NO751534L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for klaring av væsker.

Oppfinnelsen angår anvendelse av en spesiell enzym-prosess for klaring av uklare væsker eller væske som kan bli uklar under lagring.

Betydningen av at oppløsninger er klare er generelt velkjent, mer spesielt når det gjelder drikker. Man er også velkjent med ulempene ved klaring av slike oppløsninger bare på basis av fysikalske metoder (filtrering, sentrifugering, etc), særlig når det finnes koagulerbare proteiner i oppløsningene, og spesielt hvis disse har svært varierende molekylvekter idet filtrering i disse tilfelle blir meget vanskelig og sentrifugering ofte utilstrekkelig. Begge metoder er meget nyttige når det gjelder drikker med et høyt innhold av tørrekstrakt hvilket øker drikkenes egenvekt og viskositet, idet egenvekt og viskositet er to av faktorene som har innvirkning på strømningsutbyttet ved filtrering og den klassifisering som oppnås under filtreringen.

Det hender videre ikke sjelden at væsker som klares ved rent fysikalske metoder igjen blir uklare eller blakke ved henstand eller lagring, hvilket lett forklares ved: økning i størrelsen av de dispergerte småpartikler som har relativt stor størrelse og hvis molekylærstruktur (f.eks. proteiner) har mange punkter hvor bindinger kan dannes; ved ekte utfelling; ved resterende Van der Waals-bindinger; og fremfor alt på grunn av hydro-genbinainger. Dette kan forklare den høye uklarhet som dannes i oppløsninger av polyfenoler og tanniner (som J. de Clerck klart viser i "Bulletin de 1<*>Association Royale des Anciens Btudiants en Braserie de l<r>Universite de Louvain", 68. år, 1972, nrl 1, side 15-23). Saken er at en rent fysikalsk klaring ikke fjerner de store, oppløselige molekyler, men er begrenset til separasjon av slike molekyler som har en størrelse som overstiger den kritiske størrelsen for den metode eller teknikk som benyttes.

Bionedbrytning eller biodegradering av nitrogenholdige stoffer ved enzym-klaring gir derimot en dobbeltvirkning, nemlig: 1. Kår det faste proteinsubstrat hydrolyseres fjernes eller redu-seres uklarheten som derved også letter den følgende filtrering eller sentrifugering. 2. Ved innvirkning på oppløste makromolekyler og nedbrytning av disse til små peptider hlnarer enzymmetoden en etterfølgende koa-gulering og har således en klarende virkning i langtidsperspektiv idet man oppnår at man klarede væsken forblir klar og transparent under iagring.

Disse fordeler som kan forklares teoretisk på denne måten, bekreftes i praksis. I det praktiske eksempel som utgjør øldrikkings-industrien har enzymprodukter avledet fra planteriket vært brukt lenge, nesten fra århundrets begynnelse, for klaring av øl. Disse enzymprodukter åom for tiden brukes er: produkter fra "Carica Papaya", generelt i oppløsninger som er rike på papain; tekniske konsentrater av fikentre-latex ("Ficus glabrata"), som inneholder ficin som aktivt produkt. Man har også forelått hydro-lyserende enzymer utvunnet fra sopp og bygg.

Til tross for det faktum at - når det gjelder klaring av uklare væsker - resultatene som kan oppnås med enzymer avledet av papain er gode, er de ulemper som medfølger bruken av slike enzymer av vegetabilsk opprinnelse meget store. For det første er de relativt ustabile på grunn av at de må benyttes i anrikede oppløsninger, de kan ikke steriliseres ved temperaturbehandling idet de foreligger i oppløsning og de er bare aktive innenfor meget snevre pH-grenser. I tillegg er de vanligvis kostbare og forrådet avhenger av innhøsting som igjen krever egnede klimatiske forhold (som når det gjelder papain f.eks. vil si tropsik eller subtropisk klima), etc.

Oppfinnelsen har til hensikt å eliminere disse ulemper og i henhold til oppfinnelsen benyttes enzymprodukter som fremstilles ved industriell fermentering av mikroorganismer, mer spesielt Streptomyces-arter, fra hvilket medium - som benyttes båae som fermenteringsmedium og som anriket medium ved fermentering - opparbeides i fast tilstana en enzymfraksjon som er høy-aktiv for klaring og hindring av blakkingstendenser i vandige proteinholdige væsker.

Således består en side av oppfinnelsen i å hydrolysere peptia-makromolekyler som dannes i disse væsker og som er hoved-grunnen til en umiddelbar eller potensiell uklarhet, ved hjelp av et enzymprodukt avledet fra en Streptomyces-kultur.

Slike enzymer avledefe fra Streptomyces-kul-fcur er i tillegg til at de er produkter som fremstilles i industrielle måle-stokk og relativt billig og som - i motsetning til hva som gjelder for produkter fra plante-innhøstinger, som blir kostbarere ved Øket etterspørsel, blir billigere med Øket produksjon, hvoved anvenaelsen blir mer utbredt, har alle de fordeler som de vege-tabilske enzymer mangler. I tillegg til at de er ugiftige kan disse proteaser som avledes fra Streptomyces-arter og som kan fåes i fast form, steriliseres tørt uten vesentlige aktivitetstap. De kan også behandles i steril tilstand på grunn av deres store stabi-litet i tørr form. Selv om bruken i tørr tilstand har den fordelen at det ikke er nødvendig å fortynne væsken som skal klares, er det mulig på grunn av proteasenes oppløselighet å fremstille oppløs-ninger som kan stabiliseres hvis man vil bruke enzymet for tilsetning til en væske som skal klares.

Væsken som skal klares må fortrinnsvis være vandig selv om den ikke behøver å inneholde vann som eneste væske. Det må også være klart at uklarheten i disse væsker som skal klares, skyldes innhold av peptider eller proteiner. Man må også forsikre seg om at det ikke 1 den væsken som skal klares finnes ferment-hindrende forbindelser av en type som er spesifikk overfor de enzymer som benyttes og i mengder som vil denaturere enzymene, videre at det ikke foreligger noen høy salt-konsentrasjon som vil forårsake utsalting av enzymblanding som tilsettes den uklare væske og endelig at det ikke foreligger en for høy hydrogen-ion-konsentrasjon (pH større enn 11) eller så lav (pH mindre enn 3) at pH vil hindre aktivering av enzymene i oppåøsning eller nedbyrte enzymene i oppløsning. Når de uklare væskene i tillegg til vann inneholder organiske oppløsningsmidler (aceton, alkoholer, gly-koler etc), må konsentrasjonen av disse organiske oppløsnings-midler ikke være så stor at den vil gjøre de tilsatte enzymer uoppløselige og således gjøre dem uaktive eller utfelle dem.

De\jroteolytiske enzymer som benyttes som klaringsmidler, fremstilles fortrinnsvis ved inokulering av Streptolyces fradiae på en agar-plate, dyrking av inokulatet i fermenterings- kolber påfylt sterilt næringsmedium, under røring og steril gjennomlufting og fermentering av innholdet i mellom-kolbene i sterile fermenteringstanker som inneholder næringsmedium be-ståene e av mineralsalter, sukker og tilstrekkelig nitrogen-forbindelser til å gi fermentering ved en spesiell pH-verdi og unaer kontrollert temperatur og steril gjennomlufting. Kår for-gjæringen er avsluttet, filtreres kulturmediet og utfelles i aceton og det faste tørre produktet inneholder da mediets enzymaktivitet.

Den proteolytiske aktivitet fremstår klart ved aktivering av enzymene overfor proteinsubstrater som kan være kaffein, azokasein, keratin, hemoglobin etc. Hemoglobin har vist seg å være et egnet grunnlag for kvantitativ stimulering av enzymaktiviteten, ved hjelp av Anson<*>s metode (J.Gen. Physiol. 22,

79j 1938)»og i henhold til oppfinnelsen beskrives enzymproduk-tene som klaringsmidler uttrykt i Anson-enheter.

Det prolteolytiske enzym fåes i form av et hvitaktig pulver med styrke 4000 til 10.000 UA/mg (UA =» units of Activity aktivitetsenheter), hvorved den spesielle styrken vil avhenge av forholdene under fremstillingen. Når enzymet er underkastet elektroforese, finner man fire hoved-bånd som skiller seg ut,

og når elektroforesen utføres på edelagar-gel (Difco) i veronal/ natrium-veronal-puffer vea pH 8,2 og ionestyrke = 0,035, i om~trent 80 min., ved et mellomrom på 10 cm mellom saltbroene, og avsetning av prøven 2 cm fra saltbroen forbundet med anoden, ved en strømstyrke på 3>5 tnA/cm gel ved en miadelsspenning =10,9 volt/ cm, får man relative mobiliteter som i følgende tabell:

Generelt utgjør proteinet i fraksjon A den største prosent (35$)°g resten av proteininnholdet fordeler seg på de andre fraksjoner i omtrent like mengder.

Ved utførelse av en elektroforese-analyse av enzymet under eksperimentelle betingelser som beskrevet, er det klart at alle proteinfraksjonene er enzymfraksjoner, idet hemoglobin også brukes som aktivt substrat, og fordøyelsespunktene påvises vea farging av proteinbasen med Ponceau-rødt, og det viser seg at fraksjon A har den største enzymaktivitet fulgt av fraksjon C og deretter fraksjon B og D, hvor sistnevnte har omtrent like aktivitet sverdier .

Det kan foreligge kvantitative forskjeller mellom fer-menterings -sat sene innbyrdes uten forandring - for de forskjellige enzym-proporsjoner - i klaringsresultatene som oppnås i de uklare væsker, dette på grunn av at enzymene opptrer som isoenzymer, med stor likhet mellom fraksjonene. Man kan videre iaktta betydelige forskjellige spesificiteter.

Den optimale pH-verdi for aktivering av enzymoppløs-ningen og den optimale pH-verdi for stabilisering av enzymoppløs-ningen er i nærheten av nøytral pH, nemlig 6 til 8, hvilket faller sammen med den optimale verdi som ønskes for industrielle væsker som benyttes i drikker både for mennesker og dyr.

I tørr tilstand er de faste enzymer bemerkelsesverdig stabile mot temperaturpåvirkning, og dette kan utnyttes ved steri-liseringen .

I følgende tabell som gj<e>nfinnes grafisk som fig. 1, viser stabiliteten ved 100°C for en fast protease som funksjon av oppvarmingstiden.

Svingningen i kurven kan forklares ved den begrensede nøyaktighet til Anson-metoaen for kvantitativ bedømmelse av proteolytiske enzymer og en øking i aktiviteten kan også skyldes en manglende tørring og utdrivning av flyktige stoffer med føl-gende anrikning av det aktive tørre stoff.

Stabiliteten for oppløsninger av proteasen er en funksjon av lagringstemperaturen og nærvær av stabilisator-ioner

i aktiveringsmediet.

Kalsiumioner viser seg å ha en betraktelig stabili-serende virkning selv i relativt små konsentrasjoner*

Fig. 2 viser rest-aktiviteten langs ordinaten oppsatt mot oppvarmingstiden målt i min. langs abscissen, hvor tempera-turene som er brukt i hvert tilfelle er påført de aktuelle kurver.

En lignende kurve stabilisert/tid ved romtemperatur

og med og uten nærvær av kalsiumion er oppført på fig. 3»bvor aktiviteten er oppsatt i UA/ml langs ordinaten og virketiden i dager langs abscissen.

Fig. 4 viser stabiliteten for protease-oppløsning lagret under avkjøling (temperatur 0 til 5°C) i en periode på omkring 3 måneder, og viser klart at over et tidsrom av denne størrelsesorden er defiktiveringen i nærvær av kalsiumioner minure enn 20% av den opprinnelige aktivitet.

Som en oppsummering av det utførte arbeide, og sammen-ligning mellom stabilitetsverdiene som finnes ut fra de siste tre kurver, får man følgende; 1. Produktet kan behandles som en oppløsning og lagres i oppløst tilstand under industrielle forhold som f.eks. i ølarik-kingsindustrien som har vanlige kjøleanlegg (ved 5°C°S over tre måneder er aktivitetstapet under 20% av startaktiviteten). 2. For klaringsprosesser og hurtig proteinnedbrtftning kan det oppløste produktet benyttes ved forskjellige temperaturer over romtemperatur uten at aktiviteten for den stabiliserte oppløsning synker mer enn jca. 20%. Ved ca. 55°C vil den maksi-male periode være 3 timer, ved 60°C 1 time og ved 65°C ca. l/2 time, mens maksimalperioden ved 70°C vil være cå. 10 minutter. Over 70°G er midlere levetid for enzymet av størrelsesorden min. 3- Det er interessant å merke seg at enzymet er selvnedbrytende ved romtemperatur etter en periode på over 100 dager i oppløsning med kalsium-beskyttelse, mens enzymet har en midlere levetid på omkring 9 dager uten kalsiumbeskyttelse. Når enzymet benyttes til fremstilling av trykkevarer, kan man således tilsette en egnet mengde for klaring av drikken og for å hindre senere uklarhet under lagring. Ved at enzymet er selvnedbrytende etter at klaringsfunksjonen er oppfylt vil brukeren imidlertid ikke over-doseres med aktive enzymprodukter som man ellers kunne løpe risiko for hvis denne selvnedbrytning ikke fant sted. Hvis denne selv nedbrytning ikke fant sted kunne aet inntre farmakologiske, legale og til og med helse-komplikasjoner. De meget stabile enzymer i oppløsning opprettholder den påviselige farmakologiske og enzymatiske virkning etter at klaringsfunksjonen er oppfylt, slik at sekundrævirkninger kan merkes av brukeren ved inntak av den klarede drikken.

Produktets toksisitet er undersøkt toksikologisk fra to standpunkter med hensyn på akutt toksisitet, oralt, og kronisk toksisitet, også oralt.

Forsøk med hensyn på akutt toksisitet er utført på mus med enzymprodukter fra meget forskjellige fermenteringssatser, idet man har iakttatt mortalitet, sykdommer og vekstforløp. Dosen som ble blandet med forsøksdietten var omkring 1.000.000 UA/kg fdr. I alle tilfelle iakttok man en perfekt helsetilstand (for-søkets varighet fra 10 til 3° dager) på den gruppen mus som ble undersøkt og hvis f6r inneholdt proteasene, med en forbedret vekstkurve i forhold til kontrollgruppen. Man fikk ingendøds-fall i noen av forsøkene.

Undersøkelsene med hensyn på kronisk toksisitet ble utført på nyfødte kyllinger som ble f6ret med f6r tilsatt enzymer avledet fra Streptomyces fradiae og forsøkene ble oppgitt når kyllingene var 9 til 10 uker gamle. I alle tilfelle var helse-tilstanden for kyllingene som mottok enzyrafoYet bedre eller like god som for kontrollkyllinger som fikk samme fdr uten enzym-tilsetning.

Fravær av toksisitet fra proteolytiske enzymer fra Streptomyces gjør at enzymene kan brukes medisinsk og de benyttes for tiden i farmasøytiske preparater kombinert med antibiotika for å lette deres absorpsjon.

Det er ikke hensiktsmessig å gi detaljerte instruksjoner for klaring av uklare væsker generelt på grunn av de mange mulige variasjoner som foreligger, idet relevante faktorer som må tas i betraktning er uklarhetens årsak, uklarhetsgraden, muligheten til forandring av pH-verdien for væsken som skal behandles, væskens temperaturstabilitet, væskens lagringsperiode som må påregnes

etter klaring, væskens sammensetning etc. Imidlertid vil alle aisse variasjoner være variasjoner fra bestemte normer som bør følges ved en slik utførelse av oppfinnelsen og disse kan sammen-fattes slik: Tidspunktet for tilsetning av enzymproduktet avledet fra Streptomyces-fermentering til væsken som skal klares kan velges blant flere mulige tidspunkter. Videre kan fermentet tilsettes flere ganger. Tilsetning av enzymproduktet flere ganger vil være særlig gunstig når store nitrogenerte molekyler må be-handles ved relativt høye temperaturer. Enzymproduktet kan tilsettes i fast form, oppløst i vann eller i vandig oppløsning, med eller uten tilsetning av kalsiumion, eller oppløst i en del av væsken som skal klares (klaringsvæsken).

Klaringsvæsken som enzymene skal virke på bør fortrinnsvis ha en slik aciditet (surhetsgrad) at pH-verdien ikke ligger lavere enh3 eller høyere enn 10. De samme pH-grenser bør holdes for de væsker som enzymproduktet er oppløst i.

Konsentrasjonen av enzymproduktet som tilsettes vil avhenge, innen meget hæde grenser, av enzymets spesifisitet overfor det nitrogensubstrat som skal hydrolyseres, men generelt vil enzymaktiviteten ligge mellom 200.000 og 20.000.000 Uft/Hl av væske som skal klares.

Den uklare væske som enzymkomponentene er tilsatt til kan lagres eller filtreres ved følgende lagring idet man må være klar over at ved lavere tempeaturer (0 til 5°C)»vil klaringsvirkningen være langsommere, mens enzymets midlere levetid er lengere. Ved romtemperatur (18 til 25°C) er aktiviteten større og nedbrytningshastigheten likeledes større slik at man i praksis får samme klaringsresultat som i kalde oppløsninger, men i løpet av kortere tid. Mr temperaturen øker til ca. 55 til 60°C for kortest klaringstiden vesentlig, det samme gjelder enzymets midlere levetid. Det er mulig (ved å finne midlere levetid for enzymet ved separate forsøk, idet aktiviteten følges ved den kvantitative analytiske metode beskrevet av Anson) og forutsi det øyeblikk man må tilsette mer enzym for å holde et tilstrekkelig nivå av aktiv enzymkonsentrasjon, om man ønsker å opprett-holde enzymvirkningen ved en moderat høy temperatur.

Hvis man på noe tidspunkt vil stanse enzymvirkningen eller ødelegge gjenværende aktivitet (når dette anses nødvendig), er det tilstrekkelig å forlenge lagringstiden for den klare væsken i henhold til de stabilitetskurver som er nevnt og som følger denne beskrivelsen, og oppvarme den klare oppløsningen noen min. til en temperatur over ca. 90°C, og øke den klare oppløsningens pH-verdi over 10 eller senke pH-verdi til under 3 (den opprinnelige pH- verdi kan gjenopprettes hurtig).

Oppfinnelsen skal illustreres ved hjelp av de følgenae spesielle eksempler.

Eksempel 1.

Bestemmelse av klaringsvirkningen for proteaser fra Streptomyces fradiae på rest-uklarhet i vandige oppløsninger av filtrert teknisk gelatin.

Teknikk;

Uklarheten måles ved dispersjon av monokromatisk lys gjennom ae dispergerte partikler (Tyndall-effekten) i protein-oppløsningen.

Det dispergerte lyset avleses i en vinkel på 90° til

aet innfallende lys og det oppførte tall for dispergert lys finnes for samme bølgelengde som for innfallende lys. Intensiteten for dispergert lys er direkte proporsjonalt mei mengden partikler som forårsaker uklarhet i væsken.

Fremgangsmåte:

To vanlige gelatinoppløsninger av teknisk kvalitet fremstilt i samme konsentrasjon og ut fra samme metode som beskrevet senere, tilsettes enzymoppløsninger fremstilt på samme måten.

I alle tilfelle ble det innfallende lysets intensitet regulert til et egnet nivå for at man kunne gjennomføre avlesninger innenfor de eksperimentelle betingelser, idet monokromatisk lys ble sendt inn på den mest uklare oppløsning i seriene (kontrolloppløsningen). Uten forandring av innfallende lys-intensitet ble intensiteten for det dispergerte lys avlest for hver oppløsning av gelatin tilsatt deaktivert protease (se fremstillings-metoden), og oppløsning av aktiv protease var tilsatt den andre aelen av oppløsningen og inkubert under angitte forhold. Dette ble gjennomført for å oppnå en referanseprøve for hver uklare oppløs-ning som ble bragt til samme konsentrasjon og gjennomgikk samme betingelser som forsøksoppløsningen som skulle undersøkes, natur-ligvis med unntak av enzymaktivitet.

Intensiteten for dispergert lys janga konsentrasjonen av faste stoffer i dispergert tilstand, dvs. uklarheten eller turbiditeten.

Den valgte bølgelengde er den bølgelengde hvor intensiteten for dispergert lys er størst.

Eksperimentell metode:

Fremstilling av gelatinoppløsning i borat-puffer, pH 8,2, konsentrasjon =. 0,05M. 75 g<n>Sølv"-gelatin veies opp og tilsettes ca. fOO-800 ml boratpuffer (pH =8,2, konsentrasjon ■» 0,05M) som på forhånd er oppvarmet til 7° til 80°C. Oppløsningen rystes, temperaturen opprettholdes inntil gelatinen er fullstendig oppløst. Den varme oppløsning filtreres (ved 50 til 60°C) på papir og i vakuum for å fjerne de større partikler og etter avsluttet filtrering oppfylles volumet til 1 liter med boratpuffer.

Fremstilling av en oppløsning av aktiv protease i borat-puffer.

3 S Streptomyces-protease med aktivitet = 11.626

ti A/mg (ca. 35 mill. UA totalt) oppløses under mekanisk rysting i ca. 150 ml boratpuffer (pH <= 8,2, konsentrasjon «= 0,05 M). Oppløsningen filtreres på "Supercel" og etter avsluttet filtrering oppfylles volumet til 200 ml til samme puffer og 25G mg vannfri kalsiumklorid og 50 ^ propylenglykol tilsettes som stabilisator.

Oppløsningen fremstilt på denne måten har en aktivitet på ca. 100.000 UA/ml.

Fremstilling av deaktivert protease-oppløsning.

125 ml av nevnte oppløsning av aktiv protease kokes i 10 min. for deaktivering av enzymet. Etter 10 min. lar man opp-løsningen avkjøles til romtemperatur og den oppfylles med borat-puffer til utgangsvolum (125 ml).

En oppløsning behandlet på denne måten er uten enzymaktivitet.

Fremstilling av en gelatinoppløsning med deaktivert protease.

(Kontrolloppløsning).

50 ml deaktivert proteaseoppløsning tilsettes til

200 ml gelatinoppløsning. Fremstilling av en gelatinoppløsning med aktiv protease (Forsøksoppløsning)• 50 ml aktiv proteaseoppløsning (100.000 UA/ml) settes til 200 ml gelatinoppløsning og forsøksoppløsningen får en aktivitet 20.000 UA/ml.

Inkubering.

Etterat forsøks- og kontrollopplysningene er fremstilt anbringes de i en tørkeovn ved 35°C og holdes der i 24 timer.

Etter 24 timer tas oppløsningene ut og den overflytende væske tappes av fra begge oppløsninger for å måle deres respektive uklarhetsgrader (turbiditet). Man ser med det blotte øye at væsken som utgjør kontrollopplusningen er uklar og blakket, mens forsøksoppløsningen er klar og gjennomsiktig.

Bestemmelse av uklarheten ved diffraksjonsmålinger.

Man benyttet et Zeiss RPQ-20 spektrofotometer sammen

med spektral-fluorometri-hjelpemidler levert av samme firma. Lyskilden var en xenonlampe med stabilisert strømtilførsel og man tok avlesninger ved konstant amperestyrke = 2,5 A med avkjølt for-filter og seleksjon av innfallende monokromatisk lys med en dobbelt-virkende monokromator (Zeiss MM 12). Utstyret arbeidet med en blenderåpning på 1,4 mm og bølgelenger = 462 myu.

Beholderen besto av kvarts, dimensjoner 1 x 1 cm,

med en transparent basis (avlesninger 9O<0>) til innfallsvinkelen og avlesningsspektro-fotometeret ble justert for intensisitets-målinger hvor det dispergerte lyset ble avlest under samme bølge-lengde, nemlig 462 nyu og med åpning = 1,4 mm.

Under alle forsøk ble disse betingelser opprettholdt uforandret og likeledes forsterkningen av det spretite lyset, samt innstillingene av 0 til 100 og maksimal intensitet. Man fant at under de eksperimentelle forhold hadde rent destillert vann en intensitet på under 2$ (svarende til en uklarhet (turbiditet)

0), og den mest uklare oppløsning svarte til en intensitetsavles-ning som nevnt på nær opptil 100.

Eksperimentelle resultater:

Man foretok forsøk med fire grupper av oppløsninger, kontroll- og forsøksoppløsninger, fremstilt påforskjellige dager. Åtte turbiditetsavlesninger ble avlest fra hver kon-trollprøve og forsøksoppløsning og middelverdien for hver gruppe og videre pålitelighetsgrenser for et tall på 95$ sannsynlighet i den normale statistiske kurve, finnes i følgende tabell.

Som man vil se finnes ingen store og betydelige forskjeller mellom middelverdiene for 4 serier av hver prøve (kon-trollprøve og forsøks-oppløsning) innen hver statistisk gruppe, hvilket angir god reproduktivitet for metoden. Følgelig kan 4 serier av 8 avlesninger oppsummeres i en enkelt middelverdi for hver serie, hvilket gir følgende tabell:

Analyse av resultatene.

Som man vil forstå av ovenstående tabeller, blir intensiteten av det brudte (dispergerte) lys som skyldes uklarhet redusert under de resterende eksperimentelle forhold, ved enzymklaringsprosessen ifølge oppfinnelsen, fra ca. 97 1. 2 (dvs. tett opp til verdien 100) og ned til 28 + 3. Man har således oppnådd en klaring på minst 70%.

Eksempel 2.

Klaring ved filtrering av en gelatinoppløsning med streptomyces protease som filtrerings-akselerator.

Teknikk:

Relativt konsentrerte oppløsninger av gelatin kan klares ved filtrering med spesielle filtrerpapirer med store porer. Selv om disse eliminerer større suspenderte partikler gir de ikke perfekt klaring, på grunn av den store porestørrelsen. I alle tilfelle er filtreringen langsom og vanskelig.

En gruån til den langsomme filtreringshastighet er den relativt høye viskositet for disse oppløsninger ved romtemperatur.

Ved å bruke Streptomyces protease-oppløsninger som tilsettes gelatinoppløsningene ovenfor, fåe en tydelig reduksjon av mediets viskositet og dette fører til betraktelig innkortet filtréringstid og en hurtigere og bedre separasjon (selv med

vanlig eller langsom filtrerende papir), på grunn av at man kan benytte filterpapir med mindre porer.

Metode:

Metoden består i å finne viskositeten og filtreringstiden i standardutstyr for gelatinoppløsninger hvorav en del av oppløsningen er tilsatt en aktiv oppløsning av Streptomyces protease (forsøksoppløsningen) og den andre delen samme mengde av termiskdeaktivert Streptomyces protease (kontrolloppløsning). Eksperimentmetode: Forsøksoppløsning: Gelatinoppløsning med Streptomyces protease identisk med oppløsningen ifølge eksempel 1. Kontrolloppløsning: Oppløsning av gelatin inneholdende deaktivert Streptomyces protease, identisk med oppløsningen ifølge eksempel 1.

Inkubering.

Inkubering i ovn ved yj°G i 24 timer som i eksempel 1.

Hår den angitte inkuberingstid var over ble begge oppløsninger tatt ut fra ovnen (dvs. kontrolloppløsningen og forsøksoppløsningen) og homogenisert ved rysting før man bestemte viskositeten og filtreringshastigheten.

Visko sit et småling:

Målingen av viskositeten ble utført i et Cannon-Fenske viskosimeter med dobbelt nivåavlesning, påfylt i alle tilfelle samme mengde væske. Konstanten K for viskosioteteret «= 0,014009 for 15,56°C - 60°F, 0,0139900 for 37,78°C - 100°F, 0,013975 for 54,44°C 130°F, (alle K-verdiene er i cSK/sek.).

Til det rene viskosimeter anbragt i et termostatbad ved 20°C satte man forsøksoppløsningen i bestemt mengde, idet oppløsningen ble holdt i baaet inntil temperaturlikevekt var nådd.

Man målte utstrømningstiden mellom to merker og denne tiden ble målt med stoppeklokke med avlesning ned til 1/5 sek., sammenlignet med en måling for destillert vann under identiske forhold.

Man foretok to avlesninger under identiske forhold. Resultater.

Utstrømningstidene, proporsjonalt med den kinematiske viskositet og således i uirekte forhold til filtrerings hastigheten for hver oppløsning, finnes i følgende tabell:

Utstrømningstider (sekunder)

og i den følgende tabell som også omfatter de utregnede verdier for kinematisk viskositet utregnet ved å multiplisere utstrømnings-tiden for hver oppløsning med viskosimeterkonstanten ved 20°C (interpolerte tall).

Kinetisk viskositet ved 20°C (i cSK)

K - 0,014006

Analyse av aesultatene:

Man finner store variasjoner i kinematisk viskositet for gelatinoppløsnihger i form av kontrollprøver (middelverdi = 5,014, variabilitetsindeks = 30%).

Gelatinoppløsningene for forsøkseksemplene (med tilsetning av aktiv Streptomyces protease) var betraktelig mer homogene med hensyn på kinematisk viskositet, som reduserer middelverdien til 1,471 (variasjonsindeks = 0,85%), som representerer en reduksjon i viskositet = 7^,7%»og viskositeten for den behandlede blanding ved metoden ifølge oppfinnelsen lå tett opptil viskositeten for destillert vann (Vm = 1,048, variasjonsindeks =»■ 1%).

(Behandlede oppløsninger ved Vm ■» 1,471»middelverdi for vann 1,048. Kontrollprøver uten behandling, Vm = 5,014, Versus vann, Vm = 1,048).

Filtrering.

Samtidig og med samme oppløsninger som ble brukt for måling av viskositeten gjennomførte man målinger for filtreringstiden under stanaard betingelser, gjennom filterpapir, idet man målte tiden for oppsamling av 10 ml etter at de første 5 ml hadde rent gjennom, i henhold til Tappis metode med påfyllinger 20 ml filtreringsvæske.

Utstyr.

Tre filtertrakter med diameter 55 mm og høyde lik

45 mm, filterstamme lik 53 w®°S indre rørdiameter på filter-stammen lik 4 *nm> avsluttet med skråkutt, ble anbragt i et 25 ml reagens-glass og i hver trakt plaserte man et papirfilter

Schleicher-Schull nr. 589^, diameter 10 cm, uten bretting med unntak av en enkelt brett som var nødvendig for å gi papirskiven nøyaktig samme form som trakten, idet denne fold ble bøyet over på seg selv og lå an mot traktkonusens vegg.

Man foretok ved romtemperatur en avlesning av den tiden som gikk for oppsamling av 5 cm filtrat og opptil 15 cm filtrat. Minst 6 forsøk ble gjort for filtreringstiden for hver oppløsning og den følgenae tabell gjengir miaéelverdien for hver gruppe og pålitelighetsgrensene for en sannsynlighet på 95% i den statistiske fordelingskurve.

Som man vil se får man ingen signifikante forskjeller statistisk, mellom middelverdien for tre serier av hver prøve (forsøksblanding, kontrollvæske og destillert vann) innen hver gruppe, hvilket angir god reproduserbarhet for metoden og homo-genitet for papirets porer, hvilket gjør det berettiget å opp- summere de tre serier av minimalt seks avlesninger som en enkelt middelverdi, i henhold til følgende tabell:

Konklusjoner*

Enzymbehandlingen reéuserer filtreringsbehandlingen vesentlig, fra 1265 sekunder for oppløsningen som ikke er behandlet med enzym (kontrolloppløsningen) til 425 sek. for oppløsning behandlet i henhold til oppfinnelsen (forsøksoppløsningen). Således gir metoden en reduksjon på 66,4% og ved å sammenligne filtreringstiden i forhold til filtreringstiden for vann under samme forhold vil man se at: filtreringstiden for kontrolloppløs-ningen =* 10,45 ganger f iltreringstiden for vann under samme forhold, filtreringstiden for forsøksoppløsning => 3»5^ ganger filtreringstiden for destillert vann under samme forhold.

Dette viser med all tydelighet at behandlingen har vært effektiv og bragt filtreringstiden ned til i nærheten av filtreringstiden for rent destillert vann under identiske forsøksbe-tingelser.

Eksempel

Klaring av en viskøs væske inneholdende blakkende protein, ved innvirkning av Streptomyces fradiae protease.

Anvendt metode:

En viskøs oppløsning av gelatin med boratpuffer og

delt i like delers

Til hver del satte man en nøyaktig utveiet og bestemt mengde blaknings-protein som var uoppløseig i den viskøse oppløs-ning.

Et konstant volum oppløsning av Streptomyces protease med variabel aktivitet pr. ml ble tilsatt til hver uklar blanding. De forskjellige suspensjoner som skulle klares ble inkubert og deretter påfylt et sentrifugerør som består av en sylinder med mindre diameter enn inngangspartiet som også er sylindrisk, med volumkapasitet 1 ml hvor den lille yttersylinderen er gradert i enheter = 0,02 ml og endepartiet er lukket med halvkuleform. Alle forsøksoppløsninger som ble 8åfylt prøverørene (identiske) sentrifugeres samtidig.

Etter sentrifugering viste det seg at blakningsfor-bindelsen var sedimentert ut i den lille graderte bunnsylinder og ved avlesning av det tilsynelatende volum av fast gjenværende blakningsforbindelse finner man graden av uklarhet (turbiditet) Eor ethvert tilfelle.

Eksperimentell metoae

Fremstilling av gelatinoppløslng i boratpuffer (pH =»■ 8,2, konsentrasjon 0,05M). 75 g sølv-gelatin ble oppløst i 1 liter boratpuffer (pH 8,2, konsentrasjon ** 0,05 M) på samme måten som i eksempel 1.

Fremstillling av en oppløsning av aktiv Streptomyces Fradiae protease i boratpuffer.

0,6 g Streptomyces Fradiae protease med aktivitet 11,626 UA/mg (ca. 7 mill. UA totalt) ble oppløst under mekanisk rysting i 150 ml boratpuffer (pH », 82, konsentrasjon - 0,05 M)«Oppløsningen ble filtrert gjennom Supercel-kake og etter avsluttet filtrering ble volumet oppfylt til 200 ml med samme puffer, og 250 mg vannfri kalsiumklorid og 50 ml propylenglykol ble tilsatt som stabilisatorer. Den fremstilte oppløsning hadde en aktivitet på ca. 20.000 UA/ml.

Fremstilling av en oppløsning inneholdende deaktivert St reptoå-myces Fradiae protease (kontrolloppløsning).

125 ml av den tidligere aktive proteaseoppløsning ble kokt i 10 min. for deaktivering av enzymet. Etter at disse 10 min. var gått lot man oppløsningen avkjøles ved romtemperatur og oppløsningen ble oppfylt med boratpuffer til utgangs<y>olum

125 ml. Oppløsningen var uten enzymaktivitet.

Fremstilling av gelatinoppløsning med kaseinblakkingsmiddel og økende mengder aktiv proteaseoppløsning.

Nøyaktig 2 g kasein ble utveid og anbragt i 600 ml~kolber og man tilsatte hver kolbe 40 ml gelatinoppløsning under rysting slik at man fikk en pasta hvorfra det var lettere å lage en homogen suspensjon.

Man tilsatte til denne rekke av suspensjoner: 0, 2,

4, 6, 8 og 10 ml aktiv Streptomyces protease og 10, 8, 6, 4»2

og 0 ml resp. av deaktivert Streptomyces protease, slik at man fikk et sluttvolum på 50 ffll i alle beholderne som derved inneholdt omtrent: 0, 40.000, 80.000, 120.000, 160.000 og 200.000 UA/kolbe. Man gjennomførte en grundig homogenisering og innsatte beholaerne i en ovn for inkubering.

Inkubering.

Denne foregikk i ovn ved JJ°C i 24 timer som i eksempel 1. Etter disse 24 timer ble flaskene tatt ut og sentrifugert. Sentrifugering.

Man benyttet seks sentrifugerer hvor bunnen var en sylinder gradert fra 0,02 til 100 ml, med mindre diameter enn åpningen som også var sylindrisk idet målene for den Øvre sylinder var: innerdiameter = 14 mm, høyde « 52 mm. Målene for nedre sylinder: innerdiameter «= 2,6 mm, høyde = 50 n™» 5 ml av hver suspensjon ble påfylt et sentrifugerør og etter grundig homogenisering ble hele serien sentrifugert samtidig ved 3000 omdr/min i 8 min.

Etter sentrifugering avleste man sedimentets volum

på den graderte skala for hver proteasekonsentrasjon, og gjentok denne operasjon 6 ganger for å få en statistisk serie.

Middelveridrai, pålitelighetsgrenser og variabilitetsindeks fremgår av følgende tabell:

Analyse av resultatene.

I forsøk hvor mengden blakningsmiddel (kasein) var mindre enn 2 g pr. forsøksporsjon er den oppnådde klaring på grunn av enzymet fullstendig uten påviselig sediment på bunnen av sentrifugerøret.

Et omvendt forhold noteres mellom rest-turbiditet og konsentrasjonen av fiureptomyces protease, dvs. at det fåes en kontinuerlig reduksjon av påviselig sediment med økende aktivitet.

Ved å forandre konsentrasjonen i UA/ml for tilsatt

Streptomyces Faaiae kan man oppnå alle mellomstadier fra en fullstendig klaring til en delvis klaring alt etter de særlige behov.

(I alle ovenstående eksempler 1, 2 og 3 refererer tallet "tM seg til Student's t for en sannsynlighet på 95%, og i henhold til n (antall data som danner basis for det arithmetiske middeltall).

Eksempel 4-.

15 g Streptomyces Fradiae protease i tørr tilstand og ved styrke = 11.000 UA/mg ble oppløst under rysting og ved romtemperatur i 1 time idet 4 g tørr kalsiumklorid på forhånd var tilsatt pufferoppløsningene.

Etter avsluttet rysting ble enzymoppløsningen filtrert, gjennom sugetrakt og vanlig filtrerpapir belagt med en vasket tørr diatome-kake på ca. 5 mm høyde.

Etter ferdig filtrering ble hjelpefilterkaken som avsuges i vakuum vasket to ganger med 100 ml puffer og avsuget etter hver vasking, og filtervæskene oppsamlet sammen med moder-luten. De oppsamlede transparente filtratvæsker ble homogenisert og 100 ml propylen glykol tilsatt, pH innstilt på 6,0 ved tilsetning av natriumhydroksyd.

Den proteolytiske aktivitet for enzymoppløsningen ble bedømt ved Anson's metode (J. Gen. Physiol. 22, 79»1938) og ut fra analysevérdiene kunne nan utregne den mengde puffer som måtte tilsettes til den filtrerte enzymoppløsning for justering av enzymstyrken til 250.000 UA/ml.

Denne oppløsning ble benyttet til klaring av øl, idet

3 ml ^1®tilsatt pr. hl 01 som skal klares, etter den amerikanske metode, etter utgångsfiltreringen og følgelig etter primærfermen-terf.ng. Ølet ble lagret seks uker i utgangstanken som enzym- oppløsningen ble tilsatt til.

Etter at aktivitets-fasen var avsluttet foretok man den andre filtrering og det rene klare ølet ble pasteuriser og kondisjonert og deretter overført til en påfyllingsstasjon og transportert på fiske til sluttlagring.

Blakningsresultater for øl lagret ved romtemperatur,

og med temperatursjokk, er oppført i tabell 1, som også omfatter resultater av forsøk utført parallelt med to tekniske enzympre-parater fremstilt ved konsentrering av plantesaft.

Man vil se at klaringsresultater oppnådd ved disse saramenligningsforsøk er klart gunstige for proteaser avledet av Streptomyces fradiae både med hensyn på absolutt væske-klarhet (brillians) og for opprettholdelse av klarheten under lagring, idet man sammenligner resultatene med resultater oppnådd med første fremstillingssats, hvor klaring er gjennomført med de tekniske produkter som benyttes av Ølbryggingsindustrien.

Tabell 2 sammenfatter den relative økning i uklarheten for øl klaret med tekniske produkter som for tiden brukes sammenlignet med klarheten for øl klaret med hjelp av oppfinnelsens fremgangsmåte.

Man ser da at rest-filtrerings-uklarhet for øl, behandlet med protease avledet av Streptomyces, er ca. 18 ± 5% lavere enn for samme øl behandlet med protease av vegetabilsk opprinnelse bg at den uklarhet som utvikles under lagring ved romtemperatur øker hurtigere for øl behandlet med vegetabilsk protease opptil 7.1$ større uklarhet. Like gode sammenlignings-resultater oppnås med temperatursjokk.

De store fordeler for den metoden som er beskrevet, og som tar i bruk oppfinnelsen, kan oppsummere?slik: 1. Utnyttelse av et produkt uten spesifikk toksisitet ved oral administrasjon i de angitte doser, hvilket gjør produk-tene anvendelig for klaring av forskjellige drikker. 2. Muligheten til forenklet klaring ved filtrering eller sentrifugering av uklare væsker, inklusive væsker hvis turbiditet ikke er av protéinnatur, når de nitrogenerte makromolekyler er årsak til høy viskositet eller egenvekt for den uklare væsken, på grunn av nedbrytning ved hydrolyse til mindre molekyler under samtidig reduksjon av egenvekt eller viskositet. 3. En benyttende jvirkning som hinarer uklarhet under lagring av aen klarede væske. 4. Spesifikk virkning av Streptomyces enzymer overfor proteinsubstratet gjør metoden særlig egnet for uklare oppløs-ninger hvor uklarheten skyldes peptider og hvor det ikke finnes péptidenheter som skal opprettholdes uspaltet i klaringsvæsken, idet enzymet kan virke samtidig både på peptidstrukturen og blakningsmidlet. Bortsatt fra dette unntak etterlater enzymet imidlertid alle andre strukturer uforandret, bortsett fra karb-amidet, av essensielle bestanddeler i typiske væsker: f.eks. sukkere, fargestoffer, kunstige søtningsmidler, syntetiske fortykningsmijdler, aromatiske estere. Med andre ord kan man si at i motsetning til rent kjemiske behandlinger foregår ingen vesentlig forandring av klaringsvæskens sammensetning med hensyn på størstedelen av dens bestanddeler. 5»For væsker som skal klares og som inneholder bestanddeler av protein natur og som er uklare, vil en eventuell nedbrytning av protein-bestanddelene ved den klaring som foretas i henhold til oppfinnelsens metode, ikke være noen ulempe i de fleste tilfeller fordi denne nedbrytning danner assimilerbare produkter, som vil ha like stor eller større næringskvalitet og av denne grunn kan metoden være den beste for behandling av nærende drikker, bl.a. drikker på proteinbasis. 6. På grunn av den spesifikke virkning gir metoden vanligvis klare produkter uten forandring av smak, lukt eller andre egenskaper for væsken. Dette punkt er vist statistisk med spesielle smaksfjernende midler, for øl klaret ved metoden i henhold til oppfinnelsen. 7«Braden av ustabilitet for oppløsninger av Streptomyces enzymer gjør det mulig ved enkle metoder, inklusive enkel lagring å oppnå fullstendig eliminering av gjenværende enzymaktivitet.

Claims (8)

1. Enzymprodukt for klaring av og hindring av uklarhet i vandige væsker, karakterisert ved at produktet er fremstilt ved inokulert fermentering av Streptomyces kultur»

2. Produkt som angitt i krav 1, karakterisert ved at kulturen som danner proteasen er Streptomyces fradiae.

3. Fremgangsmåte som klaring av og hindring av turbiditet i vandige væsker, karakterisert ved at man fremstiller et enzymproduktet fra en Streptomyces-kultur, til-setter denne til den vanaige væske og holder denne kontakt i et bestemt tidspunkt véd bestemt temperatur, tilstrekkelig til å klare den foreliggende eller potensielle uklarhet i væsken.

4« Fremgangsmåte som angitt i krav 3» karakterisert ved at temperaturen er mellom 0 og 85°C.

5- Fremgangsmåte som angitt i krav 3 eller 4, karakterisert ved at temperaturen er romtemperatur.

6. Fremgangsmåte som angitt i et eller flere av de ovenstående krav, karakterisert ved at enzymet tilsettes i flere porsjoner til væsken.

7• FDremgangsmåte som angitt 1 et eller flere av kravene 3 til 6, gjennomført i kombinasjon med filtrering, dekantering, sentrifugering eller sedimentering av væsken.

8. Vandige væsker når de er klaret eller forhindret fra å bli uklare ved tilsetning av et produkt i henhold til et eller flere av kravene 1 eller 2, eller ved behandling ifølge en metode som angitt i krav 3 eller 7«