DE2519889A1

DE2519889A1 - Verfahren zum klaeren von fluessigkeiten

Info

Publication number: DE2519889A1
Application number: DE19752519889
Authority: DE
Inventors: Ricardo Segura Dr Ferns
Original assignee: Instituto de Farmacologia Espanola SL Fundacion Marques de Urquijo
Current assignee: Instituto de Farmacologia Espanola SL Fundacion Marques de Urquijo
Priority date: 1974-05-06
Filing date: 1975-05-03
Publication date: 1975-11-20
Also published as: RO75758A; ES437478A1; IE41037L; DD119612A5; BE828730A; FI751327A; NL7505198A; AU8088075A; NO751534L; IE41037B1; LU72395A1; FR2269873A1; FR2269873B1; IT1036212B; JPS5143854A; US4038419A; JPS542986B2; GB1512512A; DK194375A; ZA752869B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Klärung von Flüssigkeiten unter Verwendung eines Enzyms, insbesondere für trübe Flüssigkeiten oder Flüssigkeiten, die während des Lagerns trüb oder wolkig werden.

Die Bedeutung, die mit der Klarheit oder der Transparenz von Lösungen verbunden ist, ist im allgemeinen gut bekannt, insbesondere im Falle von Getränken. Ebenso bekannt
sind die Nachteile, die mit dem Klären solcher Lösungen verbunden sind, beispielsweise unter Verwendung physikalischer Verfahren (Filtrieren, Zentrifugieren usw.), insbesondere
dann, wenn koagulierbare Proteine in den Lösungen enthalten sind und insbesondere, falls diese von beträchtlich unterschiedlichen Molekulargewichten sind, wodurch die Filtration besonders erschwert und die Zentrifugierung häufig ohne Erfolg

WR/Si

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ist. Beide Verfahren sind sehr nützlich, falls es sich um Getränke handelt, die einen hohen Trockengehalt haben, der die Dichte und die Viskosität erhöht, wobei die Dichte und die Viskosität zwei der Faktoren sind, die die Durchflußgeschwindigkeit beeinträchtigen bei der Filtration und der Klassifizierung im Laufe der Filtration.

Es geschieht auch häufig, daß Flüssigkeiten, die durch reine physikalische Vorgänge geklärt worden sind, während ihres Lagerns wieder trübe werden. Dies läßt sich leicht erklären, es hat nämlich eine Erhöhung der Größe des dispergierten Myzels stattgefunden, die groß sind und deren Molekularstruktur, beispielsweise des Proteins, viele Stellen aufweist, an denen eine Verknüpfung stattfinden kann, und zwar durch echte Verbindungsbildung, durch Van der Waal'sehe Kräfte und insbesondere durch Wasserstoffbrückenbildung. Dies erklärt das Ausmaß der Trübe in Polyphenolen und Tanninen (wie J. de Clerck in "Bulletin de 1'Association Royale des Anciens Etudiants en Braserie de I¹Universite e Louvain", 68. Jahr, 1972, Nr. 1, Seiten 15-23, zeigt). Richtig ist, daß nur physikalisch geklärte Flüssigkeiten oder nur physikalische Klärung die großen löslichen Moleküle nicht entfernt, sondern beschränkt ist auf die Abtrennung jener Moleküle, deren Größe die Größe übersteigt, die für das bestimmte Verfahren oder für die bestimmte angewandte Technik kritisch ist.

Die biologisch abgebauten nitrierten Substanzen durch eine Enzymklärung ergeben einen doppelten Effekt. Erstens,

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wenn das feste Protexnsubstrat hydrolysiert wird, wird die tatsächlich vorhandene Trübe eliiriniert oder verringert, die für sich die nachfolgende Filtration oder Zentrifugalwirkungen unterstützt. Zweitens, wenn auf gelöste Makromoleküle eingewirkt wird, werden sie zu kleinen Peptiden verändert. Es wird anschließend Koagulation verhindert, wodurch der Kläreffekt auf eine potentielle Trübe unterstützt wird, so daß die geklärte Flüssigkeit auch während ihrer Lagerung transparent bleibt. Diese Vorteile, die sich theoretisch erklären lassen, bestätigen sich in der Praxis.

Die Vorteile, die sich theoretisch also erklären lassen, werden in der Praxis bestätigt.Ein praktisches Beispiel z. B.: Die bierbrauende Industrie benutzt Enzymprodukte, die sich aus der Pflanzenwelt ableiten, seit langer Zeit, ja praktisch seit Beginn des Jahrhunderts, zur Klärung des Bieres. Diese Enzymprodukte sind jene, die man aus der "Carica Papaya" erhält, die im allgemeinen in Lösung reich an Papain ist, handelsübliche Konzentrate des Feigenlatex ("Ficus glabrata"), das Ficin als aktives Produkt enthält. Auch hydrolytisch wirkende Enzyme aus Pilzen und aus Gerste sind vorgeschlagen worden.

Trotz dieser Tatsache, nämlich was die Klärung trüber Flüssigkeiten anbelangt, sind die Ergebnisse mit Enzymen, die sich vom Papain ableiten, gut. Die Nachteile bei der Verwendung solcher Enzyme aus dem Bereich der Pflanzenwelt sind jedoch sehr groß. Erstens sind sie relativ instabil, weil sie in

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Form angereicherter Lösungen verwandt werden müssen. Sie lassen sich durch eine thermische Behandlung nicht sterilisieren, weil sie in Lösung vorliegen und sie sind nur innerhalb enger pH-Grenzen aktiv. Außerdem sind sie noch im allgemeinen teuer und da ihre Lieferung von den Ernten abhängt, ist das Ausmaß, in dem sie industriell verwertbar sind, von klimatischen Bedingungen abhängig oder von der geographischen Lage der Plantagen, beispielsweise bei Papain muß tropisches oder subtropisches Klima vorhanden sein und vieles mehr.

Die Erfindung will nun diese Nachteile beseitigen und schlägt vor, solche Enzymprodukte zu verwenden, die man durch industrielle Fermentation von Mikroorganismen erhält, insbesondere von "Streptomy.ces" aus dessen Medium, daß sowohl als Fermentationsmedium und als Medium zum Anreichern durch Fermentationstechniken verwendet eine Enzymfraktion im festen Zustand abgetrennt wird, die zur Klärung außerordentlich aktiv ist und eine Trübebildung verhindert in wäßrigen Proteinflüssigkeiten.

Die Erfindung besteht zweckmäßigerweise darin, die Peptidmakromoleküle, die in diesen Flüssigkeiten sich bilden, zu hydrolysieren und die der Hauptgrund von tatsächlicher oder potentieller Trübebildung sind unter Hinzuziehung eines Enzymprodukts, das sich von induzierten "Streptomyces"-Kulturen ableitet.

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Solche Enzyme, die sich von "Streptomyces" ableiten, haben außer, daß sie Produkte sind, die man im industriellen Maßstab mit verhältnismäßig geringen Kosten herstellen kann und die im Gegensatz zu den Derivaten der belebten Natur, die bei steigendem Bedarf teurer und teurer werden, den Vorteil, daß sie mit steigender Produktion billiger werden, so daß ihre Verwendung sich weiter verbreiten wird, und schließlich besitzen sie alle Vorteile, die man bei den pflanzlichen Enzymen nicht findet. Zusätzlich zu der Tatsache, daß sie ungiftig sind, sind diese Proteasen, die sich vom "Streptomyces" ableiten und die man in festem Zustand erhält, durch trockene Wärme sterilisierbar, ohne daß ein merklicher Verlust der Aktivität eintritt. Sie lassen sich auch im sterilen Zustand handhaben, weil sie sehr stabil im trockenen Zustand sind. Obgleich ihre Verwendung im trockenen Zustand den Vorteil hat, daß die zu klärende Flüssigkeit nicht verdünnt zu werden braucht, ist die Löslichkeit dieser Proteasen vorteilhaft zur Herstellung von Lösungen ausnutzbar, die stabilisiert werden können,-falls man das Enzym durch die Zugabe der Flüssigkeit zur Klärung der Flüssigkeit verwenden will.

Die zu klärenden Flüssigkeiten müssen vorzugsweise wäßrige Flüssigkeiten sein, obgleich sie nicht unbedingt nur Wasser enthalten müssen. Es ist also klar, daß die Trübe dieser Flüssigkeiten, die zu klären sind, auf die Anwesenheit von Peptiden oder Proteinen zurückgehen muß. Es ist

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ferner erforderlich, sicherzustellen, daß in der zu klärenden Flüssigkeit keine antifermentierenden Substanzen jenes Typs enthalten sein dürfen, die spezifisch auf die verwendeten Enzyme reagieren und in solchen Mengen, daß diese Enzyme denaturiert werden. Die Flüssigkeiten dürfen außerdem keinen übermäßigen Salzgehalt aufweisen, weil die Enzyme dann, wie man zu sagen pflegt, ausgesalzen v/erden, und schließlich die Wasserstoff ionenkonzentratxon darf nicht höher als pH 11- und nicht tiefer als pH 3 sein. Dadurch würde die Aktivität des Enzyms in Lösung verhindert oder die Enzyme in Lösung denaturiert werden. Außerdem, wenn die zu klärenden Flüssigkeiten außer dem Wasser organische Lösungsmittel enthalten, beispielsweise Azeton, Alkohole, Glykole und dgl., dann dürfen die Konzentrationen dieser organischen Lösungsmittel einen Wert nicht übersteigen, der die zugefügten Enzyme unlöslich machen würde, wodurch sie wiederum inaktiv oder ausfallen würden.

A. Die Herstellung des Produkts

Das proteolytische Enzym, das zur Klärung benutzt wird, wird vorzugsweise durch Impfung von "Streptomyces.fradiae" auf einer Agarplatte erhalten durch Einsäen des Impfstoffes in einen Fermentationskolben, der mit einem sterilen Nährmedium gefüllt ist, durch Rühren und steriler Belüftung und durch Einsäen des Impfstoffes, der in einem Zwischenkolben entwickelt worden ist, in einem sterilen Fermentationstank, der mit einem Nährmedium beschickt ist, das Mineralsalze, Zucker und eine ausreichende Menge stickstoffhaltiger Produkte enthält, so daß

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die Fermentation bei einem spezifischen pH-Wert und bei geregelter Temperatur in einer sterilen Belüftung stattfinden kann. Wenn die Fermentation beendet ist, wird das (Kultur-) Medium filtriert und durch Azeton ausgefällt. Das feste trockene Produkt enthält das aktive Enzym des (Kultur-) Mediums.

B. Proteolytische Aktivität

Die proteclytische Aktivität ergibt sich einfach dadurch, daß man das dem Enzym gegenüberliegende Proteinsubstrat aktiviert, das die Form von Kasein, Azokasein, Keratin, Haemoglobin usw. haben kann. Haemoglobin hat sich als ein nützliches Substrat für die quantitative Stimulation der Enzymaktivität erwiesen. Dabei wird Anson's Methode angewandt (J. Gen. Physiol. 22: 79, 1938), und gemäß der Erfindung werden die Enzymprodukte, die verwandt werden, als Klärmittel in Anson-Einheiten verwendet.

Das proteolytische Enzym hat die Form eines weißlichen Pulvers und eine Stärke von 4000 bis 10000 UA/mg. Der jeweilige Wert hängt ab von dem jeweiligen Herstellungs-Batch. Wenn das Enzym einer Elektrophorese unterworfen wird, zeigt es sich-, daß sich vier Grundbänder trennen. Wenn die Elektrophorese auf einem "noble agar gel (Difco)" in einem Veronal/Natriumveronalpuffer bei einem pH-Wert von 8,2 und mit einer Ionenstärke von 0,035 für eine Zeitspanne von 80 Minuten und einem Abstand von 10 cm zwischen den Salzbrücken mit einem Niederschlag der Probe 2 cm von der Brückenverbindung zur Anode entfernt bei einem Verbrauch von 3,5 mA/cm Gel bei einer mittleren Spannung von

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10,9 V/cm ergeben sich folgende relative Beweglichkeiten:

Fraktion Relative Beweglichkeit A 0,5

B 0,7

C 0,8

D 1,0

Allgemein ausgedrückt ist das Protein der Fraktion A jenes, das den größten Prozentsatz (35 %) enthält. Der restliche Proteingehalt teilt sich auf die anderen Fraktionen zu etwa gleichen Prozentanteilen auf.

Bei der Durchführung einer elektrophoretischen Analyse des Enzyms unter den experimentellen Bedingungen, die den beschriebenen ähnlich sind, ist es natürlich klar, daß alle Proteinfraktionen Enzymfraktionen sind, wobei Haemoglobin als aktives Substrat wieder verwendet wird. Die Digestionsspots werden durch Verfärbung der Proteinbase mit Ponceau-Rot sichtbar gemacht. Die Fraktion A besitzt die größte Enzymaktivität, dann folgt C und schließlich die Fraktionen B und D. Diese Aktivitäten sind etwa gleich untereinander.

Es kann iniler Homogenität der Fraktionen quantitative Unterschiede zwischen den Fermentationts-Batches geben, ohne Veränderungen - für die verschiedenen Enzymanteile - in den Klärwirkungen, die man in getrübten Flüssigkeiten erzielt. Dies hängt damit zusammen, daß sie wie Isoenzyme wirken und wegen der

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großen Ähnlichkeiten unter den Fraktionen. Es lassen sich auch merkliche Unterschiede in der spezifischen Wirkung feststellen. Der optimale pH-Wert zur Aktivierung der Enzymlösung und der optimale pH-Wert zur Stabilisierung der Enzymlösung liegt nahe beim neutralen pH-Wert, d. h. zwischen 6 und 8. Dies fällt zusammen mit dem optimalen Wert, der für industrielle Flüsigkeiten vorgeschrieben ist, die für menschlichen und tierischen Genuß Verwendung finden soll en.

C. Stabilität

Im trockenen Zustand sind die festen Enzyme bemerkenswert stabil auf die Einwirkungen von Wärme, und das kann bei ihrer Sterilisation ausgenutzt werden.

Die folgende Tabelle, die in der grafischen Darstellung Nr. 1 zusammengefaßt ist, zeigt die Stabilität einer festen Protease als Funktion der Zeit der Wärmeeinwirkung.

Zeit	Aktivität	% Retention der
(min.)	UA/mg	Ausgangsaktxvität
O	8.532	100
15	8.406	99
30	8.029	95
45	8.139	96
60	8.411	99
120	7.436	88
180	7.684	91
1320	6.955	82

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Die übliche Schwankung in den Werten der Kurve läßt sich durch die Grenzen der Genauigkeit des Anson-Verfahrens für die quantitative Evalution des proteolytischen Enzyms erklären, und auch das Erscheinen einer Zunahme in der Aktivität kann sich durch Abtrocknen von Feuchtigkeit und Verflüchtigung von Substanzen ergeben, wodurch eine Anreicherung an aktiver Feststoffsubstans eintritt.

Die Stabilität der Lösungnder Protease ist eine Funktion der Temperatur, bei der sie gelagert werden und auch der Anwesenheit von stabilisierenden Ionen in dem Aktivationsmedium.

Es hat sich gezeigt, daß Kalziumionen bemerkenswerte stabilisierende Wirkung haben, selbst in verhältnismäßig kleinen Konzentrationen.

In der grafischen Darstellung 2 ist die Aktivität auf der Ordinate gegen die Erwärmungszeit in Minuten auf der Abszisse aufgetragen. Die verschiedenen Temperaturen, bei denen diese Erwärmung durchgeführt wird, sind in der Kurve der Darstellung enthalten.

Eine analoge grafische Darstellung der Stabilität gegen die Zeit bei Unu geb ungstemperatur und in Abwesenheit und Anwesenheit von Kalziumionen ist in der Darstellung Nr. 3 enthalten, in der die Aktivität in UA/ml auf der Ordinate und die tatsächliche Zeitspanne in Tagen auf der Abszisse aufgetragen sind.

Die vierte grafische Darstellung zeigt die Stabilität der Proteaselösung, die unter niedrigen Temperaturen gelagert

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wird, und zwar unter Temperaturen zwischen O und 5 C für eine Zeitspanne von drei Minuten und sigt, daß über eine solche Zeitspanne die Verringerung der Aktivität in Gegenwart von Kalziumionen kleiner als 20 % der anfänglichen Aktivität ist. Zusammenfassend läßt sich hinsichtlich der Angaben in den drei vorangegangenen Abschnitten folgendes sagen:

1. Das Produkt ist für Handhabung als Lösung und gegen eine Lagerung im gelösten Zustand wie in der bierbrauenden Industrie empfindlich, wenn übliche Kühleinrichtungen zur Verfügung stehen, d. h. bei 5°C und über Zeitspannen von drei Minuten hinaus, da dann eine Verringerung der Aktivität eintritt, die größer als 20 % der anfänglichen Aktivität ist.

2. Für den Klärvorgang und zum schnellen Abbau von Proteinen kann das gelöste Produkt auch bei verschiedenen höheren Temperaturen als Zimmertemperatur verwendet werden, ohne daß für eine merkliche Zeitspanne die Aktivität der stabilisierten Lösung um mehr als 20 % zurückgeht. Bei einer Temperatur von 50 C beträgt diese Zeitspanne drei Stunden, für eine Temperatur von 60 C eine Stunde und bei einer Temperatur von 65 C etwa eine halbe Stunde, während bei einer Temperatur von 70 C diese Zeitspanne nur etwa 10 Minuten beträgt. Oberhalb von 70°C liegt die mittlere Lebenserwartung eines Enzyms in der Größenordnung von Minuten.

3. Es ist interessant,■darauf hinzuweisen, daß sich das Enzym bei Zimmertemperatur und bei einer Zeitspanne von

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mehr als 100 Tagen in Lösung mit Kalziumionen zum Schutz selbst zerstört, obgleich das Enzym eine mittlere Lebensdauer von etwa neun Tagen ohne Kalziumschutz besitzt. Wenn ein solches Enzym in der Getränkeindustrie verwendet wird, läßt sich eine ausreichende Zugabe zur Klärung eines Getränks und um es im geklärten Zustand zu erhalten während der Lagerzeit, kontrollieren. Da sich jedoch das Enzym nach seiner Klärwirkung selbst zerstört, wird der Konsument nicht mit einer Dosis aktiven Enzymprodukts belastet oder gar überlastet. Fände diese Selbstzerstörung nicht statt, könnten sich pharmakologische, rechtliche und sogar gesundheitliche Probleme bzw. Komplikationen ergeben. Die ultrastabilen Enzyme in Lösung behalten ihre nachweisbare pharmakologische und Enzymwirkung nach der Klärfunktion bei, so daß Sekundäreffekte beim Genuß der geklärten, behandelten Substanz von dem Verbraucher festgestellt werden können.

D. Toxizität

Die Toxizität des Produkts ist toxikologisch aus zwei Gesichtspunkten heraus auf die akute Toxizität bei oraler Verabreichung und auf die chronische Toxizität ebenfalls bei oraler Verabreichung hin studiert worden.

Akute Toxizitätsversuche sind an Mäusen durchgeführt worden unter Verwendung von Enzymprodukten sehr verschiedener Fermentations-Batches. Die Versuche wurden vom Gesichtspunkt

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der Mortalität, der Erkrankungsfälle und der Wachstumskurve her untersucht und durchgeführt. Die Dosis, die der Testdiät zugefügt wurde, lag in der Größenordnung von 1 000 000 UA/kg verabreichten Futters. In allen Fällen wurde ein ausgezeichneter Gesundheitszustand beobachtet. Die Versuche dauerten 10 bis 30 Tage in der Gruppe der getesteten Mäuse. Dabei ergab sich eine Verbesserung der Wachstumskurve, relativ zur simultanen Vergleichsgruppe, es gab keine Sterbefälle in irgendeinem der aufgezeichneten Tests. Die Versuche zur chronischen Toxizität wurden an neugeborenen Küken durchgeführt, die mit einem Futter gefüttert wurden, dem ein Enzym aus dem 'Streptomyces fradiae" zugesetzt war. Diese Versuche wurden beendet, nachdem die Küken 9 bis 10 Wochen alt geworden waren. In allen Fällen war der Gesundheitszustand der mit Enzymen gefütterten Küken gleichgut, wenn nicht besser als der der Vergleichsküken, die dasselbe Futter, jedoch kein Enzym gefüttert bekommen hatten. Das Fehlen der Toxizität bei den proteolytischen Enzymen von "Streptomyces" gestattet die Verwendung in der Medizin, und gegenwärtig werden sie in pharmazeutischen Präparaten verwendet in Verbindung mit Antibiotika zur Verbesserung der Sorption derselben.

Beschreibung des Verfahrens

Es ist weder durchfürbar noch praktikabel wegen der großen Anzahl von möglichen Variationen in dem generischen

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Problem der Klärung von trüben Flüssigkeiten, die relevanten Faktoren zu berücksichtigen einschließlich der Ursache der Trübung, dem Grad der Trübung, die Möglichkeiten der Modifizierung des pH-Werts der zu behandelnden Flüssigkeit, der Stabilität hinsichtlich Erwärmung der Flüssigkeit, die Zeitdauer der Lagerung einer Flüssigkeit nach ihrer Klärung, die innere Zusammensetzung der geklärten Flüssigkeit usw., so daß man detaillierte und gleichmäßige BehandlungsInstruktionen genereller Art geben könnte. Solche Instruktionen oder Anweisungen zur Klärung trüber Flüssigkeiten müssen den spezifischen Bedingungen, die sich durch die zu klärende Flüssigkeit in jedem Augenblick in der Praxis ergeben, entsprechen. Alle diese Veränderungen haben jedoch im Detail Abweichungen von den allgemeinen essentiellen Normen zur Folge, denen das Verfahren gemäß der Erfindung unterworfen wird und was nachfolgend beschrieben werden wird:

Die Zugabe des Enzymprodukts aus der Fermentation von "Streptomyces" zu der zu klärenden Flüssigkeit kann einmal oder mehrere Male erfolgen. Die mehrfache Zugabe eines Enzymprodukts ist besonders dann nützlich, wenn große stickstoffhaltige Moleküle behandelt werden müssen bei verhältnismäßig hohen Temperaturen. Das Enzymprodukt kann in fester Form zugesetzt werden, es kann in Wasser oder in einer wäßrigen Lösung gelöst werden, mit oder ohne Kalziumionen, oder es kann auch in einem Teil der zu klärenden Flüssigkeit selbst gelöst sein. Die Flüssigkeit, auf die das Enzym einwirken soll, sollte vor-

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zugsweise keine Säure sein, d. h. der pH-Wert sollte nicht niedriger als 3 sein, sie sollte auch nicht zu alkalisch sein, d. h. der pH-Wert sollte nicht größer als 10 sein. Diese gleichen pH-Wert-Grenzen sollten auch in dem Lösungsmittel aufrechterhalten werden, in dem das Enzym gelöst ist.

Die Konzentration des Enzyms hängt innerhalb weiter Grenzen von der Eigenart des Enzyms von dem stickstoffhaltigen Substrat ab, das zu hydrolysieren ist. Im allgemeinen jedoch wird die Enzymaktivität zwischen 200 000 und 20 000 000 ÜA/hl der Lösung, die zu klären ist, liegen.

Die trübe Flüssigkeit, der die Enzymkomponente zugesetzt wird, kann gelagert oder filtriert und dann gelagert werden, wobei daran zu denken ist, daß bei niedrigen Temperaturen (0 bis 5 C) die klärende Wirkung langsamer vor sich geht, die mittlere Lebenszeit des Enzyms, durch das die Klärung durchgeführt wird, aber verlängert ist. Bei Zimmertemperatur (etwa 18 bis 25 C) ist die Wirkung (AktivitätX schneller, aber der Abfall ist stärker oder größer, so daß in der Praxis das gleiche Klärergebnis erreicht wird wie in kalten Lösungen, obgleich der Klärvorgang sich in einer kürzeren Zeit abspielt. Wenn die Temperatur auf etwa 55 bis 60°C erhöht wird, wird der Klärvorgang beträchtlich verkürzt wie auch die mittlere Lebenserwartung des Enzyms. Es ist möglich (durch Überwachung der mittleren Lebensdauer des Enzyms in getrennten Versuchen, wobei man die Aktivität durch die quantitative analytische Methode nach Anson feststellt), den Augenblick vorauszusagen,

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zu dem es notwendig ist, falls es gewünscht wird, die Enzymaktivität bei mittleren Temperaturen fortzuführen, weitere Enzymgaben zuzusetzen, damit ein ausreichender Pegel einer aktiven Konzentration an Enzym aufrechterhalten wird.

Falls zu irgendeinem Zeitpunkt die Enzymwirkung gestoppt wird oder die restliche Enzymaktivität zerstört werden soll, genügt es, die Lagerungszeit der geklärten Flüssigkeit entsprechend der Stabilitätskurve, auf die oben hingewiesen worden ist, auszudehnen, die geklärte Flüssigkeit einige Minuten auf eine Temperatur oberhalb 90 C zu erwärmen, den pH-Wert der geklärten Lösung über 10 hinaus zu erhöhen oder den pH-Wert unter 3 zu senken. Der ursprüngliche pH-Wert läßt sich dann sehr leicht und schnell wieder einstellen.

Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung des klärenden Effekts von "Streptomyces fradiae"-Protease auf Resttrübung in wäßrigen Lösungen von gefilterter handelsüblicher Gelatine

Angewandte Technik:

Die Trübe wird durch die Dispersion im monochromatischen Licht, das durch die Feststoffteilchen in der Dispersion dispergiert wird (Tyndall-Effekt), in der Proteinlösung bestimmt.

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Das dispergierte Licht wird unter einem Winkel von 90 zum einfallenden Licht abgelesen, und der aufgezeichnete Wert des dispergierten Lichts wird bei der gleichen Wellenlänge wie der des einfallenden Lichts geprüft. Die Intensität des dispergierten Lichts ist direkt proportional der Menge der Partikel, die die Trübe in der Flüssigkeit, die untersucht wird, verursachen.

Zwei Gelatinelösungen handelsüblicher Qualität mit Silber wurden mit ein und derselben Konzentration hergestellt und auch nach ein und demselben Verfahren, was unten beschrieben ist. Eine Enzymlösung wurde in der angegebenen Weise hergestellt und wurde einem Teil dieser Gelatinelösung zugesetzt.

In allen Fällen wurde die Intensität des einfallenden Lihts so adjustiert auf einen geeigneten Wert, daß eine Ablesung unter den angegebenen experimentellen Bedingungen ermöglicht wurde, wenn monochromatisches Licht auf die trübste Lösung der Serie fiel. Ohne Modifizierung der Irtensität des einfallenden Lichts wurde die Intensität des dispergierten Lichts für jede Gelatinelösung aufgezeichnet, der eine Lösung aus aktivierter Protease zugesetzt worden war. Eine Lösung aktiver Protease wurde dem anderen Teil der anderen Lösung zugesetzt und wurde uiter den angegebenen Bedingungen bebrütet. Dies wurde ausgeführt mit dem Zweck, eine Bezugsprobe für jede getrübte Lösung, die derselben Konzentration und denselben Bedingungen wie die untersuchten Lösungen ausge-

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setzt waren zu haben, natürlich mit der Ausnahme der Enzymaktivität, die in den Versuchslösungen vorhanden ist und abweichend von den Vergleichslösungen.

Die Intensität des dispergierten Lichts ist ein Anzeichen für die Konzentration der Feststoffe im dispergierten Zustand, d. h. für die Trübe.

Die Wellenlänge, die ausgewählt wurde für die Tests, entspricht der Wellenlänge, bei der die Intensität des dispergierten Lichts am größten ist.

Experimentelle Methode

Die Herstellung einer Gelatinelösung in Boratpuffer pH = 8,2, Konz. = 0,05 M

75 g einer handelsüblichen Silbergelatine werden abgewogen und zu etwa 700 bis 800 cm" eines Boratpuffers (pH = 8,2, Konz. = 0,05 M) gegeben, die auf 70 bis 80° erwärmt worden ist. Die Lösung wird geschüttelt und die Temperatur so lange aufrechterhalten, bis die Gelatine vollständig gelöst ist. Die heiße Lösung wird filtriert bei etwa 50 bis 60°C durch Papier im Vakuum, so daß die größeren Teilchen entfernt werden. Nach der Filtration wird das Volumen mit dem Boratpuffer auf einen Liter aufgefüllt.

Herstellung der Lösung einer aktiven Protease im Boratpuffer

3 g einer "Streptomyces" '-Protease mit einer Aktivität 509847/0390

von 11,626 UA/mg (etwa 35 Millionen UA insgesamt) werden gelöst unter mechanischem Schütteln in etwa 150 ml Boratpuffer (pH = 8,2; Konz. = 0,05 M). Die Lösung wirdßber Supercel filtriert und nach der Filtration auf 200 ml mit diese^m Puffer aufgefüllt. Als Stabilisator werden dann 250mg wasserfreien Kalziumchlorids und 50 ml Propylenglykol zugefügt. Die auf diese Weise hergestellte Lösung besaß eine Aktivität von etwa 100 000 UA/ml.

Die Herstellung der deaktivierten Proteaselösung

125 ml der oben erwähnten Lösung der aktiven Protease werden 10 Minuten gekocht, wodurch das Enzym deaktiviert wird. Nach diesen 10 Minuten läßt man die Lösung abkühlen auf Zimmertemperatur und füllt sie dann mit dem Boratpuffer auf das anfängliche Volumen von 125 ml wieder auf. Die so behandelte Lösung ist ohne Enzymaktivität.

Die Herstellung einer Gelatinelösung mit deaktivierter Protease
(Vergleichslösung)

50 ml der aktivierten Proteaselösung werden zu 200 ml der Gelatinelösung gegeben.

Herstellung der Gelatinelösung mit aktiver Protease (Testlösung)

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50 ml der aktiven Proteaselösung (100 000 ÜA/ml) werden zu 200 ml Gelatinelösung gegeben. Die sich dadurch ergebende Testlösung hatte eine Aktivität von 20 000 UA/ml.

Inkubation

Sobald die Tests und die Vergleichslösungen hergerichtet sind, werden sie in einen Trockenofen bei 135 C gegeben und dort 24 Stunden lang gehalten.

Nach diesen 24 Stunden werden die Lösungen aus dem Ofen herausgenommen und die überstehende Flüssigkeit wird von beiden Lösungen abgenommen und die jeweilige Trübe dieser Lösungen gemessen. Man kann durch Betrachtung mit dem nackten Auge feststellen, daß die Vergleichslösung wolkig ist, wogegen die Testlösung klar und transparent ist.

Feststellung der Trübe durch Difraktion

Unter Verwendung eines ZEISS RPQ-20-Spektrofotometers zusammen mit dem Spektralfluorometrxezusatz derselben Firma wurde hier gearbeitet. Die verwendete Lichtquelle war eine Xenonlampe mit stabilisierter Stromzuführung, die Ablesung erfolgte bei einem konstanten Strom von 2,5 A mit gekühltem Vorfilter und Auswahl des einfallenden monochromatischen Lichts erfolgte durch einen Doppeleffekt Monochromator (ZEISS MM 12). Die Apparatur arbeitete mit einer Öffnung von 1,4 mm und einer Wellenlänge von 462 μ.

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Der Arbeitsbehälter bestand aus Quarz, seine Abmessungen betrugen 2 χ 2 cm mit einer transparenten Basis (Ablesungen unter 90°), und das aufzeichnende Spektrofotometer wurde für Intensitätsmessungen justiert. Das dispergierte Licht wurde mit derselben Wellenlänge, nämlich m, aufgezeichnet und unter Verwendung einer Öffnung von 1,4 mm.

In allen Fällen wurdendie oben angegebenen Bedingungen unverändert aufrechterhalten und auch die Verstärkung des gebeugten Lichts und die 0 bis 100 und Maximal-Intensität justiert Eg wurde gefunden, daß unter experimentellen Bedingungen.das klare destillierte Wasser einen Intensitätsverlust von weniger als 2 % ergibt, was einer Trübe von 0 entsprach, und daß die allertrübste wolkigste Lösung die Intensitätsablesung, wie angegeben, auf einen Wert einjustierte, der dicht bei 100 lag.

Experimentelle Ergebnisse

Es wurden Bestimmungen an vier Gruppen von Lösungen, Vergleich und Test, durchgeführt, die man an verschiedenen Tagen nahm. Von jeder Vergleichs- und Testlösung wurden acht Trübebestimmungen gemacht, und der Mittelwert einer jeden Gruppe als auch die Grenzen der Zuverlässigkeit für einen Wert von 95 % der Wahrscheinlichkeit in der normalen statistischen Dispersionskurve sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:

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Vergleichslösungen ABCD

Anzahl der Fälle 8 8 8 8 Vm-t DS 104 101 96

Vm 102 96 93 96

Vm-t DS 100 91 90 91

Veränderlichkeit s index

Testlösungen ABCD 8 8 8 8

30 41 25 20 28 39 24 19 26 37 23 18

3 % 6% 3%

5%

6%

7% 5%

4%

Es ist zu erkennen, daß es keine großen und bedeutenden Differenzen zwischen den Mittelwerten der vier Serien eines jeden Beispiels (Vergleich und Test) gibt einer jeden statistischen Gruppe. Dies deutet darauf hin, daß das Verfahren sehr gut reproduzierbar ist. Man kann folglich die vier Serien der acht Ablesungen zu einem einzigen Mittelwert für jede Serie zusammenfassen, was in der nachfolgenden Tabelle geschehen ist:

	Vergleichslösungen	Testlösungen
Anzahl der Fälle	32	32
Vm-t DS	99	31
Vm	97	28
Vm-t DS	95	25
Veränderlich keit s index	2%	26%

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Analyse der Ergebnisse

Wie.aus den vorangegangenen Tabellen sich ergibt, ist die Intensität des dispergierten Lichts aufgrund der Trübe verringert. Unter den beschriebenen experimentellen Bedingungen zur Behandlung und zur Bestimmung durch das enzymatische Klärverfahren erhält man keine perfekte Klärung, was auf die Porengröße zurückzuführen ist. In allen Fällen ist das Verfahren langsam und mühselig.

Ein Grund für diese Langsamkeit ist die relativ hohe Viskosität dieser Lösung bei Zimmertemperatur.

Verwendet man "Streptomyces"-Proteaselosungen in den Gelatinelösungen, erhält man eine beträchtliche Verringerung in der Viskosität des Mediums, und dies insbesondere beim Filtrieren bewirkt eine erhebliche Kürzung der Filtrationszeit, selbst bei gewöhnlichem oder langsamem Filtrierpapier, so daß man eine schnellere und perfektere Trennung erreicht, wenn man die Feststoffe von der Flüssigkeit durch Filtration trennt durch die Verwendung von Filtrierpapier, dessen Poren kleiner sind.

Verfahren

Das Verfahren, welches verwendet wurde, bestand in der Bestimmung der Viskositäten und der Filtrationszeiten mit herkömmlichem Gerät von Lösungen von Gelatine, wobei einem

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Teil dieser Lösungen eine aktive Lösung von "Streptomyces"-Protease zugefügt wurde (Testlösung) , während dem anderen Teil die gleiche Menge einer thermisch deaktivierten "Streptomyces"-Protease zugefügt worden war (Vergleichslösung).

Experimentelles Verfahren
Testlösung:

Die Testlösung ist eine Gelatinelösung mit "Streptomyces"-Protease, die mit dem des Beispiels 1 identisch ist.

Vergleichslösung:

Die Vergleichslösung ist eine Gelatinelösung mit deaktivierter "Streptomyces"-Protease identisch der des Beispiels 1.

Inkubation

Es wurde ein Ofen verwendet, dessen Temperatur 37 betrug und bei einer Zeit von 24 Stunden wie im Beispiel 1. Nach der vorgeschiebenen Inkubationszeit wurden beide Lösungen, Vergleichs- und Testlösung, entnommen, durch Schütteln homogenisiert, worauf Viskosität und Filtrationsgeschwindigkeit bestimmt wurden.

Bestimmung der Viskosität

Die Bestimmungen wurden mit einem Cannon-Fenske-Viskosimeter mit doppelter Pegelbildung durchgeführt, wobei in allen

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Fällen dasselbe Flüssigkeitsvolumen zugeführt wurde. Die Konstante K des Viskosimeter war 0,014009 bei 15,56°C, 0,0139900 bei 37,78⁰C und 0,013975 bei 54,44°C. Alle diese Werte von K sind in cSK/sec. angegeben.

In das reine Viskosimeter, welches in einen Thermostaten bei 20 C eingesetzt war, wurde das Volumen der zu prüfenden Flüssigkeit hineigegeben. Die Anordnung wurde so lange in dem Bad gehalten, bis sich Wärmegleichgewicht eingestellt hatte. Es wurde für jede Bestimmung die Entleerungszeit zwischen den Marken durchgeführt, wobei die Zeit mit einer Stoppuhr festgehalten wurde, an der man 1/5 Sekunden ablesen konnte. Eine entsprechende Bestimmung mit destilliertem Wasser unter identischen Bedingungen wurde ebenfalls vorgenommen. Jede Zeitbestimmung wurde für zwei aufeinanderfolgende Ablesungen gemacht, wobei die Arbeitsbedingungen identisch waren.

Resultate

Die EntXeerungszeiten, die proportional der kinemati schen Viskosität sind und damit in einer direkten Beziehung zur Filtrationszeit einer jeden Probe stehen, sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:

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Entleerungszeit (sec.)

	Vergleich	Test	Dest. Wasser
Anzahl der Fälle	6	6	6
Vm-t DS	469	106	76,6
Vm	358	105	74,8
Vm-t DS	247	104	74,0
Veränderlichkeits index	29,6%	0,8%	1%

In der folgenden Tabelle sind auch die abgeleiteten Werte der kinetischen Viskosität enthalten, die man durch Multiplizierung der Entleerungszeit einer jeden Lösung mit der Konstanten des Viskosimeters bei 20 C (die Daten wurden interpoliert) erhält.

Kinetische Viskosität bei 20°C (in cSK) K = 0,014006

	Vergleich	Test	Dest. Wasser
Anzahl der Fälle	6	6	6
Vm-t DS	6,568814	1,484636	1,0588536
Vm	5,014148	1,470630	1,0476488
Vm-t DS	3,459482	1,456624	1,0364440
Veränderlichkeits index	29.57%	0.85%	1%

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Analyse der Ergebnisse

Es ergibt sich eine große Variation in der kinetischen Viskosität der Gelatinelösungen der Vergleichsversuche mit einem mittleren Wert von 5,014 und einem Veränderlichkeitsindex von 30 %.

Die Gelatinelösung der Testbeispiele, denen aktive "Streptomyces"-Protease zugesetzt ist, homogenisiert beträchtlich im Hinblick auf die kinetische Viskosität, wodurch der Mittelwert auf 1,471 (Veränderlichkeitsindex 0,85%) verringert wird. Dies stellt eine Verringerung in der Viskosität von 70,7 % dar. Die Viskosität der Substanz, die in der erfindungsgemäßen Weise behandelt worden ist, bleibt sehr dicht bei der Viskosität von destilliertem Wasser (Vm = 1,048; Veränderlichkeitsindex = 1 %). Die behandelten Substanzen geben Vm= 1,471 im Gegensatz zu dem mittleren Wert, Wasser = 1,048. Die Vergleichsproben ohne Behandlung ergeben Vm = 5,014 im Gegensatz zu Vm, Wasser = 1,048.

Filtration

Gleichzeitig und mit denselben Lösungen, mit denen die Vxskositätsbestimmung durchgeführt wurde, wurde eine Bestimmung der Filtrationszeit unter Standardbedingungen durch ein Filterpapier vorgenommen, die von dem ersten Herstellungs-Batch stammen. Die Zeit, die erforderlich war, 10 cm aufzu-

509847/0390

fangen, wurde notiert, und zwar nachdem die ersten 5 "cm hindurchgelaufen waren nach der Tappi-Methode mit Chargen von 20 ml der zu filtrierenden Flüssigkeit.

Apparatur

Es wurden drei konische Trichter mit einem Durchmesser von 55 mm und einer Höhe von 45 mm verwendet, die einen Schaft von 53 mm besaßen, der einen Durchlaß von 4 mm hatte und an seinem Ende schräg abgeschnitten war. Diese Trichter wurden in 25 ml-Reagenzgläser gesteckt, und jeder Trichter enthielt ein Filter von Schleicher-Schüll Nr. 589 und 10 cm Durchmesser ohne Faltung mit Ausnahme einer einzigen Falte, die erforderlich ist, um der Papierschicht eine trichterförmige Gestalt zu geben. Diese Faltung zeigte nach innen und lag gegen die Wand des Kegels an.

Bei Zimmertemperatur und einzeln wurde die Zeit aufgezeichnet, die erforderlich ist, 5 bis 15 cm des Filtrats aufzufangen. Es wurden wenigstens sechs Prüfungen der Filtrationszeit einer jeden Lösung durchgeführt, und die nachfolgende Tabelle gibt die Resultate in Form der Mittelwerte einer jeden Gruppe wieder, ebenso die Grenzen der Zuverlässigkeit mit einer Gewißheit von 95 % der Wahrscheinlichkeit in der statistischen Kurve normaler Dispersion.

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Vergleich Test Pest. Wasser

A B CA B CABC

6	7	6	6	9
480	560	149	135	127
403	437	127	119	117
325	314	105	103	107
18%	30%	17%	13%	11%

Anzahl der

Fälle 6 8 9 6

Vm-tDS 1,506 1,445 1,527 510

Vm 1,271 1,234 1,288 432

Vm-tDS 1,037 1,023 1,049 354

100 DS/Vm 17% 20% 24% 17%

Wie zu sehen ist, gibt es keine merklichen Differenzen in statistxscher Hinsicht zwischen den Mittelwerten der drei Serien eines jeden Beispiels,nämlich Vergleich, Test und destilliertem Wasser, was auf eine gute Reproduzierbarkeit des Verfahrens hinweist und eine Homogenität in den Poren des Papiers, so daß jede der drei Serien von wenigstens sechs Ablesungen in einer Tabelle der Mittelwerte wie folgt zusammengefaßt werden kann:

Vergleich

Anzahl der Fälle 23 Vm-tDs 1377

Vm 1265

Vm-tDS 1153

100 DS/Vm 20,51%

Test	Dest. Wasser
19	21
471	128
425	121
379	113
22,53%	13,30%

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Analyse der Ergebnisse

Die Enzymbehandlung verringert merklich die Filtrationsgechwindigkeit von 1265 see. der Lösung ohne Enzymbehandlung (Vergleichslösung) auf 425 see. der Lösung, die erfindungsgemäß behandelt ist (Testlösung). Das bedeutet, die Zeit wird um etwa 66,4 % verringert, verglichen mit den Filtrationszeiten im Verhältnis zu den Filtrationszeiten von Wasser unter den gleichen Bedingungen. Es zeigt sich, daß die Filtrationszeit der Vergleichslösung = 10,45 mal der Filtrationszeit von destilliertem Wasser unter den gleichen Bedingungen entspricht, während die Filtrationszeit der Testlösung = 3,51 mal der Filtrationszeit von destilliertem Wasser unter diesen Bedingungen ist.

Daraus ergibt sich klar, daß die Behandlung wirkungsvoll ist und die Filtrationszeit einer langsamen Proteinfiltration in der Nähe der Filtrationszeit reinen destillierten Wassers unter identischen experimentellen Bedingungen gebracht hat.

Beispiel 3

Klärung einer viskosen Flüssigkeit mit trübendem Protein durch die Wirkung von "Streptomyces. Fradiae"-Protease angewandter Technik

Eine viskose Lösung von Gelatine in einem Boratpuffer wurde hergerichtet und in gleiche Anteile unterteilt. Jedem aliquoten Teil wurde eine genau abgewogene und feste Menge

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eines festen Proteintrübstoffes zugesetzt, der in der viskosen Lösung löslich war.

Ein konstantes Volumen von "Streptomyces"-Proteaselösung mit einer variablen Aktivität pro ml wurde jeder wolkigen oder trüben Mischung zugesetzt. Die verschiedenen Suspensionen, die zu reinigen waren, wurden bebrütet und schließlich in ein Zentrifugenrohr gegeben, dessen Basis ein Zylinder ist mit einem geringeren Durchmesser als der Einfüllteil, der auch ein Zylinder ist und ein Volumen von 1 ml aufweist. Der kleine äußere Zylinder ist in Einheiten von 0,02 ml geeicht und logischerweise sein Ende halbkugelig verschlossen.

Alle Testlösungen, die in diesen Rohren enthalten sind, werden gleichartig zentrifugiert.

Nach dem Zentrifugieren hatte sich die Trübe bewirkende Substanz in dem kleinen graduierten Zylinder abgesetzt, wobei man an der Graduierung das Volumen des festen Rückstandes ablesen konnte und das in jedem Falle die Trübe anzeigte.

Experimentelles Verfahren

Die Herstellung einer Gelatinelösung in Boratpuffer pH= 8,2, Konz. = 0,5 M

75 g einer handelsüblichen Silbergelatine werden in 1 1 eines Boratpuffers, pH = 8,2, Konz. = 0,05 M, in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise gelöst.

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Herstellung der Lösung der aktiven "Streptomyces Fradiae"-Protease im Boratpuffer

0/6 g einer "Streptomyces Fradiae"-Protease mit einer

Aktivität von 11,626 UA/mg (etwa 7 Millionen UA in toto) wer-

den unter mechanischem Schütteln in etwa 150 cm eines Boratpuffers mit dem pH-Wert von 8,2 und der Konz. von 0,05 M gelöst. Die Lösung wurde über Supercel filtriert, und nach der Filtration wurde das Volumen auf 200 cm in demselben Puffer erhöht und 250 mg wasserfreien Kalziumchlorids zugesetzt sowie 50 ml Propylenglykol als Stabilisatoren. Die Lösung, die auf diese Weise hergestellt wurde, hatte eine Aktivität von etwa 20,000 UA/ml.

Die Herstellung der Lösung deaktivierter "Streptomyces Fradiae"-Protease

Vergleichslösung

125 ml der anfänglich aktiven Proteaselösung wurden 10 Minuten gekocht, wodurch das Enzym deaktiviert wurde. Nach 10 Minuten ließ man die Lösung auf Zimmertemperatur abkühlen und ergänzte auf das anfängliche Volumen von 125 ml mit Boratpuffer. Diese Lösung besaß keine Ensymaktivität.

Die Herstellung der Gelatinelösung mit Kasein als Trübemittel und steigenden Mengen von aktiver ProteaseJcsung

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Genau 2 g Kasein wurden abgewogen und in jeweils einen 600 cm -Kolben gegeben. Jedem dieser Kolben wurden 40 cm Gelatinelösung zugefügt. Durchschütteln wurde anfänglich eine Paste hergestellt, die die Bildung einer homogenen Suspension unterstützte.

Dann wurden dieser Serie von Suspensionen 0, 2, 4, 6, 8 und 10 ml aktiver "Streptomyces"-Protease zugefügt und 10, 8, 6, 4, 2 und 0 ml deaktivierter "Streptomyces"-Protease, mit dem Ergebnis, daß das endgültige Volumen 50 ml in allen Kolben der Serie betrug und etwa 0, 40 000, 80 000, 120 000, 160 und 200 000 UA/Kolben enthielt. Dann wurde eine sorgfältige Homogenisierung vorgenommen und in einem Ofen die Lösungen bebrütet.

Inkubation

Erfolgte in einem Ofen bei 37°C 24 Stunden lang wie im Beispiel 1. Nach diesen 24 Stunden wurden die Kolben herausgenommen und zentrifugiert.
/

Zentrifugierung

Dafür wurden 6 Zentrifugenrohre verwandt, deren Basis zylindrisch war und von 0,02 bis 100 ml graduiert war. Diese hatten einen geringeren Durchmesser als das Mundstück, das auch zylindrische Form besaß. Die Abmessungen des oberen Zylinders betrugen: Innerer Durchmesser = 14 mm, Höhe = 52 mm.

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Die Abmessungen des unteren Zylinders betrugen: Innerer Durchmesser = 2,6 mm, Höhe = 50 mm.

5 ml einer jeden -Suspension wurden in ein Zentrifugenglas gegeben, nachdem diese sorgfältig homogenisiert war und die gesamte Serie wurde gleichzeitig bei 8000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Volumen des Sediments abgelesen auf der Skala, und zwar bei jeder Proteasekonzentration. Dieser Vorgang wurde sechs mal wiederhit, so daß man eine statistische Serie erhielt.

Die Mittelwerte, die Grenzen der Zuverlässigkeit und der Veränderlichkeitsindex sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:

ÜA/Kolben	UA/ml	Vm-tDS	Vm	Vm-tDS	100	DS/Vm
0	0	o.61	0,57	0,53	6	,5 %
40.000	800	0,23	0.19	0.15	19	,7 %
80.000	1.600	0.10	0.09	0.08	11	,0 %
120.000	2.400	0.09	0.08	0.07	20	.0 %
160.000	3.200	0.06	0.06	0.06	0	.0 %
200.000	4.000	0.04	0.03	0.02	31	.0 %

Analyse der Ergebnisse

In den Tests, in welchen die Menge des Trübebildners (Kasein) niedriger als 2g/ aliquotem Teil war, war die von dem Enzym durchgeführte Klärung total ohne irgendwelchen

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merklichen Niederschlag auf dem Boden des Zentrifugenrohres.

Ein umgekehrtes Verhältnis stellt man fest zwischen der Resttrübe und der Konzentration von "Streptomyces"-Protease, d. h. es findet eine kontinuierliche Verringerung in dem feststellbaren Sediment statt mit zunehmender Aktivität.

Durch Änderung der Konzentration von UA/ml der zugefügten "Streptomyces Fradiae"-Protease ist es möglich, von einer totalen Klärung auf eine partielle Klärung entsprechend den besonderen Anforderungen überzugehen.

(Für alle vorangegangenen Beispiele 1, 2 und 3 bezieht sich der Wert "t" auf Student's t für eine Wahrscheinlichkeit von 95 % und befindet sich in Übereinstimmung mit η (der Anzahl der Daten in dem arithmetischen Mittel)).

Beispiel 4

15 g von "Streptomyces Fradiae"-Protease in trockenem Zustand und mit einer einheitlichen Stärke von 11,000 UA/mg wurden bei Zimmertemperatur gelöst und dabei eine Stunde geschüttelt und sodann 4 g trockenes Kalziumchlorid in einem Puffer zugegeben.

Nach dem Schütteln wurde die Enzymlösung filtriert, und zwar durch ein gewöhnliches Papierfilter, das mit einer Schicht gewaschener, getrockneter Diatomeenerde, die etwa

war, 5 mm hoch/beschichtet war.

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Nach dem Filtrieren wurde der Kuchen, der im Vakuum getrocknet worden war, zweimal mit 100 ml der Pufferlösung gewaschen. Nach jedem Waschen wurde der Kuchen sorgfältig ablaufen gelassen und die gesammelten Waschflüssigkeiten mit der Mutterlauge vereinigt. Das gesammelte durchsichtige Filtrat wurde homogenisiert und dazu 100 ml Propylenglykol gegeben, wobei der pH-Wert auf einen Wert von 6 durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung eingestellt wurde.

Die proteolytische Aktivität der Enzymlösung wurde nach Anson's Verfahren (J. Gen Physiol. 22: 79, 1938) bestimmt, und aus den erhaltenen analytischen Daten war es möglich, die Menge des Puffers abzulesen, die erforderlich war, die Enzymstärke der filtrierten Enzymlösung auf 250,000 ÜA/ml einzustellen.

Zur Klärung von Bier wurde diese Lösung verwendet, wobei 3 ml/hl dem zu klärenden Bier zugesetzt wurden. Man folgte damit dem amerikanischen Verfahren nach der ersten Filtration und folglich nach der ersten Fermentation. Das Bier wurde 6 Wochen in dem Ausgangstank gelagert, in den die Enzymlösung gegeben wurde.

Nachdem die aktive Phase beendet war, fand die zweite Filtration statt, woraufhin das klare Bier pasteurisiert und kondensiert wurde. Das Bier ging dann in die Flaschenfüllstation und wurde für die endgültige Lagerung abgefahren. Die Transparenzergebnisse des ,gelagerten Biers bei Zimmertempe-

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ratur und mit einem thermischen Schock sind in Tabelle 1 aufgeführt. In dieser Tabelle sind auch die Versuchsergebnisse enthalten, die parallel dazu mit zwei handelsüblichen Enzympräparaten erhalten wurden in konzentrierten Pflanzensäften.

Es ist zu erkennen, daß die Klärergebnisse, die in den durchgeführten Vergleichsversuchen erzielt wurden, ausgesprochen günstig für die Verwendung von Proteasen sind, die sich vom "Streptpmyces Fradiae" ableiten und das sowohl für die absolute anfängliche Brillianz als auch für die Aufrechterhaltung einer klaren Lösung, verglichen mit den Ergebnissen, die man erhält aus dem ersten Herstellungs-Batch, geeignet ist. Die Klärung wurde mit handelsüblichen Produkten durchgeführt, welche gewerbliche Verwertung in der bierbrauenden Industrie finden.

Die Tabelle Nr. 2 faßt die relative Zunahme in der Trübe des zu klärenden Bieres zusammen bei der Verwendung der handelsüblichen Produkte, wie es z. Z. der Fall ist, verglichen mit Bieren, die nach der erfindungsgemäßen Methode geklärt sind.

Es ist deutlich zu erkennen, daß die letzte Trübefiltration von Bier bei jenen Bieren, die mit einer Protease des "Streptomyces" behandelt wurden, um 18 - 5 % niedriger liegt als die bei denselben Bieren, die mit einer Protease vegetabilen Ursprungs behandelt wurden, und daß die Trübe,

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die sich während der Lagerung entwickelt und die bei Zimmertemperatur wesentliche schneller entsteht in jenen Bieren, die mit vegetabilen Proteasen behandelt wurden, und zwar um bis zu 71 %, und zwar bis zu einer Trübe , die 71 % größer ist. Ähnlich gute Ergebnisse erhält man bei thermischen Schocks.

Die Vorteile des erfindungsgemaßen Verfahrens sind in den nachfolgenden Punkten zusammengefaßt:

1. Verwendung eines Produkts ohne spezifische. Toxizität, wenn es oral in den verabreichten Dosen verabreicht wird, so daß das Produkt zur Klärung von Getränken für den menschlichen Genuß anwendbar ist.

2. Die Möglichkeit, Klärung herbeizuführen durch Filtration oder Zentrifugation wolkiger Flüssigkeiten einschließlich Flüssigkeiten, deren Trübe nicht durch Protein gebildet ist, wenn stickstoffhaltige Makromoleküle, was die Ursache für hohe Viskosität oder Dichte der wolkigen Flüssigkeit ist und Abbau durch Hydrolyse, herbeigeführt durch Enzyme zu kleineren Molekülen bei gleichzeitiger Verringerung der Dichte oder der Viskosität.

3. Ein Schutz, durch den eine Trübebildung in der geklärten Flüssigkeit bei der Lagerung verhindert wird.

4. Die spezifische Wirkung von "Streptomyces"-Enzymen im Hinblick auf das Proteinsubstrat macht das Verfahren beson-

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ders brauchbar für wolkige Lösungen, in denen der Trübebildner Peptidnatur hat und in denen keine Peptidnaturen vorhanden sind, die in den zu klärenden Flüssigkeiten erhalten werden müssen, da das Enzym gleichzeitig sowohl auf die Peptidstrukturen als auch auf den Trübebildner einwirken kann. Außer dieser Ausnahme jedoch läßt das Enzym alle anderen Strukturen (mit Ausnahme der Carbamide) unbeeinflußt, beispielsweise Zucker, die Farbäboffe, die künstlichen Süßstoffe, synthetische Dickmacher, aromatische Ester und dgl. Mit anderen Worten, es kann gesagt werden, daß im Gegensatz zur rein chemischen Behandlung keine wesentliche Veränderung in der Komposition der zu klärenden Flüssigkeit eintritt, wenigstens insoweit es die große Mehrzahl der Bestandteile der Flüssigkeit anbetrifft.

5. Im Falle von Flüssigkeiten, die zu klären sind und die im wesentlichen von Proteinnatur/und gelegentlich oder durch Zufall getrübt sind, ist die mögliche Zersetzung der wesentlichsten Proteine durch die durchgeführte Klärung aufgrund dieses Verfahrens kein großer Nachteil, weil der Abbau zur Bildung von assimilablen Produkten führt, die, weil sie leichter absorbierbar sind, gleichwertige oder gar eine größere Nährqualität besitzen. Aus diesem Grund kann dieses Verfahren auch für nährende Getränke einschließlich solcher auf Proteinbasis sehr empfohlen werden.

6. Als Konsequenz seiner spezifischen Wirkung führt das Verfahren im allgemeinen zur Bildung klarer Produkte ohne

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Änderung des Geschmacks, des Geruchs, des Aromas der Flüssigkeit vor und nach der Behandlung. Dieser Punkt ist statistisch bewiesen worden unter Verwendung spezieller geschmacksbeseitigender Mittel im Falle von Bieren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren geklärt worden sind.

7. Die vergleichsweise Labilität oder Instabilität der "Streptomyces"-Enzymlösungen macht es möglich, durch die Verwendung einfacher Techniken, beispielsweise durch einfache Lagerung, die Restenzymaktivität vollständig zu beseitigen.

-41-

509047/03

Tabelle

ο co co

Versuchs	Versuchs	Trübeindex	Prot. von Strept.	Prot. von Vege- tabilien - 1 -	Prot. von Vege- tabilien - 2 -	Prot. von Vege- tabilien -Vm-
bedingungen	dauer (Tage)	*O,36	0,44	0,41	0,425
	O (anfängl. Brillianz)	0,36	0,46	0,49	0,475
Lagerdauer	15	0,33	0,45	0,47	0,46
bei Zimmer	30	0,28	0,49	0,47	0,48
temperatur	60	0,37	0,50	0,53	0,515
	15	2,7	8,6 %	8,0 %	0,3 %
		0,37	0,52	0,56	0,54
	30	12 %	15 %	19 %	17 %
		0,31	0,52	0,54	0,53
	60	10 %	6 %	14 %	10 %
		0,37 0,72	0,52 1,13	0,54 1,33	ΓΟ 0,53 Öl CD 1,23 °° CX)
Thermal Shock von 60°C bis OC	Zimmer tempera tur O⁰C	94 %	117 %	146 %	131,5 % <°

cn ο co

c»

*-■

te

Tabelle 2

% von Trübe von Bieren, geklärt mit "Streptomyces"-Protease (Standard = 100 %), verglichen mit vegetabilen Proteasen in gewerblicher Verwendung für verschiedene Lagerperioden bei Zimmertemperatur und bei thermischen Schocks von 0 bis 60 C

Testbedingungen	Testdauer	"Streptomyces"-	Protease von	I Protease von Protease von
	(Tagen)	Protease	Vegetabilien 1	Vegetabilien 2 · Vegetabilien Vm
		Trübe =	Trübe =	Trübe = ; Trübe =
	anfans = 0	100 %	122,2 %	113,9 % ' 118,1 %
Z immertemperatur	15	100 %	131,5%-3,7%	l39,7%-3,6% ' l35,6%-3,7% j
	30	100 %	138,5%-2,1%	1A6,9%-A,5% ^! Ι42,7%ί3,3%
	60	100 %	17l,4%-3,6%	l7l,O%-3,2% ' 171,2%-O,2%
Thermal-Shock	Z immer-	100 %	140,5 %	145,9 % ; 143,2 %
	temperatur
	0°C	100 %	156,9 %	184,7 % : 170,8 %
		100 %	124,5 %	155,3 % ! 139,9 % 1

to I

ro cn

Ul

CD OO OD CD

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Klären von Flüssigkeiten und zur Verhinderung der Trübebildung eines Enzymprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Enzym aus einer indizierten Fermentation von

"Streptomyces"-Kulturen ableitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur eine "Streptomyces Fradiae"-Kultur ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzymprodukt der "Streptomyces"-Kultur einer wäßrigen Flüssigkeit zusetzt und es eine bestimmte Zeitspanne damit zusammenläßt bei einer bestimmten Temperatur, die ausreicht, dLe tatsächliche oder potentielle Trübe der Flüssigkeiten zu klären.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur im Bereiche von 0 bis 85°C liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur Zimmertemperatur ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in aufeinanderfolgenden Anteilen der zu klärenden Flüssigkeit zugesetzt wird.

WR/Si -44-

509847/Ö33Ö

7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in Verbindung mit Filtration, Dekantation oder Sedimentation der Flüssigkeiten angewandt wird.

9 847/0 3

HS .

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