunglobuliner, albumin, plasminogen, fibri-15 nogen , fibronectin eller plasma.

Der foreligger en omfangsrig litteratur, der beskæftiger sig med varmeinaktivering af formeringsdygtige, filtrerbare sygdomsvækkere i blodprodukter.

20

De forskellige fremgangsmåder omfatter: - opvarmning af blodprodukter i vandig opløsning, evt. under tilsætning af virucide stoffer, - opvarmning af blodprodukter i vandig opløsning i nærværelse 2 5 af stabilisatorer, - behandling af blodprodukter med organiske opløsningsmidler, - bestråling af blodprodukter i fast tilstand, - opvarmning af blodprodukter i tør tilstand.

30

Bestræbelserne ved alle disse inaktiverings fremgangsmåder går ud på at ophæve præparaternes potentielle mulighed for infektion, men i vidt omfang at bibeholde deres biologiske aktivitet. Dette mål har dog hidtil kun kunnet opnås ved albuminpræparater, nemlig ved opvarmning af vandige albuminopløsninger 3 5 q til en temperatur på 60 C i 10 timer, idet albumin er væsentligt mere stabil over for varraeindvirkning end alle andre blodproteiner.

2

DK 162966 B

I detaljer kan der eksempelvis anføres følgende litteratursteder: DE offentliggørelsesskrift nr. 2.916.711 beskriver en frem-5 gangsmåde til behandling af præparater, der indeholder koaguleringsfaktorer, i vandig opløsning under anvendelse af en temperatur fra 30-100°C, idet der til opløsningen af koaguleringsfaktorerne sættes en aminosyre og en monosaccharid, oligo-saccharid eller sukkeralkohol.

10 EP-A2 nr. 0.053.338 beskriver en fremgangsmåde til inaktivering af hepatitis-vira i præparater, der indeholder faktor IX og X, hvor der foretages en opvarmning af den vandige opløsning af et blodpræparat i nærværelse af calciumioner og evt. en ami-15 nosyre og/eller et saccharid ellerensukkeralkohol ved temperaturer på op til 100°C.

I EP-A2 nr. 0.035.204 beskrives en fremgangsmåde til inaktivering af vandige proteinopløsninger, der kan indeholde faktor 20 VIII, fibronectin, globulin, fibrinogen og andre proteiner, hvor kompositionen blandes med en polyol og blandingen opvarmes til en temperatur på 60 til 75°C.

I EP-A2 nr. 0.052.827 beksrives en fremgangsmåde til inakti-25 vering af hepatitis-vira i en vandig opløsning, der indeholder faktorerne II og VII, i nærværelse af en chelatdanner og evt. en aminosyre og/eller et saccharid eller en sukkeralkohol.

I US-patentskrift nr. 4.379.085 beskrives en fremgangsmåde til 30 varmeinaktivering af et plasmaprotein, såsom C^-inhibitor eller faktor IX, i vandig opløsning i nærværelse af kaliumcitrat eller ammoniumcitrat.

I EP-A2 nr. 0.077.870 beskrives en inaktiveringsfremgangsmåde, 35 hvor en vandig opløsning, der indeholder faktor VIII, opvarmes med aminosyrer, monosaccharider, oligosaccharider, sukkeralko- 3

DK 162966 B

holer og hydrocarboncarboxylsyrer eller hydroxyIhydrocar-boncarboxylsyrer med 3 til 10 carbonatomer til en temperatur på 50 til 80°C.

5 I PCT-ansøgningen nr. WO 83/04371 beskrives en fremgangsmåde til inaktivering af hepatitis-vira, hvor et præparat, der indeholder en virus, behandles på en temperatur på 4 til 40°C med en halogenhydrocarbon, navnlig chloroform.

10 EP-B1 nr. 0.015.055 beskriver en fremgangsmåde til behandling af et blodprodukt, hvor produktet i vandfri tilstand udsættes for en mikrobølgebestråling for at inaktivere tilstedeværende mikroorganismer.

15 Rosenberg et al. beskriver i en afhandling fra XII, International Congress on Blood Transfusion, Abstracts, "MIR" Publishers, Moskva 1969, side 473-475 en fremgangsmåde til inaktivering af albuminholdige præparater og fibrinogen i tør tilstand ved en 10 timers opvarmning til 60°C.

20 EP-A2 nr. 0.094.611 beskriver en fremgangsmåde til behandling af en sammensætning, der indeholder faktor VIII,i tør tilstand med mindre end 5 vægt% (0,05) vand under anvendelse af en temperatur på mindst 60°C til inaktivering af tilstedeværende he-25 patitis-vira.

Den offentliggjorte PCT-ansøgning WO 82/03871 beskriver en fremgangsmåde til behandling af præparater, der indeholder blodkoaguleringsenzymer, hvor præparaterne til inaktivering af til-30 stedeværende inficerende vira opvarmes i tør tilstandj som tør tilstand defineres en sådan med mindre end 5 vægt% (0,05) vand.

Som det fremgår af den ovenstående oversigt kendes der både 35 fremgangsmåder, hvor de blodproteinholdige præparater, der skal behandles, foreligger i vandig opløsning eller suspen-

DK 162966 B

4 deret i et organisk opløsningsmiddel, og fremgangsmåder, hvor præparaterne underkastes inaktiveringsbehandling i tør tilstand, f.eks. frysetørret. Til trods for alle de hidtidige anstrengelser er det endnu ikke lykkedes at udvikle en inakti-5 veringsmetode, der sammenlignet med inaktiveringen af blodproduktet albumin, sikrer en lige så stor sikkerhed mod overføring af hepatitis-vira og andre patogene vira og sikrer en opretholdelse af de pågældende blodprodukters biologiske aktivitet. I 30 år har man millioner af gange klinisk anvendt 10 albuminholdige opløsninger, der i nærværelse af egnede stabilisatorer har været opvarmet i 10 timer til 60°C, uden at der derved har været overført infektionssygdomme. Som det har kunnet vises ved forsøg med chimpanser, bliver hepatitis-vira, der blev sat til de albuminholdige opløsninger, fuldstændigt 15 inaktiveret ved opvarmning af disse opløsninger til 60°C i 10 timer.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at anvise en inaktiveringsfremgangsmåde, som under opretholdelse af det be-20 handlede blodprodukts biologiske aktivitet opnår en pålidelig sikkerhed over for vira, navnlig hepatitis-vira, der er lige så god eller endog bedre end den effektivitet, der kan opnås ved inaktiveringen af albuminholdige opløsninger.

25 Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde af den ovenfor beskrevne art, der er ejendommelig ved at blodprodukterne i fast tilstand indstilles på et indhold af vand, methanol eller ethanol større end 0,05 (5 vægt%) og mindre end 0,70 (70 vægt%), fortrinsvis mindre end 0,40 (40 30 vægt%) og behandles i en lukket beholder ved en temperatur i området fra 50 til 121°C under forhøjelse af partialdamptryk-ket for vandet, methanolen eller ethanolen.

Da de nødvendige undersøgelser vedrørende inaktivering af he-35 patitis-vi rus i blodprodukter ikke straks kan foretages på mennesker, og da chimpanser kun er til rådighed i utilstrækkeligt antal, foregår bestemmelsen af inaktiveringsvirkningen

DK 162966 B

5 ved hjælp af modelvira. Ved eksempelvis at anvende hundehepa-titis-virus som modelvirus kunne det vises, at de i indledningen nævnte kendte fremgangsmåder til virusinaktivering af blodprodukter var meget underlegne i forhold til fremgangsmå-5 den til inaktivering i albumin. Således bliver f.eks. hunde-hepatitis-virus ikke inaktiveret i proteinopløsninger i nærværelse af 0,50 saccharose og 2M glycin som stabilisatorer; og ligeledes ikke i faktor VIII-præparater i tør tilstand ved opvarmning til 60°C i 10 timer. Hundehepati ti s-vira i nakt ive-10 res derimod i albuminopløsninger ved opvarmning til 60eC i 10 timer. Det samme gælder for E. coli bakteriofag T4.

Ved bedømmelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen har det vist sig, at hundehepatitis-virus og andre modelvira inakti-15 veres fuldstændigt. Inaktiveringshastigheden for E. coli bakteriofag T 4 i vilkårlige blodprodukter i nærværelse af den ifølge opfindelsen virksomme mængde af hydroxylgruppeholdige forbindelser er endda større end i en til 60eC opvarmet albuminopløsning.

20

Varigheden af varmebehandlingen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan varieres inden for vide grænser i afhængighed af den anvendte temperatur og arten henholdsvis varmefølsomheden af det blodprodukt, der skal behandles. Varigheden kan ligge 25 mellem 1 sek. og 100 timer.

Ved anvendelse af vand består en foretrukket udførelsesform for opfindelsen i, at man gennemfører varmebehandling af præparaterne, der indeholder 0,06 (6 vægt%) til 0,30 {30 vægt%) 30 vand, ved en temperatur fra 50 til 90°C. Endvidere har det vist sig som særligt gunstigt at gennemføre varmebehandlingen af blodprodukterne i nærværelse af en oxygenfri inaktiv beskyttelsesgas, fortrinsvis nitrogen og eventuelt i nærværelse af oxygenbindende stoffer. Ved udførelsesformen med beskyttel-35 sesgas har det vist sig, at restaktiviteten eller udbyttet af blodprodukterne, navnlig af koaguleringsfaktorer er væsentligt højere end ved opvarmning i oxygenholdig atmosfære, mens vi-

DK 162966 B

6 rusinaktiveringen med hensyn til omfang og hastighed er lige så høj.

En yderligere foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden 5 ifølge opfindelsen kan også bestå i, at blodprodukterne varmebehandles i et flydende medium, hvori de er uopløselige. Som flydende medium kan anvendes chloroform eller eddikesyreethyl-ester.

10 Fortrinsvis gennemføres behandlingen af blodprodukterne med vanddamp på et tryk eller partialtryk mellem 0,1 og 2 bar.

Inaktiveringsfremgangsmåden ifølge opfindelsen kan med fordel anvendes ved en fremgangmsåde til fremstilling af blodproduk-15 ter, valgt blandt enzymer, proenzymer indbefattet koaguleringsfaktorer, enzyminhibitorer, immunglobuliner, albumin, plasminogen, fibrinogen, fibronectin eller plasma eller blandinger af de enkelte blodprodukter, og som er ejendommelig ved, at inaktiveringen foretages i et vilkårligt valgt trin af 20 fremstillingsfremgangsmåden, hvorefter blodprodukterne eventuelt omdannes til et galenisk præparat.

Inden for rammerne af fremstillings fremgangsmåden ifølge opfindelsen falder også den arbejdsmåde, at der anvendes et 25 blodprodukt, som er kovalent bundet til en vanduopløselig matrix. Eksempelvis kan immunglobulin immobiliseres på sepha-rose og underkastes inaktiveringen. På den anden side er det muligt, at adsorbere et blodprodukt ikke-kovalent på en vævsforligelig bærer, såsom et kollagenlag,og varmebehandle det.

30 En særlig udførelses form ved fremstilling af et fibrinogen- holdigt præparat består i at anbringe en fibrinogenholdig komposition på en vævsforligelig bærer, såsom et kollagenlag,og varmeinaktivere.

3 5 Inden for rammerne af fremstillings fremgangsmåden ifølge op findelsen kan der også anvendes yderligere fraktioneringsforanstaltninger for at befri de varmeinaktiverede blodprodukter fra under varmeinaktiveringen evt. dannede neoprotei-ner eller neoantigener.

7

DK 162966 B

Inaktiveringsfremgangsmåden ifølge opfindelsen samt fremstillingen af blodprodukter under anvendelse af fremgangsmåden, de opnåede virkninger og overlegenheden i forhold til kendte fremgangsmåder skal nærmere belyses i de følgende eksempler 5 og tabeller.

Eksempel 1 a) Fremstilling af et faktor VHI-præparat 6660 ml frisk frossen plasma optøedes ved 0°C til +4°C. Det fremkomne kryobundfald fraskiltes ved centrifugering og opløstes i 700 ml trinatriumcitratopløsning, der indeholdt 0,05 mg natriumpentosansulfat pr. ml og 30 enheder aprotinin pr. ml. Opløsningens pH-værdi indstilledes på 6,3 og tempera-15 o turen på +4 C. Det fremkomne bundfald fraskiltes ved centrifugering og kastedes bort.

Ved tilsætning af ethanol til en koncentration på 0,08 udfæld-tes den faktor VIII-holdige fraktion. Det fremkone bundfald 20 fraskiltes ved centrifugering og opløstes i en glycin-citrat-NaCl-puffer.

b) Inaktivering af en modelvirus.

25

Den på den beskrevne måde vundne faktor VIII-holdige opløsning indstilledes på 50 mg protein/ml og der tilsattes henholdsvis en sindbis-virussuspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes. Det frysetørrede faktor VHI-koncentrat indstilledes på forskellige vandindhold, 30 nærmere bestemt på 0,08, på 0,20, på 0,30 og på 0,50, og opvarmedes i lukkede beholdere ved en temperatur på 60°C eller 80°C i forskellige tidsrum. Der blev hver gang udtaget 3 prøver før opvarmningen og til bestemte tider under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side restaktiviteten og vandindholdet.

Bestemmelsen af virustiteren blev gennemført på følgende måde :

Det faktor VIII-indeholdende lyofilisat opløstes i vand oq 8

DK 162966 B

fortyndedes med en isotonisk kogsaltopløsning i serier i forholdet 1:10. Titeren for sindbis-virus bestemtes ved måling af cytopatiske virkninger på sensitive vero-celler i mikrotiter-pladen. Resultaterne udtryktes efter statistisk behandling af bedømmelsen svarende til Reed og Muench's formel, som log 5 TCID50 (J.L. Reed og H. Muench; Amer. J. Hyg. 27, 493 (1938)).

c) Bestemmelse af restaktivitet i virusfri prøver.

^ Bestemmelsen af restaktiviteten af faktor VIII skete ved hjælp af thromboplastin-dannelses-prøven (2-trins-prøve)

Faktor VIIl-restaktiviteten beregnedes ved dannelsen af kvotienterne for faktor VIII-aktiviteten af den opvarmede prøve og faktor VIII-restaktiviteten af den tilsvarende ikke-opvarmede prøve.

15 d) Bestemmelse af vandindholdet i virusfri prøver.

Det frysetørrede faktor VIII-koncentrat ekstraheredes før og efter varmebehandlingen med vandfri methanol. Methanol-opløsningens vandindhold bestemtes ifølge Karl Fischer i en titrator efter den coulometriske fremgangsmåde (E. Scholz; Fresenius1 Z.anal. Chem. 314, 567-571 (1983)).

De efter gennemført varmebehandling målte virustitere og den 2 5 efter behandlingen endnu tilstedeværende restaktivitet er vist i tabel 1, hvorfra det tydeligt fremgår, at inaktiveringshastigheden er afhængig af vandindholdet. Mens eftervisningsgrænsen for virus ved anvendelse af en temperatur på 60°C ved et vandindhold på 0,08 opnås efter 3 timer, når man denne grænse ved et vandindhold på 0,20 og 0,30 allerede efter 1 time. og ved et vandindhold på 0,50 allerede efter 0,3 timer. Inaktiveringsvirkningen er også afhængig af temperaturen. Ved en temperatur på 80°C og et vandindhold på 0,08 opnås eftervisningsgrænsen for virus allerede efter 0,3 timer.

3 5

Restaktiviteten efter inaktiveringsbehandlingen var ved alle prøver med et vandindhold op til 0,30 tilfredsstillende med mindst 0,80 (80 %), selv ved et vandindhold på 0,50 var restaktiviteten efter 3 timer ved 60°C stadig 0,38 (38%). Til A. VS 1 4 wvt -i M J3 1.1 A9* -C 1. X. Λ «Α X XT T T — Ir* Λν» MAM 4· β 4·Α>* Η A "V— ΤΤ3 V* 9

DK 162966 B

fremstillet på samme måde som beskrevet ovenfor, behandlet i "tør tilstand", dvs. med et vandindhold tilpasset efter kendt tekniks betegnelse "tør tilstand" på mindre end 0,05 vand. Resultaterne er vist i tabel la), hvoraf det ses, at ved det lave vandindhold, der svarer til "tør tilstand", opnås eftervisningsgrænsen for virus ved et vandindhold på 0,015 5 først efter 10 timer og ved et vandindhold på 0,006 først efter 30 timer. Det fremgår heraf, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen er 10 til 100 gange mere virksom ved formindskelsen af en virustiter med 3 til 4 ti-potenser.

10 Denne overlegenhed ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forhold til den kendte teknik anskueliggøres også ud fra virusinaktiveringskurverne på tegningens fig. l,hvor de fuldt optrukne kurver viser inaktivering ifølge opfindelsen ved henholdsvis 0,50* 0,30; 0,20 eller 0,08 I^O og de punkterede kur-15 ver viser virustiterfaldet i "tør tilstand" på henholdsvis 0,015 H20 og 0,006 ^O.På abscissen på fig. 1 er tidsforløbet for behandlingen i timer angivet i logaritmisk målestok, på ordinaten er virustiterenvist i logaritmisk målestok. Desuden er på fig. 1 angivet forløbet for restaktiviteten, idet de 20 fuldt optrukne kurver står for vandindholdet i overensstemmelse med opfindelsen og de stiplede kurver står for restaktivitetsforløbet i tør tilstand.

Eksempel 2 25

Til en på samme måde som i eksempel 1 fremstillet faktor VIII-holdig opløsning sattes henholdsvis en sindbis-virus-suspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes. Det frysetørrede faktor VIIl-koncentrat underkastedes 30 inaktiveringsbehandling i nærværelse af methanol ved en temperatur på 60°C. Til en yderligere faktor VIII-holdig opløsning sattes mannitol, der frysetørredes og varmeinaktiveredes ligeledes ved 60°C.

35 De efter gennemført varmebehandling målte virustitere er vist i tabel 11^ idet tabel.' Ila angiver sammenligningsresultater uden det ifølge opfindelsen anviste 10

DK 162966 B

indhold af hydroxylgruppeholdige forbindelser. Desuden fremgår overlegenheden ved arbejdsmåden ifølge opfindelsen tydeligt ved at opretholdelsen af restaktiviteten er væsentlig større ved denne inaktiveringshastighed for modelvirus.

5

Eksempel 3 a) Fremstilling af et præparat, der indeholder det partielle prothrombinkompleks: 10

Et præparat indeholdende koaguleringsfaktorerne II, IX og X fremstilledes på den i Vox. Sang. 33, 37-50 (1977) beskrevne måde ud fra menneskeligt plasma ved adsorption på BEAE-Sepha-dex vask af ionbytteren og eluering af komplekset.

15 b) Inaktivering af en modelvirus:

Eluatet dialyseredes, frysetørredes og deraf tilberedtes en vandig opløsning af det partielle prothrombinkompleks med et 20 indhold af 50 mg protein/ml. Til opløsningen sattes henholdsvis en suspension af bakteriofagen T4 i kulturmedium for Escherichia coli 11303' eller virusfri kulturmedium og frysetørredes. Det frysetørrede koncentrat indstilledes på et vandindhold på 0,09. Lukkede beholdere med frysetørrede par-25 tielle prothrombinkompleks-prøver - med og uden virus - opvarmedes ved en temperatur på 60°C i forskellige tidsrum. Der blev hver gang udtaget 3 prøver før opvarmning og til bestemte tider under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side restaktiviteten og vand-30 indholdet.

Bestemmelsen af virustiteren gennemførtes på følgende måde:

Lyofilisatet, der indeholder det partielle prothrombinkom-35 pleks, opløstes efter varmebehandlingen i vand og fortyndedes med 1 mM MgClj i serier i forholdet 1:10. En blanding af 3 ml 11

DK 162966 B

0,7% Bacto-Agar, 43 til 45°C, 100 μΐ suspension af E. coli i flydende medium og 200 jul af henholdsvis bakteriofagholdig prøve eller fortynding deraf gennemblandedes og udhældtes hurtigt på en næringsagarplade (ATCC 129). Efter inkubering nat-5 ten over ved 37°C taltes ved hjælp af et tælleapparat de af den formeringsdygtige viruspartikeludviklede antal plak i den sammenflydende celleflade (PFU, plague-forming-units). Resultaterne udtryktes som log^Q PFU.

10 c) Bestemmelse af restaktiviteten på virusfri prøver:

Bestemmelsen af faktor IX-aktiviteten blev foretaget ved at sætte den under afprøvning værende prøve til en faktor IX-mangel-plasma og bestemme den aktiverede partielle thrombopla- 15 stintid (1-trins-prøve). Faktor IX-restaktiviteten for en opvarmet prøve beregnedes ved at danne kvotienten af faktor IX-aktiviteten af den opvarmede prøve og faktor IX-aktiviteten af den tilsvarende ikke-opvarmede prøve.

20 d) Bestemmelse af vandindholdet på virusfri prøver:

Bestemmelsen foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

25 De efter den foretagne varmebehandling målte virustitere og den .efter behandlingen stadig tilværende restaktivitet er vist i tabel III, hvoraf det fremgår, at eftervisningsgrænsen for virus blev nået allerede efter kort tid - mindre end 1 time -mens restaktiviteten forblev fuldt bibeholdt. I sammenligning 30 hermed ses det af tabel Illa, at ved en varmebehandling af partielle prothrombinkompleks-præparater i "tør tilstand" ved et vandindhold på 0,004 selv efter 10 timers behandling var virusti teren med 2,0 stadig forholdsvis høj, selv ved anvendelse af højere temperaturer på 80 og 90°C.

Virusinaktiveringskurverne og forløbet for restaktiviterne i- 35

DK 162966 B

12 følge dette eksempel er vist på fig. 2 på samme måde som i fig. 1 med fuldt optrukne linier, mens de ifølge kendt teknik i tør tilstand opnåede kurver er angivet punkteret.

5 Eksempel 4 a) Fremstilling af et præparat, der indeholder det totale prothrombinkompleks:.

10 Et præparat indeholdende koaguleringsfaktoren VII fremstilledes på den i AT patentskrift nr. 359.646 beskrevne måde ud fra menneskeligt citratplasma. Efter fraskillelse af kryobund-faldet og en DEAE-SEPHADE^-behandling adsorberedes faktor VII på Al(OH)2* Al (OH)2 underkastedes en vakeproces og en faktor 15 VII-elueringsproces ved forhøjet ionstyrke. Det faktor VII-holdige eluat dialyseredes og blandedes med det dialyserede partielle prothrombinkompleks-præparat fremstillet ifølge eksempel 3 i et sådant forhold, at koaguleringsaktiviteterne af faktorerne II, IX, X og VII var ca. lige høje.

20 b) Inaktivering af en modelvirus:

Den på den beskrevne måde vundne opløsning af det totale prothrombinkompleks indstilledes på 50 mg protein/ml og 25 der tilsattes en sindbis-virus-suspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes. Det frysetørrede koncentrat indstilledes på et vandindhold på 0,07. Lukkede beholdere med de frysetørrede totale prothrombinkom-pleks-prøver - med og uden virus - opvarmedes til en tempera-30 tur på 60°C i forskellige tidsrum. Der blev udtaget i hvert tilfælde 3 prøver før opvarmning og til bestemte tider under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side restaktiviteten og vandindholdet.

35 Bestemmelsen af virustiteren skete på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

DK 162966 B

13 c) Bestemmelse af restaktiviteten på virusfri prøver:

Bestemmelsen af faktor IX-aktiviteten foregik ved tilsætning af den under afprøvning værende prøve til en faktor IX-5 mangel-plasma og bestemmelse af den aktiverede partielle thromboplastintid (1-trins-prøve). Faktor IX-aktiviteten af en opvarmet prøve beregnedes ved at danne kvotienten af faktor IX-aktiviteten af den opvarmede prøve og faktor IX-aktiviteten af den tilsvarende ikke-opvarmede prøve.

10 d) Bestemmelse af vandindholdet på virusfri prøver:

Denne bestemmelse foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

15

Den efter foretaget varmebehandling målte virustiter og den efter behandlingen stadig tilstedeværende restaktivitet er vist i tabel IV, hvoraf det fremgår, at eftervisningsgræneen for virus blev nået efter en behandlingstid på 3 timer, mens rest-20 aktiviteten i det væsentlige forblev bibeholdt.

Eksempel 5 a) Fremstilling af et FEIBA-præparat: 25

Et præparat indeholdende FEIBA fremstilledes ud fra frisk frossen menneskelig citratplasma på den i AT patentskrift nr. 368.883 beskrevne måde, idet man efter optøning af plas-maen, fraskilning af det derved dannede kryobundfald og ge-30 nerering af FEIB-aktiviteten udvandt koaguleringsfaktorerne ved adsorption på en ionbytter og eluering.

b) Inaktivering af en modelvirus: 35 Den vundne FEIBA-holdige opløsning indstilledes på 50 mg pro-tein/ml og der tilsattes en sindbis-virus-suspension i cel-

DK 162966 B

14 lekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes. Det frysetørrede FEIBA-koncentrat indstilledes på forskellige vandindhold, nærmere bestemt på 0,07? 0,08 eller på et ethanol-indhold 0,10 og opvarmedes i lukkede beholdere ved forskellige 5 temperaturer, nemlig 60°C og 90°C i forskellige tidsrum. Der blev i hvert tilfælde udtaget 3 prøver før opvarmningen og til bestemte tidspunkter under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side til bestemmelse af restaktiviteten og vandindholdet.

10

Bestemmelsen af virustiteren foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

c) Bestemmelse af restaktiviteten i virusfri prøver: 15

Bestemmelsen af FEIB-restaktiviteten forgik, som beskrevet i AT patentskrift nr. 350.726, ved tilsætning af den under afprøvning værende prøve til en faktor VIII-inhibitorplasma og bestemmelse af den aktiverede partielle thromboplastintid 20 (1-trins-prøve). FEIB-restaktiviteten af en opvarmet prøve beregnedes ved dannelse af kvotienten mellem FEIB-aktiviteten for den opvarmede prøve og FEIB-aktiviteten for den tilsvarende ikke-opvarmede prøve.

25 d) Bestemmelse af vandindholdet i virusfri prøver:

Denne bestemmelse foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

30 De efter foretaget varmebehandling målte virustitere og den efter behandlingen endnu tilstedeværende restaktivitet fremgår af tabel V., hvoraf det fremgår, at inaktiveringshastigheden afhænger af såvel vandindholdet som af inaktiveringstemperaturen. Ved et vandindhold på 0,07 og en temperatur på 35 60°C når man eftervisningsgrænsen for virus efter 3 timer og ved et vandindhold på 0,08 og en temperatur på 90°C nås efter-

DK 162966B

15 visningsgrænsen allerede efter 0,2 timer. I alle tilfældene er restaktiviteten tilfredsstillende.

Til sammenligning hermed angives i tabel Va et sammenlig-5 ningseksempel, hvor en FEIBA-prøve er blevet behandlet i "tør tilstand" med et vandindhold på 0,009 ved 60°C. Virustiteren er selv efter 30 timers behandling relativ høj med en værdi på 1,7.

10 Inaktiveringen af et ifølge dette eksempel fremstillet FEIBA-præparat afprøvedes yderligere på anden modelvirus, nemlig med hundehepatitis-virus, idet det frysetørrede FEIBA-koncentrat indstilledes på et vandindhold på 0,07 og behandlingstemperatu-ren var 60 henholdsvis 80°C. De efter foretagen varmebehandling 15 målte virustitere fremgår af tabel VI'. Titeren for hundehepatitis-virus bestemtes ved bedømmelse af den cytopatiske virkning på sensitive MDCK-celler i mikrotiterpladen. Resultaterne udtryktes efter statistisk behandling under tilsvarende anvendelse af den formel, der er angivet af Reed og Muench som log 20 TCID50 (J.L.Reed og H.Muench; Amer. J. Hyg. 27, 493, (1938)).

Ud fra virustiterbestemmelsen viste det sig, at man ved et vandindhold på 0,07 og en temperatur på 60°C nåede eftervisningsgrænsen for virus efter 1 time, og ved en temperatur på 80°C allerede efter 0,1 time.

25 I tabel ' Via er der igen angivet et sammenligningseksempel, hvor behandlingen foregik i "tør tilstand" med det resultat at inaktiveringen endnu ikke var tilstrækkelig efter 30 timers behandlingstid.

30 På fig. 3 er der med en fremstilling ligesom den der er vist på fig. 1 anskueliggjort virusinaktiveringskurver og restaktiviteter i overensstemmelse med dette eksempel.

35 Eksempel 6 a) Fremstilling af et imraunglobulin-holdigt præparat:

DK 162966 B

16

Et immunglobulin-holdigt præparat vandtes ud fra menneskelig plasma ved den alkohol-fraktioneringsmetode, der er beskrevet af J.L. Oncley i Journal of Amer. Chem. Soc. ,71. 541-550 (1949). Opløsningen indeholdt 100 mg protein, 14 mg glycin og 5 1,9 mg NaCl pr. ml.

b) Inaktivering af en modelvirus:

Til den vundne vandige opløsning sattes henholdsvis en sind-10 bis-virus-suspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og der frysetørredes. Det frysetørrede immunglobu-linkoncentrat indstilledes på et vandindhold på 0,054 og opvarmedes i lukkede beholdere - med og uden virus - ved en temperatur på 60°C i forskellige tidsrum. Der blev i hvert 15 tilfælde udtaget 3 prøver før opvarmningen og på bestemte tidspunkter under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side. virustiteren og på den anden side til bestemmelse af den molekylære integritet og vandindholdet.

20 Bestemmelsen af virustiter forgik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

c) Bestemmelse af den molekylære integritet på virusfri prøver: 25

Bestemmelsen foregik ved at sammenligne proteinsammensætningen af den opvarmede og den ikke opvarmede prøve, idet adskillelsen af proteinblandingen foregik i elektrisk felt ved hjælp af c^) celluloseacetat-elektroforese og C2) SDS-polyacrylamid-30 gel-elektroforese (SDS-PAGE).

c^) Mikrozone-elektroforese på celluloseacetat-membram (Beckman-system) : 35 Elektroforesen foregik ifølge Beckman-systernet (Microzone Electrophoresis Manual, Beckman Instructions 015-083630-C, 1977),

DK 162966 B

17 idet prøverne anbragtes på en med veronalpuffer (pH 8,6) ekvilibreret celluloseacetat-membran på hvilken proteinerne adskiltes ved 250 V (strømstyrke 3-4 mA pr. membran, løbetid 20 min.). Efter fiksering blev der foretaget farvning 5 med Ponceau S, tørring og densiometrisk bestemmelse af membranen .

C2) SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE): 10 Den elektroforetiske adskillelse af det med natrium- dodecylsulfat (SDS) bebyrdede protein foregik i en 5% poly-acrylamid-gel ifølge den af Weber og Osborn i "The Reliability of Molecular Weight Determinations by Dodecyl Sulfa-te-polyacrylamid Gel Electrophoreses", J. Biol. Chem. 244, 15 4406 (1969) beskrevne metode. Farvningen af det adskilte prote in ''foregik ifølge den af Merril et al. i "Ultrasensitive Stain for Proteins in Polyacrylamid Gels Shows Regional Variation in Cerebrospinal Fluid Proteins", Science 211, 1437 (1981) beskrevne metode ved hjælp et sølvfarvnings-reagenstilsætnings-20 middel fra firmaet BIO-RAD (Bulletin 1089).

d) Bestemmelse af vandindholdet på virusfri prøver:

Denne bestemmelse foregik på samme måde, som beskrevet i 25 eksempel 1.

målte

De efter den foretagne varmebehandling/virustitere og resultaterne fra molekylære integritetsbestemmelse fremgår af tabel

VII

30

Eksempel 7 a) Fremstilling af et C^-esterase-inhibitor-præparat 35 Et C^-esterase-inhibitor-holdigt præparat vandtes ud fra human plasma under anvendelse af den i Vox. Sang. 26,118 (1974) be-

DK 162966 B

18 skrevne måde ved adsorption på en anionbytter (DEAE-Sephadex ©, og efterfølgende eluering. Efter saltfældning til fraskillelse af uønskede proteiner frysetørredes det rensede C^-esterase-inhibitor-præparat.

5 b) Inaktivering af en modelvirus:

En ud fra lyofilisatet af C^-esterase-inhibitor-præparatet vundet vandig opløsning indstilledes på 50 mg protein/ml og 10 der tilsattes henholdsvis en sindbis-virus-suspension i celle-kulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes påny. Koncentratet indstilledes på et vandindhold på 0,10 og opvarmedes i lukkede beholdere - med og uden virus - ved en temperatur på 60°C. Der blev udtaget i hvert tilfælde 3 prøver 15 før opvarmning og til bestemte tidspunkter under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side restaktiviteten og vandindholdet.

Bestemmelsen af virustiteren forgik på samme måde, som be-20 skrevet i eksempel 1.

c) Bestemmelse af restaktiviteten i virusfri prøver:

Aktiviteten af C^-esterase-inhibitoren bestemtes ved hjælp 25 af dennes evne til at hæmme hydrolysen af chromogent substrat Cl-1 (Pentapharm) ved hjælp af C^-esterase, bestemt i overensstemmelse med M.Kleindel, H. Lang, A. Philapitsch, G. Wober, "Thrombosis and Haemostatis", 50, 244 (1983).

30 d) Bestemmelse af vandindhold på virusfri prøver:

Denne bestemmelse foregik på den måde, der er beskrevet i eksempel 1.

35 De efter foretagen varmebehandling målte virustitere og den efter behandlingen endnu tilstedeværende restaktivitet fremgår af tabel VIII.

DK 162966 B

19

Eksempel 8 a) Fremstilling af et plasminogen-holdigt præparat: 5 Et plasminogen-holdigt præparat fremstilledes på den måde, der er beskrevet af D.G. Deutsch og E.T. Mertz i Science 170, 1095 (1970). 50 ml lysin-Sepharose ekvilibreredes i en kolonne med 0,1 M phosphat, pH 7,4. 340 ml plasma fortyndedes med vand til 640 ml og kolonnen belastedes med denne opløsning.

10 Efter fjernelse af ledsageproteiner ved vask med en 0,3 M phosphatopløsning (pH 7,4) elueredes plasminogen ved hjælp af 0,2 M 6-aminocapronsyre (pH 7,4). Den plasminogenholdige opløsning dialyseredes til fjernelse af 6-aminocapronsyre og blev derpå frysetørret.

15 b) Inaktivering af en modelvirus:

En ud fra lyofilisatet fremstillet vandig opløsning af plasminogen indstilledes på 50 mg protein/ml og der til-20 sattes henholdsvis en sindbis-virus-suspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og der frysetørredes påny. Koncentratet indstilledes på et vandindhold på 0,08 og opvarmedes i lukkede beholdere - med og uden virus -ved en temperatur på 60°C. Der blev udtaget i hvert tilfælde 25 3 prøver før opvarmning og på bestemte tidspunkter under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virusti-teren og på den anden side restaktiviteten og vandindholdet.

Bestemmelsen af virustiteren forgik på samme måde, som be-30 skrevet i eksempel 1.

c) Bestemmelse af restaktiviteten på virusfri prøver:

Denne bestemmelse foregik på den måde, at en plasminogen-35 holdig prøve aktiveredes til plasmin med streptokinase ifølge den metode, der er beskrevet af K.C.Robbins, L. Summaria, Methods in Enzymology, 19, 184-186 (1970) og den frigjorte plas-

DK 162966B

20 minaktivitet bestemtes kvantitativt ud fra det af kasein frigjorte TCA-opløselige spalt®P^o^-ukt.

Den efter foretagen varmebehandling målte virustiter og den efter behandlingen endnu tilstedeværende restaktivitet fremgår af tabel IX, hvoraf det fremgår, at eftervisningsgrænsen for virus med en tilfredsstillende restaktivitet blev nået efter 5 timer.'

Eksempel 9 10 a) Fremstilling af et plasmapræparat:

Blod blev udtaget fra sunde donorer i en blodoptagelsespose, hvori der var indeholdt en trinatriumcitratop-15 løsning. Efter at blandingen var forsigtigt gennemblandet, centrifugeredes den. Den ovenstående plasma afdekanteredesj 400 ml plasma blandedes med 22 ml af en 15% glycinopløsning, pH 3,6.

20 b) Inaktivering af en modelvirus: plasma

Til den med glycin pufrede /sattes henholdsvis en sindbis-virus-suspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199, der frysetørredes og indstilledes på et vand-25 indhold på 0,08. Lukkede beholdere med de tørre plasmaprøver - med og uden virus - opvarmedes til 60°C i forskellige tidsrum. Der blev udtaget i hvert tilfælde 3 prøver før opvarmningen og til bestemte tider under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den 30 anden side restaktiviteten og vandindholdet.

35 c) Bestemmelse af restaktiviteten i virusfri prøver:

DK 162966 B

21

Bestemmelsen foregik ved, at plasmaens aktiverede partielle thromboplastintid bestemtes, idet man målte koaguleringstiden for en blanding af 0,1 ml plasma, kaolin/phospholipid-suspension og 0,025 molær calciumchlorid. Restaktiviteten 5 for en opvarmet prøve beregnedes ved dannelse af kvotienten mellem aPTT for den ikke-opvarmede prøve og aPTT for den tilsvarende opvarmede prøve.

d) Bestemmelse af virusfri prøvers vandindhold: 10

Denne bestemmelse foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

Den efter den foretagne varmebehandling målte virustiter og 15 den efter behandlingen stadig tilstedeværende restaktivitet er vist i tabel X , hvoraf det fremgår, at eftervisningsgrænsen for virus med tilfredsstillende bibeholdelse af restaktiviteten allerede var nået efter 0,3 timer.

20 Eksempel 10 a) Fremstilling af et fibrinogen- og fibronectin-holdigt præparat: 25 Efter fraskillelse af kryobundfaldet og prothrombin-kompleks-komponenterne fra menneskelig plasma afkøledes den vundne ovenstående væske til 0°C og under omrøring tilsattes der så meget ethanol, at der blev nået en s lutkoncentration på 0,08 (8%). Temperaturen indstilledes på -2°C og pH-værdien på 7,0. 30 Suspensionen centrifugeredes og det vundne pastaagtige bundfald, der indeholdt fibrinogen og fibronectin, vaskedes så længe med en citrat-glukose, pH 6,9 - puf ret 6,5% ethanol-opløsning, til der i den ovenstående væske ikke kunne eftervises mere end 0,5 mg protein/ml. Det rensede fibrinogen ind-35 frossedes og frysetørredes for at fjerne ethanol.

DK 162966B

22 b) Inaktivering af en modelvirus:

En vandig opløsning af lyofilisatet indstilledes på 50 mg protein/ml og der tilsattes henholdsvis sindbis-virus-5 suspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes påny. Koncentratet indstilledes på et vandindhold på 0,08 og i lukkede beholdere - med og uden virus - opvarmedes der til en temperatur på 60°C. Der blev udtaget i hvert tilfælde 3 prøver før opvarmning og til 10 bestemte tider under opvarmningsprocessen til bestemmelse af på den ene side virustiteren og på den anden side restaktivitet og vandindhold.

Bestemmelsen af virustiteren forgik på samme måde, som -beskre-15 vet i eksempel 1.

c) Bestemmelse af restaktiviteten i virusfri prøver:

Denne bestemmelse udførtes 20 c·^) med en virknings-prøve (thrombintid) , hvor virkningen af en fibrinogen-opløsning ifølge US Pharmacopeia, 16. Revision (USP XVI, 1960), side 298 blev bestemt, idet en prøve af fibrinogenopløsningen blandedes med calciumchlorid og thrombin og koaguleringstiden blev bestemt. Restaktiviteten blev be-25 regnet ved at danne kvotienten mellem koaguleringstiden for den ikke-opvarmede prøve og koaguleringstiden for den opvarmede prøve, og c2) ved bestemmelse af størkningsdygtige proteiner. En fi-30 brinogen-opløsnings størkningsdytige protein bestemtes ifølge USP XVI, side 298, idet (1) fibrinogenopløsningens samlede proteinindhold blev bestemt (nitrogenbestemmelse ifølge Kjel-dahl) og (2) proteinindholdet af det efter tilsætning af thrombinstørknede fibrin bestemtes ved den samme metode (Kjel-35 dahi). Kvotienten for proteinværdien for fibrin (2) og proteinværdien for det samlede protein (1) gav mængden af størkningsdygtigt protein.

DK 162966 B

23

Restaktiviteten beregnedes ved at danne kvotienten mellem det størkningsdygtige protein i den opvarmede prøve og det størkningsdygtiqe protein i den ikke-opvarmede prøve.

5 d) Bestemmelse af vandindholdet i virusfri prøver:

Bestemmelsen af vandindholdet foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

10 De efter foretaget varmebehandling målte virustitere og den efter behandlingen stadig tilstedeværende restaktivitet fremgår af tabel XI , hvoraf det fremgår, at eftervisningsgrænsen for virus blev nået efter 5 timer, idet restaktiviterne var tilfredsstillende ifølge de angivne metoder.

15

Eksempel 11 a) Fremstilling af et albumin-holdigt præparat: 20 Til 10 1 menneskelig blodplasma sattes ved en pH-værdi på 7,0 og en temperatur på -2°C 0,08 ethanol, idet der udfældede sig et bundfald, der indeholdt fibrinogen. Efter at bundfaldet var skilt fra, forøgedes alkoholkoncentrationen til 0,25 og temperaturen sænkedes til -6°C. Det udfældende 25 bundfald, der indeholdt immungiobulin, skiltes fra, og alkoholkoncentration af den ovenstående væske forøgedes ved en pH-værdi på 6,5 og en temperatur på -8°C til 0,40, hvorved der skete en yderlige udfældning. Bundfaldet skiltes fra og kastedes bort . Til udfældning af albumin indstilledes den 30 ovenstående væskes pH-værdi på 5,4 ved den samme temperatur. Bundfaldet skiltes fra ved centrifugering og underkastedes et yderligere rensningstrin, idet det opløstes i vand og etha-nolkoncentrationen indstilledes ved en pH-værdi på 4,8 og en temperatur på -2°C på 0,10. Det udfældede globulin skiltes 35 fra og kastedes bort. Den ovenstående væskes ethanolkoncentra-tion forøgedes til 0,40, temperaturen sænkedes til -8°C , og

DK 162966 B

24 pH-værdien indstilledes på 5,1. Bundfaldet er albumin og opsamledes ved centrifugering og frysetørredes.

b) Inaktivering af en modelvirus: 5

En vandig opløsning af lyofilisatet indstilledes på 50 mg protein/ml og der tilsattes henholdsvis hundehepatitisvirus i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og der frysetørredes. Det frysetørrede albuminkoncentrat indstille-10 des på et vandindhold på 0,07 og opvarmedes i lukkede beholdere - med og uden virus - ved 60°C i forskellige tidsrum.

Der blev i hvert tilfælde udtaget 3 prøver før opvarmning og på bestemte tidspunkter linder opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side 15 den molekylære integritet og vandindholdet.

Bestemmelsen af virustiteren foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 5. Bestemmelsen af den molekylære integritet, nemlig forholdet ved celluloseacetat-elekroforese og SDS-20 polyacrylamid-gel-elektroforese skete på samme måde, som beskrevet i eksempel 6.

c) Bestemmelse af vandinholdet i virusfri prøver: 25 Denne bestemmelse foregik på samme måde, som beskrevet i eksempel 1.

De efter foretaget varmebehandling målte virustitere og den molekylære integritet fremgår af tabel XIIJ, hvoraf det frem-30 går, at eftervisningsgrænsen for virus allerede blev nået efter 1 time, og den molekylære integritet viste i forhold til ikke-opvarmede kontrolprøver ikke nogen forandring.

Eksempel 12 35

Fremstilling af blodpræparater under anvendelse af et flydende medium, hvori de er uopløselige.

DK 162966 B

25

Et som beskrevet i eksempel 1 a) fremstillet faktor VIII-præparat indstilledes på 50 mg protein/ml/ der tilsattes henholdsvis en sindbis-virus-suspension i cellekulturmedium TGM 199 eller virusfri TCM 199 og der frysetørredes. Det fryse-5 tørrede faktor Vlll-præparat indstilledes på et vandindhold på 0/09. Flere beholdere med de frysetørrede faktor VIII-prøver - med og uden virus - tilsattes hver 10 ml vandmættet chloroform (for ikke at ændre prøvernes vandindhold), lukkedes og opvarmedes i 10 timer til 60°C. Der blev i hvert til-10 fælde udtaget 3 prøver før opvarmningen og på bestemte tidspunkter under opvarmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side restaktiviteten og vandindholdet.

15 Før bestemmelsen af virustiteren og restaktiviteten blev prøverne befriet for opløsningsmiddel ved bortsugning under vacuum.

Bestemmelsen af virustiteren og vandindholdet foregik, som 20 beskrevet i eksempel 1.

De efter gennemført varmebehandling målte virustitere og den efter behandlingen stadig tilstedeværende restaktivitet fremgår af tabel χπΐ* hvoraf det fremgår/ at virustiteren efter 25 3 timer sank ned under eftervisningsgrænsen, mens restaktivi teten udgjorde o,85.

På samme måde afprøvedes inaktiveringen af hundehepatitis-virus i et FEIBA-præparat og et partielt prothrombinkompleks-30 præparat, idet FEIBA-præparatet var fremstillet i overensstemmelse med eksempie 5 a), og det partielle prothrombinkompleks-præparat var fremstillet i overensstemmelse med eksempel 3 a). Bestemmelsen af virustiteren forgik, sådan som det er beskrevet i eksempel 5. De efter foretaget varmebehandling målte 35 virustitere fremgår af tabel xm.

DK 162966 B

26 I de følgende eksempler beskrives fremstillingen af blodprodukter, hvori inaktiveringen ifølge opfindelsen blev anvendt, for at uskadeliggøre evt. tilstedeværende formeringsdygtige, filtrerbare sygdomsvækkere.

5

Eksempel 13

Fremstilling af et faktor VHI-præparat.

10 100 1 frisk frossen plasma optøedes ved 0°C til +4°C. Det fremkomne kryobundfald skiltes fra ved centrifugering og opløstes i 10,5 1 trinatriumcitratopløsning, der indeholder 50 mgnatriumpentosansulfat/1 og 30.000 enheder aprotinin/1. Opløsningens pH-værdi indstilledes på 6,3 og temperaturen 15 på +4°C. Det fremkomne bundfald skiltes fra ved centrifugering og kastedes bort.

Ved tilsætning af ethanol til en koncentration på 0,08 fældede den faktor VIII-holdige fraktion ud. Det fremkomne bund-20 fald skiltes fra ved centrifugering, opløstes i en glycin- citrat-NaCl-puffer, frysetørredes, bragtes til et vandindhold på 0,08 og opvarmedes i 10 timer til 60°C. Faktor VIII-aktivi-tetsbestemmelsen efter opvarmningsprocessen gav en restaktivitet på 0,92 (92%) i sammenligning med det ikke-opvarmede ma-25 ter i ale.

Til fremstilling af et galenisk præparat opløstes det inaktive-rede pulver i destilleret vand under tilsætning af glycin-trinatriumcitrat-NaCl på en sådan måde, at der vandtes en op-30 løsning med 25 IE faktor VIII pr. ml, 10 g glycin/1, lOg trinatriumcitr at--21^0/1 og 5 g natriumchlorid/1. Efter indstilling af pH-værdien på 7,0 sterilfiltreredes opløsningen, fyldtes i slutbeholderne med 20 ml pr. flaske og frysetørredes. Faktor VIII-aktivitetsbestemmelsen på det frysetørrede materi-35 ale i s lutbeholderne gav 480 IE faktor VIII/f laske.

DK 162966 B

27

Eksempel 14

Fremstilling af et faktor VHI-præparat efter fjernelse af under inaktiveringen dannede neoproteiner.

5 46 1 frisk frossen plasma optøedes ved 0°C til +4°C. Det fremkomne kryobundfald skiltes fra ved centrifugering og opløstes i 960 ml af en trinatriumcitrat-opløsning ved 37°C. Opløsningens pH-værdi indstilledes på 6,3 og temperaturen 10 på +4°C. Det fremkomne bundfald skiltes fra ved centrifugering og bortkastedes. Den faktor VIII-holdige ovenstående væske frysetørredes, lyofilisatet indstilledes på et vandindhold på 0,075 (7,5%) og varmeinaktiveredes i 10 timer ved 60°C for på pålidelig måde at udskadeliggøre evt. tilstedeværende 15 formeringsdygtige, filtrerbarere sygdomsvækkere, såsom hepatitis- vira. Faktor Vlll-aktivitetsbestemmelsen efter opvarmningen gav en restaktivitet på 0,95 (95%) faktor VIII i sammenligning med ikke-opvarmet materiale.

20 Prøver af det ikke-opvarmede og det opvarmede, frysetørrede faktor VIII-præparat undersøgtes ved hjælp af SDS-polyacryl-amid-gel-elektroforese. Ved den ikke-opvarmede pjrøve opnåedes det på fig. 4 med a betegnede båndmønster. Ved den opvarmede prøve fremkom det på fig. 4 med b betegnede båndmønster, hvori 25 der fremkom de med N^, N^ og betegnede bånd, der tilskrives under inaktiveringsopvarmningsbehandlingen fremkomne neoproteiner. Disse neoproteiner skal ifølge opfindelsen fjernes ved hjælp af en efterbehandling af det opvarmede faktor VHI-præ-parat. Efterbehandlinoen eller den videre fraktionering fore-30 gik ved opløsning af det opvarmede faktor VIII-præparat i 900 ml vand og tilsætning af ethylalcohol til en koncentration på 0,10. Derved udfældede der sig en faktor VIII-holdig fraktion, denne skiltes fra ved centrifugering og opløstes i en glycin-citrat-NaCl-^puffer. Opløsningen overførtes til et galenisk 35 præparat på den i eksempel 13 beskrevne måde.

DK 162966 B

28 SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese af den rensede fraktion gav det på fig. 4 med d betegnede båndmønster·; undersøgelsen af den ovenstående væske fra udfældningen med 0,10-alkohol gav det med c betegnede båndmønster. Det ses her, at 5 neoproteinerne N^, Ng og forbliver i den overstående væske ved alkoholudfældning, mens det rensede faktor VHI-præparat ikke mere indeholder disse bånd. Ved den beskrevne alkoholfraktionering fjernes også andre proteiner. Faktor VIII-akti-viteten i det fraktionerede præparat er i det væsentlige bi-10 beholdt, nemlig med 0,70.

Opvarmningsinaktiveringsbehandlingen ifølge opfindelsen kan udvides op til 100 timer uden at aktiviteterne går tabt. Stabiliteten for vigtige koaguleringsfaktorer ved opvarmning i op 15 til 100 timer ved bestemte, indenfor opfindelsens rammer, opretholdte temperaturer og vandindhold, fremgår af tabel XIV.

Eksempel 15 20 Fremstilling af et faktor VHI-præparat under anvendelse af beskyttelsesgas.

En på samme måde som i eksempel 1 fremstillet faktor VHI-hol-dig opløsning fik tilsat henholdsvis en sindbis-virus-suspen-25 sion i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes.

Det frysetørrede faktor Vlll-koncentrat indstilledes på et vandindhold på 0,08 (8 vægt%), bragtes under forskellige "at-30 mosfærer" ved 3 gange evakuering til 100 mbar og efterfølgende beluftning med henholdsvis luft, nitrogen, helium eller argon og opvarmedes i lukkede beholdere ved en temperatur på 80°C i forskellige tidsrum. For hver variant blev der udtaget 3 prøver før opvarmning og til bestemte tider under op-35 varmningsprocessen til måling af på den ene side virustiteren og på den anden side restaktiviteten af faktor VIII og vandindholdet.

DK 162966 B

29

Bestemmelsen af virustiter, restaktivitet af faktor VIII og vandindhold foregik som beskrevet i eksempel 1? resultaterne fremgår af tabel XV. Det fremgår heraf, at restaktiviteterne eller udbyttet af faktor VIII ved opvarmning i en 5 atmosfære af inaktiv gas (nitrogen, helium, argon) er væsentligt højere end ved opvarmning i luft. Hastigheden for virusinaktivering er derimod uafhængig af den atmosfære, hvorunder der blev opvarmet.

10 Eksempel 16

Fremstilling af et præparat, der indeholder det partielle prothrombinkompleks under anvendelse af beskyttelsesgas.

15 Et på samme måde som i eksempel 3 fremstillet præparat, der indeholdt koaguleringsfaktorerne II, IX og X, fik tilsat henholdsvis en sindbis-virus-suspension i cellekulturmedium TCM 199 eller virusfri TCM 199 og frysetørredes. Det frysetørrede koncentrat indstilledes på et vandindhold på 0,08 og bragtes 20 under forskellige "atmosfærer" ved 3 gange evakuering til 100 mbar og efterfølgende beluftning med henholdsvis luft, nitrogen, helium og argon og opvarmedes i lukkede beholdere til en temperatur på 9o°C i forskellige tidslængder. For hver variant blev der taget 3 prøver før opvarmningen og på bestem-25 te tidspunkter under opvarmningsprocessen til måling af for det første virustiteren og for det andet restaktiviteten af faktor IX og vandindholdet.

Bestemmelsen af virustiteren og vandindholdet foregik, som 30 beskrevet i eksempel 1, bestemmelsen af restaktiviteten for faktor IX skete,som beskrevet i eksempel 3.

Resultaterne fremgår af tabel xvi. Det ses her, at restaktivi-terne henholdsvis udbytterne af faktor IX ved opvarmning i en 35 atmosfære af inaktiv gas (nitrogen, helium, argon) er væsentligt 30

DK 162966 B

højere end ved opvarmning i luft. Hastigheden for virusinaktivering er derimod uafhængig af den atmosfære, hvorunder der blev opvarmet.

5 10 15 20 25 30 35

DK 162966 B

31 Η Λ o o w o o w o *· *

> Γ0 i—I rH

(-1 -H O O

o o o -P tji * -

X β O rH .H

Π3 -iH —I

«η i

+) p 00 O CN O

di to ro oo σ> o 4-J J> ro H Q4 ^0 ^0 CO r—i > o -h omo in o σι 4J 5-1 LO CO 03 O 00 Λί 0) iH »«.** (0 4-1 O O O <H o 4J m W 0) CU o in o o n~ os ro 00 σι o o σι

O O O rH rH O

Λ

rH rH

~ 0 V v

o ro Y

uo P . — H (C Ό* 0 o rH *

Μ EH rH H y H

0 -π r- o rH P' Γ0 i--! r—1 <H r"4 >“4 *“4 “ * 05 O Vv V V v © N O) ^2 ή ·η £t ιΰ ^ ο re r- ^ £-1 ^ *"4 »“4 rH rH * rH E4 w ^ tø 3 YV V ™ v

-H S

+1 S n 01 ri li M u * k

? £ O Η N fO O rH

•S S, v v

> O

1 , rH LO !" 01 >4 „ T,! © O CM -0· X, 4-> rp m

£ © rHtNHO σ Γ" rH

•^o*··.*·»· - » - ^ n in m in ro τ 4-i -'--

(0 P

Μ P

(0 4-) CU © ς_)

P ^ O OOOO O O O

w Ϊ lO IC IC IC 00 VO LO

IH W4 i © w * H -1-—--- > Ό

Vj ^ O t-L 2 in 1;

4J O O O CO 00 rHO

X 5 g UOrOCMO O O O

<0 ,-J *·*»*· » ^

Ct, ^ π OOOO o 00 uo o uo

rH rH

DK 162966 B

32

H

M

> p x: ° , o •P Ή O σι r-i X . m -

15 5 O

m c

•H

-p S o φ f; O O r-{ +> H h •H fO _j

> > H

•H o °

-P 0 O

·* L, M H

5 S H

»ϋ ° 0) m o « ω Ή ιΗ

iH

Sg> &> 5 0 d H § Λ --5 in η (Tj o ». (0 *

H P ·> tn rH H CN

H ® O, V H

•h ° in \o P l, ° Ή W Λ) rH iH c—{ Γ0 S ? +» v ® •Q H C ^ Si (ø ni m to id H ? oo ^ 1 m rr ω —» ή o ολ m X! m >h >.

Ό Q 'tf m

C H

•HU 00 Η

CO E-i -H O

"5T in

P

3

P

(C

P

0) U o o

_P Dj o ID KO

3 e P e> 3 E-i

Dj--- 8 p in in η· Ό o o I 3 o o H ip 3 ·.

H (tf > O O

H

> Ό---

H i—I

P -.0 0

0 ' £ C

4J Ό U o λ; αχ .η m H +j fcj " Q) o s in o

DK 162966 B

33

X

M

U X oo o o 0 co o o 4-)-.-1 O - - Αί H O '—I *—1 as εή m c

•H

C c „ „ O) E m o o 4-) C σ\ o o •H tc ro - -

> > O -H rH

-H C, •P 0 Αί m ^ o

4J 0) O

tn -P r-t

d) rH

O' o {_ U c

O) -H

•y g •H £ +) g

H “ 5 Λ « 0 O

i_J 3 £ H ° O

Πμ^οο μ, -

H , -g O η H CM CM

1 U

I—I >-l

CD &< £ <D

X! *·-< Λ m· r- Λ C en Ο (0 - -

Eh E-i CM CM

tJ) _ n ft, γ-ί r~- 0' CH ι-c o --

*r4 CM CM

Μ o CD r-1 4J tJl , 0 -r1 ^ m vo (0 !-) O -- - -

Q CM CM CM

4-) C

r—I D

Φ 4-)

•H „ (C

jj “ 5η

Sh ^ CD U O O O

to; Cii o vo co crv

Oi Oi g e £ Ό X--- Ί) £ ε -H m h to •p e ¢0 0¾ m y h to X« o _ q q

Cl -U -d 13 g ο o rj ο 'ϋ c ° ° ° ^ C [β _ ο o

Oi D H > ° m o m

pH rH

34

DK 162966 B

x

H

w o •P -C t" M -Η σι ' (ti _ ro -!H Di o 3 ! 4J Ti

Q S

S g

> ra O

•H > O

-P & H

X 0 _) tJ , 4J u «0 js m +1 ^ Φ

O

•P Æ

Di .

0 c η h 1 § v > ξ ro ω g4 n

4J U

Η Ή j, O -P Ϊ! CO 00 Λ to fi (0 3 Jj O o· ^ 3 «

T* H <N

a —* - · - •h o .. o in jQ in Ή Q 6i c H C ή

•H U _j O

01 g VO

u - - 3

4J

m +j u dj oj Φ U o π λ: S* 0 ό

Dj φ E

•g H « -o a eh ~x g - o Ό --

(li C

g Ή «W

Λ <tf ' -P g «ο <σ nu h - <ΰ Λ O - r> ' c.-p x: u o o *o c n u c to o cu cu H > in

35 DK 162966 B

sz o cn o o -no ή < o o IB ^ O * «-

M »H rH <—I

w cn 00

tu C O IT« O

•H

•P g rH O rH

0 6

•p Li O O O

•H ra n *· » *

> > iH rH CO rH

-H Qj CO

4J O A - p o

10 U O

v Φ tn ra +> ή σι O) tw - - os o; o o sz r*· O rH - Π \S Ή co

O rH

>H -V

CO CO

m i—ί »Η w CM V V/· ^ τΐ in >—t co rH « * rH * o tr n cm \s *r

r- C

cn ·η n rH

0 fB *» —' iH

H E o n v w 5-1 ^ > 10 U > CM rH « QJ Pi * \s ^

i 4J 0 O

rH -H <H

dj 4J H 0) ja 1» Bl H CO Λ 10 3 H ·. ·> (0 E-* Η ^ o n Eh * ® 1 m σι 03 O °

•H ° - CM

ja « o

Ό S o rH r- CN

C M ' ' *· •h r O n m· ^ m W ="

H

3

P

CO

p O O O o Φ lp VO vo σ» o o, 0 ε 4J g m _Ξ--— -

Sh (O <w .i 0 CU CO CO 2 ft’ SZ H ^ Η Ό -P 0 ' G, Η H G ° 0___ i. jS p* σι

α CO o r> CO O

S hg o o o o g g °* o o lo in o

rH

36

DK 162966B

.c o o < : o *

a -H Cl iH

H

W Cl

t C O

•H O

4J C O

- QJ 5 rH Ή -M u •H m > > co in •H 04 ΟΙ Γ* 4-> O m - * JA o o

(C SH

4-i ti) or*

W +> O CO

0) <« rH *

« <D rH O

0 Λ ih m

01 O

Om n i—i -<r

54 O

01 J h m

U C

•H * C? T) C - « p — tf

CO P"' Π iH »H

M 3 rrt V V H

> u £ ^ v > 'M η ™

> Π Η H rH

1 ° V V ^

M W ^ pH

<1) Ή 7. 0

-Q 4-1 2 m pH JQ

<0 Ή in * * rH (0 M 4J ΐ! O NV Eh (0 ^

Qi

ω —* p-H lO

-C O » »pH

qj m © nv

no Q

C Η σι in ao 3 U © * * S Eh mm «y

Ih 3

4J

m u u QJ o

4J Qi O O O

(C S ιο oo ίο SH ® m c*

Qt __ _ ffi--- 54 o* Ό Ό

I pH C

< om C3 sa > r* r* m

M ' Ό - O O pH

H C m * * o te H nj o o * o m o

pH

DK 162966 B

37 n o o\ I (D *H Ή »

M Ό O

' Od) Ov

^ *> ε : C

«> n -Η h vo ϋ * 5 åg" s M 0> 0. ? § ^ o 0» CO 2 nj ° Λ -Hl· 5 > , -P M <I) 5-1 Ro.

v C ΌΛ Ο) 2 O

•h c λ: > „ ·« -η s. ^ m

M M 5-1 d) S

' rø OHO. M +J fs, .Η Ή -Η H ^ IH 04 ' >1 -P O rn <D ° M CM Z ' Φ (D T3 -U IT Λ

H tn H c .2 7T

O C O O ri +J

S Η Λ ^ £ g

____ (0 4J

jj to σν w Λ σι

0 3 H

« cn ° H __ 0 /- _ tJ> - tn -1 ® c x;

Qn C o i—i J7 "M

5 s rt v ° 1 S £ „ “S h C S v SS?»·0- SS®·»0 ·“§ " * S 0 «

4J Η -H M

_i rft Φ ^ <J) 5 2 -5 " ^ « 8 £ « “1 • o * -¾ * 1 «η r* o i i s s

CM T fi Η -V

CO ϋ ° VO +> -Η u H O

-uwei ^ nj μ e «s C u M__m

<d * o. .. ΙΟ. N

« <, M

U " O. u o. 2 13

« M 4J

¢1 Μ ϋ ° ° 2

H « « « -Η Φ O O

Ό m JO ft o vo

Il 2 § * 5 61 •5--i.

, Q) . ..... .

3 2 Ή

£ tu 2 aJ

η ® 2 Ό ετ> -α in h

5 Η · £ (DO

2 0 ΰ I Λ Ό O

§ -C Ό ° ^OC h

SOC ~ o C RJ

1-1 c <a ° vh> o H > _;__

·" S S

38

DK 162966 B

i !

<D Æ I N I

σ' I o 0 tn *

C I M

•h I

e h .

10 E-l Tt ns Ή: Οι ~ I *3 ? i ft 5* *a· . C r- C en % Tf ^

JtJ .·£ c·» * L® £ I cn

® I o -U § Η I

+> p -h y o •η m > ® ·Η >

•Η > I JJ S1 I

4J Λ ϋ 0 Γ' ϋ 0 ns ., m σ\ ίβ . 4J " η » -U « οι ® ο ι ο

S ® 1 {ί I

I ~ο I

I m j α Ο Η Μ

Ή h, U

σ» 2* εη

Ο 5 ο I

Η Τ* J2 · . <Η I

-3 tn X σ' I

^ tf ** 0 I

Μ Μ g m ^ I Ή s & V ^ - .

ϊ 5 ° r. ϋ S - Λ Μι,Ν *· <8 +> jr, r

β 3 m «η Η 'Η C I

HI η ii- +J ·η

•Η (1( to g Ή ,—I

” m 10 - £ V

1 ω —i h π I

W ^ ·Η (0

•HO > > I

Ό tn i q, m i Ό a vo to o ^ ή i C Η O I -Η O ν' •HU tn I -Ω u W Η Ό ¢) "3- 4J C 4J * -H IH O in 2 ω <u (0 __ ffl4 ^ Il 13 a ϋ i

Qj +j 3

ns 4J I

-pH <8 I

c: au o u i

-H Qi o lO G) O O I

rrt S α o i vo i

H <U S I

OH +> O I

JZ ΠS Η I

7 £ S o.

I .g C Ό Ό .¾ Ό Ό -Η Ή C oo 2 « £ g 0 nS tn E 0 nS c\j ta Λ > o tn -C > m m Ό v ns Ό o H £ >H O Ή β «Η * a, h <8 -¾ h ns o in 39

DK 162966 B

T3 rH

. Λ H O

‘ <Ί 0 u

£ O Æ -P

aj — jz o <*> t! c S t» r* 0 0

Bern»- jj. m x ® -H o o m 01 O M, -ri o

+? ^ S 'O

—' 0 ^ <j tn <u

m te & G S

o & 21 <n -hu ·· w j, 5 om ^ u «1 JJ-P-H CO 00 ri T3,> 0 5 s n 5 c 0j 2 £ u 00 2 <o o

•H 7J &> W u U J

> Ή >? £ ftf o 0) H c ω i *H *H ^ ' •P -Η & Λ >, u ϋ Λ c 0 S C-HO) G G -3 O iH jj (1)> POS” CO cn £ bi Η β.

W U & _g· ih - - O C -H U

® τ! S ϋ o o g Η-ΡΛ ,¾ ω O O ---- _ 0 o i-T1

θ'" O - JS

M -* ,

kJ ^ «· <H

O U V

2 ® w

01 3 G

0 Tj -p

pH 2 -Jf G

^ X 3 E

u , m iH . iJ S N ^ •2 01 p-i i o * G ^ 0) to υ g s ^ i is

* U * 3 ϋ Η H

S ? > _ °i S. ω v o * r= 'n , <D tn

M ~ U - Ό Q CN

01 ^2 <D _ Λ cm .£> = P ° ‘ DUO cn (C ' Ή ^ as ε-* gH C to 0) * ^ P ”” ~ --------- 0 u p

<u 3 rt U

c +j ® 5 0 (0 & 5

Lj U Q ti 2 . dl U o u jo

•H.QjO VD O) Oiu O

* * I s.

§' S ___5 g (¾ O-- 1 « Ή y GU (S 7 m ^ rrt c T3 Ό

2* ,. 2 -Η «Η G

0. -P h - c o <d C dl o m I £ > -H-HJdO o 2 £ U Ό 'OG O 5 g fc o •α M c <0 « < 5 rt fc Λ ____-J -__

DK 162966 B

40

M

Η X

> H

Μ ί|

O < O

4J -ri O i4 43 -H

43 fi 43 C i 43 C

•4 Dj O -W Qj O -H Dj ro O

4J O 43 O 43 O

X X X

M Η H

0 y V

si -c r= h o .h H S. cjl Λ

H σ' Q Q

X O 3 ro r-ι C. ro <-t

Ή ' JZ Vi V

32 U * V -H IH »i 3 , rH rH

© © ^ ’X3, nal Xi Tf v H 43 £· tt * K -0, •h G σι p , s ? _jj *H ^ .. U O' no CJ — J4 fi τ r»· © s cm 'r> S - ,. *rj *. r-t 1 I f fi ° N « £ i ° v .2 η» 5 e 54 “· 54 > > ro \a +-5¾ s 43[0 © O 0- ^ -p >1 ® g £ g· -

•Hu Ec^OCM^ E, 0 O -H

= © Dj S

----5--

C

2 Qj o 10 CjO iO ίι Dj o 10

n. E S -C S

tf V 'O < *0 O -π £> O

~ cm - Q c ^ *> jj fQ *» i® H «J 0 ^ H <0 O U C *M 0 ^ iG H (0 i_! & 1___ i d, I_I_ 41

DK 162966B

w

H

M X X

> H W

p 5-1 V-l

O < O O

•p a -p -p

Pi i—i Pi Pi jg h <o to . W Cu <P «Ρ •P ^ 4J r~ r- oo ro m ;? o ·<τ vo ro ro S fi O - -

•H "2 f-4 O O O O

S i

4J H

\£ tD

0 ^ in οι σι ro 4J Ϊ oo co r- r* w u o » Q) . ro o o o o

* Φ V <P

<D

*r in i—i oo

o cjs o* o\ CO

H ·* - * “ o o o o > -—-- w * 3 -i +)

O) RJ

jQ P _ (0 O U o o o o g* Cj o vo vo vo vo

S

Λ»

P

• 0 <H

P' ni 0 P Ό

Pi H

(0 0 m jc Ό co r~ r~ σ> οι Ό c o o o o

Di C <0 * * - -

β H > O O O O

•PΓ P_____

<D

rP I I

3 C E

Di ·Ρ O

(0 -Q P

0 I E Æ

Pi fi O -P

0 P 0

P P) Pi Æ P

0 Pi I -P ' &

U-4 3 M 0 W

.p p <0 -p 0) 0) E

rP O P <C iH iH -H O

•H 4J -P O β Qj -P Pi

X5 Pi C tP JJ £ P C

β β 0) W 0 O (0 *P

4J Cu .u fcj E-ι Pi £P -Q

rø __—i in o

rH

DK 162966 B

42 w

M

W

>

U

O ·.'

U £ CO O CM CM

X CM VO VO VO

flj -P O ·» «. v

Ή rP O O O O

•0) 3 -P r> m m in -U S in oo oo co φ H rn * - ».

P P O O O O

•π m > > in in n* co -P CU oo σ» σι σι 4J O r-ι ·· w X o o o o nj P 4J q in +> (U >w os ® o x; m Q o W r—I i—I ip i—l ip CJ V V V v en 0 lp - n ^ ip rp ip V V v v

> -P

* S c

*H j iH »H «Η iH

* t! 1 v ^ ^ v Φ 3 g « g g

t* ^ α M

1 λ I—< iH rH iH

:: ^ o v v- ν' !q * I 5 C i æ o r* σι -H ' co w o «τ in p· p·

I Φ S 3 S

0 g JJ 5» -P 0 ε S IW P rP cn p> tg s 43 Φ u < 0) ip *P Λ 3 c +J -- 2 S. 2 OJ Φ Ξ o- u o o o o o. £P0 æ co oo oo Φ 3

I £p 4J

IP

M - ---

M

> Ό ep y io o ?o ,c

4J c ert 00 CO 00 CO

Λί (ae; o o o o 3 > -P k fa o o o o in o

X

43

DK 162966 B

h .C Γ~ cN *r O CN >—) |“4 $4 O ·· ' ' '

0 i-H O O O O

U H X

ø tji o in n· · cn (Hg CO If) 9 O' ^ rn ·> » * - JJ g o o o o ø s +j H ro cn m o -hø id oo r* > > pH «· «* »· *

•H Q, O O O O

JJ o i 0 u P (i) CO 4->

0 <H

es ø

JZ

O

«“» ιΗ «Η >H pH pH

O S/ V V V

in

Q

M

u £h CO pH i—I pH r-l

v v V

M

> U Ή X 0 4-1 O’

·' ·Η C i—I i—I rH pH iH

4-> -Η V V V V

r-l CO C

0 3 S

λ p y 0 -H 5

Eh co > > m

X I di - r-4 pH pH pH

0 CO 0 O Vp· V1 V- V

Ή ' —i d X n £ B ® 0 c -u r~ -c « * -η «η * - - C CO 0 O <9 «9 uo 9 •h I____

O - E

5.! i 0 g 3 c X 0 J-ι 4J m -H 0 4- > g (8 114 Q pH O' o S «Η 3 H ø ij 5- ) <r CO <-i 4J ϋί ra * "c 4-)

^ I

0 03 ti s jj a u o o o ° 0 EPO σ' σ* σ’ O’

Or øg

H 4J

0 _11_- e i +> Ό

0 H

54 I 0

0 *2 5 CO CD 00 CO

g 0 c ® ® ® ®

54 > Ο Ο Ο O

Pj · L_II-——- in ο «η »—I ^

Claims

1. Fremgangsmåde til inaktivering af formeringsdygtige, fil-5 trerbare sygdomsvækkere i blodprodukter under anvendelse af forhøjet temperatur, kendetegnet ved, at blodprodukterne i fast tilstand indstilles på et indhold af vand, methanol eller ethanol større end 0,05 (5 vægt%) og mindre end 0,70 (70 vægt%), fortrinsvis mindre end 0,40 (40 vægt%) og be-10 handles i en lukket beholder ved en temperatur i området fra 50 til 121°C under forhøjelse af partialdamptrykket for vandet, methanolen eller ethanolen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 behandlingen af blodprodukterne gennemføres med vanddamp ved et tryk på 0,1 til 2 bar.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at de formeringsdygtige, filtrerbare sygdomsvækkere er 20 hepatitis-vira eller ubekendte overførere af AIDS (acquired immune deficiency syndrome).

4. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at man behandler blodprodukterne i et tids- 25 rum på fra 1 sekund til 100 timer.

5. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kende tegnet ved, at man gennemfører behandlingen af blodprodukterne ved et vandindhold på 0,06 (6 vægt%) til 0,30 (30 30 vægt%) ved en temperatur på 50 til 90°C.

6. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører behandlingen af blodprodukterne i nærværelse af en oxygenfri, inaktiv beskyttelses- 35 gas, fortrinsvis nitrogen, og eventuelt i nærværelse af oxygenbindende stoffer. DK 162966 B

7. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at blodprodukterne behandles med vanddamp eller gasformig methanol eller ethanol.

8. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kende tegnet ved, at blodprodukterne behandles i et flydende medium, hvori de er uopløselige.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at 10 der som flydende medium anvendes chloroform eller eddikesyre- ethylester.

10. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at der anvendes et blodprodukt, der er bun- 15 det kovalent eller ikke-kovalent til en matrix.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at der anvendes et blodprodukt, der er anbragt på en vævsforligelig bærer, såsom et kollagenlag (Kollagenvlies). 20

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at der anvendes et fibriogenholdigt materiale, der er anbragt på en vævsforligelig bærer, såsom et kollagenlag.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de inaktiverede blodprodukter ved yderligere fraktioneringsforanstaltninger befris for de eventuelt under inaktiveringen dannede neoproteiner eller neoantigener.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af blodprodukter valgt blandt enzymer, proenzymer indbefattet koaguleringsfaktorer, enzyminhibitorer, immunglobuliner, albumin, plasminogen, fibrinogen, fibronectin eller plasma eller blandinger af de enkelte blodprodukter under anvendelse af fremgangsmåden ifølge 35 krav 1 til 13, kendetegnet ved, at inaktiveringen foretages i et efter ønske valgt trin af fremstillingsproces-den, hvorefter blodprodukterne om ønsket omdannes til et ga-lenisk præparat.