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Verfahren zur Herstellung von gereinigten Papainen bzw. papainähnlichen
Fermenten Als Papai ne bezeichnet man gewisse proteolytische Ferrnente, die im Milchsaft
des tropischen Caricapapaya-Baumes enthalten sind. Papainähnliche Fermente enthält
auch der Milchsaft von Ficus carica, welche gewöhnlich als Ficin bezeichnet werden.
Der eingetrocknete Milchsaft dieser Pflanzen kommt als Rohpapain bzw. -ficin in
den Handel. In derartigen Produkt-en liegen die Fermente zum einen Teil in einer
aktiven, zum anderen in einer reversibel inaktiven Form vor, die durch Zusatz eines
Aktivators, wie Natriumbisulfit oder Kaliumcyan:id, aktiviert werden kann.
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Zur Auswertung der handelsüblichen Papain-bzw. papainähnlichen Präparate
bedient man sich gewisser Testmethoden, z. B. des Willstätter-Tests oder einer viskosimetrischen
Methode, bei welcher die Viskositätsminderung von Gelatine durch Papain in ähnlicher
Weise wie beim Viskositätsminderungstest zur Hyaluronidasebestimmung (vgl. H. Gibia*n,
Zeitschr. physiol. Chem., Bd.289, [19511,S.ibi.s5)benutztwird.Fii,rdieim,folgenden
beschriebenen Untersuchungen wurde indessen eine neue Testmethode erarbeitet, die
als »Biuret-Methode« bezeichnet werden soll und deren Einzelheiten aus der Anlage
ersichtlich sind.
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Sie benutzt die bekannte Bestimmung von Proteinen mit dem Biuret-Reagenz
(G. Beisenherz und Mit. Z. F. Naturforsch. 8b [19531, S.
576) und beruht auf einer colorimetrischen Bestimmung des restlichen Caseins,
welches von einer vorgegebenen Menge nach Einwirkung des zu untersuchenden Papainpräparates
unter festgelegten Bedingungen übrigbleibt. Diese Methode gab, an gleichen Papainpräparaten
überprüft, eine ausreichende Übereinstimmung
mit den nach anderen
Methoden gefundenen Resuiltaten und hat den Vorzug, daß ihre Resultate genauer reproduzierbar
sind als dort.
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Die Herstellung reinen Papains ist bisher noch nicht gelungen. Man
weiß, daß Rohpapaine neben dem an sich wasserlö.slichen Papain wasserunlösliche
Verunreinigungenenthalten, von welchen man die ganzen aktiven Bestandteile durch
Extraktion mittels Wasser abtrennen kann.
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Eigenartigerweise nimmt jedoch der durch Wasser extrahierbare Gehalt
an wirksamen Fermenten bei längerer Lagerung, Erhiltzen auf ioo' oder längerer L-ufteinwirkung
auf frisches Rohpapain in kurzer Zeit stark ab. Beispielsweise konnte bei einem
Rohpapain, dessen Gehalt an Papain sofort nach Lieferung durch Extraktion mit der
zehnfachen Menge Wasser und Testung des wäßrigen Extraktes nach der Biuret-M--thode
zu 2ooo Einheiten pro mg bestimmt worden war, nach 3otägiger Lagerung auf die gleiche
Weise nur noch ein Gehalt von i2oo Einheiten pro mg ermittelt werden.
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Es hat sich herausgestellt, daß diese Abnahme der Aktivität indesse-n
nur eine scheinbare ist, die auf einer bisher in ihren letzten Ursachen noch nicht
geklärten Verminderung der Extrahierbarkeit des Papains aus dem Rohprodukt mittels
Wassers beruht, da klar in Wa%ser lösliche Papaintpräparate einen. entsprechenden
Aktivitätsrückgang beim Lagern nicht zeigen-. Offenbar spielen sich beim Lagern
zwischen einem Teil des Ferments und seinen wasserunlöslichen Begleitstoffen Vorgänge
vielleicht chemischer, vielleicht sonstiger Nalur (Vernetzung?) ab, die diesen Teil
des Ferments wasserunlöslich machen.
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Es wurde nun gefunden, daß eine der obengenannten entsprechende Abnahme
der Aktivität überraschenderweise nicht festzustellen ist, wenn man die Extraktion
des Ferrnents aus dem Rohpapain (bzw. Roh-fiein) statt mittels Wassers unter Verwendung
rhodanidhaltiger wäßriger Lösungen, beispielsweise einer etwa molaren Kaliurarhodanidlösung,
vornimmt. Man findet in diesem Falle auch nach 3otägigem Lagern noch den gleichen
Fermentgehalt des Rohproduktes, den man bei der frischen Ware übereinstimmend bei
Anwendung wäßriger oder rhodanidhaltiger Extraktion bestimmt'hatte. Ähnliche Effekte
eines Rohdani#dzusatz!es sind bei der Extraktion tierischer Organe zwar auch schon
beobachtet worden. Ihr Auftreten bei der Übertragung der Rhodanidextraktion auf
den varliegenden Fall war jedoch keinesfalls vorauszusehen.
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Daß Rhodanide auf Papain auch keinerlei Aktivatorwirkung der Art ausüben,
wie man sie vom Natriumbisudfit oder Kaliumeyanid kennt, sei ausdrücklich erwähnt.
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Die Verwendung von rhodanidhaltigen wäßrigen Lösungen bedeutet also
unbestreitbar einen ersten technischen Fortschritt auf dem Wege der Reinisolierung
des Papains, insofern sie eine beachtliche Ausbeuteerhöhung insbesondere bei der
Verarbeitung älterer Rohprodukte ermöglicht.
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Zur weiteren Reinigung von Rohpapainen und papainähnlichen Produkten
hat man sich auch schon der fraktionierten Fällung des Ferments aus wäßrigen Lösungen
mittels Alkohols bedient, jedoch ohne hierbei eine wesentliche Erhöhung des Reinheitsgrades
zu erreichen. Meist waren derartige Präparate nicht einmal völlig klar wasserlöslich.
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Es wurde nun weiterhin gefunden, daß sich der Reinigungseffekt dieser
Methode ganz wesentlich steigern läßt, wenn man die Alkohc>Ifraktionierung in Gegenwa-rt
von Schwermetallionen, insbesondere Zinkionen, vornimmt. Man kommt hierbei unschwer
auf Reinheitsgrade von 50oo bis 6ooo Einheiten pro mg. Die Alkoholfällung kann aus
relativ konzentrierter, bis zu etwa 3o'/oiger wäßriger Lösung des Ferments, z. B.
des Papains, vorgenommen werden, wobei die Anwesenheit von Rho,-dansalz nicht stört.
Einstellung der wäßrigen Lösung auf ein pl, von etwa 6,5 ist vorteilhaft.
Bemerkenswert ist, daß Schwermetallionen den Reinigungseffekt nicht nur verstärken,
sondern den Fraktionierungsablauf im Vergleich zuT reinen Alkoholfraktionierung
auch insofern ändern, als die weniger reinen Fraktionen in Gegenwart von Zinkionen
zuerst fallen, während sie in deren Ab-
wesenheit zuletzt erschienen. Die
Fällungen werden zweckmäßig bei niedriger Temperatur abzentrifu#-gi,ert und zur
Befreiung von Überschüssigem Schwermetallgehalt und sonstigen niedermolekularen
Beimengungen nach Suspension in verdünnter Essigsäure gegen fließendes Wasser dialysiert.
Hierbei zeigt sich ein weiterer Vorteil des Zusatzes von Schwermetallionen bei der
Alkoholfällung. Sie bewirken nämlich einen überraschenden Schutz der Fällungsprodukte
gegen Ausbeuteverlust bei der nachfolgenden Dialyse. Während bei den in Abwese,nheit
von Schwermetallionen gewonnenen Alkoholfällungen die nachfolgende Dialyse (die
hauptsächlich der Entfernung niedermolekularer Verunreinigungen des Rohferments
dient) mit einem Verlust von rund der Hälfte der vorher verhandenen Einheiten verbunden
ist, tritt ein solcher Verlust bei den in Gegenwart von Schwermetallionen gewonnenen
Alkoholfällungen nicht ein. Letztere gehen während der Dialyse bis auf kleine Reste,
die sich nun leicht abfiltrieren lassen, allmählich in Lösung. Man erhält also schließlich
eine klar.-, nicht opalisierende, nicht zu verdünnte, d. h. etwa 2&/oige
Fermentlösung, die sich ohne. Schwierigkeit z. B. durch ein Seitzfilter unter Verwendung
von Stickstoff als Druckgas sterilfiltrieren läßt. Die bisher übliche, mit erheblichen
Verlusten an Aktivität verbundene Sterilisation des Papains durch einstündige Trockenerhitzung
auf ioo', die wegen äußerst schlechter Filtrierbarkeit der stark opalisierenden
wäßrigen Lösungen nuir äthanolgefällter Präparate meist nicht zu umgehen war, entfällt
also.
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Die erfind'ungsgemäß erhältlichen sterilfiltrierten wäßrigen Papainlösungen
lassen sich verlustfrei gefriertrocknen. Man erhält dabei Trockenpräparate, die
sich in der dreifachen Menge destillierten Wassers völlig klar auilösen lassen.
Derartige Präparate zeigen bereits ohne Zusatz eines Aktivators 6o04 der vollen
Aktivität, die bei Zusatz eines Aktivators, z. B. Natriumbisulfit, gefunden wird,
und
behalten diese Aktivität bei Raumtemperatur für sehr lange Zeit, selbst bei
56' über mindestens 14Tage, unwerinind,-rt bei.
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Beispiel 30g Rohpapain (iZ-)oo Biuret-Einheiten pro mg 45 Megaeinheiten
pro 30 9) wurden mit ioo ccm eitler i molaren K S C N-Lösung fÜr
30 Minuten bei ,io' extrahiert. Zur Abtrennung der Lösung wurden etwa io
g mit destilliertem Wasser gewaschene KieselguT eingerührt. Der Brei wurde
über einer Kieselgurschicht abgesaugt. - Nachwaschung mit io ccm destilliertem
Wasser. Ausbeute: io5 ccm 410 000 E pro cem = 43 Megaeinheiten.
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In dieklareLösung-werden 4,69Zn-Ac;2tat-2H,0 (200 MOI) eingerührt.
Hierbei fällt bereits ein Niederschlag aus, der nicht abgetrennt wird. Das PH der
Suispension wird mit Na OH auf pli 6,5 gestellt. Zu. der Suspension
wurde langsam in der Kälte (o auf -8' gehend) Äthanol eingetropft, bis zt,
5o0/eiger Äthanolkonzenträtion. Der Niederschlag wurde bei -8' abzentrifugiert,
in 50 Ocm :2n-Essigsäure stispendiert und über Nacht gegen fließendes Wasser
dialysiert.
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i. Fraktion: 6o ccm mit - 2oo ooo E pro ccm entsprechend
insgesamt - 12 Megaeinheiten.
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Zu der klaren Lösung wurde weiter bei -8'
Äthanol bis zur 8o0/9igen
Äthanolextraktion zugetropft. Aufarbeitung des Niederschlags wie bei der ersten
Fraktion.
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2. Fraktion: 6,5 ccm mit
- 380 000 E Pro ccm entsprechend insgesamt
- 25 Megaeinheiten. Beide Fraktionen wurden ohne Verlust Seitzfiltriert (EKS)
unter Stickstoffdruck. Ans!chlielßend Gefriertrocknung der Lösung.
| i. Fraktion: o bis 5o'/o Äthanol = 49 = 3000 E
Pro Mg = 12 Megaeinheiten |
| 2. Fraktion: 5o bis 8ol/o Äthanol = 5 9 = 5ooo
E pro mg = 25 Megaeinheiten |
| 37 Megaeinheiten (82010). |
Biuret-Test zur Papainbestimmung i. Reagenzien Citratpufferlösung: 5oocm3 einer
n/S-Na OH werden mit 2o0/eiger Citronensäure auf pl,
6 gestellt und auf iooo
cm3 mit destilliertem Wasser aufgefüllt.
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Substratlösung: 62 5 Mg Casein nach I-1 a in in a r s t e n
werden in 50 CM3 11/5-Na OH gelöst, mit C/eiger Citronensäurt auf PH
6 eingestellt und das Volumen auf ioo cm3 aufgefüllt. (Eventuell filtrieren.)
Das gelöste Substrat, das nicht am gleichen Tage aufgebra,ticht wird, wird in der
Kühltruhe (-2o') eingefroren; es ist nicht länger als i Woche haltbar. Aktivatorlösung:
Na-Bisulfit wird in obengenanntem Citratpuffer zu einer Konzentration i mg/crn3
gelöst. Biu(ret-Reagenzlösluing: 9 g Seignettesalz (K-Na-Tartrat)
werden in etwa 4oo cm3 n/5-Na OH gelöst, nacheinander werden zu dies-er Lösung
3 9 feingepulvertes CuS 04 +15 H2 0
p. a. und
5 g K j p. a. zugefügt. jedes der Salze muß vor Zufügen des
nächsten gelöst sein. Die Mischung wird mit n/5-Na OH auf iooo em3 aufgefüllt.
Das Reagenz ist in einer braunen silicon.ierten Fla-sche im Eisschrank lange Zeit
haltbar.
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Trichloressigsäurelösung: Etwa 3molar; 5og werden mit destilliertem
Wasser auf ioo cm3 aufgefüllt.
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2. Ausführung der Bestimmung Herstellung der Fernientlösung: i. Lösliche
Papainpräparate werden in destilliertem Wasser zu einer Konzentration i mg/cm3 gelöst
-und eventuell mit destilliertem Wasser weiter verdünnt.
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2. Von, den unlöslichen Rohpapain-en werden Auszüge hergestellt, und
zwar werden immer ioo mg Rohpapain mit i cm3 destilliertem Wasser bzw. i cm3 molarer
K S C N-Lösung extrahiert. Extraktionsdauer 30 Minuten bei
37' unter häufigem Umrühren mit einem Glasstab. Der wäßrige Auszig wird mit
4 cm3 destilliertem Wasser verdünnt und filtriert. Das Filtrat wird erforderlichenfalls
mit destilliertem Wasser weiter verdü#nnt.
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ProteoLyse des Substrats: o,8o CM3 Substratlösung- (= 5 mg
Casein) + o,ioo em3 Aktivatorlösung (= ioo y Na-Bi-SUI.fit)
+ 10, 100 CM3 Fermentlösung werden in einem Zentrifugenröhrchen genau
30 Minuten in einen auf 37' eingestellten Thermostaten eingesetzt.
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Beendigung der Fermenteinwirkung erfolgt durch Zusatz von oao em3
Trichloressigsäure unter Schütteln.
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Abtrennung und colorimetrische Bestimmung des unveränderten Substrats:
Das nicht abgebaute Casein fällt aus und wird abzentrifugiert, die Lösung wird abgegossen,
an der Glaswand hafende Reste der Lösung sind mittels Filtrierpapier zu entfernen.
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Die Cas,einfällung wird im Zentriftigenröhrchen in 3 em3 destilliertem
Wasser mit einem Glasstab aufgewirbelt und danach mit 3 cm3 des Biuret-Reagenz
versetzt. Die Lösung wird nach io Minuten ' unter Verwendung eines WK-Photozellenkolorimeters
nach Havemann kolorimetriert und der gefundene Wert der Extinktion (e) notiert.
Reagenzblindwert: Nun legt man durch kolorimetrische Bestimmupg uinter gleichen
Bedingungen an einer Mischung von
3 CM3 destilliertem Wasser
+ 3 cm-9 Biuret-Reagenz den Blindwert des Bäurtt-Reagenzes (a.) fest,
der von dem oben ermittelten Extinktionewert in Ab-
zug zu bringen
ist.
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Sämtliche Röhrchen und Pipetten müssen vor jedem Ansatz mit Chromschwefels-äure
gereinigt werden.
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Die Differenz e -eo = a, entspricht dann dem =veränderten
Casein, dessen Menge als Maß für die Aktivität des geprüften Papains dient, wobei
zu beachten ist, daß sie immer niedriger liegen- muß als die Extinktion des ursprünglich
eingesetzten Cas&in.s, die man bei. ganz gleicher Ausführung der Bestimmung
ohne Zusatz von Ferment finden würde (Ausgangswert) und um so niedriger,
je
höher die Aktivität des geprüften Ferments ist.
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Um klare Beziehungen zwischen e, und Aktivität zu schaffen, ist letztere
nun noch genauer zu definieren. Wie bei biologischen Testen üblich, vergleicht man
die nach obiger Methode ermittelte Aktivität eines beliebigen Fermentpräparates
mit der nach der gleichen Methode ermittelten Aktivität eines Standardpräparates.
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Einen international festgelegten Papainstandard gibtes bisher noch
nicht.
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W i 11 s t ä t t e r benutzte bei der Auswertung von
Papainen nach seiner Methode als Vergleichsstandard ein von ihm willkürlich ausgewähltes
Papainpräparat. Da der Willstättersche Urstandard bzw. ein von ihm abgeleiteter
Hilfsstandard nicht zur Verfügung stand, mußte der Durchführung des neugeschaffenen
Biuret-Testes ein eigener Standard zugrunde gelegt werden. 3. Herstellung
des Standards Ein Rohpapain (Merck 1 :350 ) wurde mit Wasser extrahiert.
Der Extrakt wurde gegen fließendes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet und das
so gewonnene Trockenpräparat als Urstandard für die Biuret-Methode benutzt. Auswertung
diesesUrstandards nach dem Willstätter-Test unter Verwendung der von Willstätter
veröffentlichten Standardkurve (vo. B a m a n n -Myrbäck, Bd. 3, S.:2946)
ergab eine Aktivität von 0,7 Willstätter-Einheiten pro mg.
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Aus praktischen Gründen wurde für den Biuret' Test jedoch eine kleinere
Einheit als die Willstättersche gewählt. Sie wurde wie folgt definiert: »i mg des
in oben angegebener Weise gewonnenen Urstandards enthält bei Durchführung des Biuw,et-Tests
unfer den festgelegten Bedingungen die proteolytische Aktivität von iooo Biuret-Einheiten.«
Eine allgemein gültige zahlenmäßige Relation zwischen Willstätter-Einheiten und
Biuret-Einheiten besteht nicht, da die bei den jeweils untersuchtenRohpapainen unterschiedlicher
Aktivität und Herkunft ermittelten Zahlenwerte bis zu einem gewissen Grade von der
benutzten Aulswertungstechnik abhängig sind und sich auch nicht aud einen identischen
Urstandard beziehen.
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Für genauere Vergleichsversuche kann der für die Riuret-Methode benutzte
Urstandard bzw. ein standardisierter HiIfsstandard von der Schering
A. G.
aud Anforderung geliefert werden. 4. Auswertung der Bestimmung am Standard Die Auswertung
der ermittelten Extinktion
a,
des untersuchten Papainmusters geschieht nun
durch Eingehen in ein Ktirvendiagramm (s. Anlage!), in welchem auf der Ordinate
d.ie Extinktionswerte aufgetragen sind, die man erhält, wenn man die
auf
der Abszisse eingetragenen Mengen (in
y)
des Standards in den Biuret-Test
einsetzt. (Diese Extinktionskuirve des Standards muß jeweils an dem Tage und mit
dem Casein neu bestimmt werden, an dem man auch die Extinktion des zu untersuchenden
Papainmusters ermittelt, um die Fehlergrenze der Methode möglichst eng zu halten,)
Zur Bestimmung des Ausgangswertes der Kurve wird die Extinktion an o,8o cm3 Substratlösung
+ o,2o em3 Citratpufferlösuing ohne Ferment und Aktivatorzusatz genau, wie oben
unter 2 angegeben, ermittelt. Das Ablesen der den am Muster gefundenen Extinktionswerten
zugehörigen Papain-Werte
(y) ist nur auf dem linearen Teil der Kuirve zulässig.
Fällt der am Muster gefundene Extinktionswert aus diesem Teil der Kurve heraus,
so ist- die Bestimmung mit kleinerem Einsatz (entsprechen& Verdünnung der Fermentlösung!)
zu wiederholen. Das untersuchte Papainmuster enthält dann
| (abgelesene y) - io - (eventuelle Weiterverdünnung
der Fermentlösung) |
| Fermenteinwage pro cm3 = Biuret-Einheiten pro mg |
| Papainmuster |