DK154553B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af ether- eller thioethermercaptoacylproliner - Google Patents

Description

i

DK 154553 B

o

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte ether- og thio-ethermercaptoacylproliner med formlen X-lf 5 R2 HC/t>( I 2| 2 1

R4- S- CH 2- CH — CO-*N-c — COOR

H

hvori X-R -gruppen er anbragt i prolinringens 3- eller 4-10 -stilling, X er oxygen eller svovl, R er hydrogen eller alkyl, R"*" er C^_^ alkyl eller phenyl, eventuelt substitueret med et halogenatom eller en methyl- eller methoxygrup-pe, R er hydrogen eller C^_^ alkyl, og R^"er' hydrogen, C^_^ alkanoyl eller benzoyl, eller salte heraf.

15 De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstil lede ether- og thioethermercaptoacylproliner med ovenstående formel I er nyttige anti-hypertensive midler.

Fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.703.828 kendes beslægtede forbindelser med samme type aktivitet, nemlig 20 hypotensiv virkning. Disse kendte forbindelsers struktur adskiller sig fra ovennævnte formel I, idet de ikke udviser substituent gruppen XR^, men i stedet er enten usubstituerede (dvs. har hydrogen) eller bærer en hydroxy- eller alkylgruppe. Den mest bemærkelsesværdige blandt disse kendte forbindelser 25 er den usubstituerede, der forhandles kommercielt under navnet "Captopril", og som har strukturen ?h3 Is

HS-CH,-CH-C0-N_I-COOH

30 1-(3-mercaptopropanoyl)-D-prolin ("Captopril") kendt fra DE 2.703.828

Denne forbindelse er i nedenstående sammenlignings-forsøg (jfr. "Biologisk afprøvning") afprøvet sammen med den 35 ifølge nedenstående eksempel 13 fremstillede tilsvarende 4- 2

DK 154553 B

o phenylthioforbindelse med formlen ?H3

5 HS-CH2“CH-CO-N__COOH

1-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-cis.-4-phenyl -thio-L-prolin, hvor sidstnævnte forbindelse udviser et højere aktivitetsni-10 veau.

alkanoylgrupper er acylgrupper i fedtsyrer som f.eks. acetyl, propionyl, butyryl og isobutyryl, hvoraf acetyl er særlig foretrukket.

Produkterne med formlen I forekommer i stereoisome-15 re former eller som racemiske blandinger deraf. Alle disse kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Den nedenfor beskrevne syntese kan benytte racematet eller en af enantiomererne som udgangsmateriale. Når der til syntesen anvendes det racemiske udgangsmateriale, kan de stereoisomere, 20 der fås i slutproduktet, adskilles ved gængse chromatografiske eller fraktionelle krystallisationsmetoder. X-R"*"-gruppen kan også give anledning til cis-trans-isomeri.

Fortrinsvis er det asymmetriske center ved C2 i prolinringen i L-konfiguration, og hvis der er et asymmetrisk 25 center i mercaptoacylsidekæden, er det i D-konfiguration.

Særlig foretrukne blandt ovenstående forbindelser er sådanne med formlen I, hvor X er oxygen, R^ er methyl eller 2 ethyl, især methyl, R er hydrogen eller methyl, især methyl, 4 1 R er hydrogen, og XR -gruppen er i 4-stillingen i prolinrin-30 gen, især når -XR^-gruppen er i cis-konfiguration.

Etherne og thioetherne med formlen I fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at en prolinforbindelse med formlen 35

O

3

DK 154553 B

r<

HN__COOR

5 hvori R, R1 og X har den ovenfor anførte betydning, kobles med en syre med formlen R2

r,4-s-ch2-ch-cooh III

10 2 4 hvori R er som ovenfor anført, R' er alkanoyl eller benzoyl, eller et funktionelt derivat deraf, til dannelse af 4 et produkt, hvori R er C^_4 alkanoyl eller benzoyl, og at produktet om ønsket hydrolyseres til dannelse af et produkt, 4 12 15 hvori R er hydrogen, og R, R , R og X er som ovenfor anført, hvorpå en eventuelt dannet syre om ønsket overføres i et salt deraf.

Denne reaktion kan udføres i nærværelse af et koblingsmiddel såsom dicyclohexylcarbodiimid eller lignende, el-20 ler syren kan aktiveres ved dannelse af de blandet anhydrid, symmetrisk anhydrid, syrehalogenid, aktiv ester eller anvendelse af Woodward-reagens K, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-di-hydroquinolin eller, lignende. Med hensyn til acetyleringsme-toder henvises til Methoden der Organischen Chemie (Houben-25 -Weyl), bd. XV, del II, side 1 ff. (1974). Fortrinsvis omsættes syrehalogenidet, især syrechloridet, med formlen III med syren med formlen II.

Esterforbindelserne (formel I hvori R er alkyl) kan omdannes til den frie syre (dvs. R er hydrogen) på gængs måde.

30 Hvis f.eks. R er t-butyl, giver behandling med trifluoreddi-kesyre og anisol den frie syre.

Produktet med formlen I isoleres fortrinsvis og renses ved krystallisation, f.eks. ved at danne dicyclohexylamin-saltet og derefter omdanne saltet til den frie syreform ved be-35 handling med en vandig opløsning af en syre såsom surt kaliumsulfat.

4 4

O

DK 154553 B

Produkter med formlen I, hvori R er alkanoyl, eller benzoyl, kan omdannes til produkter med formlen I, hvor 4 R er hydrogen, ved gængs hydrolyse eller ammonolyse.

Esterne med formlen I, hvor R er C1-4 alkyl, kan 5 fås ud fra carboxylsyreforbindelserne, dvs. hvor R er hydrogen, ved gængse esterificeringsmetoder, f.eks. ved esterifi-cering med en diazoalkan såsom diazomethan, 1-alkyl-3-p-to-lyltriazin såsom l-n-butyl-3-p-tolyltriazen eller lignende.

Prolinreaktanterne med formlen II kan fremstilles 10 på forskellig måde. F.eks. kan et hydroxy- eller mercapto-prolin med formlen

XH

"Ή

HN—>— C-COOH

15 |

H

acetyleres med et acetyleringsmiddel såsom eddikesyreanhy-drid, acetylchlorid, propionsyreanhydrid, smørsyreanhydrid, 20 benzylchlorformiat eller lignende for at beskytte nitrogenet. R^-gruppen indføres derefter ved at omsætte den N-beskyttede form for forbindelsen med formlen 17med et halogenid, R^-hal, hvor hal er et halogen, fortrinsvis iod, i nærværelse af sølvoxid, natriumhydrid, natriumhydroxid eller lignende, hvorved 25 der fås et mellemproduktet med formlen beskyttet-N-C-COOR1 30 '

H

Alkalisk hydrolyse af mellemproduktet ined formlen V med en base såsom bariumhydroxid, natriumhydroxid, kaliumhydroxid eller lignende giver den frie syre (COOH) og derefter hydro-35 lyse med en mineralsyre såsom svovlsyre giver udgangsmaterialet med formlen II.

4

DK 154553 B

O

5

En anden fremgangsmåde til fremstilling af prolin-reaktanterne med formlen II er at behandle den N-beskyttede tosyloxyprolinester, fortrinsvis methylesteren med formlen 5

beskyttet-N-C-COOalkyl VI

10 I

H

med et natriumsalt med formlen

R1-X-Na VII

15 hvilket giver mellemproduktet med formlen

2o Η2ί^><Γ VIII

beskyttet-N-(jl-COOalkyl

H

I formlen VI er symbolet Ts -S02“ ^-CH^, og den N-beskyt- 25 tende gruppe er benzyloxycarbony1, der er foretrukket, eller andre almindeligt benyttede acylbeskyttende grupper. Dersom tosylatgruppen er i cis-konfiguration, vil XR^-gruppen ved denne reaktion være i trans-konfiguration, og hvis tosyloxy- gruppen er i trans-konfiguration,vil XR^gruppen være i cis-30 -konfiguration. Mellemproduktet med formlen VIII omsættes derefter for at fjerne alkylestergruppen og omsættes derefter med hydrogenbromid, hvilket giver HBr-saltet af prolinreak-tanten med formlen II, der derefter kan kobles med syren, fortrinsvis syrechloridet, med formlen III.

35 6

DK 154553 B

proiinudgangsmaterialerne med formlen II, hvor X er svovl, og XR^-gruppen er knyttet til prolinets 3-stil-ling, kan også fås ved at behandle en 1,2-dehydroprolinester, fortrinsvis t-butylesteren, med formlen 5

O

N ~==-i— COOalkyl med et acyleringsmiddel såsom benzylchlorformiat, acetylchlo-10 rid etc., hvilket giver 4,5-dehydroforbindelsen Γ'Ti

beskyttet N-COOalkyl X

15 som derefter omsættes med mercaptanen R^-SH, hvilket giver rf*

beskyttet N--COOalkyl XI

20 hvor -S-R^-substituenten er i transkonfiguration. De N-be-skyttende og alkylgrupperne fjernes derefter, hvorved fås det ønskede udgangsmateriale.

Prolinudgangsmaterialerne med formlen II, hvor R"*" 25 er phenyl, substitueret phenyl, phenyl-lavere alkylen eller substitueret phenyl-lavere alkylen, kan ligeledes fås ved at behandle benzylesteren af det N-beskyttede prolin med formlen IV med alkoholen R-OH i nærværelse af triphenylphosphin og diethylazodicarboxylat ifølge den metode, der er beskrevet 30 af Bittner m.fl. i Chemistry and Industry, 15. marts 1975, side 281. Fjernelse af den N-beskyttende gruppe og benzyl-estergruppen giver udgangsmaterialet med formlen II.

Der henvises ligeledes til de følgende publikationer med hensyn til yderligere oplysning vedrørende fremstil-35 ling af udgangsmaterialer og mellemprodukter: USA patentskrifterne nr. 4.046.889, 4,105.776 og 4.145.935, Neuberger, J.

Chem. Soc., 1945, side 429-432, Patchett m.fl., J. Amer. Chem.

7

DK 154553 B

Soc. 79, side 185-192 (1957), Baer irt.fl., Can. J. Biochem. and Phys., 37, side 583-587 (1959), Sheenan m.fl., J. Amer.

Chem. Soc. 85, side 3863-3865 (1963), og Magerlein, J. Med.

Chem. 10, side 1161-1163 (1967). De deri omtalte metoder 5 kan benyttes som almene metoder ved syntesen og stereoom-lejringen af forbindelser, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Yderligere eksperimentelle detaljer er omtalt i eksemplerne, der er foretrukne udførelsesformer og også kan 10 tjene som modeller til fremstillingen af andre forbindelser inden for gruppen.

Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, danner basiske salt med forskellige uorganiske og organiske baser. Det saltdannende ion, der stam-15 mer fra sådanne baser, kan være metalioner, f.eks. aluminium-, alkalimetalioner, såsom natrium eller kalium, jordalkalime-talioner såsom calcium eller magnesium, eller et aminsaltion, hvoraf et antal er kendt til dette formål, f.eks. aralkylami-ner såsom dibenzylamin, Ν,Ν-dibenzylethylendiamin, lavere al-20 kylaminer såsom methylamin, t-butylamin, procain, lavere alky lpiperidiner såsom N-ethylpiperidin, cycloalkylaminer såsom cyclohexylamin eller dicyclohexylamin, 1-adamantanamin, benzathin eller salte af aminosyrer såsom arginin, lysin o. lign. De fysiologisk acceptable salte såsom natrium- eller 25 kaliumsalte, kan anvendes medicinsk som beskrevet nedenfor og er fortrukket. Disse og andre salte, der ikke nødvendigvis er fysiologisk acceptable, er anvendelige til isolering eller rensning af et produkt, der er acceptabelt til de nedenfor beskrevne formål som belyst med dicyclohexylaminsaltet og 30 cyclohexylaminsaltet i eksemplerne. Saltene fremstilles ved at omsætte forbindelsens syreform med 1 ækvivalent af basen, der giver den ønskede basiske ion, i et middel, hvor saltet udfældes, eller i vandigt medium og derefter lyofilisere.

Den frie syreform kan fås af saltet ved konventionel neutra-35 liseringsteknik, f.eks. med kaliumbisulfat, saltsyre etc.

Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, inhiberer omdannelsen af decapeptidet an- 8

DK 154553 B

giotensin I til angiotensin II og er derfor nyttige til nedsættelse eller helbredelse af hypertension. Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, griber ind i rækkefølgen renin —^ angiotensinogen —^ 5 angiotensin I —> angiotensin II ved at inhibere det angio-tensinomdannende enzym og reducere eller eliminere dannelsen af pressorstoffet angiotensin II. Når man således indgiver en hypotensivt effektiv mængde af et præparat indeholdende en eller en kombination af forbindelser med formlen I eller 10 et fysiologisk acceptabelt salt deraf, formindskes eller helbredes hypertension hos pattedyrarter, der lider heraf.

En enkelt dosis eller fortrinsvis to-fire opdelte daglige doser på basis af ca. 0,1-ca. 100 mg/kg/dag, fortrinsvis ca. 1-ca. 50 mg/kg/dag, nedsættes blodtrykket som 15 anført i dyreforsøg beskrevet af S.L. Engel, T.R.· Schaeffer, M.H. Waugh og B. Rubin i Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 143, 483 (1973). Stoffet indgives fortrinsvis oralt, men også parenterale indgivelsesveje såsom subcutant, intramuskulært, intravenøst eller intraperionealt kan anvendes.

20 Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan anvendes til opnåelse af en nedsættel-se af blodtryk ved at sammensættes til præparater dermed såsom tabletter, kapsler eller eliksirer til oral indgivelse eller sterile opløsninger eller suspensioner til parenteral 25 indgivelse. Ca. 10-ca. 500 mg af en forbindelse eller blanding af forbindelser med formlen I eller et fysiologisk acceptabelt salt heraf blandes med et fysiologisk acceptabelt bærestof, excipiens, bindemiddel, konserveringsmiddel, stabilisator, smagsstof etc. i en enhedsdoseringsform efter gængs 30 farmaceutisk praksis. Mængden af aktivt stof i disse midler eller præparater er afpasset således, at der fås en passende dosering inden for det angivne interval.

Som eksempler på hjælpestoffer, der kan inkorporeres i tabletter, kapsler og lignende, kan nævnes følgende: 35 et bindemiddel såsom gummitragant, akacie, majsstivelse eller gelatine, excipiens såom dicalciumphosphat eller mikro-

O

9

DK 154553 B

krystallinsk cellulose, et disintegreringsmiddel såsom majsstivelse, kartoffelstivelse, algininsyre og lignende, et smøremiddel såsom magnesiumstearat, et sødemiddel såsom sach- carose, lactose eller saccharin, et smagsstof såsom pebermynte, 5 vintergrøntolie eller kirsebæraroma. Når enhedsdoseringsformen er en kapsel, kan den ud over materialer af ovennævnte type indeholde et flydende bærestof såsom en fed olie.

Der kan findes forskellige andre materialer såsom overtræk eller andetø der modificerer doseringsenhedens fysiske form.

10 Således kan tabletter være overtrukket med shellak, sukker eller begge dele. En sirup eller eliksir kan indeholde den aktive forbindelse, saccharose som sødemiddel, methyl- og propylparabener som konserveringsmidler, et farvestof og et smagsstof såsom kirsebær» eller oranaearoma.

15 Sterile præparater til injektion kan sammensættes i overensstemmelse med gængs farmaceutisk praksis ved at opløse eller suspendere det aktive stof i et bærestof såsom vand til injektion, en naturligt forekommende vegetabilsk o-lie såsom sesamolie, kokosnødolie, jordnøddeolie, bomulds-20 frøolie etc.

De følgende eksempler tjener til yderligere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og til illustration af de fremstillede forbindelsers aktivitet som ovenfor omtalt.

25 Eksempel 1 1-(3-Acetylthio-l-oxopropyl)-trans-4-methoxy-L-prolin a) N-Acetyl-trans-4-hydroxy-L-prolin

En omrørt suspension af 26,2 g (0,2 mol) trans-4--hydroxy-L-prolin i 400 ml eddikesyre behandles med 26 ml 30 eddikesyreanhydrid. Det faste stof opløses gradvis efter to timers omrøring ved stuetemperatur. Opløsningen hældes på en 2 liters kolbe, og opløsningsmidlet fjernes i en roterende fordamper ved en badtemperatur på 45°C. Den sirups-agtige remanens (57,5 g) fortyndes med 100 ml ether, hvilket 36 giver et krystallinsk faststof. Efter afkøling natten over .10

DK 154553 B

filtreres det faste stof fra, vaskes med kold ether og tørres i en ekssiccator. Dette materiale, der vejer 35,7 g, pulveriseres og suspenderes i 100 ml ether, afkøles og filtreres, hvilket giver 33,8 g (98%) N-acetyl-trans-4-hydroxy-5 -L-prolin, smeltepunkt 128-131°C. Omkrystallisation af 0,5 g af dette materiale ud fra 5 ml acetonitril giver 0,45 g farveløst fast stof, smeltepunkt 130-132°C: [a] ^ -92° (c, 1% i EtOH).

b) N-Acetyl-trans-4-methoxy-L-prolin-methylester 10 En blanding af 30,0 g (0,17 mol) N-acetyl-trans-4- -hydroxy-L-prolin og 130 g sølvoxid pulveriseres i en morter, og denne ensartede blanding sættes til en 1-liters kolbe med 300 ml acetone. Opslæmningen omrøres, behandles portionsvis med 130 ml methyliodid, og temperaturen holder under 40°C ved 15 afkøling med koldtvandsbad. Efter omrøring i 7 timer henstår blandingen natten over. Det faste stof filtreres fra, vaskes godt med actone, og filtratet inddampes på en roterende fordamper, hvilket giver 38,3 g sirupsagtig remanens. Denne genopløses i 350 ml acetone og behandles igen med 130 g sølv-20 oxid og 130 ml methyliodid, hvilket giver 41 g remanens. Denne destilleres, hvilket giver 32,2 g destillat, kogepunkt 130-140°C (0,3 mm). Efter opløsning i 30 ml cyclohexan og afkøling vejer den næsten farveløse faste N-acetyl-trans-4--methoxy-L-prolin-methylester 31,4 g, smeltepunkt 71-75°C.

25 Omkrystallisation ud fra 31 ml ethylacetat giver 25,1 g (66%) farveløst fast stof, smeltepunkt 76-77°C. [a]^ -83° (c, 1% i EtOH).

c) trans-4-Methoxy-L-prolin

Til en omrørt opløsning af 27,0 g (0,085 mol) bari- 30 umhydroxid . 8^0 i 525 ml vand (ca. 3,3 N) sættes 11,0 g (0,05 mol) N-acetyl-trans-4-methoxy-L-prolin-methylester.

Den fremkomne opløsning omrøres ved 18-20°C i 3 timer, afkøles og behandles med fortyndet svovlsyre (8,8 g koncentreret H2S0^ i 20 ml vand). Den sure suspension henstår natten over.

35 Blandingen filtreres gennem et tykt lag "Celite", hvilket giver et "mælkeagtigt" filtrat. Dette inddampes på en roteren de fordamper ved 50°C under anvendelse af en højvakuumpumpe, hvilket giver en mælkeagtig remanens, der vejer 121 g. Dette 11

DK 154553 B

materiale behandles med fortyndet svovlsyre (19,0 g koncentreret i 75 ml vand), og den fremkomne blanding omrø res og tilbagesvales i 3 timer. Efter afkøling til 30°C behandles blandingen portionsvis med 48 g bariumhydroxid .

5 8H2O,. og pH indstilles fra 6,0 til 4,0 med fortyndet svovl syre. Efter henstand natten over filtreres blandingen gennem et tykt lag "Celite". Det mælkeagtige filtrat inddampes som ovenfor, hvilket giver 50 g farveløs tør remanens. Denne opløses i 200 ml varm chloroform og filtreres gennem et 10 lag "Celite" for at fjerne bariumsulfatet. Det let uklare filtrat inddampes på en roterende fordamper, hvilket giver et gelatinøst materiale (17,7 g), der suspenderes i 100 ml ether og filteres, hvilket giver 7,5 g (94%) næsten farveløst fast stof, smeltepunkt 185-190°C (sønderdeling). Det-15 te materiale suspenderes i 30 ml varm acetonitril, afkøles og filtreres, hvilket giver 4,0 g (50%) af et farveløst fast trans-4-methoxy-L-prolin, smeltepunkt 209-211°C (sønderdeling) ; [aJ^5 -75° (c, 1% i EtOH) .

d) 1-(3-Acetylthio-l-oxopropyl)-trans-4-methoxy-L-prolin 20 En opløsning af 3,5 g (0,024 mol) trans-4-methoxy- -L-prolin i 50 ml vand omrøres, afkøles til 5°C, og der tilsættes 3 g natriumcarbonat. Denne blanding behandles med en opløsning af 4,0 g (0,024 mol) 3-acetylthiopropionylchlorid i 5 ml ether i løbet af 10 minutter med intermitterende til-25 sætning af 3 g natriumcarbonat for holde pH på ca. 8,0.

Blandingen omrøres i isbad i yderligere en time, der tilsættes 25 ml vand og derefter en opløsning af 5 ml koncentreret saltsyre i 25 ml vand (CC^-udvikling). Den stærkt su re opløsning mættes med natriumchlorid og ekstraheres med 50 ml 30 ethylacetat (fire gange). De organiske faser forenes, tørres (MgSO^), filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 6,0 g (90%) farveløst sirupsagtigt 1-(3-acetylthio--1-oxopropyl)-trans-4-methoxy-L-prolin. Denne syre opløses i 25 ml ethylacetat og behandles med 4,7 g dicyclohexylamin, 35 hvilket giver en opløsning, der hurtigt bliver en fast masse.

Der tilsættes yderligere 15 ml ethylacetat, og blandingen opløses på dampbad, afkøles og filtreres, hvilket giver 8,7 g 12

DK 154553 B

dicyclohexylaminsalt, smeltepunkt 170-172°C. Efter krystallisation ud fra 60 ml acetonitril vejer det farveløse faste stof 8,3 g (75%), smeltepunkt 171-173°C; [a]^ -35° (c, 1% i EtOH).

5 Decyclohexylaminsaltet omdannes til l-(3-acetyl- thio-l-oxopropyl)trans-4-methoxy-L-prolin ved at suspendere 8,0 g i 60 ml ethylacetat afkølet i isbad og behandle det portionsvis med 60 ml 10% kaliumbisulfat. De klare lag adskilles, og den vandige del ekstraheres med 60 ml ethylace-10 tat (2 gange). De organiske faser forenes, tørres (MgSO^), filtreres og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 4,6 g (80%) af en farveløs sirup.

Eksempel 2 15 1-(3-Mercapto-l-oxopropyl)-trans-4-methoxy-L-prolin

Til 1-(3-acetylthio-l-oxopropyl)-trans-4-methoxy--L-prolinet, der fremstilles i eksempel 1 (4,6 g, 0,017 mol) sættes en kold opløsning af 9 ml koncentreret ammoniak i 22 ml vand. Basen opløses på ca. 30 minutter, og den fremkomne 20 opløsning (under argon) henstår i 2 timer ved stuetemperatur. Denne opløsning afkøles, ekstraheres med 25 ml ethylacetat (2 gange), og ethylacetatekstrakten kasseres. Opløsningen ekstraheres igen med 25 ml ethylacetat og gøres sur med 17 ml 1:1 saltsyre. Blandingen rystes, skilles, og den vandige 25 fase ekstraheres med 25 ml ethylacetat (3 gange). De organiske faser forenes, tørres (MgSO^), filtreres, og opløsningsmidlet fjernes på den roterende fordamper, hvilket giver 2,3 g (59%) farveløs sirup, 1-(3-mercapto-l-oxopropyl)-trans-4--methoxy-L-prolin, [a]^ -60° (c, 1% i EtOH); R^ 0,49 (MeOH 30 på silicagel, fremkaldt med nitrosoferricyanid som reagens), Analyse: Beregnet for C^H^NO^S. 1/4 H20: C 45,46, H 6,57, N 5,87, S 13,48.

Fundet: C 45,42, H 6,78, N 5,96, S 13,27.

35 Der fås yderligere 1,1 g produkt (ialt 3,4 g, 87%) ved at mætte den vandige fase med natriumchlorid og ekstrahere med 25 ml ethylacetat (2 gange).

13

DK 154553 B

Natriumsaltet dannes ved at behandle siruppen med vandigt natriumbicarbonat og frysetørre.

Eksempel 3 5 (trans)-1»[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-metho- oxy-L-prolin

En opløsning af 4,3 g (0,029 mol) trans-4-methoxy--L-prolin i 50 ml vand omrøres, afkøles til 5°C, og der tilsættes 3 g natriumcarbonat. Denne opløsning behandles med 10 5,2 g (0,029 mol) D-3-(acetylthio)-2-methylpropionylchlorid i 5 ml ether i løbet af 10 minutter med intermitterende tilsætning af 3 g natriumcarbonat for at holde pH på ca. 8,0.

Denne blanding omrøres i isbad i 1,5 time, der tilsættes 25 ml vand og derefter en opløsning af 6 ml koncentreret salt-15 syre i 25 ml vand (CC^-udvikling). Den fremkomne stærkt sure opløsning ekstraheres med 50 ml ethylacetat (fire gange).

De organiske faser forenes, tørres (MgS04), filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 6,1 g (73%) (trans)--1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-methoxy-L-pro-20 lin som en svagt gul sirupsagtig remanens. Denne syre opløses i 50 ml ethylacetat og behandles med en opløsning af 4,0 g dicyclohexylamin i 20 ml ethylacetat. Produktet begynder at krystalliseres ud fra opløsningen i løbet af ca. 1 minut. Efter afkøling natten over filtreres det næsten farveløse 25 faste stof og tørres, udbytte 6,7 g, smeltepunkt 175-177°C; [a]^ -55° (c, 1% EtOH). Efter krystallisation ud fra 60 ml acetonitril vejer det næsten farveløse faste dicyclohex-ylaminsalt 5,6 g (41%), smeltepunkt 179-181°C, [a]^ -62° (c,1% i EtOH).

30 Dicyclohexylaminsaltet omdannes til syren ved at suspendere 5,5 g i 50 ml ethylacetat, afkøle i isbad og behandle med 50 ml 10% kaliumbisulfat. Lagene adskilles, og den vandige del ekstraheres med 50 ml ethylacetat (2 gange).

De organiske faser forenes, tørres (MgSO^), filtreres, og 35 opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 3,4 g (41%) næsten farveløst (trans)-1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]--4-methoxy-L-prolin som sirup.

DK 154553 B

3.4

Eksempel 4 (trans)-4-Methoxy-l-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)- -L-prolin

Til 3,4 g (trans)-1-[D-e-(acetylthio)-2-methy1-1-5 -oxopropyl]-4-methoxy-L-prolin sættes en kold opløsning af 8 ml koncentreret ammoniak i 20 ml vand. Basen opløses på ca. 10 minutter, og den fremkomne opløsning (under argon) henstår ved stuetemperatur i to timer. Denne opløsning afkøles, ekstraheres med 20 ml ethylacetat (2 gange), skilles 10 i lag med 20 ml ethylacetat og gøres sur med 15 ml 1:1 saltsyre. Denne blanding mættes med natriumchlorid, lagene adskilles, og den vandige fase ekstraheres med 20 ml ethylacetat (3 gange). De organiske faser forenes, tørres (MgSO^), filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 2,9 15 g (100%) næsten farveløst (trans)-4-methoxy-1-(D-3-mercapto--2-methyl-l-oxopropyl)-L-prolin, [a]^ -80° (c, 1% i EtOH);

Rf 0,53 (MeOH på silikagel, fremkaldt med nitroso-ferricyanid som reagens).

Analyse: Beregnet for C^qH^NO^S . 1/4^0: C 47,69, H 6,83, 20 N 5,56, S 12,73

Fundet: C 47,90, H 6,84, N 5,85, S 12,76.

Eksempel 5 25 (trans)-1-[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-ethoxy- -L-prolin

Ved at benytte den i eksempel 3 beskrevne fremgangsmåde, men anvende en ækvivalent mængde trans-4-ethoxy-L-pro-lin (J.Med. Chem., 10, 1161 (1967)) i stedet for (trans)-4-30 -methoxy-L-prolin fås (trans)-1-(D-3-(acetylthio)-2-methy1--1-oxopropyl]-4-ethoxy-L-prolin. Produktet renses som dicy-clohexylaminsaltet, smeltepumpt 170-172°C (krystalliseret ud fra isopropylalkohol) ; -64° (c, 1% i EtOH).

Dette salt (7,75 g) omdannes til den frie syre ved 35 behandling med kaliumbisulfatopløsning som beskrevet i eksempel 4, hvilket giver 4,85 g næsten farveløst (trans)-1-[D-3--(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-ethoxy-L-prolin som sirup.

15

DK 154553 B

Eksempel 6 (trans)-4-Ethoxy-1-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-L- -prolin

Til materialet fra eksempel 5 (4,85 g) sættes en 5 kold opløsning af 9 ml koncentreret ammoniak i 22 ml vand (under argon). Blandingen behandles på samme måde som i eksempel 4, hvilket giver 4,2 g (100%) næsten farveløst (trans)-4-ethoxy-1-(D-3-mercapto-2-methy1-1-oxopropy1)-L--prolin som sirup, [a]^ -80° (c, 1% i EtOH) , 0,64 (MeOH

10 på silicagel, fremkaldt med nitroso-ferricyanid som reagens). Analyse: Beregnet for C-^H^NO^S: C 50,55, H 7,33, N 5,36, S 12,27.

Fundet: C 50,34, H 7,34, N 5,39, S 12,11.

15

Eksempel 7 (cis)-1-[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-methoxy- -L-prolin a) N-Carbobenzyloxy-cis-4-hydroxy-L-prolin 20 N-Carbobenzyloxy-4-keto-L-prolin (10 g, 0,038 mol) opløses i 300 ml methanol og reduceres med 5,8 g (0,15 mol) natriumborhydrid i 20 ml vand som beskrevet i JACS, 79, 189 (1957), hvilket giver 8,7 g af et skumagtigt produkt. Dette materiale opløses i 30 ml ethanol, behandles med 3,5 g cy-25 clohexylamin i lidt ethanol og fortyndes til 500 ml med e-ther. Ved podning og gnidning udskilles det krystallinske cyclohexylaminsalt hurtigt og der fås 10,8 g, smeltepunkt 163-165°C. Dette cyclohexylaminsalt behandles derefter med 30 ml 2N HC1 og ekstraheres med ethylacetat (4 x 50 ml), 30 hvilket giver 8 g N-carbobenzyloxy-cis-4-hydroxy-L-prolin som et glaslignende materiale.

b) N-Carbobenzyloxy-cis-4-methoxy-L-prolin-methylester 13,9 g N-carbobenzyloxy-cis-4-hydroxy-L-prolin (0,052 mol) behandles med 40 g sølvoxid og 40 ml methyliodid 35 (2 gange) i acetone (først 100 ml, derefter 120 ml) som be skrevet i eksempel 1(b), hvilket giver 17,5 g (100%) N-carbo-benzyloxy-cis-4-methoxy-L-prolin-methylester som en gul olie.

16

DK 154553 B

c) N-Carbobenzyloxv-cis-4-hnethoxy-L-prolin

De .-ovennævnte 17,5 g N-carbobenzyloxy-cis-4-meth-oxy-L-prolin-methylester (ca. 0,052 mol) opløses i 135 ml methanol, behandles dråbevis ved -1°C til 4°C med 32 ml 5 (0,064 mol) 2N natriumhydroxid, holdes derefter ved 0°C i en time og ved stuetemperatur natten over. Efter at ca. halvdelen af opløsningsmidlet er fjernet på en roterende fordamper, fortyndes opløsningen med 300 ml vand, vaskes med ether (vaskevæsken kasseres), gøres sur under afkøling med 10 12,5 ml 1:1 saltsyre til pH 2 og ekstraheres med ethylacetat (4 gange 150 ml). Ekstrakterne forenes, tørres (MgSC>4), filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 15 g af en orangegul sirup. Denne opløses i 60 ml ethanol, behandles med 6 g cyclohexylamin i 10 ml ethanol og fortyndes 15 til 900 ml med ether. Ved podning og gnidning udskilles det krystallinske N-carbobenzyloxy-cis-4-methoxy-L-prolin-cy-clohexylaminsalt: vægt efter afkøling natten over 10,2 g, smeltepunkt 148-150°C (s. 144°C), [a]^ -35° (c, 1% i ethan ol) . Efter omkrystallisation ud fra 40 ml acetonitril ve-20 jer det næsten farveløse faste stof 8,8 g, smeltepunkt 150-152°C (s. 145°C) , [cc]^6 -34° (c, 1% i ethanol).

Cyclohexylaminsaltet behandles med saltsyre, hvilket giver 6,9 g (48%) N-carbobenzyloxy-cis-4-methoxy-L-pro- 26 o lin som en svagt gul viskos sirup, [a] -32 (c, 1% i ethan- 25 ol).

d) cis-4-Methoxy-Ir-prolin

En blanding af 6,8 g N-carbobenzyloxy-cis-4-meth-oxy-L-prolin, 210 ml 2:1 methanol og vand og 2,3 g 5% palladium på kul anbringes i en hydrogenator ved 3 atm hydrogen 30 i fire timer. Blandingen filtreres for at fjerne katalysatoren, og filtratet inddampes, hvilket giver 3,15 g af et gråligt fast stof, smeltepunkt 218-220°C (sønderdeling). En prøve krystalliseres ud fra methanol-ether, hvilket giver farveløst cis-4-methxoy-L-prolin, smeltepunkt 224-226°C (sønderde-35 ling), [α]^5 -42° (c, 1% i methanol).

17

DK 154553 B

Analyse: Beregnet for CgH^NO^: C 49,64, H 7,64, N 9,65.

Pundet: C 49,63. H 7,71, N 9,54.

e) (cis)-1-[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-meth-oxy-L-prolln 5 3 g cis-4-'methoxy-L-prolin (0,031 mol) og 4,2 g (0,023 mol) D-3-acetylthio-2-methylpropionylchlorid i 5 ml ether omsættes i 60 ml vand i nærværelse af natriumbicarbo-nat som beskrevet i eksempel 3. Der kræves ca. 20 ml 25% natriumcarbonat (vægt/volumen) for til at begynde med at 10 . bringe pH på 8,5 og for at holde det på 7,5-8,4 under acetyleringen. Det fremkomne rå viskose produkt (6,4 g) opløses i 50 ml ethylacetat og behandles med 3,9 g dicyclohexyl-amin i 20 ml ethylacetat. Produktet krystalliserer ud fra opløsningen og filtreres og tørres, hvilket giver 6,6 g di-15 cyclohexylaminsalt, smeltepunkt 172-174°C (s. 170°C),

2 £ Q

[a] p -60 (c, 1% i ethanol). 6,5 g af dette materiale om krystalliseres ud fra 35 ml acetonitril, hvilket giver 6 g farveløst fast dicyclohexylaminsalt, smeltepunkt 173-175°C (s. 170°C) , [<x]2d6 -60° (c, 1% i ethanol).

20 Analyse: Beregnet for Cj2H]_9^0^S.^2^23^5 c 61/24, H 9,00, N 5,95, S 6,81.

Fundet: C 61,16, H 8,81, N 5,95, S 6,67.

Ved at benytte den i eksempel 3 beskrevne frem-25 gangsmåde omdannes dicyclohexylaminsaltet til syren ved at suspendere 5,9 g i 60 ml ethylacetat, afkøle i isbad og behandle med 60 ml 10% kaliumbisulfat. Lagene adskilles, og den vandige fase ekstraheres med 50 ml ethylacetat (4 gange).

De organiske faser forenes, tørres (MgSO^), filtreres, og 30 opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 3,5 g (60%) farveløst (cis)-1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-meth-oxy-L-prolin, smeltepunkt 90-92°C (tritureret med ether), [a] -139° (c, 1% i ethanol), Rf 0,63 (methanol på silica- gel) .

35 Analyse: Beregnet for C^H-^NO^S: C 49,81, H 6,62, N 4,84.

Fundet: C 49,85, H 6,66, N 4,97.

O

18

DK 154553 B

Eksempel 8 (cis)-4-Methoxy-l-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-L- -prolin 2,9 g (cis)-1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopro- 5 pyl]-4-methoxy-L-prolin (0,01 mol) hydrolyseres i 15 ml vand indeholdende 6,5 ml koncentreret ammoniak som beskrevet i eksempel 4, hvilket giver 2,3 g (93%) yderst viskos (cis)- -4-methoxy-l-(D-3-mercap to-2-methy1-1“oxopropy1)-L-prolin, 26 o der bliver voksagtigt ved henstand; [a] ^ -88 (c, 1% i e- 10 thanol).

Eksempel 8a (cis)-4-Methoxy-l-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-L--prolin-l-adamantanaminsalt 15 En opløsning af 0,55 g (0,0022 mol) cis-4-methoxy- -1-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-L-prolin i 15 ml ethyl-acetat behandles under argonatmosfære med en varm opløsning af 0,34 g (0,0022 mol) 1-adamantanamin i 10 ml ethylacetat til udfældning af saltet. Efter tre timer i kulden, fil-20 treres det farveløse faste stof fra under argon (opløsningsmidlet vedholdende), vaskes med noget koldt ethylacetat og tørres i vakuum i 20 timer, hvilket giver 0,7 g (79%) (cis)--4-methoxy-l-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-L-prolin-1--adamantanaminsalt, smeltepunkt 215-217°C (s. 210°C, sønder-25 deling 220°C) , [a]^* -60° (c, 1% i methanol).

Eksempel 9 (trans)-1-[D-3-Acetylthio)-2-methyl-1-oxopropyl]-4-propoxy-30 -L-prolin a) N-acetyl-trans-4-propoxy-L-prolin-propylester

Omsætning af 30 g N-acetyl-trans-4-hydroxy-L-pro-lin fra eksempel 1(a) med 110 g sølvoxid og 110 ml propylio-did i 300 ml acetone som beskrevet ved fremgangsmåden i ek-35 sempel 1(b) giver 19,6 g (41%) svagt gul-orange N-acetyl-

19 DK 154553 B

O

-trans-4-propoxy-L-prolin-propylester, kogepunkt 155-165°C (0,2 mm).

b) N-Acetyl-trans-4-propoxy-L-prolin

En opløsning af 6 g (0,15 mol) natriumhydroxid i 5 150 ml vand sættes til 19,4 g (0,075 mol) N-acetyl-trans-4- -propoxy-L-prolin-propylester, hvilket giver en svagt orange opløsning. Efter henstand natten over ved stuetemperatur ekstraheres opløsningen med 60 ml ethylacetat (vaskevæsken kasseres), gøres derefter sur med 1:1 saltsyre, mættes der-10 · efter med natriumchlorid og ekstraheres med 50 ml chloroform (3 gange), De organiske faser forenes, tørres, (MgSO^), filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 12,6 g af en brun olie. Denne opløses i 80 ml ethylacetat og béhandles med en opløsning af 10,7 g dicyclohexylamin i 15 20 ml ethylacetat. Saltet krystalliserer ved stuetempera tur. Efter henstand natten ovér under køling filtreres dicy clohexylaminsaltet og vaskes med koldt ethylacetat, hvilket giver 17,3 g næsten farveløst fast dicyclohexylaminsalt, smeltepunkt 148-153°C. Omkrystallisation af dette materi-20 ale ud fra 125 ml ethylacetat giver 14,5 g farveløst dicyclohexylaminsalt, smeltepunkt 157-159°C [a]^ -30° (c, 1% i ethanol).

Analyse: Beregnet for C]_oH17N04 * C12H23^: ^ ^6/63, H 10,17, N 7,07.

25 Fundet: C 66,47, H 10,22, N 7,06.

De 14,4 g dicyclohexylaminsalt omdannes til den fri syre ved at pulverisere dette, suspendere i 100 ml ethylacetat og behandle opslæmningen portionsvis med 100 ml 10% ka-30 liumbisulfat. Den organiske fase skilles fra, og den van dige fase ekstraheres med 100 ml ethylacetat (2 gange). De organiske faser forenes, tørres, (MgSO^), filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 6,7 g (41%) N-acetyl--trans-4-propoxy-L-prolin som en svagt brun væske.

35

20 DK 154553 B

O

c) (trans)-1-[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-pro-poxy-Ii-prolin 6,4 g N-acetyl-trans-4-propoxy-L-prolin (0,03 mol) behandles med en opløsning af 10 g koncentreret svovlsyre i 5 100 ml vand, og den fremkomne opløsning omrøres og tilbage svales i tre timer. Derefter afkøles opløsningen til 15°C, behandles portionsvis med 12 g natriumcarbonat for at bringe pH på 8,0 og behandles derefter med en opløsning af 5,4 g (0,03 mol) D-3-acetylthio-2-methylpropionylchlorid i 5 ml 10 ether i løbet af 10 minutter, medens der tilsættes 7 g natriumcarbonat for at holde pH på ca. 8,0. Derefter omrøres blandingen i isbad i 30 minutter og ved stuetemperatur i en time. Produktet isoleres derpå og renses som et dicyclohexylamin-salt ved fremgangsmåden ifølge eksempel 3, hvilket giver 6,3 15 g dicyclohexylaminsalt, smeltepunkt 165-167°C (ud fra aceto-nitril) , [a]^5 -56°C (c, 1% i ethanol).

Analyse: Beregnet for . Cj_2®23^: C 62,62, H 9,30, N 5,61, S 6,43.

Fundet: C 62,35, H 9,48, 20 N 5,88, S 6,45.

De 6,1 g dicyclohexylaminsalt omdannes til den fri syre ved at blive suspenderet i 60 ml ethylacetat, afkølet i isbad og behandles med 60 ml 10% kaliumbisulfat. Lagene adskilles, og den vandige fase ekstraheres med 60 ml ethylace-25 tat (2 gange). De organiske faser forenes, tørres (MgSO^), filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 4,0 g (42%) (trans)-1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4--propoxy-L-prolin som en næsten farveløs sirup.

30 Eksempel 10 L-(D-3-Mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-trans-4-propoxy-L-prolin

Hydrolyse af 4,0 g (trans)-1-[D-3-(acetylthio)-2--methyl-l-oxopropyl]-4-propoxy-L-prolin med 8 ml koncentreret ammoniak i 20 ml vand under argon efter den i eksempel 4 an-35 givne fremgangsmåde giver 3,42 g (97%) 1-(D-3-mercapto-2-meth- 21

DK 154553 B

O

yl-l-oxopropyl)-trans-4-propoxy-L-prolin som en næsten farveløs sirup, [a]^ -72° (c, 1% i ethanol).

Analyse: Beregnet for · 1/4 H^O: C 51,49, H 9,74, N 5,05, S 11,46.

5 Fundet: C 51,66, H 7,76, N 5,94, S 10,51.

Eksempel H

(cis)-4-(4-Fluorphenoxy)-!-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-10 -L-prolin a) (cis)-4-(4-Fluorphenoxy)-L-prolin

Til en opløsning af 8,4 g (0,024 mol) N-carbobenz-oxy-trans-4-hydroxy-L-prolin-benzylester (Baer m.fl., Can. J. Biochem. & Phys., 37, 583 (1959)), 4,0 g (0,036 mol) 4-fluor-15 phenol og 9,27 g (0,036 mol) triphenylphosphin i 75 ml tør tetrahydrofuran sættes dråbevis i løbet af en time 6,2 g (0,036 mol) diethylazodicarboxylat i 25 ml tetrahydrofuran. Opløsningen henstår under omrøring natten over ved stuetemperatur. Blandingen inddampes til tørhed, og der tilsættes 20 100 ml ether til remanensen. Et bundfald af triphenylphoshin og diethylazodicarboxylat filtreres fra. Søjlechromatrografi (silicagel) fraskiller 8,1 g af en blanding indholdende ca.

70% N-carbobenzoxy-cis-4-(4-fluorphenoxy)-L-prolin-benzylester. En opløsning af 7,5 g af ovennævnte benzylester-25 holdige blanding hydrogeneres ved 1 atm (stuetemperatur) med 0,8 g 10% pd/C. Der dannes et hvidt bundfald under reaktionen. Efter at hydrogenoptagelsen er ophørt, filtreres blandingen, og filterkagen udvaskes med tre 125 ml-portioner varm methanol. Methanolopløsningen inddampes til tørhed, hvilket 30 giver 3,2 g cis-4-(4-fluorphenoxy)-L-prolin, smeltepunkt 235-236°C.

Analyse: Beregnet for C^H^FNO^. 1/3 E^O: C 57,14, H 5,48, N 6,06, F 8,22.

Fundet: C 56,94, H 5,19, N 5,94, F 7,97.

35

O

22 DK 154553B

b) I-[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-cis-4-(4-fluor-phenoxy)-L-prolin

Til en suspension af 2,25 g (0,01 mol) cis-4-(4--fluorphenoxy)-L-prolin i 125 ml tør pyridin ved stuetempera-5 tur sættes 1,0 g (0,01 mol) triethylamin og 2 g (0,011 mol) ... D-3-(acetylthio)-2-methylpropionylchlorid. Efter omrøring natten over ved stuetemperatur inddampes blandingen til tørhed. Remanensen tages op i vand, dækkes med ether og gøres sur med 10% saltsyre. Vandlaget ekstraheres gentagne gange 10 med ether, etherlagene forenes, vaskes med vand, tørres (Na2SO^) og inddampes til tørhed, hvilket giver 3,9 g remanens. Remanensen chromatograferes på 250 ml silicagel med ether, hvilket giver en fraktion indeholdende det ønskede produkt. Søjlen vaskes med methanol, og methanolvaskevæsken 15 rechromatograferes på en kort søjle af silicagel, hvilket giver yderligerere produkt. Denne proces gentages endnu engang, hvilket ialt giver 1,2 g rent 1-[D-3-(acetylthio)-2-me-thyl-l-oxopropyl]-cis-4-(4-fluorphenoxy)-L-prolin.

c) (cis)-4-(4-Fluorphenoxy)-1-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxo-20 propyl)-L-prolin 1,2 g 1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]--cis-4-(4-fluorphenoxy)-L-prolin opløses i 25 ml methanol og behandles med 5 ml koncentreret ammoniak under argon i 40 minutter. De flygtige stoffer fjernes, og remanensen dækkes 25 med ethylacetat. Vandlaget gøres surt med 10% saltsyre.

Lagene skilles, og det sure lag vaskes med ethylacetat. De forenede organiske lag befries med vand (2 gange, mættet natriumchloridopløsning (2 gange) og tørres (Na2SO^). Opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 1,1 g af en fast skum-30 remanens bestående af cis-4-(4-fluorphenoxy)-1-(D-3-mercapto--2-methyl-1-oxopropy1)-L-prolin.

Analyse: Beregnet for C-^H^gFNO . 1/3 E^O: C 54,04, H 5,70, N 4,20, F 5,70, S 9,60.

Fundet: C 54,04, H 5,71, N 4,05, F 5,40, S 9,61.

35

DK 154553B

23

O

Tyndtlagschromatografi viser produktet ved 0,30 'som påvist ved UV-lys, SH-reagens (gul plet) og vanillin (gul plet), [a]^ -80° (c, 1% i chloroform), 5 Eksempel 12 (cis)-4-(4-Fluorphenylthio)-1-(D-3-mercapto-2-methyl-l—oxo- propyl)-L-prolin

Ved anvendelse af den i eksempel 11 anførte fremgangsmåde med ved i stedet for 4-fluorphenolen i del (a) at 10 anvende en ækvivalent mængde 4-fluorphenylmercaptan fås (cis)-4-(4-fluorphenylthio)-l-(D-3-mercapto-2-methy1-1-oxo-propyl)-L-prolin, smp. 242-243° (sønderdeling) som adamam— tanaminsalt efter omkrystallisation fra (1:1) chloroform/me- 25 o thanolblanding fortyndet med ether. [α] -51,8 (c = 0,5% i ·

pr D

15 methanol). Fri syre [α]β -42,5 (c = 1%'absolut ethanol,) .

Eksempel 13 1-(D-3-Mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-cis-4-phenylthio-L- -prolin 20 a) N-Carbobenzyloxy-cis-4-phenylthio-L-prolin-methylester 0,85 g natriummetal (©-,037 mol) ‘opløses i 40 ml absolut ethanol. Hertil sættes under omrøring 3,7 ml (0,036 mol) thiophenol efterfulgt af 7,5 g (0,017 mol) N--carbobenzyloxy-trans-4-tosyloxy-L-prolin-methylester (J„ 25 Am. Chem. Soc., 79, 191 (1957)). Sidstnævnte forbindelse går gradvis i opløsning, men snart efter fraskilles et fast produkt. Efter omrøring i 4 timer og henstand natten over ved stuetemperatur fjernes størstedelen af ethanolen i em roterende fordamper. Den hovedsagelig faste remanens ©m-30 røres med 120 ml diehlormethan ©g 60 ml vand. Lagene adskilles (noget methanol tilsættes for at fremme nedbrydningen af emulsioner), og den vandige fase ekstraheres med y-derligere diehlormethan (2 x 60 ml). De forenede organiske faser vaskes med 100 ml mættet matriumchloridopløsning, 35 tørres (MgSO^), og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver

O

24

DK 154553 B

6.5 g (100%) N-carbobenzyloxy-cis-4-phenylthio-L-prolin--methylester som en svagt gul viskos olie.

b) N-Carbobenzyloxy-cis-4-phenylthio-L-prolin

Methylesterproduktet fra del (a) (6,5 g, 0,017 5 mol) opløses i 55 ml methanol, behandles portionsvis ved -1 til 4°C med 13 ml (0,026 mol) 2N natriumhydroxid, omrøres ved 0°C i en time og holdes ved stuetemperatur i ca. 16 timer. Efter af ca. halvdelen af opløsningsmidlet er fjernet på en roterende fordamper,fortyndes den afkølede opløsning 10 med 100 ml vand, vaskes med 60 ml ether (vaskevæsken kasseres), et lag af 70 ml ethylacetat hældes over, omrøres, afkøles og gøres sur med 4,8 ml 1:1 saltsyre. Efter adskillelse ekstraheres den vandige fase med yderligere ethylacetat (3 x 40 ml), og de forenede organiske lag tørres (MgS04) 15 og inddampes, hvilket giver 5,9 g af en lys gul viskos olie.

Denne opløses i 30 ml ethanol, behandles med 1,9 g cyclohexyl-amin i 3 ml ethanol og fortyndes til 330 ml med ether. Efter podning fraskilles det krystallinske cyclohexylaminsalt.

Dette vejer efter afkøling i ca. 16 timer 5,3 g, smelte-20 punkt 148-151°C (s. 135°C). Dette materiale forenes med 1.5 g identisk produkt fra et tidligere eksperiment, omrøres med 200 ml kogende acetonitril og afkøles, hvilket giver 6,3 g farveløst cyclohexylaminsalt, smeltepunkt 152-155°C (s. 137°C); [a]^6 -24° (c, 1% i ethanol).

25 Dette cyclohexylaminsalt suspenderes i 25 ml e- thylacetat, omrøres og behandles med 25 ml N saltsyre.

Når der er opnået to klare lag, adskilles de, og den vandige fase ekstraheres med yderligere ethylacetat ( 3 x 25 ml). De forenede organiske lag tørres (MgS04), og op-30 løsningsmidlet afdampes, hvilket giver 5,0 g (65%) N-car-bobenzyloxy-cis-4-phenylthio-L-prolin som en næsten farveløs, meget viskos sirup.

c) (cis)-4-Phenylthio-L-prolin-hydrochlorid 4,9 g N-carbobenzyloxy-cis-4-phenylthio-L-prolin 35 (0,014 mol) behandles med 25 ml hydrogenbromid i eddikesy-

O

25 DK 154553 B

re (30-32%), tilproppes løst og omrøres magnetisk. Efter 1 time fortyndes den orangegule opløsning til 250 ml med ether, for at udfælde produktet som en tung olie, der gradvis krystallisere efter podning, gnidning og afkøling. Ef-5 ter omrøring i isbad i en time filtreres materialet under nitrogen, vaskes med ether,.suspenderes i frisk ether, afkøles i ca. 16 timer og filtreres igen, hvilket giver 3,2 g (77%) farveløst fast (cis)-4-phenylthio-L-prolin-hydrdb.ro-mid, smeltepunkt 106-109°C (s. 99°C), [a]^* "3° (c, 1% i 10 methanol).

d) 1-[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-cis-4-phenyl·-thio-L-prolin

Omsætning af 3,0 g (0,0094 mol) (cis)-4-phenylthio--L-prolin-hydrobromid og 2,0 g (0,011 mol) D-3-acetylthio-2-15 -methylpropionylchlorid i 25 ml vand som beskrevet i eksempel 1(d) (under anvendelse af ca. 15 ml 20% natriumcarbonat-opløsning for at holde pH på 8,0-8,4) giver 3,8 g af en svagt gul viskos olie. Dicyclohexylaminsaltet (fremstillet i 30 ml ethylacetat under anvendelse af 1,8 g dicyclohexylamin) 2o vejer 2,9 g (isoleret i to udbytter), smeltepunkt 184-188°C (s. 180°C). Efter triturering med 15 ml acetonitil fås 2,4 g farveløst fast dicyclohexylaminsalt, smeltepunkt 184-186°C (s. 180°C) , [a]p6 -75° (c, 1% i ethanol).

Dette cieyclohexylaminsalt behandles med 30 .ml 10% 25 kaliumbisulfat og ekstraheres i ethylacetat som beskrevet i eksempel 1, hvilket giver 2,0 g (59%) glaslignende 1-ID-3-- (acetylthio) -2-methyl-l-oxopropyl] -cis-4-phenylthio-L-pro-ling.

e) 1- (D-3-Mercapto-2-methyl-l-oxopropyl) -cis-4-phenyli:hiD-30 -L-prolin 1- [D-3- (Acetylthio) -2-methyl-l-oxopropyl] -ciLs-4--phenylthio-L-prolinet (2,0 g, 0,0042 mol) behandles med 3,5 ml koncentreret ammoniak i 8,5 ml vand ved anvendelse af den i eksempel 2 anførte fremgangsmåde (det faste ammoniumsalt 35 af produktet skilles fra reaktionsblandingen), hvilket gi- 26

DK 154553 B

o ver 1,35 g (100%) viskos sirupsagtigt 1-(D-3-mercapto-2-meth-- yl-l-oxopropyl)-cis-4-phenylthio-L-prolin, [a]^6 -43° (c, 1% i ethanol) 5 Eksempel 14 1-(D-3-Mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-cis-4-(4-chlorphenyl- thio)-L-prolin

Ved anvendelse af den i eksempel 13 anførte fremgangsmåde, men ved i stedet for thiophenolen i del (a) at an-10 vende en ækvivalent mængde 4-chlorphenylmercaptan fås 1-(D--3-mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-cis-4-(4-chlorphenylthio)--L-prolin, smp. 241-242°C (sønderdeling) som adamantanamin- salt efter omkrystallisation fra (1:1) chloroform/methanol- 25 o blanding fortyndet med ether. [α]η -55,4 (c = 0,5% i methanol). 25 o - 15 Fri syre [a]D - 38,1 (c = 1% i absolut ethanol).

Eksempel 15 (trans) -1- (3-Mercapto-l-o'xopropyl)-3-methylthio-D,L-prolin a) 1,2-Dehydroprolin-t-butylester 20 Til en omrørt opløsning af 34,2 g (0,20 mol) pro- lin-t-butylester i 600 ml ether ved -5 til 0°C sættes dråbevis i løbet af 10 minutter 21,7 g (23,9 ml, 0,20 mol) frisk fremstillet t-butylhypochlorit (Org. Syn., Coll. bd. V, 184 (1973)]. Under tilsætningen holdes temperaturen på -5 til 25 0°C. Efter at tilsætningen er tilendebragt omrøres opløs ningen ved denne temperatur i yderligere fem minutter.

Til den kraftigt omrørte opløsning sættes hurtigt ( oj 3-5 minutter) en opløsning af 7,8 g (0,20 mol) kalium i frisk destilleret tør (Cal^) t-butanol. Efter tilsætningen 30 ligger reaktionsblandingens temperatur omkring 18°C. Reaktionsbeholderen fjernes fra kølebadet og omrøres i 30 minutter. Reaktionsblandingen filtreres gennem "Celite" (diatoméjord), og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen tages op i ether og vaskes med flere portioner vand. Etheropløs-35 ningen tørres og inddampes i vakuum til 31,6 g gul væske.

DK 154553B

27

O

Der tilsættes spor af hydroquinon, og det rå produkt destilleres, hvilket giver 22,4 g 1,2-dehydroprolin-t-butylester (66%), kogepunkt 60-62°C/0,l mm.

b) l-Benzyloxycarbonyl-4,5-dihydro-IH-pyrrol-2-carboxylsyre-5 -t-butylester

En opløsning af 16,9 g (0,1 mol) 1,2-dehydroprol.in--t-butylester i 70 ml dichlormethan afkøles til -10°C under argon. En opløsning af frisk destilleret benzylchlorformiat (14,2 ml, 0,1 mol, kogepunkt 62-64°C/0,4 mm) i 70 ml dicblor-10 methan tilsættes dråbevis i løbet af 30 minutter. Efter omrøring i kulde i yderligere 30 minutter tilsættes en opløsning af 15,22 g (0,1 mol) l,5-d±azabicyclo[5,4,0]undec-5-en i 70 ml dichlormethan i løbet af 20 minutter. Derefter fjernes kølebadet, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 en time. Efter to gange vask med kold fortyndet saltsyre og én gang med mættet natriumcarbonatopløsning tørres opløsningen i vakuum, hvilket giver 18,2 g (60%) 1-benzyloxycar-bonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-2-carboxylsyre-t-butylester som en svagt gul olie.

20 c) (trans)-l-Benzyloxycarbonyl-3-methylthio-D,L-prolin-t-bu-tylester

En opløsning af 18,2 g (0,06 mol) 1-benzyloxycar-bonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-2-carboxylsyre-t-butylester i 180 ml tør methanol behandles med 3,24 g (0,06 mol) natrium-25 methoxid og afkøles i isbad. Methanthiol bobles langsomt ind i opløsningen i 30 minutter. Blandingen omrøres natten over under argon ved stuetemperatur. Der tilsættes fortyndet vandig eddikesyre, indtil opløsningen er let sur. Der bobles argon gennem opløsningen 1 en time, før den inddamp-30 es til næsten tørhed i vakuum. Der tilsættes ethylacetat, og opløsningen vaskes to gange med mættet natriumcarbonatopløsning, tørres og befries for opløsningsmiddel i vakuum, hvilket giver 17 g gul olie. Denne olie chromatograferes under anvendelse af 300 g silicagel og petroleumether: ether 35 (4:1), hvilket giver 11,1 g (trans)-l-benzyloxycarbonyJL-l- -methylthio-D,L-prolin som en farveløs olie.

O

28

DK 154553 B

d) (trans)-3-Methylthio-D,L-prolin 8.4 g (0,024 mol) (trans)-1-benzyloxycarbony1-3--methylthio-D,L-prolin behandles med 45 ml 4N hydrobromsyre i eddikesyre. Efter omrøring i en time ved stuetemperatur 5 tørres opløsningen i vakuum. Der tilsættes en lille smule vand, og dette vaskes to gange med ether. Den vandige opløsning påføres en søjle med 300 ml ion-bytterharpiks, og der ledes vand igennem, indtil eluatet ikke mere er stærkt surt. Derefter elueres produktet med pH 6,5 (vandig pyridinacetat) 10 puffer. Fraktioner, der er positive over for ninhydrin, forenes og lyophiliseres, hvilket giver 3,4 g (88%) hvide fnug.

En lille prøve af dette materiale krystalliseres ud fra methanol, hvilket giver (trans)-3-(methylthio-D,L-prolin, smeltepunkt 196-200°C, sønderdeling (s. 192°C).

15 Analyse: Beregnet for CgH^C^NS: C 44,70, H 6,88, N 8,69, S 19,89.

Fundet: C 44,53, H 7,10, N 8,61, S 19,95.

e) (trans)-1-[3-(Acetylthio)-1-oxopropyl]-3-methylthio-D,L-20 -prolin 3.05 g (0,019 mol) (trans)-3-methylthio-D,L-pro-lin opløses i 19 ml IN natriumcarbonat og fortyndes med 10 ml vand. Opløsningen afkøles i isbad, og under hurtig omrøring tilsættes en opløsning af 3-acetylthiopropionylchlo- 25 rid i 20 ml ether. pH holdes på 8 ved tilsætning af IN natriumcarbonat. Efter 30 minutters forløb holdes pH konstant, og der er tilsat 45 ml natriumcarbonatopløsning. Lagene adskilles, og det vandige lag vaskes én gang med ether.

Det vandige lag gøres derefter surt med 10% kaliumbisulfat-30 opløsning, og produktet ekstraheres i ethylacetat, tørres og befries for opløsningsmiddel i vakuum, hvilket giver 5,2 g olie. Dette materiale chromatograferes på 150 g silicagel under anvendelse af ethylacetat til eluering. 3,85 g af en noget rå (trans)-1-(3-(acetylthio)-1-oxopropyl]-3-methyl-35 thio-D,L-prolin opnås.

DK 154553B

29

O

En lille prøve opløses i ether og omdannes til di-cyclohexylaminsaltet, der derefter omkrystalliseres ud fra ethylacetat, hvilket giver (trans)-1-[3-(acetylthio)-1-oxo-propyl]-3-methylthio-D,L-prolin-dicyclohexylaminsalt, smel-5 tepunkt 153-157°C.

Analyse: Beregnet for C^H^O^NS . (CgH^^NH: C 58,44, H 8,53, N 5,83, S 13,57.

Fundet: C 58,77, H 8,57, N 5,68, S 13,74.

f) (trans) -1- (3-Mercapto-l-oxopropyl) -3-methylthio-D,L-pro- 10 lin 2,05 g (0,007 mol) (trans)-l-[3-(acetylthio)-1— -oxopropyl]-3-methylthio-D,L-prolin afkøles i isbad under argon og behandles med en kold argon-mættet blanding af 7 ml vand og 7 ml koncentreret ammoniak. Efter omrøring i 30 15 minutter ved 0°C gøres opløsningen sur med saltsyre. Produktet ekstraheres i ethylacetat, tørres og befries for opløsningsmiddel i vakuum, hvilket giver 1,85 g materiale, der bliver delvis krystallinsk ved henstand. Triturering .med ether giver 1,0 g (57%) hvidt krystallinsk produkt. Omkry-20 stallisation ud fra 5 ml ethylacetat giver 0,85 g (trans)--1-(3-mercapto-l-oxopropyl)-3-methylthio-D,L-prolin, smeltepunkt 89-93°C.

Analyse: Beregnet for CgH^^O^NS : C 43,35, H 6,06, N 5,62, S 25,72.

25 Fundet: G 43,35, H 6,27, N 5,54, S 25,91.

30 35 0 30

DK 154553 B

Eksempel 16 (cis) -4- <ly 1-Dimethylethoxv) -1- (D-3-mercaoto-2-methyl-l-oxo- propyl)-L-prolin (a) N-Carbobenzyloxy-cis-4-(1,1-dimethylethoxy)-L-prolin-methyl-5 ester

En opløsning af 6,0 g (0,021 mol) N-carbobenzyloxy--cis-4-hydroxy-L-prolin-methylester i 60 ml methylenchlorid anbringes i en Parr-apparat, omrøres magnetisk, afkøles i et bad af tøris/isopropanol og behandles med ca. 40 ml flydendegjort 10 isobutylen efterfulgt af 0,75 ml koncentreret svovlsyre. Appara-tet lukkes, og reaktionsblandingen får lov at varne op til stuetemperatur under fortsat omrøring. Der forekommer ingen målelig trykstigning. Efter omrøring ved stuetemperatur i 4 dage, åbnes apparatet, og opløsningen (80 ml) fortyndes med 120 ml me-15 thylenchlorid og vaskes med 5 g natriumbicarbonat i 100 ml vand.

Den vandige fase returekstraheres med 50 ml methylenchlorid, de organiske lag kombineres og tørres (MgS04), og opløsningsmidlet afdampes, hvilket giver 7,5 g N-carbobenzyloxy-cis-4-(l,l-dimethyl-ethoxv)-L-prolin-methylester som en bleggul olie.

20 [a]^ ="46° (c, 1% i chloroform).

TLC (på silicagel): 0,62 (ethylacetat), 0,43 (7:1 benzen/eddikesyre)

Synliggjort UV, n^-damp.

b) N-Carbobenzyloxy-cis-4-(1,1-dimethylethoxy)-L-prolin 25 En omrørt opløsning af methylesterproduktet fra af snit (a) (7,2 g, 0,02 mol) i 15 ml ether afkøles i isvand og behandles portionsvis med 42 ml (0,042 mol) iskoldt N natriumhydroxid. Efter omrøring og afkøling i ialt 6 timer fjernes kølebadet, og omrøringen fortsættes natten over ved stuetemperatur.

30 Den klare opløsning vaskes med. 40 ml ether (vask kasseres), der anbringes et lag af 40 ml ethylacetat, omrøres, afkøles og syr-nes med 8 ml 6N saltsyre. Efter adskillelse ekstraheres den vandige fase med yderligere ethylacetat (3 x 40 ml), de organiske lag kombineres og tørres (MgS04), og opløsningsmidlet af-35 dampes,' hvilket giver 6,8 g bleggul viskos olie. Denne olie opløses i 50 ml acetonitril og behandles med en varm opløsning af 3,2 g 1-adamantanamin i 20 ml acetonitril. Det faste adamantan-

31 DK 154553 B

O

aminsalt udskilles hurtigt. Efter afkøling natten.over filtreres det farveløse salt under nitrogen, vaskes xaed kold aeetoni-tril og ether og tørres i vakuum, hvilket giver 8,8 g N-carbo-benzyloxy-cis-4-(1,1-dimethylethoxy)-L-prolin-adamantanaminsalt, 5 smeltepunkt 228-230°C (sønderdeling), begynder 215°C.

[a]p5 =-28° (c, 1% i methanol).

Analyse: Beregnet for h20: C 67,96, H 8,56, N 5,87.

Fundet: C 67,77, H 8,54, N 5,93.

10 Behandling af ovennævnte adamantanaminsalt (8,5 g) med syre giver 5,5 g N-carbobenzyloxy-cis-4-(1,1-dimethylethoxy)-L--prolin som en næsten farveløs viskos sirup.

TLC: 0,20 (85:15 toluen/eddikesyre på silicagel, fremkaldt I2-damp eller PMA plus varme).

15 (c) cis-4-(1,1-Dimethoxyethoxy)-L-prolin N-Carbobenzyloxyproduktet fra afsnit (b) (5,5 g, 0,017 mol) hydrogeneres i 165 ml 2:1 methanol/vand under 3 atm. hydrogen i nærvær af 1,7 g 51's palladium-carbon-katalysator, hvilket giver 3,2 g af en klæbrigt delvis fast produkt. Dette materia-20 le suspenderes i 30 ml acetonitril, gnides og afkøles natten o-ver, hvilket giver 1,35 g cis-4-(1,1-dimethylethoxy)-L-prolin som et farveløs faststof, smeltepuntk 240-242°C (sønderdeling), forudgående gradvis mørkfarvning og sintring.

25 o [a] D = -36 (c, 0,5% i methanol).

25 Analyse: Beregnet for CgH^N03.0,25 H20: C 56,37, Έ 9,20, N 7,31.

Fundet: C 56,26, H 9,27, N 7,26.

(d) 1- [D-3- (Acetylthio) -2-methyl-l-oxopropyl] -cis-4- (.1,1—dime-thylethoxy)-L-prolin 30 cis-4-(1,1-Dimethylethoxy)-L-prolinet fra afsnit (c) (1,3 g, 0,0069 mol) omsættes med 1,4 g (0,0078 mol) D-5-acetyl- thio-2-methylpropionylchlorid i 20 ml vand i nærvær af natrium- bicarbonat som beskrevet i eksempel 3, hvilket giver 2,2 g af en næsten farveløs viskos olie. Det fremkomne råprodukt ©pløses i 35 50 ml ethylacetat og behandles med 1,3 g dicyclohexylamin i 20 ml ethylacetat. Produktet krystalliserer ud fra opløsningen og filtreres og tørres, hvilket giver 2,65 g dicyclohexvlaminsalt,

O

32 DK 154553 B

smeltepunkt 181-183°C, begynder-ved 170°C.

[a]^ = -62° (c, 1% i ethanol).

Udrivning med 15 ml varm acetonitril efterfulgt af afkøling giver 2,4 g farveløst fast dicvclohexylaminsalt, smelte-5 punkt 183-185°C, begynder ved 175°.

[a] ^ = -65° (c, 1% i ethanol).

Analyse: Beregnet for ci5H25N05S* C 63,24, H 9,44, N 5,46, S 6,25 Fundet: C 63,22, H 9,61, N 5,41, S 6,02.

10 Ved at benytte fremgangsmåden i eksempel 3 omdannes de 2,4 g dicyclohexylaminsalt til syren ved at suspendere i e-thylacetat, afkøle i isbad og behandle med 30 ml 10%'s kaliumbi-sulfat. Lagene adskilles, og den vandige fase ekstraheres med 25 ml ethylacetat (4 gange). Efter fjernelse af opløsningsmid-15 let gnides materialet, der bliver delvis krystallinsk ved henstand, under 10 ml ether for at fuldende krystallisationen, fortyndes med 20 ml hexan, gnides og afkøles, hvilket giver 1,3 g 1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-cis-4-(1,1-dimethyl-ethoxy)-L-prolin som et farveløst faststof, smeltepunkt 96-98°C, 20 begynder ved 93°C.

[ct]^ = -109° (c, 1% i ethanol).

Analyse: Beregnet for C-^I^NO^S: C 54,36, H 7,60, N 4,23, S 9,68.

Fundet: C 53,92, H 7,73, N 4,30, S 9,29.

(e) cis-4-(1,l-Dimethylethoxy)-1-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxo-25 propyl)-L-prolin 1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-cis-4-(1,1- -dimethylethoxy)-L-prolinen fra afsnit (d) (1,3 g, 0,0039 mol) hydrolyseres med 2,6 ml koncentreret ammoniakhydroxid i 6 ml vand, hvilket giver 1,1 g af en glaslignende remanens. Ved hen-30 stand fremkommer podekrystaller i produktet. Dette materiale dæk-kes med 8 ml ether, podes og gnides. Efterhånden som glasset går i opløsning, udskilles gradvis et krystallisk faststof. Efter 2 timer ved stuetemperatur tilsættes 20 ml hexan, og blandingen afkøles natten over under argon. Opløsningsmidlet fjer-35 nes, hvilket giver 1,0 g farveløs fast cis-4-(1,1-dimethylethoxy)--1-(D-3-mercapto-2-methyl-l-oxo-propyl)-L-prolin, smeltepunkt 106-108°C (begynder ved 103°C).

33 DK 154553 B

O

[a]^ = -78° (c, 1% ± methanol).

Analyse: Beregnet for C]_3H23N°4S·0'25 H20: C 53,12, H 8,06, N 4,77, S 10,91.

Fundet: C 53,30, H 8,28, N 4,76, S 10,70.

5

Eksempel 17 (cis)-1-[D-3-(Benzovlthio)-2~methyl-l-oxopropyl3-4-(phenylthio)- -L-prolin 9,9 g (0,031 mol) cis-4-phenylthio-L-prolin snspen-10 deres i 100 ml vand (pH 5,6), og pH justeres til 10,2 ved tilsætning af ca. 20 ml 10%'s natriumbicarbonat, så at der fås en klar opløsning. pH justeres derpå til 9,5 ved tilsætning af ca.

4,5 ml koncentreret HC1. Opløsningen holdes ved 30°C, medens der tilsættes 8,1 g (0,033 mol) (D)-3-(benzoylthio)-2-methylpropan-15 syre-chlorid i 30 ml toluen samtidig med 100 ml 10%'s natriumbicarbonat for at holde pH på 9,3. Efter at ca. en fjerdedel af svrechloridet er tilsat, begynder et slimet bundfald .at dannes, hvilket holder sig under hele reaktionen. Efter omrøring af reaktionsblandingen ved pH 9,3 i 2,5 timer gøres denne stærkt 20 sur ved tilsætning af 20%'s HCl i nærvær af ethylacetat. Det vandige lag ekstraheres to gange med 350 ml-portioner ethylace-tat, og de forenede organiske lag vaskes med 300 ml mættet saltvandsopløsning og tørres (MgSO^,) . Opløsningsmidlet fjernes, hvilket giver 11,8 g skumagtigt fast råprodukt.

25 Til en opløsning af disse 11,8 g (0,027 mol.) skumag tigt faststof i 70 ml acetonitril tilsættes der ca. 6 g dicyclo-hexylamin i 25 ml ether. Der da‘nnes straks et hvidt .krystallinsk bundfald. Efter henstand natten over i kølerum filtreres faststoffet fra og vaskes med ether, hvilket giver (cis)-1-[D-3-30 -(benzoylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-(phenylthio)-L-nrolin-di- cyclohexylaminsalt (1:1).

Analyse: Beregnet for C22H23N04S2’C12H23N: C 66,85, H 7,59, N 4,59.

Fundet: C 66,33, Έ. 7,30, N 4,48.

35 Det let fugtige dicyelohexylaminsalt omrøres i 2,5 ti mer i en blanding af 300 ml ethylacetat og 200 ml 10%!' s ’kalium-bisulfat. Der dannes to klare lag. Det vandige lag ekstraheres

34 DK 154553 B

O

med to 200 ml-portioner ethvlacetat, og de kombinerede organiske lag tørres (MgSO^). Opløsningsmidlet fjernes, hvilket giver et udbytte på 10,1 g skumagtigt fast (cis)-1-[D-3-(benzoyl-thio)-2-methyl-l-oxopropyl]-4-(phenylthio)-L-prolin, smeltepunkt 5 42-44°C.

[a]^ = -36,5° (c = 1, methanol).

Analyse: Beregnet for ^22Η23Ν04δ2: C 60,87, H 5,46, N 3,23.

Fundet: C 60,75, H 5,35, N 3,17.

10 Eksempel 18 (cis) -1- (D-3-Mercapto-2-!-methyl-l-oxopropyl) -3-phenoxy-D,L-prolin (a) 3-Phenoxy-l,2-dehydroprolin-l-butylester

En blanding af 9,25 g (50 mmol) 1,2-dehydroproplin-l--butylester i 70 ml toluen opvarmes sammen med 8,9 g (50 mmol) 15 n-bromsuccinimid ved tilbagesvaling, medens det udsættes for en sollampe (ca. 5 cm's afstand) i en time. I dette tidsrum produceres succinimid, og reaktionen afkøles til stuetemperatur. Suc-cinimidet fjernes ved filtrering, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen destilleres ved 80°C, hvilket som udbytte giver 20 3,5 g rå 3-brom-l,2-dehydroprolin-l-butylester.

En blanding af denne rå 3-brom-l,2-dehydroprolin-l-bu-tylester og 3,9 g (13 mmol) thalliumphenoxid i 30 ml tørt dime-thvlformamid omrøres ved stuetemperatur under argon i 24 timer. Opløsningsmidlet fjernes under vakuum, og remanensen fortyndes 25 med ether til udfældning af thalliumbromid, der fjernes ved filtrering. Filtratet inddampes, hvilket giver en olie, der renses ved detstillation. Efter to timer ved 0,005 mm og 80°C er der 1,48 g 3-phenoxy-l,2-dehydroprolin-l-butvlester tilbage i destillationskolben .

30 (b) (cis)-3-Phenoxy-D,L-prolin.

En blanding af de 1,48 g 3-phenoxy-l,2-dehydroprolin--1-butylester, 5 ml IN natriumhydroxid og 20 ml 80%'s dioxan/vand omrøres ved stuetemperatur i 4 timer. Opløsningsmidlerne fjernes i vakuum, og remanensen opløses i 25 ml vand og behandles med 35 168 mg hatriumborhydrid i et tidsrum på en time ved stuetempera tur. Blandingen svrnes til pH 6 ved tilsætning af 2N HC1, og opløsningen holdes på 0°C i 16 timer, hvorefter der udfældes kry-

O

35

DK 154553 B

staller (ca. 25 mg) af (trans)-3-phenoxy-D,L-prolin. Disse fjernes ved filtrering, og filtratet afsaltes ved at blive ført gennem en "Dowex1® 50 W x 8 kolonne (2,5 x 30 cm), idet der anvendes IN ammoniumhydroxid som elueringsmiddel. De UV-aktive 5 fraktioner kombineres og inddampes, hvilket giver 616 mg fast (cis)-3-phenoxy--D,L-prolin.

(c) (cis)-1-[D-3-(Acetylthio)-2-methyl-l-oxopropyl]-3-phenoxy--D,L-prolin

De 616 mg (cis)-3-phenoxy-D,L-prolin opslæmmes 1 20 10 ml vand ved 5°C, og pH indstilles til 8,0 med fast natriumcarbo-nat. En opløsning af 550 mg (2,5 mmol) D-3-acetvlthio-2—methvl-propanoyl-syrechlorid i 1 ml ether tilsættes, og reaktiomsblandingens pH holdes mellem 7,3 og 8,2 i den næste 1,5 time ved tilsætning af natriumcarbonat. Blandingen vaskes med ethylacetat 15 (2 x 20 ml), syrnes til pH 2 ved tilsætning af 10% HC1 og ekstra- heres med ethylacetat (3 x 50 ml). Ekstrakterne forenes, tørres (MgSO^) og inddampes, hvilket som udbytte giver 810 mg af en olie. Denne olie renses ved lynchromatografi på silicagel (LP-1, 300 ml), idet der anvendes 10-20%’s eddikesyre/toluenblandinger som 20 elueringsmidler, og udbyttet er 530 mg (cis)-1-[D-3-(acetylthio)--2-methy1-1-oxopropy1]-3-phenoxy-D,L-prolin.

(d) (cis)-1-(D-3-Mercapto-2-methyl-l-oxopropyl)-3-phenoxy-D,L--prolin

De 530 mg (cis)-1-[D-3-(acetylthio)-2-methyl-1-oxopro-25 pyl]-3-phenoxy-D,L-prolin opløses i 50:50 koncentreret ammoniak/ vand (afgasset ved at boble argon gennem opløsningen i 15 minutter) under argon og omrøres ved stuetemperatur i 1,5 time. Den let uklare opløsning justeres til pH 6,5 med koncentreret HC1 (nogen varme forekommer) og ekstraheres med methylenchlorid 30 (2 x 25 ml). Derpå indstilles pH til 1, og opløsningen ekstrahe- res igen med methylenchlorid (3x50 ml). Ekstrakterne kombineres, tørres (MgSO^) og inddampes, hvilket som udbytte giwer 410 mg af en glasagtig forbindelse. Udrivning med chlorførm resulterer i krystallisation. Faststoffet omkrystalliseres ud fra 35 ethylacetat/hexan, hvilket som udbytte giver 261 mg ('c.is))—l-(D-3--mercapto-2-methyl-l-oxopropylf~3-phenoxy-D,L-prolin, smeltepunkt 134-135°C.

O

36

DK 154553 B

Analyse: Beregnet for C^H^NO^S: C 58,23, H 6,19, N 4,53, S 10,36.

Fundet: C 58,07,' H 6,18, N 4,45, S 10,16.

5 Biologisk afprøvning

Et af de systemer, som regulerer (forøger) blodtryk hos mennesker, er systemet renin/angiotensin/aldoste-ron. Renin er et enzym, der frembringes i myoepitheliecel-lerne i nyrernes juxtaglomerulære apparat, og som frigives 10 derfra. Mekanismen, der styrer sekretionen af renin, synes primært at reguleres ved blodets salt- og vandindhold og ved det tryk, ved hvilket blodet pumpes gennem nyren. Når disse faktorer sænkes, sendes renin direkte ud i blodet.

Der møder det som substrat et -globulin, angiotensinogen 15 (et inaktivt proteinstof). Renin spalter angiotensinogen i to ligeledes inaktive komponenter, et tetrapeptid og et de-capeptid kaldet angiotensin I (forkortet til A-I). Når A-I cirkulerer gennem kapillærerne (primært lungens kapillærer), møder det det angiotensinomdannende enzym (forkortet til ACE), 20 der er lokaliseret i kapillærernes endothelieceller. ACE spalter A-I i et dipeptid og et octapeptid, angiotensin II (forkortet til A-II), som er det stærkeste kendte blodtryksforøgende stof i menneskelegemet. A-II1s blodtryksforøgende virkning finder sted både lokalt i muskulaturen og centralt.

25 Efter stimulering ved hjælp af A-II udsender postremaområdet i hjernen til resten af kroppen impulser, som fremkalder blodtryksforøgelse. Derudover frembringer A-II endnu en virkning, nemlig den fysiologiske stimulering af sekretionen fra binyrebarken af aldosteron, et mineralcorticoid. Aldosteron 30 forøger resorptionen af natriumioner fra nyrerørene, hvorved det effektive blodrumfang forøges, således at blodtrykket hæves yderligere ved hjælp af denne sekundære mekanisme.

Foruden omdannelsen af A-I til A-II har ACE endnu en yderligere virkning. Blod indeholder et octapeptid, bra-35 dykinin', som har vasodi later ende egenskaber. ACE transforme-

DK 154553B

37

O

bradykinin til inaktive komponenter. Med hensyn til denne funktion betegnes ACE til tider som kininase II.

Renin-angiotensin-aldosteronsystemet er i uorden hos hypertensive personer og bidrager således afgørende til 5 patientens høje blodtryk. Et lægemiddel, som således inhlbe-rer ACE, er altså i stand til at frembringe følgende virkninger : 1. Inhibering af dannelsen af A-II og dermed: a) direkte inhibering af vasoconstriktion og 10 b) inhibering af udsendelsen af aldosteron Æra binyrebarken (dvs. inhibering af overskydende vand- og saltresorption), samt 2. som resultat af ACE-inhibitionen fås en inhibering af bradykinins spaltning, således at dets vasodilatxeren- 15 de virkning (blodtrykssænkende) bibeholdes.

Ingen af de almindelige antihypertensive midler virker som ACE-inhibitor.

Forbindelserne med den ovenstående almene formel I er derimod stærke ACE-inhibitorer. De inhiberer omdannelsen 20 af decapeptidet angiotensin I til angiotensin II og minimerer eller eliminerer således hypertension fremkaldt ved hjælp af angiotensin II. Forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen griber ind i omdannelsesprocessen for an-giotensinogen (renin) -^angiotensin I-^angiotensin II ved at blo-25 kere ACE og således minimere eller eliminere dannelsen af angiotensin II, hvilken forbindelse er ansvarlig for forøgelsen i blodtrykket. Det effektive ingrebssted eller virkningssted for forbindelserne med den almene formel I er fuldstændig forskelligt fra det, som kendes for et hvilket som helst af de 30 almindeligvis anvendte antihypertensive lægemidler. Forbandelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt - i modsætning til de almindelige antihypefteansi-ver - at opnå et indgreb i de årsags fremkaldende faktorer til hypertension.

35 Således er den farmakologiske anvendelighed af for-

O

38

DK 154553 B

bindeiserne med formlen I baseret på deres evne til at inhi-- bere det angiotensinomdannende enzyms virkning. Denne inhi-bering er bestemt på in vitro-basis ved måling af virkningen på det angiotensinomdannende enzym ekstraheret fra kaninlun-5 ge og ved at bestemme den inhiberende aktivitet på angiotensin I-fremkaldte kontraktioner af marsvinetyktarm. Disse prøver er standardiserede og anvendes som sådanne inden for dette område af medicinen, og de er i Øvrigt nærmere beskrevet nedenfor.

10

Inhibition af angiotensin-omdannende enzym isoleret fra kaninlunge

Aktiviteten hos det angiotensinomdannende enzym fra kaninlunge i cellefri ekstrakt måles ved spektrofotometrisk 15 bestemmelse af hippursyre frigivet ved indvirkning af ensymet på hippuryl-L-histidyl-L-leucin (HHL) således som beskrevet af Cushman og Cheung i Biochem. Pharmacol., 20, 1637 (1971), jfr. nedenstående reaktionsskema.

-Gly-His-Leu —“Gly + His-Leu HHL hippursyre 25 Måling af det angiotensinomdannende enzyms inhibi tion under anvendelse af denne spektrofotometriske biologiske afprøvning kræver inkubation af blandinger af følgende * komponenter ved 37°C i et rumfang på 0,25 ml: 100 mM phosphatpuffer (pH 8,3) 30 300 mM natriumchlorid 0,001-1000 jig/ml inhibitor eller eventuelt ingen inhibitor 5-10 millienheder enzym.

Efter ovennævnte blandingers inkubation ved forskel-35 lige inhibitorkoncentrationer eller i fraværelse af inhibito-

DK 154553B

39

O

rer i 30 minutter standses enzymreaktionen ved tilsætning af 0,25 ml 1 H saltsyre. Det er også nødvendigt at køre kontrolforsøg, hvor enzymet inaktiveres ved tidspunktet 0 ved tilsætning af syren før enzymet. 1,5 ml ethylacetat sættes til 5 hvert reagensglas for at ekstrahere den ved hjælp af enzymet dannede hippursyre. Efter 20 sekunders kraftig blanding ((i hvirvelstrøm) og fraskillelse af ethylacetatlaget ved centrifugering udtages fra hvert reagensglas 1,0 ml af opløsningsmidlet og inddampes til tørhed ved 100°C, og hippursyren «genio opløses i 1,0 ml vand, og dens mængde bedømmes ved hjælp af opløsningens basorptionsevne ved bølgelængden 228 nm.

Kraften som inhibitorer for det angiotensinomdannen-de enzym udtrykkes som I50 -værdien, der er den mængde inhibitor i pg/ml eller mikromolært, som kræves for at inhibere 15 det angiotensinomdannende enzyms aktivitet med 50% således som målt ved den spektrofotornetriske biologiske afprøvningsmetode. Denne værdi opnås ved grafisk at afsætte den procentvise inhibition, som frembringes ved inhibitorkoncentrationer varierende fra to gange til tre gange den -foregående over et· interval fra 20 0,001 pg/ml til 1000 pg/ml. En sådan procentvis inhibition be regnes ifølge nedenstående udtryk: procentvis inhibition = —^ A -------- ^ (A-A°) 25 hvor A betegner hippursyres absorptionsevne ved en 30 minutters biologisk afprøvning uden inhibitor, A° betegner Jbag-grundsabsorptionsevnen ved en biologisk afprøvning inkuberet i 0 minutter, B betegner hippursyres absorptionsevne ved en 30 minutters biologisk afprøvning ved den afprøvede inhibi-30 torkoncentration, og B° betegner baggrundabsorptionen ved biologisk afprøvning indeholdende inhibitoren, men kun inkuberet i 0 minutter.

35 0 40

DK 154553 B

Procedure ved afprøvning af den inhibitoriske aktivitet på • det angiotensin I-omdannende enzym (ACE) på marsvinetyktarm in vitro

Denne procedure anvendes til at bestemme, hvorvidt 5 en forbindelse udgør en inhibitor for angiotensin I-omdannende enzym baseret på dens aktivitet afsat som funktion af måleresultater for angiotensin I-fremkaldte kontraktioner af marsvinetyktarm. ACE-inhibitorer inhiberer typisk angiotensin I-fremkaldte kontraktioner.

10 Marsvin af begge køn af stamme Hartley, som ikke har fastet, og som vejer fra ca. 300 til ca. 400 g, dræbes ved et slag mod hovedet. Tyktarmen udtages, og 2-3 cm afsnit præpareres ifølge Vane's metode, jfr. nedenstående litteratursted 1. Hver tyktarmsstrimmel suspenderes derpå i et 10 ml's 15 vævsbad fyldt med Krebs's opløsning, jfr. nedenstående litteraturlisten nr. 2, og holdes ved 37°C og luftes ved 95% O2 og 5% COj· Muskelaktiviteten registreres isotonisk under en belastning på 1 g målt ved hjælp af Harvard nr. 356 spændingsmåler (transducer) for hjertemuskulator/glatmuskulator for- 20 bundet med en Beckman type R dynograf.

Efter at vævene har opnået ligevægtsindstilling efter ca. 90 minutter, opnås 2 minutters kontrolrespons med intervaller på 10 minutter ved hjælp af følgende agonist..

25 angiotensin I (A-I) 0,025 mikrogram/ml FBC (endelig bladkoncentration)

Kontraktionerne, som frembringes ved denne koncentration af A-I, repræsenterer fra 50 til 75% af de maksimale.

30 Prøveforbindelsen opløses sædvanligvis i vandig el ler vandig saltholdig opløsning, og der fremstilles tifoldige fortyndinger i H20. Agonisten' forbehandles i 2 minutter med prøveforbindelsen, og den procentvise ændring i kontraktions-responset beregnes . Specifikt aktive forbindelser, dvs.

35 forbindelser, som sandsynligvis vil være ACE-inhibitorer, in-

DK 154553B

41

O

hiberer typisk angiotensin I-fremkaldte kontraktioner.

A—B

Procentvis inhibition = —x 100 5 hvor A betegner kontraktionen imms) forårsaget af A-I før tilsætning af prøveforbindelse, og B betegner kontraktionen (mms) forårsaget af A-I efter tilsætning af prøveforbindelsen.

10 EC50 (koncentrationen af prøveforbindelse, som frembringer 50%'s inhibition af A-I*s kontraktive virkning) udregnes grafisk eller biometrisk. Nogle få koncentrationer af prøve-forbindelsen anvendes typisk til at konstruere kurven- over inhibitorisk respons som funktion af koncentrationen.

15

Under anvendelse af ovenstående teknik er der opnået følgende 1^ og EC^q data for ’"Captopril" og en forbindelse fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen; 20 Aktivitet ' Aktivitet

Marevine

Kaninlunge ACE ileum Forb._Struktur_150 mM_ECgp xnM

Kendt sammlign. ,3 Γ I on On "Captopril" HSCH^CHCO-N_l-CCØH 20 20 25 S-CfiH,-

Fremst. JL

iflg· opf. I I o eks. 13 HSCH2CHCO-N_l-COOH 0 30 35

Claims (2)

1. 20 HN_—COOR hvori R, R^" og X har den ovenfor anførte betydning, kobles med en syre med formlen R2
2. 25 R,4-S-CH2-CH-COOH III 2 4 hvori R er som ovenfor anført og R' er C^_4 alkanoyl eller benzoyl, eller et funktionelt derivat deraf, til dannelse af 4 et produkt, hvori R er C1-4 alkanoyl eller benzoyl, og at 30 produktet om ønsket hydrolyseres til dannelse af et produkt, 4 12 hvori R er hydrogen, og R, R , R og X er som ovenfor anført, hvorpå en eventuelt dannet syre om ønsket overføres i et salt deraf. 35