DE4004001A1

DE4004001A1 - Kosmetische zusammensetzungen und isolation und reinigung von in kosmetischen zusammensetzungen verwendeten natrium-hyaluronat-fraktionen

Info

Publication number: DE4004001A1
Application number: DE19904004001
Authority: DE
Inventors: Alan Drizen
Original assignee: STERIVET LABORATORIES Ltd MISSISSAUGA ONTARIO CA; STERIVET LAB Ltd
Current assignee: Hyal Pharmaceutical Corp
Priority date: 1989-02-10
Filing date: 1990-02-09
Publication date: 1990-08-16
Also published as: CA2009730A1; GB9001733D0; GB2228736A; FR2642971A1

Description

Die Erfindung betrifft Hyaluronsäure-Fraktionen, Formu lierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten, die eine Hyaluronsäure-Fraktion enthalten, Verfahren zur Herstellung einer Hyaluronsäure-Fraktion, Verfahren zur Herstellung sowie Verwendung dieser Formulierungen.

Die vorliegende Erfindung betrifft kosmetisch brauchbare Präparate auf Basis von Hyaluronsäure einer natürlich vorkommenden Substanz, die man in tierischem Gewebe, und insbesondere in Hahnenkämmen, als Beimischung zum Glaskörper des Auges, Nabelschnüren, und Gelenkschmiere von Säugetieren findet. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung gereinigtes Natrium-Hyaluronat; Isolations- und Reinigungsverfahren von Natrium-Hyaluro nat; Formulierungen und Zusammensetzungen mit Natrium-Hyaluronat geeignet für kosmetische Zwecke; und Verfahren zur Herstellung einer Formulierung, die eine derartige für diese Zwecke geeignete Hyaluronsäure-Fraktion enthält. Ergänzend dazu betrifft die Erfindung Methoden zur Herstellung und Verwendung derartiger Formulierungen und Zusammensetzungen, die derartige Hyaluron säure-Fraktionen für kosmetische Zwecke enthalten.

Die natürliche Funktion von gesunder Haut besteht in einem Schutz gegenüber einer großen Anzahl von potentiel len schädlichen Umwelteinflüssen. Daher ist gesunde Haut sowohl in physikalischem Sinne kräftig als auch gleich zeitig geeignet, schädliche Wellenlängen des Sonnen lichts und ebenso schädliche Bakterien abzuwehren. Zusätzlich ist die gesunde Haut ebenfalls geeignet als Schutzbarriere gegenüber ständigen Angriffen durch eine große Anzahl von gefährlichen, sich in der Luft befind lichen chemischen Verunreinigungen, die in den meisten modernen Städten ständig vorhanden sind, zu dienen.

Die mechanische Festigkeit von gesunder Haut ist zumindest zum Teil auf ein Netzwerk von hochentwickelten Proteinfasern zurückzuführen, die die gesamte Hautstruk tur in allen Richtungen durchziehen. Collagen und Elastin sind zwei der Substanzen, aus denen sich die Fasern zusammensetzen. Dieses Fasernetzwerk hilft, um die Blutgefäße der Haut, Nerven und lebende Zellen gegenüber Angriffen durch Umweltfaktoren, sowohl großen als auch geringen (unter Bezug auf das Alltagsleben), zu schützen.

Die Lücken zwischen den Maschen dieses Bindegewebes sind mit einer gallertartigen Mischung eines Mucopolysac charids (zuckerverwandt), die auch als Hyaluronsäure (Hyaluronat) bekannt ist, und Wasser ausgefüllt. Die Anwesenheit des Hyaluronat/Wasser-Komplexes innerhalb des Bindegewebes ist für den Nährstofftransport zu den lebenden Zellen der Haut essentiell. Die Fähigkeit der Haut eine effektive Barriere gegenüber Bakterien und außerirdischen Schadstoffen aufrecht zu erhalten hängt von dem Zustand des Hyaluronat/Wasser-Komplexes ab. Gleich wichtig ist die Fähigkeit des Hyaluronat/Wasser-Komplexes vor Trockenheit, rauher Haut, Falten und Altern zu schützen.

Der Hyaluronat/Wasser-Komplexes macht bei weitem den größten Teil des gesamten Hautvolumens aus und jegliche zeitweilige oder andauernde Qualitätsverschlechterung des Hyaluronats in dem Hyaluronat/Wasser-Komplex wird trockene Haut, Falten und das Auftreten von Hautalterung hervorrufen.

Hyaluronsäure (HA) ist ebenso als ein Glycosaminoglycan bekannt. Die sich wiederholende Einheit des Hyaluron sauremoleküls ist ein Disaccharid, das aus D-Glucuron säure und N-Acetyl-D-glucosamin besteht.

Da Hyaluronsäure eine negative Ladung bei neutralem pH besitzt, ist sie in Wasser unter Bildung von hochviskosen Lösungen löslich. Die D-Glucuronsäureeinheit und N-Acetyl-D-glucosamineinheit sind durch eine glycosidische, beta(1→3)-Bindung verbunden, während jede Disaccha rideinheit mit der nächsten durch eine beta(1→ 4)-Bindung verknüpft ist. Die beta(1→ 4)-Verbindungen können durch Hydrolyse mit dem Enzym Hyaluronidase gespalten werden.

Eine Anzahl von Substanzen, allgemein als Hyaluronsäuren bezeichnet, wurden mittels einer Anzahl von Methoden aus verschiedenen Gewebeproben, die Nabelschnüre, Haut, Glaskörper des Auges, Gelenkschmiere, Tumore, haemoly tische Streptokokken - Schweinehaut, Hahnenkämme und Venen und Arterienwände umfassen, isoliert.

Konventionelle Methoden zum Darstellen von Hyaluronsäure erzielen ein Produkt mit unterschiedlichen Eigenschaften und einem weiten Viskositätsbereich. Das US-Patent 25 85 546 zeigt ein Beispiel eines Verfahrens zur Darstellung von Hyaluronsäure. Das Verfahren umfaßt: Extraktion von acetongewaschenen Nabelschnüren mit einer verdünnten Salzlösung, Ansäuerung des resultierenden Extrakts, Entfernen des so gebildeten Coagulats, Präzipitation eines Teils der Hyaluronsäure - zusammen mit Protein - aus dem angesäuerten Extrakt mit Ammonium sulfat, Rühren der Flüssigkeit mit Pyridin, Präzipitation einer weiteren, ziemlich mit Protein kontaminierten Fraktion, gefolgt durch Zugabe von weiterem Ammoniumsul fat, das einen Teil des Pyridin zusammen mit der hochviskosen Hyaluronsäure aus der Lösung heraustreibt. Die Hyaluronsäure sammelt sich an der Grenzfläche zwischen den beiden flüssigen Phasen und kann mittels Filtration, Zentrifugation oder anderen üblichen Verfahren abgetrennt werden. Eine Modifikation dieses Verfahrens schließt die Fraktionierung des acidischen Salzextraktes aus Nabelschnüren mit Alkohol und Ammonium sulfat ein. Alkohol wird zu dem acidischen Salzextrakt hinzugefügt, und das resultierende Präzipitat wird entfernt. Festes Ammoniumsulfat wird bis zur Sättigung zu der Flüssigkeit hinzugegeben und die Lösung bildet zwei Phasen mit einem Hyaluronsäurepräzipitat an der Grenzflä che.

Gemäß dem US-Patent 33 96 081 wird ein trockenes Hyaluronsäurepulver hergestellt, das aus Ausgangsmaterial für Hyaluronsäure, wie z.B. tierischen Organen ein schließlich dem Glaskörper des Auges, Nabelschnüren und ähnlichem, oder aus hyaluronsäureproduzierenden Bakte rienkulturen dargestellt wird. Eine Suspension des resultierenden trockenen Pulvers wird in Wasser für eine kurze Zeit in einem alkalischen Bereich erwärmt, so daß der Proteingehalt denaturiert wird. Nach Einstellung des optimalen pH-Wertes und des Temperaturbereiches für das verwendete Enzym wird das Protein durch proteolytische Fermente, vorzugsweise durch eine Hydrolase-Mischung von Aspergillusoryzae abgebaut. Nach Entfernung der freien Aminosäuren und Mineralsalze durch Behandlung mit Ionenaustauschern wird eine rohe Hyaluronsäurelösung, die immer noch Protein enthält, dargestellt. Die resultierende rohe Hyaluronsäurelösung, die Proteinreste enthält, wird dann auf einen sauren pH-Wert von etwa 3-4, in dem die Unreinheiten mit Hyaluronsäure einen unlöslichen Komplex bilden, eingestellt, während ein Teil der Hyaluronsäure selber als Präzipitat für die Unreinheiten dient, insbesondere für das Restprotein, das in anderer Weise nur sehr schwierig ohne Depolymerisation der Hyaluronsäu re entfernt werden kann, woraufhin die resultierenden unlöslichen Komplexverbindungen durch Hochgeschwindig keitszentrifugation abgetrennt werden. Nach einem Natriumsalz hat die resultierende Hyaluronsäurelösung mit einer Konzentration von 0,2% in Wasser eine relative spezifische Viskosität von 20 und stellt eine wasserklare Lösung frei von Proteinen, Antigenen, und Pyrogenen dar, die als geeignet zur Hitzesterilisation, ohne daß sie einen beträchtlichen Abfall in der Viskosität erfährt, beschrieben wird.

US-Patent 38 62 003 betrifft ein Verfahren zum Extra hieren von Mucopolysacchariden aus zusammenhängenden Tiergeweben, wobei das Verfahren die Exposition des zusammenhängenden Gewebes mit Wasser bei einer Temperatur von 100°-150°C unter erhöhtem Druck, Unterziehen des resultierenden Extraktes einer Protease- und/oder Alkalibehandlung, und das darauffolgender Separation und Wiedergewinnung von Mucopolysacchariden umfaßt.

US-Patent 41 41 973 betrifft die Herstellung einer ultrareinen, hochmolekulargewichtigen Hyaluronsäure-Fraktion, die aus hyaluronsäurehaltigem Tiergewebe mittels einem Verfahren dargestellt wird, das folgende Schritte einschließt:

Umrühren von Blut aus hyaluronsäurehaltigen Tiergewebe, Extraktion von Hyaluronsäure aus dem Blut, Deprotonisie ren des Hyaluronsäureextrakts, und Entfernen von jeglichen nicht identifizierten entzündungsauslösenden Wirkstoffen, die darin enthalten sind durch Behandlung des deprotonisierten Hyaluronsäureextrakts bei einem pH von 6,0 bis 7,0 mit einem Volumen an Chloroform, das wenigstens etwa gleich zu dem des deprotonisierten Extraktes ist, so daß eine zwei-Phasen-Mischung gebildet wird; diese wird dann ausreichend umgerührt, um einen innigen Kontakt mit den zwei Phasen bei etwa 15° bis 40°C zu gewährleisten, gefolgt von der Abtrennung und Verwerfung der Chloroformphase.

US-Patent 45 17 296 ist auf die Präparation von Hyaluron säure in hohen Ausbeuten aus Streptokokkus-Bakterien mittels Fermentation der Bakterien unter anaeroben Bedingungen in einem CO₂ angereicherten Wachstumsmedium, Trennung der Bakterien aus dem resultierenden Medium und Isolation der Hyaluronsäure aus den verbleibenden Komponenten des Mediums, gerichtet. Die Trennung der Mikroorganismen von der Hyaluronsäure wird ermöglicht durch Abtöten der Bakterien mit Trichloressigsäure. Nach Entfernung der Bakterienzellen und Konzentration der hochmolekularen Fermentationsprodukte wird die Hyaluron säure isoliert und mittels Präzipitation gereinigt, resuspendiert und repräzipitiert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, kosmetische Formulierungen zur lokalen Anwendung auf epidermalem Gewebe, zur Verfügung zu stellen, wobei diese eine in kosmetischen Formulierungen verwendbare Hyaluronsäure- Fraktion mit bestimmten weiteren Charakteristika enthalten soll. Weiterhin soll ein Verfahren zur Herstel lung einer stabilen, gereinigten, hitzesterilisierten Hyaluronsäure-Fraktion angegeben werden, das die oben genannten Nachteile des Standes der Technik vermeidet.

Schließlich liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen Formulierung zur lokalen Anwendung auf epidermalem Gewebe zur Verfügung zu stellen, wobei die oben erwähnten Nachteile des Standes der Technik vermieden sind.

Die Aufgaben werden durch die kennzeichnenden Merkmale der Ansprüche 1 bzw. 7 bzw. 12 bzw. 13 bzw. 18 gelöst.

Die Erfindung wird durch die Merkmale der Unteransprüche weitergebildet.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die oben im Stand der Technik angeführten Nachteile durch die erfindungsgemäßen Hyaluronsäure enthaltenden Formulierun gen, die hitzestabile, gereinigte und hitzesterilisierte HA-Fraktionen enthalten, überwunden werden können.

Überraschenderweise wurde ebenfalls gefunden, daß die HA-Fraktionen sehr effektiv sind für die Verwendung in kosmetischen Präparationen und Formulierungen zur Verwendung bei der Hautschutzbehandlung.

Erfindungsgemäß werden daher kosmetische Formulierungen zur lokalen Anwendung auf der Haut zur Verfügung gestellt, die eine Hyaluronsäure-Fraktion enthalten. Vorzugsweise ist die Hyaluronsäure darin in Form eines Salzes, wie z.B. des Natriumsalzes (Natrium-Hyaluronat) anwesend. Die Formulierung enthält wenigstens ein Konservierungsmittel, das vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumbenzoat, Methyl-PHB-Ester, Propyl-PHB-Ester, und Kombinationen von Natrium benzoat, Methyl-PHB-Ester und Propyl-PHB-Ester, aber insbesondere auch nur aus Methyl-PHB-Ester alleine bestehen kann.

Weiterhin wird erfindungsgemäß eine Formulierung wie oben beschrieben bereitgestellt, die etwa 1-1,2% eines Natriumsalzes von Hyaluronsäure, und etwa 0,2-0,25% Methyl-PHB-Ester; und insbesondere etwa 1,0% des Natriumsalzes der Hyaluronsäure, d.h. Natrium-Hyaluronat, etwa 0,2% Methyl-PHB-Ester und als Rest, d.h. 98-99% Wasser enthält.

Erfindungsgemäß wird weiterhin eine in den kosmetischen Formulierungen nützliche Hyaluronsäure-Fraktion, wie oben beschrieben, bereitgestellt, worin die Hyaluronsäure-Fraktion ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 800 000, insbesondere von größer als 500 000 aufweist, insbesondere worin das mittlere Molekulargewicht innerhalb des Bereiches von etwa 600 000 bis 700 000 und insbesondere innerhalb des Bereiches von 625 000 bis 675 000 liegt.

Die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellte, in kosme tischen Formulierungen nützliche Hyaluronsäure-Fraktion, weist eines oder mehrere der folgenden Charakteristika auf:

a) ein Gehalt an sulfatierten Mucopolysacchariden pro 100 mg Hyaluronat von weniger als 1,25 mg, und vorzugsweise von weniger als 0,5 mg, bestimmt durch eine Extinktionsanzeige 0,018 nicht überschreitend;
b) ein Gehalt an Eisen von nicht mehr als 150 ppm, und vorzugsweise von weniger als 100 ppm, bestimmt mittels Atomabsorptionsspektrometrie;
c) ein Gehalt an Blei von nicht mehr als 15 ppm, und vorzugsweise von weniger als 10 ppm, bestimmt mittels Atomabsorptionsspektrometrie;
d) basierend auf 300 µg Natriumhyaluronat ein Gehalt an folgenden Stoffen:
- i) weniger als 0,75 µg Glucosamin, und vorzugsweise weniger als 0,5 µg Glucosamin;
- ii) weniger als 7,5 µg, und vorzugsweise weniger als 5,0 µg Glucuronsäure;
- iii) weniger als etwa 7,5 µg, und vorzugsweise
  weniger als etwa 7,5 µg und vorzugsweise
  weniger als etwa 5,0 µg N-Acetylglucosamin;
- iv) weniger als etwa 0,15 µg und vorzugsweise weniger als etwa 0,5 µg Aminosäuren;
e) ein Proteingehalt von weniger als etwa 0,6% und vorzugsweise weniger als 0,4% unter Verwendung der Lowry-Methode;
f) ein UV-Extinktionskoeffizient bei 257 nm von weniger als etwa 0,275 und vorzugsweise weniger als etwa 0,23;
g) ein UV-Extinktionskoeffizient bei 280 nm von weniger als etwa 0,25 und vorzugsweise weniger als etwa 0,19;
h) eine pH innerhalb des Bereiches von 7,3-7,9 und vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 7,5-7,7.

Erfindungsgemäß wird ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen Formulierung zur lokalen epidermalen Anwendung bereitgestellt, wobei das Verfahren enthält:

Bereitstellung einer derartigen Hyaluronsäure-Fraktion, vorzugsweise Natrium-Hyaluronat, wie oben beschrieben; Füllen eines Mischbehälters mit heißem Wasser, wobei dieses auf eine Temperatur von etwa 60°C bis 90°C erhitzt wird; Eintragen und Lösen von Konservierungsmitteln ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methyl-para hydroxybenzoat, Propyl-Parahydroxybenzoat, Natriumbenzoat und Mischungen aus Methyl-Parahydroxybenzoat, Propyl parahydroxybenzoat und Natriumbenzoat, aber vorzugsweise Methyl-PHB-Ester in Wasser, so daß eine Lösung der Konservierungsmittel gebildet wird; Hinzufügen und Lösen der Hyaluronsäure-Fraktion in der Konservierungslösung, so daß eine Lösung resultiert; Einstellen des pH der resultierenden Lösung auf 7,5-7,7; Verdünnen der auf diesen pH eingestellten Lösung mit einer Menge an Wasser zu einem Endvolumen einer wäßrigen Formulierung; Einfüllen der wäßrigen Formulierung in Behälter; wobei vorzugsweise das Verfahren ebenso die Filtrierung des Endvolumens der wäßrigen Formulierung durch eine Membran in ein aufnehmendes Gefäß vor der Beschickung der Behälter einschließt, wobei vorzugsweise die oben erwähnte Membran eine 0,8 micron Membran ist.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher beschrieben.

Es zeigen:

Fig. 1 einen Elektrophorese-Streifen, mit einer erhaltenen einzelnen blauen Bande Hyaluronsäure darstellend, detektiert mittels elektrophore tischer Identifikation der Hyaluronsäure, wie im folgenden näher beschrieben wird;

Fig. 2 einen ähnlichen zu dem in Fig. 1 gezeigten, elektrophoretischen Streifen, der zusätzlich eine charakteristische blaue Bande, nämlich Natrium- Hyaluronat enthält, d.h. wobei diese ein relativ schwaches Band mit einem höheren Rf-Wert darstellt;

Fig. 3 eine Vorrichtung zur Bestimmung des Sulfatgehal tes von in der Hyaluronsäure enthaltenen Mucopolysacchariden;

Fig. 4 eine grafische Darstellung, in der die Analyse von bekannten Produkten auf Hyaluronatbasis unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeits-Chromato graphie (HPLC) gezeigt wird;

Fig. 5 ein Diagramm mit einem Vergleich der Reinheit von Produkten auf Basis von Hyaluronsäure.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß einer schlech ten Hautqualität, verursacht durch abgereicherte oder verminderte Hyaluronatgehalte, mittels der Applikation der Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten, die eine Hyaluronsäure-Fraktion gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, auf trockene oder beschädigte Haut Abhilfe geschaffen werden kann.

Die außergewöhnlichen Absorptionseigenschaften der Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten, die eine Hyaluronsäure-Fraktion gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, werden schon bei der ersten Anwendung ersichtlich. Ohne sich an irgendeine Theorie zu binden, wird angenommen, daß die Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten gemäß der vorliegenden Erfindung in die tieferen Hautschichten penetriert, um das natürliche Hauthyaluronat, das durch Umweltschäden und Alter verloren wurde, zu ersetzen.

Es wurde beobachtet, daß die Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten gemäß der vorliegenden Erfindung in tieferen Schichten einen Feuchtigkeits- und andere Alterschutzeffekte gegenüber trockener, faltiger und in anderer Weise geschädigter Haut vermittelt. Aufgrund der Tatsache, daß die Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten gemäß der vorliegenden Erfindung ein neues und einheitliches Molekül von natürlichem Hyaluro nat, das speziell für Hautzwecke entwickelt ist, enthalten, werden die o.g. Formulierungen im wesentlichen total in die tiefesten Schichten der Haut absorbiert, wo dieses die verminderte Hyaluronatkonzentration von trockender, geschädigter und gealterter Haut auffüllt, da die Molekularstruktur der erfindungsgemäßen Hyaluron säure-Fraktion im wesentlichen identisch mit der in gesunder Haut ist.

Die Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffen heiten gemäß der vorliegenden Erfindung stellen essen tielles natürliches Hyaluronat zur Alterungsrehydra tation, und Hydratation von geschädigter oder trockener Haut zur Verfügung. Ohne die Formulierungen zur Be handlung von Hautbeschaffenheiten gemäß der vorliegenden Erfindung ist es praktisch unmöglich den in normaler Haut gefundenen Hyaluronat/Wasserkomplex wieder herzustellen.

Die vorliegende Erfindung basiert daher darauf, daß überraschenderweise ein neues und einheitliches Hyaluron säure-Molekül, speziell zur Hautpflege entwickelt, gefunden wurde, und daß dieses Charakteristiken aufweist, die bisher in keiner anderen Formulierung auf Hyaluronat-Basis gefunden wurden.

Es wird angenommen, daß die erfindungsgemäße, hypo allergene Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffen heiten die reinste Form, im wesentlichen 100% des verfügbaren Hyaluronats enthält. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein wird angenommen, daß Hyaluronat, eine natürlich vorkommende, feuchtigkeitsbindende, in Haut und Bindegewebe vorkommende Substanz, durch Sonne, Wind und Alterung hervorgerufene Hautschäden sofort repariert. Eine nur geringe Anwendung der erfindungs gemäßen Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffen heiten verbessert die Hautqualität und die äußere Erscheinung, reduziert Falten und frischt die Haut auf.

Zusätzlich dazu, daß die erfindungsgemäße Formulierung eine hervorragende Hautpflege-Formulierung ist, wurde gefunden, daß sie unübliche, vielseitige Verwendungsmög lichkeiten und Annehmlichkeiten bietet. Geeignete Bemühungen um ihren Reinheitsfaktor (100%), Absorptions fähigkeit, Effizienz und Viskoelastizität (Leichtigkeit der Applikation) zeichnet die Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten gemäß der vorliegenden Erfindung als ein ideales Hautpflegeprodukt aus. Gekoppelt mit ihren nichtallergenen Eigenschaften handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten nicht nur um eine Sonderhaut behandlung über Nacht, sondern sie stellt eine perfekte Grundlage für alle Typen von Make-up dar.

Die vorteilhaften Anti-Alterungseigenschaften der erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten umfassen:

Regeneration von geschädigter Haut; Vermitteln eines tiefen Feuchtigkeitseffektes, totale Absorption; allergenfrei; Farbe, und Duft und Kompatibilität mit Make-up und Hautcremes, ergänzend zu einem Gehalt von im wesentlichen 100% reinem, natürlichem Hyaluronat.

Reines, natürliches Hyaluronat stellt eine relativ neue Substanz zur Hautpflege dar. Wie oben erwähnt, hat Hyaluronat spezielle Charakteristiken wie Viskoelasti zität, fettspendende Eigenschaften und Zellernährung, wobei diese Eigenschaften die Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten gemäß der vorliegen den Erfindung und ihre aktiven Ingredenzien, Hyaluronat, unschätzbaren Anti-Alterungswirkstoff steuern.

Obgleich es nicht beabsichtigt ist, sich an eine spezielle Theorie anzulehnen, enthalten die erfin dungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbe schaffenheiten natürliches Hyaluronat, das sich mit menschlicher Haut verbindet und extrem hydrophil ist, wodurch die Haut hydratisiert wird. Ebenso dringt Luft in die erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten ein, so daß während der Hydratisie rung ein Atmen der Haut erlaubt wird. Wie Elastin und Collagen ist der aktive Bestandteil der erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheit, d.h. Hyaluronat eine natürlich vorkommende Komponente von menschlicher Haut. Es beeinflußt die Hautstruktur durch Bildung von Bindungen zwischen Collagen-Fibrillen und Zurückhalten von Feuchtigkeit wie ein molekularer Schwamm. Der gesamte Effekt der erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten besteht darin, die Blutzirkulation zu erhöhen und die Hauternährung zu beschleunigen.

Auf diesem Weg verbessern die erfindungsgemäßen Formu lierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten, die Hyaluronat enthalten, Farbe, Ton und Textur der Haut, was ein gesünderes Aussehen und weicheres Anfühlen zur Folge hat.

Aus dem Stand der Technik war es vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt, ein Hyaluronat-Molekül herzu stellen, das speziell für die Hautpflege gedacht war, wie es in den erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten enthalten ist.

Im folgenden werden bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Hyaluronat und den Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten, die Hyaluronat enthalten, gemäß der vorliegenden Erfindung näher beschrieben.

Obwohl die Isolation und Reinigung von Natrium-Hyaluronat aus Hahnenkämmen die beste Methode für die erfindungs gemäßen Zwecke ist, sollte verstanden werden, daß auch andere Hyaluronsäurequellen für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet werden können.

Vor ihrer Auswahl müssen die Hahnenkämme untersucht und für gesund befunden werden, bevor sie mit einem an nähernden Gewicht von 20 bis 80 g vom Kopf von kürzlich enthaupteten Vögeln geschnitten und in einer automa tischen Einrichtung verarbeitet werden. Innerhalb von 30 Minuten werden die Kämme schockgefroren bei vorzugsweise -40°C unter Zuhilfenahme einer Kühlplattentechnik.

Nachfolgend zu dem Einfrieren der Kämme werden diese in Plastiktaschen gegeben und in Pappschachteln verpackt. Die gefrorenen Hahnenkamm-"Blöcke", die zwischen 2 und 5 kg wiegen, werden bei -20°C bis -40°C während des Transports gelagert, und danach bei -20 bis 40°C in Kühlschränken gelagert, die mit kontinuierlichen Aufzeichnungsgeräten, Alarm- und automatischen Re-Start- Systemen während der Lagerung ausgestattet sind. Obwohl die Kämme ohne Verlust des Hyaluronsäure-Gehaltes bis zu 12 Monaten bis zu ihrer Weiterverarbeitung gefroren gelagert werden können, besteht ein Lagerungs limit von 8 Monaten, vom Datum des Lagerzugangs an.

Vorzugsweise werden 3000 kg gefrorener Hahnenkämme zur selben Zeit verarbeitet und ihnen wird eine getrennte Chargennummer zugeteilt. Eine genügende Anzahl von Kämmen werden zu einem Verarbeitungsraum mit Klimaanlage mit gefilterter Luftzufuhr transportiert, wobei dieser Raum unter strikten sanitären Bedingungen gehalten wird. Nach teilweisem Auftauen in geeigneten Behältern werden die Kämme durch und durch mit Leitungswasser gewaschen. Nach dem Waschen werden die Kämme gewogen und in einem rostfreien (S/S) 316 Fleischwolf, der Öffnungen mit 4mm Durchmesser aufweist, zerkleinert.

Die zerkleinerten Kämme werden durch eine S/S bogige Pumpe und S/S Zuführungsleitungen zu einem 10000 L S/S Kessel gepumpt, der mit einem geschwindigkeitsregulierten Rührer ausgestattet ist, und mit wasserfreiem Aceton gemischt, das aus einem externen Lagerungstank durch einen Durchflußmesser gepumpt wird. Alle Teile die sich in Kontakt mit Aceton befinden, sind aus 316 S/S herge stellt. Aceton im Verhältnis von 2 : 1 (v/v) von Aceton zu zerkleinerten Kämmen wird dem Kessel hinzugefügt und bei 50 rpm für 6 Stunden gerührt. Der Anteil von Aceton zu frischem Gewebe ist insbesondere wichtig, da die ersten drei Dehydratationsschritte wasserlösliche Verunreinigun gen entfernen. Die acetonzerkleinerte Kamm-Mischung wird für annähernd 12 Stunden zum Absetzen stehengelassen, wonach das überstehende Aceton entleert und verworfen wird (Aceton wird zurückbehalten und zur Wiederverwendung mittels Destillation zurückgewonnen).

Die Aceton-Extraktion wird wenigstens 6 mal wiederholt bis ein klarer, farbloser Acetonüberstand, der weniger als 5% Feuchtigkeit enthält, erhalten wird. Indem so verfahren wird, analysiert man den Wassergehalt des Acetons als ein Prozeßkontrollverfahren mit Hilfe der Karl-Fischer-Methode und die Ergebnisse werden auf dem Produktionsarbeitsbogen aufgezeichnet. Wenn der 6. Aceton-Extrakt nicht die 5% Grenze erreicht, wird die Aceton-Extraktion wiederholt.

Nach der letzten Aceton-Extraktion wird der nasse zerkleinerte Kuchen während dieser am Rühren gehalten wird, durch eine Alfa-Comi-Condor-Dauerdurchflußzentri fuge gepumpt, um ein trockenes Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt innerhalb des Bereiches von etwa 1-3%, vorzugsweise von etwa 1-2% und vorzugsweise von etwa 1% herzustellen. Das getrocknete Produkt wird in einem geeigneten Behälter gesammelt, der nach Charge, Gesamt gewicht und Trocknungsdatum markiert ist. Auf diese Stufe wird das Material für 90 Tage bei 17 bis 18°C bevor es weiterverarbeitet wird, gelagert. Das oben beschriebene Verfahren ergibt eine Ausbeute von 500 bis 600 kg trockenen Pulver ausgehend von 3000 kg rohen Hahnenkämmen.

250-300 kg trockenes Hahnenkammpulver, wie oben herge stellt, wird in einem doppelwandigen S/S-Kessel mit 3000 L eines Cystein-Phosphat-Puffers, pH 7,5, der wie folgt hergestellt wird, gemischt:

Na₂HPO₄ · 12 H₂O\|30.750 g
NaH₂PO₄ · 2H₂O	5.850 g
Cystein HCI	5.400 g
Methyl/Ethyl-PHB-Ester	2.500 g
Nichtpyrogenes, deionisiertes Wasser, hergestellt durch Umkehrosmose unter Verwendung einer Millipor Membran RO-60	zu 3.000 L

Unter Verwendung eines automatischen Thermoregulators wird die Phosphat-Puffer-Gewebemischung unter konstantem Rühren bei 60 rpm auf 60 bis 65°C gebracht und bei dieser Temperatur für eine Stunde gehalten. Zu der gerührten Masse wird eine Papain-Präparation, hergestellt durch hinzufügen von 200 g kristallinem Papain mit einer mindestspezifischen Aktivität von 60 000 proteolytischen Einheiten/g, in einen 5 Liter Glasballon, der 4 Liter deionisiertes Wasser enthält, gegeben.

Die Enzym-Puffer-Gewebemischung wird bei 60 rpm für 24 Stunden bei 60 bis 65°C gerührt. Die Mischung wird dann durch Zirkulation von kaltem Wasser in der Kesselwandung auf 25°C abgekühlt, während sie weiterhin gerührt wird. Zu der Mischung werden 60 kg Celit-535 als Filterhilfe hinzugefügt und das Rühren wird für eine Stunden fortge setzt, wonach die Mischung unter Druck durch eine Filterpresse gefiltert wird. Eine klare gelbliche Lösung wird erhalten, die in einem 5000 L S/S-Kessel gesammelt wird. Der Proteingehalt sollte im Bereich zwischen 30-40 mg/ml liegen, gemessen unter Verwendung der Biuret-Reaktion.

Die klare, gelbliche Flüssigkeit wird durch eine S/S-Membran-Ultrafiltrationseinheit mit einer gesamten Filteroberfläche von 42,6 m² und einer Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 30 000 Daltons gepumpt. Der erste Ultrafiltrationsschritt wird bei konstantem Volumen durch die kontinuierliche Zugabe von deionisier tem Wasser betrieben. Ein farbloses Ultrafiltrat wird erhalten entsprechend dem 5 bis 6-fachen des Ausgangs volumens. Vorzugsweise nachdem das fünfte Volumen des Ultrafiltrats erhalten wird, prüft man die Abwesenheit von Aminosäuren mit Hilfe eines Ninhydrin-Tests. Die Ultrafiltration wird solange fortgesetzt, bis das Permeat keine Aminosäuren mehr anzeigt. Nach Vervollständigung der Ultrafiltration wird das Volumen auf 1/3 des Ausgangsvolumen durch Fortsetzen der Ultrafiltration, jedoch ohne Hinzugabe von Wasser fortgesetzt um eine konzentrierte Flüssigkeit herzustellen.

Der Ultrafiltrationsschritt ist wichtig, da nieder molekulare Moleküle, wie z.B. Aminosäuren, Peptide, und Nukleotide entfernt werden, die inflammatorische Eigenschaften aufweisen können, wodurch ein Produkt frei von diesen Aktivitäten zur Verfügung gestellt wird.

Nach Ultrafiltration muß die Lösung klar ein. Ihr Volumen wird genau aufgezeichnet und der Glycosaminoglycan (GAG)-Titer wird mittels eines Carbazol-Tests gemessen. Der GAG-Gehalt sollte 12-17 mg/ml sein.

Die konzentrierte Flüssigkeit wird dann in einen 5.000 Liter S/S-Kessel überführt, der mit einem geschwindig keitskontrollierten Rührwerk und konstanter Temperatur kontrolle ausgerüstet ist. Genügend NaCl (kristallin) wird unter Rühren hinzugefügt, um die Lösung 0,1 Molar zu machen. Die Molarität wird unter Verwendung eines Silbernitrat-Tests zur Bestimmung des Chloridgehaltes überprüft. Die Mischung wird auf 50°C bei einer Rate von 100 L/Minute unter konstantem Rühren bei einer Geschwin digkeit von 60 rpm erhitzt.

Eine Cetylpyridinium-Chlorid-Lösung (CCP) wird in einem separaten Kessel durch Zugabe von 45,0 kg Cetylpyridinium- Chlorid zu 3000 l 0,1 M Natriumchlorid in deionisiertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird unter Rühren dem wäßrigen Gewebeextrakt hinzugefügt. Das Rühren wird bei 50 rpm für 60 Minuten fortgesetzt. Während dieser Zeit bildet sich ein Präzipitat. 50 kg Celit-535 werden hinzugefügt und in dem Kessel gemischt. Die Mischung wird auf 25°C während einer Periode von bis zu 4 Stunden gekühlt, wonach sie bei konstanter Geschwindigkeit von 250 rpm in 850 mm S/S-Siebmanteln zentrifugiert wird. Die klare flüssige Phase wird entleert und das Präzipitat in einen geeigneten S/S-Behälter transferiert.

Die Molaritätskontrolle und CCP-Präzipitationsschritte sind wichtig für das Entfernen von Glycoprotein.

Das resultierende Präzipitat wird in einem 5000 L S/S-Kessel mit einer wäßrigen 0,01 M-Natriumchlorid-Lösung gelöst, welches in einem getrennten Behälter, der 0,05% CCP enthält, hergestellt. Die Mischung wird für 60 Minuten bei 100 rpm während sie auf 50°C gehalten wird, gerührt. Die Mischung wird dann auf 25°C während 4 Stunden abgekühlt und wie in Schritt 40 beschrieben, zentrifugiert. Diese Waschprozedur wird vorzugsweise für wenigstens 2 oder 3 Male wiederholt. Das gewaschene Endpräzipitat wird bei 800 rpm für 60 Minuten gewaschen (um die restlichen Glycoproteinverunreinigungen abzutren nen) und das Präzipitat wird in einen 5000 L S/S-Kessel überführt.

Zu dem gewaschenen Präzipitat werden 3000 L 0,05 M Natriumchloridlösung, die 0,05% CCP enthält, hinzugege ben, wobei dieses bei 50 rpm ständig gerührt und für 60 Minuten auf einer Temperatur von 50°C gehalten wird. Die Mischung wird auf 25°C während zwei Stunden gekühlt. Die Mischung wird, wie oben beschrieben, zentrifugiert und die klare Überstandsflüssigkeit verworfen. Diese Prozedur wird unter Verwendung einer Natriumchlorid-Konzentration von 0,1 Molar und 0,05% CCP wiederholt. Die Mischung wird wie zuvor zentrifugiert und der klare Überstand ausge tragen. Diese Prozedur wird wenigstens noch einmal unter Verwendung von 0,1 Molar Natriumchlorid mit 0,05% CCP wiederholt. Die Waschlösungen werden dann ausgetragen. Die Extraktion des Präzipitats dieses Schritts wird wenigstens 3 oder 4 Male unter Verwendung von 0,25 M Natriumchlorid durchgeführt, wobei bei jedem Schritt kleinere Volumina von 3000 L, 500 L, 500 L und 500 L verwendet werden, und wobei die Hyaluronsäure in jedem Extrakt gemessen wird. Der Hyaluronsäure-Gehalt der Extrakte erstreckt sich von 2-3, 1-3, 0,2-1 und 0 bis 0,6 mg/ml, wobei die Hyaluronsäure in jedem Extrakt gemessen wurde. Der Hyaluronsäure-Gehalt reicht in den Extrakten von 2-3, 1-3, 0,2-1 und 0 bis 0,6 mg/ml. Die Extraktüberstände werden in einen 5000 L S/S-Behälter überführt und das Präzipitat ausgetragen.

Dieses Verfahren ist wichtig für die Isolation von reiner Hyaluronsäure und die Elimination von anderen CCP-komplexierenden Mucopolysacchariden. Der Extraktüberstand wird unter Rühren auf eine Temperatur von etwa 50°C gebracht und NaCl wird hinzugefügt, um die Mischung auf etwa 0,33 Molar zu bringen. 1,0 kg CCP wird hinzugefügt, während die Mischung für etwa 12 Stunden unter ständigem Rühren auf einer Temperatur von etwa 50°C gehalten wird. Die Mischung wird auf etwa 25°C während einer Zeit von bis zu etwa 5 Stunden abgekühlt; während dieser Zeit wird dem Präzipitat erlaubt sich abzusetzen. Das gebildete Präzipitat enthält Unreinheiten und wird mittels Filtration durch eine Filterpresse auf Celit-535 beschichteten Tampons gesammelt. Die klare wäßrige Lösung wird unter Druck durch ein 0,7 µ-Filter refil triert und der Überstand wird für eine nachfolgende Ultrafiltration abgetrennt.

Die überstehende Flüssigkeit wird bei konstantem Volumen während die Lösung auf 0,33M Natriumchlorid gehalten wird, bis das Äquivalent von 3 ursprünglichen Volumina filtriert sind. Das Filtrat wird dann mittels einer weiteren Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit Ausschlußlimits von 300 000 DDS konzentriert.

Dieser Schritt eleminiert niedermolekulare Hyaluronsäure- Fraktionen, die an Peptide gebunden sein können.

Die konzentrierte Lösung wird unter Rühren bei etwa 60 rpm für etwa 4 Stunden bei einer kontrollierten Temperatur von etwa 20°C mit 2 Volumen 95%igem Ethanol präzipitiert. Dem Präzipitat wird erlaubt sich abzusetzen, wonach dieses dann durch Zentrifugation gesammelt und der Überstand ausgetragen wird. Das Präzipitat wird in 1000 L einer 0,1M Natriumchlorid-Lösung gelöst und mit 3 Volumina 95%igem Ethanol unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie in dem vorhergehenden Schritt repräzipi tiert. Das Präzipitat wird dann gesammelt und drei Male mit 70%igem Ethanol unter Verwendung von 500 L, 250 L und 250 L Volumen und dann drei Male mit absolutem Ethanol mit Volumina von 500 L, 250 L und 250 L gewaschen. Das Präzipitat wird dann drei Male mit 500 L, 250 L und 250 L von wasserfreiem Aceton gewaschen.

Diese Phase ist wichtig zur Reinigung der Hyaluronsäure von dem CCP-Komplex und von anderen Substanzen, die durch die verschiedenen vorhergehenden Schritte geschleppt worden sein können.

Das feste Präzipitatmaterial wird dann unter Vakuum bei 1-10^-2 Torr und 30°C während 60 Stunden getrocknet.

Diese Prozedur ergibt 2,0-2,5 kg Natrium-Hyaluronat pro 1000 kg rohen Hahnenkämmen. Die Spezifikationen der bei der Reinigung von Hyaluronsäure verwendeten Reagen zien sind unten aufgeführt:

Aceton:
U. S. P. XX
Natriumchlorid:	U. S. P. XX
Cetylpyridinchlorid:	U. S. P. XX
Ethanol:	U. S. P. XX - denaturiert durch die Zugabe von 1%Toluol
Wasser:	Leitungswasser wurde gereinigt durch Umkehrosmose bis zu einer elektrischen Leitfähigkeit von 30 micro ms.

Es wird angenommen, daß die Abwesenheit von histaminähn lichen Substanzen in der gemäß der oben beschriebenen Methode hergestellten Hyaluronsäure das gereinigte Natrium-Hyaluronat insbesondere für seine Verwendung für kosmetische Formulierungen geeignet macht. Diesbezüglich kann die Abwesenheit von histaminähnlichen Substanzen in Hyaluronsäure unter Verwendung des folgenden Verfahrens bestimmt werden:

Der Test auf histaminähnliche Substanzen wurde in verschiedenen aufeinanderfolgenden Materialpartien durchgeführt. Daten für drei folgende Partien, zeigten die Abwesenheit von derartigen Substanzen an. Bei dem verwendeten Test handelt es sich um die Meer schwein-Intestinal-Streifenpräparation, die in den meisten amtlichen Arzneibüchern beschrieben ist. Ein Meerschwein mit einem Gewicht von zwischen 200 und 350 g wird getötet (Cranial Trauma) und ausgeblutet. Das Ileum wird von dem Punkt der Ileocoecal-Verbindung herausgeschnitten. Die ersten 10 cm des Darm werden aufgrund der Anwesenheit von Peyerplaque herausgeschnitten, die die Präparation extrem instabil machen würden, zurückzuführen auf das in den Plaques enthaltenen Histamin. Das verbleibende Darmstück wird durch und durch mit einer voroxygenierten Lösung, die bei einer höheren Temperatur als Raumtemperatur gehalten wurde, gewaschen. Diese Lösung, die ebenso für die Inkubation des Streifens verwendet wird, setzt sich wie folgt zusammen:

Konzentrierte physiologische Kochsalzlösung (50 ml), folgenderweise formuliert:

Auf diese Weise wird eine sehr stabile Basislinie ohne systematische Fehler zwischen peristaltischen Bewegungen und Reaktionsbewegungen gegenüber exogenem Histamin erreicht.

Ein 4 cm langer Streifen des Ileums wird an beiden Enden mit einem dünnen Seidenfaden befestigt, ohne das intestinale Lumen zu verstopfen. Ein Ende ist an dem Boden des Inkubationsbades befestigt, in welchem das Organ mittels Mischung aus O₂ und CO₂ (95%+5%) oxygeniert wird. Die Temperatur des Bades wird konstant bei 37°C gehalten. Das andere Ende ist an einem iso tonischen Überträger befestigt, der mit einem Instrument zur Aufzeichnung von Oscillationen verbunden ist. Nach Oxygenierung hat die Inkubationsflüssigkeit einen pH von 7,3-7,4. Nach einer Stunde Rückstellung, während der die Präparation wiederholt gewaschen wird, kann der Test gestartet werden.

Organkontraktion wird alle 10 Minuten durch wiederholte Zugabe von Histamindihydrochlorid (Endkonzentration 0,1 µg/ml) angezeigt, bis man 2-3 gleiche Antworten erhält. Wiederholte Waschungen finden statt nachdem eine maximale Kontraktion induziert wurde, die auf dem Kymograph-Rekorder aufgezeichnet wird, so daß ein Rückkehren zu Grundlinienwerten (maximale Ausdehnung) ermöglicht wird. Alle 5 Minuten werden zusätzliche ganzheitliche Waschungen durchgeführt. Das verwendete Histamin wird in der Inkubationsflüssigkeit gelöst und bevor man die Menge, die eine Endkonzentration von 0,1 µg/ml (0,2 ml) ergibt, zusetzt, wird die gleiche Flüssigkeitsmenge aus dem Bad genommen.

Wenn sich eine Basislinie etabliert hat, wird eine Probe Natrium-Hyaluronat in einem Volumen von 0,5ml (nach Wegnahme von 0,5 ml aus dem Bad) hinzugegeben. Diese Probe wird aus einer 10 mg/ml-Lösung in 0,9% NaCl hergestellt. Da das Inkubationsbad eine Kapazität von 6,5 ml hat, erreicht die Endkonzentration an Natrium-Hyaluronat in dem Bad 769,23 µg/ml. Während 10 Minuten wird die Abwesenheit von Kontraktionen aufgezeichnet, wonach, ohne zu Waschen, 0,1 µg/ml Histamin in das Bad eingetragen werden. Die resultierende Kontraktion sollte den Kontrak tionen gleichen, die vorher in der Abwesenheit von Natrium-Hyaluronat induziert wurden.

Zeigt die Testprobe, die eine Partie respräsentiert, keine histaminähnliche Antwort, wird diese als frei von histaminähnlichen Substanzen deklariert.

Das erfindungsgemäß hergestellte und in kosmetischen Formulierungen verwendete Natrium-Hyaluronat ist ein weiches, weißes, geruchloses hygroskopisches Pulver, das wasserlöslich, nicht dialysierbar und unlöslich in organischen Lösungsmitteln ist. Es kann mittels Elektro phorese auf Zellulose-Acetat-Streifen identifiziert werden, auf denen die Wanderung der Probe mit der eines Standards verglichen wird. Die Sichtbarmachung erfolgt mit Phtalocyaninblau. Die Anwesenheit von Natrium wird in der sulfatierten Hyaluronsäure-Asche unter Zuhilfenahme von Atom-Absorptions-Spektrophotometrie detektiert. Die Anwesenheit von sulfatierten Mucopolysacchariden wie z.B. Chrondroitin-Sulfat kann mittels der vorhergehend genannten Elektrophorese-Methode detektiert werden. Die sulfatierten Verbindungen haben einen höheren Rf als Hyaluronsäure. Die Anwesenheit von sulfatierten Mucopoly sacchariden wird qantifiziert durch Messung des Sulfat gehaltes eines Perchlorsäuredigestes von Natrium-Hyaluronat unter Verwendung der weiter unten beschriebe nen analytischen Methode.

Vorzugsweise enthält das Natrium-Hyaluronat nicht mehr als 0,5 mg sulfatierte Mucopolysaccharide pro 100 g Natrium-Hyaluronat, bestimmt als Extinktionsablesung, die 0,018 nicht überschreiten sollte (100 µg SO₄ hat eine Extinktion von 0,18 bei 660 nm), nicht mehr als 100 ppm Eisen, bestimmt mittels Atom-Absorptions-Spektrometrie, und nicht mehr als 10 ppm Blei, bestimmt durch Atom- Absorptions-Spektrometrie. Mittels Dünnschicht-Chromato graphie wird die Anwesenheit von freier Glucuronsäure, Glucosamin und N-Acetylglucosamin bestimmt. In 300 µg Natrium-Hyaluronat sind alle Verbindungen (außer Aminosäuren) zu einem nicht detektierbaren Gehalt vorhanden, im Vergleich zu den auf der Platte aufgetra genen Standards:

Glucosamin:\|0,5 µg
Glucuronsäure:	5,0 µg
N-Acetylglucosamin:	5,0 µg
Aminosäuren:	0,5 µg

Das erfindungsgemäß hergestellte Natrium-Hyaluronat besitzt ein Molekulargewicht innerhalb des Bereiches von etwa 600 000-700 000, gemessen mit einem automatischen Haney-Viscometer, und weist einen Proteingehalt von weniger als etwa 0,4% (Lowry) auf, und zeigt einen UV-Extinktions-Koeffizient von E (257 nm) = weniger als 0,230; und E (290 nm) = weniger als 0,190. Der pH ist vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 7,5-7,7.

Der Hyaluronsäure-Test basiert auf der Messung von stöchiometrischen Mengen an Glucuronsäure, die aus Hyaluronsäure freigesetzt wird, gefolgt von Säurehydro lyse, die nicht weniger als 97% und nicht mehr als 102%, kalkuliert in bezug auf das Trockengewicht, sein sollte.

Ein alternatives Test-Verfahren kann verwendet werden, daß auf dem elektrophoretischen Identitätstest (A) nach Elution der mit Phtalocyaninblau angefärbten Hyaluronsäu re-Bande mit Eisessig und Ablesen der O.D. bei 670 nm gegenüber einem Standard, von nicht weniger als 97% und nicht mehr als 102%, kalkuliert in bezug auf das Trockengewicht, basiert.

Eine bevorzugte analytische Methode schließt elektropho retische Identifikation und eine Prüfung des Hyaluron säure-Materials ein, wobei folgendes verwendet wird:
ELVI oder eine geeignete ähnliche Elektrophorese-Apparatur;
Zellulose-Acetat-Streifen 10×2,7 cm;
Phtalocyaninblau (Colorindex 74240) 1%ige Lösung in 0,01 N Hydrochlorsäure, frisch zubereitet;
eine Waschlösung: 0,01 N-HCl-Lösung;
eine Pufferlösung: pH 8,6, Ionenstärke 0,025;
Diethylbarbitursäure und ihr Natriumsalz.

Ein 10 µl Aliquot einer wäßrigen Lösung der Testsubstanz (2 mg/ml enthaltend) wird auf den negativen Pol des Streifens aufgebracht. Elektrophorese wird bei 300 V für 20 Minuten durchgeführt. Der Streifen wird entfernt und in die Phtalocyaninblau-Lösung für 5 Minuten einge taucht. Der nicht fixierte Farbstoff wird durch wieder holte Waschungen mit 0,01 normaler HCl-Lösung wegge waschen. Als Resultat ergibt sich eine einzelne, blau gefärbte Bande (vergleichbar mit einem geeigneten Standard), die die Hyaluronsäure darstellt, wie in Fig. 1 illustriert ist.

Andere Mucopolysaccharide als Hyaluronsäure können durch das vorhergehend beschriebene elektrophoretische Verfahren detektiert werden. Beispielsweise kann der Streifen in Ergänzung zu der charakteristischen blauen Natrium-Hyaluronatbande eine schwache Bande mit höherem Rf, wie beispielsweise in Fig. 2 gezeigt, aufweisen. Diesbezüglich zeigt Fig. 2 anstelle von einer Bande, zwei Banden: die erste ist Natrium-Hyaluronat, resultierend vom Auftrag des 10 µl Aliquots; die zweite, weniger deutliche Bande stellt ein anderes Mucopolysaccharid als Natrium-Hyaluronat, nämlich Chrondroitin-Sulfat dar, resultierend von dem Auftrag eines 0,4 µg Aliquots. Das gemäß der Erfindung hergestellte Natrium-Hyaluronat sollte vorzugsweise nicht mehr als 0,5% andere Mucopoly saccharide als Hyaluronsäure enthalten.

Insofern als im wesentlichen alle Mucopolysaccharide, die als Unreinheiten anwesend sind, sulfatierte Mucopolysac charide darstellen, die annähernd 10% SO₄ ^-- enthalten, stellt die Prüfung auf SO₄ ^-- eine indirekte Methode zur Bestimmung dieser Unreinheiten dar.

In diesem Zusammenhang wird das organische Material oxidiert, so daß Na₂SO₄ gebildet wird, gefolgt von der SO₄ ^-- Präzipitation mit Bariumchlorid und Ablesen der Trübung.

In einem Pyrex-Probengefäß wird etwa 20 mg Testmaterial gewogen und 1 ml sulfatfreier, 70%iger HClO₄ hinzugegeben; das Probengefäß wird in ein Sandbad bei 180°C mit einem Ausdehnungsgefäß aus Glas, wie in Fig. 3 gezeigt, gestellt, bis die Mineralisierung vollständig ist. Darauf folgend wird das Probengefäß über einer Flamme getrock net, abgekühlt, wonach der Rückstand mit wenigen Tropfen konzentrierter HCl aufgenommen und wiederum getrocknet wird, so daß Hydrochlorsäure und nitrose Gase nicht mehr vorhanden sind. Das Probengefäß mit seinem Inhalt wird erneut abgekühlt und der Rückstand mit 2 ml 1N HCl gelöst, wonach 2 ml einer 5%igen Bariumchloridlösung hinzugegeben werden. Diese resultierende Lösung wird gerührt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Extinktion bei 660 nm wird gegenüber einem Reagenzien lehrwert abgelesen. Insofern als 100 µg SO₄ ^-- einen Extinktionswert von 0,180 ergeben, darf dieser Test nur eine Extinktion anzeigen, die 0,018 nicht überschreitet, 0,5 mg sulfatierte Mucopolysaccharide in 100 mg (0,5%) des Testproduktes (oberes Limit) repräsentierend.

Mit Hilfe der folgenden Verfahren wird die Anwesenheit von Eisen, Blei, freier Glucuronsäure, N-Acetalglucosamin nachgewiesen.

Zur Bestimmung des anwesenden Eisens wurden 100 mg Na-HA genau gewogen und in 10 ml 1N HCl gelöst. Die Absorption bei der geeigneten Wellenlänge wird unter Verwendung eines geeigneten Atom-Absorptions-Meßgerätes gegenüber ähnlich hergestellten Standards abgelesen.

Die Hyaluronsäure-Fraktion (Na-HA) gemäß der vorliegenden Erfindung sollte nicht mehr als 100 ppm Eisen enthalten.

Um die Anwesenheit von Blei zu detektieren, wurden 100 mg von Na-HA genau gewogen und in 10 ml von 1N HCl gelöst. Die Absorption wird bei einer geeigneten Wellenlänge unter Verwendung eines geeigneten Atom-Absorptions- Meßgerät gegenüber einem ähnlich hergestellten Standard gemessen. Na-HA gemäß der vorliegenden Erfindung sollte nicht mehr als 10 ppm Blei enthalten.

Das folgende Verfahren wird benutzt um die Anwesenheit von freier Glucronsäure, N-Acetylglucosamin und Glucosamin zu bestimmen.

Auf einer Kieselgel-60-Platte werden 0,5 µg Glucosamin, 5 µg N-Acetylglucosamin und 300 µg Natrium-Hyaluronat aufgetragen und danach mit einem Ethanol-Wasser-Laufmit tel (67.33), das Ninhydrin (50 mg/100 ml) enthält, ent wickelt und danach die Platte auf 100°C erwärmt. Glucosamin wird als rosa Punkt mit einem Rf von annähernd 0,02 entwickelt. Wenn andere rosa Punkte mit verschie denen Rf erscheinen, repräsentieren diese verschiedene Aminosäuren. Die Glucuronsäure (Rf ca. 0,65) und N- Acetylglucosamin (Rf ca. 0,7) darstellenden Flecke werden unter Verwendung von Joddampf (Sensitivität 5 µg) sichtbar gemacht.

Das Na-HA sollte so geprüft werden, daß augenscheinlich keine anderen Komponenten mehr anwesend sind. Daher sind freie Glucuronsäure, N-Acetylglucosamin und Glucosamin in Na-HA gemäß der Erfindung nur in Konzentrationen anwesend, die unterhalb der Sensitivität des Verfahrens liegen.

Für Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Molekular gewicht, das innerhalb des Bereiches von 600 000 bis 700 00 liegt, von Na-HA unter Verwendung eines Haney-Auto matik-Viscometers bestimmt. Ein typisches Verfahren für eine derartige Bestimmung umfaßt: Herstellung einer 0,05M-Natriumsulfatlösung und deionie siertes Wasser, Filtrierung von zwei Litern der 0,05 Molen Natriumsulfatlösung unter Verwendung eines Vakuumfiltriergefäßes, bevor ein Liter der filtrierten 0,05 Molaren Natriumsulfatlösung in eine Lösungsmit telkontrolleinrichtung überführt wird. 2 ml Na-HA werden dann zu 100 ml der 0,05 Molaren Natriumsulfatlösung gefügt, so daß sich eine Standardlösung ergibt. Die Standardlösung wird dann in ein Differentialviskometer (Modell 100) injiziert und das Differentialviskometer wird bei 30°C mit dieser Standardlösung kalibriert. Eine zu analysierende Probe wird dann in das Differentialvis kometer injiziert und die Viskosität aufgrund der Daten mit Hilfe eines Personal-Computers kalkuliert.

Der Proteingehalt von Na-HA der vorliegenden Erfindung soll weniger als 0,2% sein, wobei die Lowry-Methode und Serum Albumin als Standard verwendet werden.

Die Lowry-Methode zur Bestimmung von Protein enthält zuerst die Herstellung von Standards durch Verdünnen einer Protein-Standardlösung mit Wasser auf ein Volumen von 1,0 ml in vorher markierten Probengefäßen:

Ein Probengefäß wird mit "Leerwert" markiert und 1,0 ml Wasser werden dann in dieses "Leerwert"-Probengefäß gegeben. Andere Proben werden dann in vorher markierte Probengefäße gegeben und mit Wasser auf 1,0 ml Endvolumen verdünnt. 1,0 ml Lowry-Reagenzlösung wird dann zu jeder Probe hinzugegeben und daraufhin wird gut gemischt. Die Lösungen werden bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehengelassen, gefolgt von sofortigem und schnellem Mixen werden 0,5 ml Folin & Ciocalteu′s-Phenol-Reagenz zu jeder Probe hinzugegeben.

Während 30 Minuten kann sich die Farbe entwickeln, wonach die Lösungen in Küvetten transferiert und die Absorption der Standards und Proben gegenüber dem Leerwert bei einer Wellenlänge von zwischen 500 und 800 nm gemessen werden, wobei die Messung innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen sein soll.

Die Absorptionswerte der Standards werden gegenüber ihren Protein-Konzentrationen aufgetragen, um eine Eichkurve zu erhalten.

Die Protein-Konzentrationen der anderen Probengefäße werden mit Hilfe der Eichkurve bestimmt. Das Ergebnis wird mit dem erforderlichen Verdünnungsfaktor multi pliziert, um die ursprüngliche Protein-Konzentration der Ausgangsprobe zu erhalten.

Charakterisierung von Polymeren und und dem erfin dungsgemäßen Na-HA kann unter Verwendung der Viskosität der Lösung, insbesondere unter Anwendung eines Hanley automatischen-Viskosimeters durchgeführt werden. Dies ist die schnellste und einfachste Methode zur Messung des Molekulargewichts der Polymeren auf einer relativen Basis. Die differentielle Messung basiert auf einer Flüssigkeit analog der Wheatstonschen Brücke. Der differentielle Druck über dieser Brücke wird kontinuier lich aufgezeichnet und sobald der Durchlauf abgeschlossen ist, berechnet ein Computer die wirkliche Viskosität. In Abhängigkeit davon wird das Molekulargewicht unter Heranziehung der wirklichen Viskosität und Polymerkon stanten berechnet.

Im folgenden werden Untersuchungsmethoden, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beschrieben.

Der colorimetrische Test der Mucopolysaccharide besteht aus der colorimetrischen Bestimmung der Glucuronsäure hälfte des Mucopolysaccharid-Moleküls. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung enthält der Test auf Natrium- Hyaluronat (einen Mucopolysaccharid) eine colorimetrische Bestimmung des Glucuronsäureanteils des Natrium-Hyaluro nat-Moleküls. Der Test wird durchgeführt unter Verwendung einer geeigneten Glucuronsäure.

Der Test wird wiederholt unter Verwendung eines geeig neten Glucuronsäure-Standards (STD), um geringe Ab weichungen der Extinktion auszugleichen, zurückzuführen auf Differenzen bei den Erwärmungs- und Abkühlungszeiten. Zur Herstellung der Standard-Glucuronsäure-Lösung werden 52 mg D-Glucuronsäuresalz (99%), das 889.3 mg D-Glucuron säure per g enthält, in einem 100 ml Gefäß eingewogen und mit Wasser verdünnt, gefolgt von Mischen und Ultra schallbehandlung für 3 Minuten. Ein 10,0 ml Aliqout wird in ein 100 ml-Gefäß pipettiert, auf dieses Volumen (100 ml) mit Wasser aufgefüllt, gemischt und für 3 Minuten mit Ultraschall behandelt, so daß eine Konzentration von 46,2 µg D-Glucuronsäure pro ml resultiert.

Für das Natrium-Hyaluronat-Testmaterial wird eine wäßrige Lösung mit 100 µg/ml Natrium-Hyaluronat durch fortlaufende Verdünnung hergestellt. Dies beinhaltet das Einwiegen von 10 mg Natrium-Hyaluronat-Standard in ein 100 ml-Gefäß, Verdünnung mit Wasser und Ultraschallbehand lung für drei Minuten, so daß eine Lösung mit 0,1 mg Natrium-Hyaluronat/ml resultiert. Ein 1 ml Natrium- Hyaluronat-Aliqout wird in ein maßanalytisches Gefäß pipettiert, auf das Endvolumen mit Wasser verdünnt, gemischt und für 3 Minuten mit Ultraschall behandelt.

Zur Standard-Glucuronsäure-Lösung muß eine wäßrige Lösung mit 0,0462 mg/ml Glucuronsäure frisch hergestellt werden, wiederum durch Herstellung von aufeinanderfolgen den Verdünnungen.

Reagenz A wird hergestellt durch Lösen von 1,9 g Natrium- Tetraborat in 100 ml konzentrierter Schwefelsäure. Dieses Reagenz ist im Kühlschrank für mehrere Monate stabil.

Reagenz B wird hergestellt durch Lösen von 125 mg Carbazol in 100 ml absolutem Ethanol. Dieses Reagenz hat eine Stabilität von 2 Wochen, wenn es in einer Braunglas flasche im Kühlschrank aufbewahrt wird.

Zu einer Serie von 6 Probengefäßen werden 10 ml Reagenz A hinzugefügt; alle Probengefäße werden in ein Eiswasserbad gestellt. Für den Leerwert werden zu dem ersten Proben gefäß 2,0 ml Wasser und 2,0 ml der Natrium-Hyaluronat- Standardlösung hinzugefügt. Zu zwei anderen Probengefäßen werden 2,0 ml der Glucuronsäure-Standardlösung hinzu gefügt. Zu weiteren zwei Probengefäßen werden 2,0 ml der Probenpräparationen hinzugefügt. Die Probengefäße werden vor einem ersten sanften Umrühren verschlossen und dann stark umgeschüttelt. Die Probengefäße werden dann in ein kochendes Wasser- oder Dampfbad unter Verwendung der in Fig. 3 gezeigten oder einer ähnlichen Rückflußapparatur über 10 Minuten transferiert und dann in Eiswasser abgekühlt. 0,5 ml Reagenz B wird dann hinzugefügt und man schüttelt das Probengefäß stark, bevor für 15 Minuten eine Erwärmung in dem Bad erfolgt bis sich eine rote Färbung entwickelt. Die Probengefäße werden dann auf Raumtemperatur unter Wasser abgekühlt und dann die Extinktion gegenüber dem Leerwert bei 530 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen.

Die Farbe ist für wenigstens zwei Stunden stabil.

Die Extinktionswerte von Test- und Standard-Material sollten annähernd die gleichen sein, da die Menge an Glucuronsäure im Testmaterial ähnlich dem des Standards ist, wie durch die folgende Formel gezeigt wird:

Alternativ kann dies wie folgt ausgedrückt werden:

worin bedeuten:
0,8893
	= Korrekturfaktor für die Glucuronsäurelösung.
	= 99% in Form von reiner Glucuronsäure.
Asp	= Absorption der Proben
Astd	= Absorption des Glucuronsäurestandards.

Das hier benutzte reine Natrium-Hyaluronat enthält 46,297% Glucuronsäure.

Die Natrium-Hyaluronat-Testsubstanz wird geprüft unter Verwendung einer Elektrophoresetechnik, in dem man 10 µl einer wäßrigen Hyaluronat-Lösung (2 mg/ml) auf drei Elektrophorese-Streifen aufträgt, wobei parallel dazu drei weitere Streifen mit aufgebrachten Natrium-Hyaluro nat-Standards angeordnet werden. Nach Anfärben und Waschen wie vorher beschrieben, wird überflüssige Flüssigkeit von den Streifen mit Filterpapier entfernt. Darauf erfolgt eine komplette Trocknung bei Raumtempera tur. Der Bereich, der die Bande enthält, wird von jedem Streifen ausgeschnitten und in ein Probengefäß, das 2 ml Eisessig enthält, gebracht. Die Probengefäße werden in ein Wasserbad bei 30°C bis 40°C gestellt und ab und zu geschüttelt, so daß eine feine Dispersion gewährleistet ist. 1 ml Wasser wird hinzugegeben, bevor man wiederum umrührt. Die erhaltene Lösung sollte klar und hellblau gefärbt sein. Die Farbe ist stabil und folgt dem Lambert-Beerschen Gesetz für Natrium-Hyaluronat-Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 mg; die Verweilzeit des Streifens in der Anfärbelösung ist nicht problematisch, da verlängerte Extraktion lediglich in einer vernachlässig baren Farbänderung resultiert.

Die optische Dichte der Lösung wird bestimmt in einem geeigneten Spektrophotometer bei 620 nm gegenüber einem Leerwert, der aus einem Streifenabschnitt weit entfernt von der Bande wie oben beschrieben, erhalten wird. Der Leerwert sollte zwischen 0,020 und 0,040 liegen. Die Extinktionswerte der Banden, die 0,020 mg der Standards repräsentieren, sollte zwischen 0,24 und 0,26 liegen, wobei die folgende Formel Anwendung findet:

wobei der Extinktionswert die mittlere optische Dichte (OD) von 3 Lösungen darstellt.

Die Präzision und Abweichung des elektrophoretischen Tests kann wie folgt kalkuliert werden:

Die Präzision wird kalkuliert als der %-Koeffizient der Variation (K.V.%):

worin bedeuten:
S = Standardabweichung und
X = Mittelwert der Ablesungen (12 Ablesungen in Dreiergruppen).

Die Standardabweichung ist die Quadratwurzel der Varianz, oder mittlerer guadratischer Fehler. Die Varianz (S ²) wird erhalten durch Division der Summe der Quadrate der Streuung von dem Mittelwert durch die Anzahl der Freiheitsgrade (n-1), wobei n die Zahl der für die Kalkulation verwendeten Bestimmungen ist.

Die Abweichung wird kalkuliert als:

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Natrium-Hyaluronat (Na-HA) charakterisiert.

Na-HA ist eine klare, farblose, viskose, wäßrige Lösung. Die Anwesenheit von Na-HA wird bestimmt durch das elektrophoretische Verfahren. Die charakteristische HA-Bande mit zu einem Standard vergleichbaren Rf sollte mittels Phtalocyaninblau sichtbar gemacht werden.

Glucuronsäure, Glucosamin und N-Acetylglucosamin werden durch Dünnschicht-Chromatographie einer säurehydrolysier ten Probe von Natrium-HA unter Sichtbarmachung mittels Ninhydrin und Joddampf identifiziert.

Die Anwesenheit von Natrium wird in der sulfatierten Asche von HA mittels Atom-Absorptions-Spektrophotometrie detektiert.

Der pH von HA liegt innerhalb des Bereiches von 7,5-7,7 (elektrometrische Messung).

Die Abwesenheit von Unreinheiten wie z.B. sulfatierte Mucopolysaccharide und Aminosäuren und Abbauprodukte wie Glucuronsäure, Glucosamin und N-Acetylglucosamin in einer nicht hydrolysierten Probe wird mittels der Dünnschicht chromatographischen-Methode nachgewiesen, wodurch solche Unreinheiten nicht detektiert werden konnten.

Die HA-Untersuchung basiert auf der Messung von stöchio metrischen, aus HA nach Säurehydrolyse freigesetzten Glucuronsäuremengen unter Verwendung der Carbazol-Reak tion, d.h. zwischen 97 und 102% der markierten Menge.

Das Füllvolumen erfüllt die Bedingungen des amtlichen Arzneibuches der Vereinigten Staaten von Amerika (U.S.P. XX) für Überschußfüllvolumina (Seite 8670).

Die Abwesenheit von Pyrogenen erfüllt die Bedingungen des U.S.P. XX (Seite 907), wobei der Inhalt eines Glasfläschens pro Kaninchen verwendet wird.

Die Na-HA-Sterilität erfüllt die Bedingungen des U.S.P. XX (Seite 878).

Der Gehalt an Methyl-PHB-Estern wird bestimmt mittels der U.S.P. XX- Dünnschicht-chromatographischen-Methode, oder einem geeigneten alternativen Verfahren.

Im folgenden wird ein bevorzugtes Verfahren zur Herstel lung von kosmetischen Formulierungen aus gereinigtem Natrium-Hyaluronat, das gemäß der vorhergehend aufge führten erfindungsgemäßen Methode erhalten wurde, beschrieben.

In einen sauberen, rostfreien Stahlbehälter, der mit einem Rührwerk und einem Thermostat ausgerüstet ist, werden 250 L doppelt destiliertes Wasser und Methyl-PHB-Ester eingebracht und auf etwa 60°C bis 90°C erwärmt. Daraufhin wird Natrium-Hyaluronat hinzugefügt, bis dieses vollständig gelöst ist, aber vorzugsweise während einer Zeit von wenigstens 4 Stunden, nach der die Mischung auf etwa 25°C unter langsamem Rühren abgekühlt wird. Der pH sollte mit 1 N Natronlauge oder 1 N Salzsäure, wie gewünscht, auf etwa zwischen 7,5-7,7 eingestellt werden, wonach Wasser für Injektionszwecke (U.S.P.) bis auf ein Endvolumen von etwa 300 L hinzugegeben wird. Die Lösung wird dann unter Stickstoffdruck durch eine 0,8 µ Pall AXP-Membran filtriert und dann in eine 30 ml Flasche (farbloses, neutrales Glas) gefüllt.

Eine bevorzugte kosmetische Formulierung ist

Natrium-Hyaluronat\|3000 g
Methyl-PHB-Ester	600 g
Wasser für Injektionszwecke (U. S. P.)	300 L

Labortests haben gezeigt, daß die Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten gemäß der vorliegen den Erfindung eine viel größere Reinheit als andere Hautpflegeprodukte auf Basis von Hyaluronat aufweisen.

Die HPLC-Gel-Ausschlußmethode wird zur Bestimmung der Natrium-Hyaluronat-Konzentration in der erfindungsgemäßen Formulierung im Vergleich zu anderen Natrium-Hyaluronat enthaltenden Formulierungen, die kommerziell verfügbar sind, verwendet. Das Verfahren umfaßt: Einwiegen von exakt 1,0 g Natrium-Hyaluronat in einen 100 ml Meßkolben, gefolgt von Mischen und Auffüllen auf dieses Volumen, so daß eine Konzentration von 10 mg pro ml resultiert. 2,0 ml HA Vorratslösung werden in einen 10 ml Meßkolben pipet tiert und bis zur Meßmarke mit Wasser aufgefüllt und durch und durch gemischt.

2,0 ml Formulierungs-Lösungen, die Natrium-Hyaluronat enthalten, werden in einen 10 ml-Meßkolben pipettiert, auf die Meßmarke mit Wasser aufgefüllt und durch und durch gemischt.

Ein Flüssig-Chromatograph wird gestartet bis durch die Parameter und den Betrieb bei einer Durchflußrate von 1,5 ml/Minute eine stabile Grundlinie erhalten wird. Um die Säule gegenüber Schwankungen in der Umgebungstem peratur zu schützen, ist diese mit einem geeigneten Material isoliert und die Raumtemperatur wird soweit es möglich ist, konstant gehalten.

Ein Versuchslauf mit 20 µl externen Standart werden benö tigt, um dessen Retentionszeit feststellen zu können. 20 µl des externen Standards werden dann injiziert, so daß ein elektronischer Integrator kalibriert werden kann.

Die Berechnungen können ebenso mit Hilfe der Flächen unter der Kurve wie folgt durchgeführt werden:

Die Vergleichsergebnisse der erfindungsgemäßen Natrium-Hyaluronat-Formulierung im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Formulierungen sind in den Fig. 4 und 5 gezeigt.

Die vorliegende Erfindung ist daher auf die Bereitstel lung und Verwendung einer gereinigten, im wesentlichen pyrogenfreien, hitzesterilisierten Hyaluronsäure-Fraktion (HA) und die Herstellung von Formulierungen und Zusammen setzungen, die eine derartige für kosmetische Behandlung von menschlichem Gewebe verwendbare Hyaluronsäure-Fraktion zur Verminderung von Alterungsanzeichen oder durch Verbrennungen oder Abreibungen hervorgerufene Wunden enthalten, gerichtet. Die vorliegende Erfindung basiert darauf, daß überraschenderweise gefunden wurde, daß eine Hyaluronsäure-Fraktion sowohl sicher und effektiv ist in der Behandlung von verschiedenen Hautbeschaffenheiten, z.B. zur Behandlung von Alterungs falten oder exzessiver Umweltexposition als auch der Behandlung von Gewebe, das abgerieben oder verbrannt wurde.

In Fällen, in denen Wind oder im Übermaß Sonne Hautschä den einschließlich Trockenheit verursacht hat, sollten die Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheit gemäß der vorliegenden Erfindung mehrmals täglich angewendet werden, um die Haut in ihrer normaler Beschaffenheit innerhalb von wenigen Tagen wieder herzustellen. Zur Verjüngung und Wiederherstellung von Haut, die Alterungszeichen, wie z.B. Trockenheit, Falten, rauhe Flecke und Pigmentänderungen zeigt, sollten die erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten auf die frisch gereinigte Haut ein- oder zweimal täglich aufgetragen werden. Die erfin dungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbe schaffenheiten können als Grundlage für Make-up oder als Über-Nacht-Behandlung verwendet werden. Es wird daher angenommen, daß regelmäßige Anwendungen der erfindungs gemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffen heiten daher helfen, eine jugendliche Erscheinung zu gewährleisten und die Haut gegenüber Umweltfaktoren, die den Hautalterungsprozeß beschleunigen, zu schützen.

Zum Erzielen von hervorragenden Ergebnissen, sollten die erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten großzügig über die ersten zwei oder drei Wochen angewendet werden, bis die Haut die benötigte Hyaluronat-Nahrung absorbiert hat. Danach sollte eine kleine Menge, wie weiter unten beschrieben, angewendet werden. Andere Wirkstoffe guter Qualität, wie z.B. Collagen, Elastin oder Liposomen können direkt auf die Haut aufgetragen werden, nachdem die erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten angewendet wurden.

Insbesondere sollten die erfindungsgemäßen Formulierungen zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten mit einem zusammengefalteten Baumwoll-Wattebausch auf die frisch gewaschene Haut des Gesichts und Nacken aufgetragen werden, bevor Nacht-Creme oder Feuchtigkeits-Creme, zweimal täglich, zur Schlafenszeit und am Morgen angewendet werden.

Claims

1. Hyaluronsäure-Fraktion, gekennzeichnet durch, wenigstens ein Merkmal ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) ein Molekulargewicht innerhalb des Bereiches von 500 000 bis 800 000;
b) weniger als etwa 1,25% sulfatierte Mucopolysac charide, bezogen auf das Gesamtgewicht;
c) weniger als etwa 0,6% Protein, bezogen auf das Gesamtgewicht;
d) weniger als etwa 150 ppm Eisen, bezogen auf das Gesamtgewicht;
e) weniger als etwa 15 ppm Blei, bezogen auf das Gesamtgewicht,;
f) weniger als 0,0025% Glucosamin;
g) weniger als 0,025% Glucuronsäure;
h) weniger als 0,025% N-Acetylglucosamin;
i) weniger als 0,0025% Aminosäuren;
j) ein UV-Extinktions-Koeffizient bei 257 nm von weniger als etwa 0,275;
k) ein UV-Extinktions-Koeffizient bei 280 nm von weniger als etwa 0,25;
l) ein pH innerhalb des Bereiches von 7,3-7,9.

2. Hyaluronsäure-Fraktion gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch, wenigstens ein charakteristisches Merkmal ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:.

a) ein Molekulargewicht innerhalb des Bereiches von 600 000 bis 700 000;
b) weniger als etwa 1% sulfatierte Mucopolysaccharide, bezogen auf das Gesamtgewicht;
c) etwa 0,4% Protein, bezogen auf das Gesamtge wicht;
d) weniger als etwa 100 ppm Eisen, bezogen auf das Gesamtgewicht;
e) weniger als etwa 10 ppm Blei, bezogen auf das Gesamtgewicht;
f) weniger als 0,00166% Glucosamin;
g) weniger als 0,0166% Glucuronsäure;
h) weniger als 0,0166% N-Acetylglucosamin;
i) weniger als 0,00166% Aminosäuren;
j) ein UV-Extinktions-Koeffizient bei 257 nm von weniger als etwa 0,23;
k) ein UV-Extinktions-Koeffizient bei 280 nm von weniger als etwa 0,19;
l) ein pH innerhalb des Bereiches von 7,5-7,7.

3. Hyaluronsäure-Fraktion gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronsäure-Fraktion ein mittleres Molekular gewicht innerhalb des Bereiches von 625 000 bis 675 000 aufweist.

4. Hyaluronsäure-Fraktion gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronsäure-Fraktion weniger als 0,5% sul fatierte Mucopolysaccharide, bezogen auf das Gesamtge wicht, enthält.

5. Hyaluronsäure-Fraktion gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronsäure-Fraktion in Form eines Salzes, insbesondere in Form des Natriumsalzes vorhanden ist.

6. Hyaluronsäure-Fraktion gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Natriumsalz Natrium-Hyaluronat ist.

7. Formulierung zur Behandlung von Hautbeschaffenheiten gekennzeichnet durch,

a) eine Hyaluronsäure-Fraktion gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, erhalten aus natürlichen Ausgangsmaterialien;
b) Konservierungsstoffe;
und
c) Wasser.

8. Formulierung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Konservierungsstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumbenzoat, Methyl-PHB-Ester, Propyl-PHB-Ester und Kombinationen von Natriumbenzoat, Methyl-PHB-Ester und Propyl-PHB-Ester.

9. Formulierung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Konservierungsstoff Methyl-PHB-Ester ist.

10. Formulierung gemäß den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierung, bezogen auf das Gesamtgewicht, enthält.:

- 1-1,2% Natrium-Hyaluronat;
- 0,2-0,25% Methyl-PHB-Ester;
und
- 98-99% Wasser.

11. Formulierung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierung, bezogen auf das Gesamtgewicht, enthält:

- etwa 1,0% Natrium-Hyaluronat;
- etwa 0,2% Methyl-PHB-Ester;
und als Rest Wasser.

12. Verfahren zur Herstellung einer Hyaluronsäure- Fraktion gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 aus natürlichen Hyaluronsäure-Ausgangsmaterialien, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen von Gewebe, das eine Hyaluronsäure- Fraktion enthält;
b) Zerkleinern des Gewebes in Partikel;
c) Unterziehen der Gewebeteile einer Aceton-Extraktion, die folgende Schritte enthält:
- aa) Mischen der Gewebepartikel mit Aceton zur Herstellung einer Aceton-Gewebepartikel- Mischung;
- bb) Absetzenlassen dieser Aceton-Gewebepartikel- Mischung; und
- cc) Entfernen des Aceton-Überstandes von diesen Gewebepartikeln;
d) Fortsetzen dieser Aceton-Extraktion zur Bildung von überstehendem Aceton, das weniger als etwa 5% Feuchtigkeit enthält;
e) Entfernen von Flüssigkeit aus den extrahierten Gewebepartikeln zur Herstellung eines trockenen Aceton-extrahierten Pulvers;
f) Einbringen von Papain zur Bildung einer Enzym-Puffer- Gewebe-Mischung;
h) Filtrieren dieser Enzym-Puffer-Gewebe-Mischung, so daß eine Flüssigkeit resultiert;
i) Ultrafiltration dieser Flüssigkeit, so daß ein Ultrafiltrat mit einem Volumen erhalten wird, das wenigstens 5× größer ist als das Volumen der Enzym- Puffer-Gewebe-Mischung;
j) Fortsetzen dieser Ultrafiltration bis im Permeat keine Aminosäuren mehr nachweisbar sind;
k) Reduktion dieses Ultrafiltrationsvolumens zur Herstellung einer konzentrierten Flüssigkeit;
l) Bildung eines im wesentlichen glycoproteinfreien Präzipitats, das Cetylpyridiniumchlorid enthält;
m) Unterwerfen dieses im wesentlichen glycoprotein freien, Cetylpyridiniumchlorid enthaltenden Präzipi tats, einer Extraktion mit einer Natriumchlorid- Lösung zur Gewinnung eines Extraktüberstandes, der Hyaluronsäure enthält;
n) Präzipitation von Unreinheiten aus diesem Extrakt überstand zur Herstellung einer im wesentlichen klaren, wässerigen Lösung;
o) Ultrafiltration dieser im wesentlichen klaren, wässerigen Lösung bei einem im wesentlichen konstan ten Volumen zur Bildung eines resultierenden Filtrats;
p) Konzentrieren dieses Filtrats durch Ultrafiltration des Filtrats mittels einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von etwa 300 DDS zur Entfernung von niedermolekularer Hyaluronsäure, so daß ein Kon zentrat hergestellt wird;
q) Präzipitation dieses Konzentrats in Alkohol;
r) Waschen des resultierenden Präzipitats mit wasser freiem Aceton zur Bildung eines im wesentlichen festen Präzipitats;
s) Trocknung dieses im wesentlichen festen Präzipitat materials, das die Hyaluronsäure-Fraktion enthält.

13. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung gemäß den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die folgenden Schritte enthält:

a) Bildung einer wässerigen Mischung bei einer Tempe ratur innerhalb des Bereiches von etwa 60°C bis 90°C, die eine Hyaluronsäure-Fraktion und Wasser in der resultierenden Lösung enthält;
b) Einstellen des pH der resultierenden Lösung, so daß eine pH-justierte Lösung, die eine Hyaluronsäure- Fraktion, Konservierungsstoffe und Wasser enthält, erhalten wird; und
c) Überführen dieser pH-eingestellten Lösung in Behälter.

14. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-eingestellte Lösung mit einer Wassermenge auf ein Endvolumen eingestellt wird, so daß eine wäßrige Formulierung mit folgender Zusammensetzung resultiert:

- 1-1,2% Natrium-Hyaluronat;
- 0,2-0,25% Methyl-PHB-Ester;
und
- 98-99% Wasser.

15. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die wässerige Formulierung, bezogen auf das Gesamt gewicht, enthält:

16. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Bildung der wässerigen Mischung umfaßt:

a) zur Verfügung stellen einer Hyaluronsäure-Fraktion;
b) Einbringung eines Konservierungsmittels, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methyl-Parahydroxyben zoat, Propyl-Parahydroxybenzoat, Natriumbenzoat und Mischungen derselben, in Wasser, das auf eine Temperatur innerhalb des Bereiches von etwa 60°C bis 90°C erwärmt wurde, so daß eine Konservierungsstoff- Lösung gebildet wird;
c) Hinzufügen und Lösen der Hyaluronsäure-Fraktion in der Konservierungsstoff-Lösung zur Bildung der resultierenden Lösung.

17. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Konservierungsmittel Methyl-PHB-Ester ist.

18. Verwendung der Formulierung gemäß den Ansprüchen 7 bis 11 zur Behandlung von Hautbe schaffenheiten dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierung lokal angewendet wird und daß die Hyaluronsäure-Fraktion in der Formulierung bei deren Anwendung in einer Menge anwesend ist, die effektiv ist, um sicher Hautbeschaffenheiten wie durch Alterung oder Umwelteinflüsse hervorgerufene Falten, abgeschabtes und verbranntes Gewebe zu behandeln.