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Verfahren zur Herstellung von kristallinem Insulin Bei der Herstellung
von kristallinem Insulin wird in der Regel das Insulin zur Kristallisation gebracht,
indem man das wässerige Medium durch Verschieben des pH-Wertes auf annähernd den
isoelektrischen Punkt des Insulins bringt. Wenn das Insulin selbst nicht von vornherein
ausreichende Mengen eines die Kristallisation fördernden Metalls, gewöhnlich Zink,
enthält, so werden dem Kristallisationsmedium solche Metalle zugesetzt. Zur Fixierung
des PH-Wertes werden Pufferstoffe verwendet.
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Bei der Kristallisation von Insulin nach den bekannten Verfahren besitzen
.die Kristalle ein sehr unterschiedliches Aussehen. Es hängt dies sowohl von der
Herkunft und vomReinheitsgrad des Insulins als auch von den Kristallisationsbedingungen
ab. Die Kristallstruktur des Insulins ist, wie Röntgenuntersuchungen ergeben haben,
rhomboedrisch. Die nach den üblichen Methoden hergestellten Kristalle erscheinen
jedoch nur selten als reguläre, durch ebene Kristallflächen begrenzte Rhomboeder.
Wenn das Insulin vor der Kristallisation geringe Mengen an Verunreinigungen enthält,
so fallen bei den üblichen Verfahren abgerundete Kristallkörper an, die als Sterne,
deformierte Rhomboeder, Zwillingsrhomboeder, Zitronen usw. ausgebildet sind und
einen Teil der Verunreinigungen des Ausgangsmaterials enthalten. Selbst bei wiederholter
Rekristallisation ist .es sehr oft unmöglich, reine rhomboedrische Kristallformen
zu erzielen. Derartig deformierte Kristalle ergeben sich auch bei einem zu niedrigen
pH-Wert
oder bei zu niedriger Zinkkonzentration auch dann, wenn
sehr reines Insulin zur Kristallisation gebracht wird.
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Es wurde nun gefunden, daß sich die Kristallisationsbedingungen verbessern
lassen, wenn man dem Kristallisationsmedium Halogene in. ionogener Form zusetzt.
Das Insulin kristallisiert dann ohne Rücksicht auf Herkunft und Reinheitsgrad besonders
rein und in rhomboedrischer Form als ein scharfkantiger, von ebenen Kristallflächen
begrenzter Kristallkörper. Es ist lediglich notwendig, daß, unter Einhaltung der
üblichen Kristallisationsbedingungen, das ionogene Halogen in einer Konzentration
von über o,2 Mol, höchstens jedoch 4 Mol, pro.Liter vorhanden ist.
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In Übereinstimmung mit dem Vorgesagten besteht also das kennzeichnende
Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahren darin, dem wässerigen Kristallisationsmedium
Halogene in ionogener Form in einer Konzentration von mehr als o,2 Mol pro Liter
zuzusetzen.
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Es ist bekannt, daß die Art des Säurerestes des bei der Kristallisation
des Insulins gewöhnlich angewandten Puffers auf die Kristallisationsfähigkeit des
Insulins Einfluß hat. So erzielt man in Gegenwart vonZitrationen eine schnellereKristallisation
und eine größere Ausbeute an reineren Insulinkristallen als bei der Anwesenheit
von Anionen anderer Pufferstoffe. Man erhält aber auch bei Anwesenheit von Zitrationen
deformierte Insulinkristalle, und es war nicht vorauszusehen, daß die gleichzeitige
Gegenwart von Halogenionen in der obengenannten Mindestmenge zu scharfkantigen,
von ebenen Kristallflächen begrenzten Kristallkörpern führen würde.
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Es ist weiter bekannt, daß auch die Kristallisation von Zink-Protamin-Insulin
durch eine bestimmte Salzkonzentration beschleunigt wird, die größer ist als diejenige,
die durch Mischen der verwendeten Ausgangsstoffe, Anpassen des p11-Wertes usw. erzielt
wird. Diese erhöhte Salzkonzentration kann durch erhöhte Pufferkonzentration oder
durch Zugabe eines Salzes, beispielsweise Natriumchlorid, oder anderer willkürlich
gewählter Salze erzielt werden.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich jedoch nicht auf die Kristallisation
einer besonderen Insulinverbindung, sondern auf die Kristallisation des Insulins
selbst. Eine zufällige Auswahl von Salzen ruft nicht die Wirkung hervor, wie sie
gemäß der Erfindung erreicht wird. Diese Wirkung ist an das Vorhandensein von Halogenionen
in einer genau bestimmten Minimalkonzentration gebunden. Sie steht in keiner Beziehung
zur Kristallisationsgeschwindigkeit, sondern äußert sich darin, daß Insulinkristalle
von besonderer Reinheit in Form scharfkantiger Rhomboeder mit ebenen Kristallflächen
gewonnen werden können. Es ist dabei gleichgültig, ob das Insulin von Schweine-,
Rinder- oder anderer Pankreas herrührt.
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Das Kristallisationsmedium erhält den erforderlichen Gehalt an Halogenionen
durch einen einfachen Zusatz von Halogensalzen. Als solche sind die der Alkalimetalle,
des Ammoniaks oder der Erdalkalien besonders geeignet. Weniger geeignet sind Halogensalze
von Schwermetallen, da diese gewöhnlich proteinfällende Eigenschaften besitzen.
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Wird zur Kristallisation ein Insulin mit verhältnismäßig hohem Gehalt
an Verunreinigungen verwendet und ist während der Kristallisation kein organisches
Lösungsmittel, z. B. Aceton, zugegen, so fällt des öfteren mit den Insulinkristallen
auch Insulin in amorphem Zustand aus. Amorphes Insulin kann jedoch durch Zusatz
eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton, entfernt werden.
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Die Menge an ausgefälltem amorphem Insulin hängt dagegen von der Konzentration
der Halogenionen ab und nimmt mit steigender Halogenionenkonzentration zu. Es ist
deshalb nicht vorteilhaft, eine Halogenionenkonzentration von mehr als 2 bis 4 Mol
pro Liter zu wählen. Die besten Ergebnisse wurden mit einer Halogenionenkonzentration,
die zwischen etwa o,5 und 1,5 Mol pro Liter betrug, erzielt.
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Der Kristallisationsvorgang kann, wie bereits oben erwähnt, in an
sich bekannter Weise erfolgen. Bekanntlich ist für die Kristallisation von Insulin
das Vorhandensein bestimmter Metalle (Zink, Kobalt, Nickel, Kadmium, Kupfer, Mangan
oder Eisen) erforderlich. In der Praxis wurde bisher nur Zink verwendet. Bei der
Festlegung des Metallgehalts des Kristallisationsmediums ist zu berücksichtigen,
in welcher Menge das verwendete Insulin schon von vornherein Zink oder ähnliche
Metalle enthält.
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Um die Kristallisation zustande zubringen, wird der pg-Wert des wässerigen
Kristallisationsmediums, je nachdem, ob das Kristallisationsmedium vor der Angleichung
des p$ Wertes einen höheren oder niedrigeren pH-Wert hat, mittels einer Säure, beispielsweise
Salzsäure, oder einer Base, beispielsweise Natriumhydroxyd, auf 5,4 bis 6,2 eingestellt.
Das Kristallisationsmedium wird zwar in der Regel sauer sein, es können aber auch
basische Insulinlösungen Verwendung finden, die dann auf den entsprechenden PH-Bereich
eingestellt werden.
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Zur Fixierung des pH-Wertes werden Pufferlösungen oder eine Mischung
solcher Stoffe, z. B. Acetatpuffer, Boratpuffer, Zitratpuffer, Diäthyl-Barbiturat-Puffer,
Maleatpuffer verwendet. Die Acetat- und Zitratpuffer haben unter den genannten Pufferstoffen
den Vorzug.
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In bezug auf die Beschaffenheit des für die Kristallisation verwendeten
Insulins ist noch zu bemerken, daß das Insulin im Hinblick auf die Ausbeuten so
rein als möglich sein soll. Insulin, wie es durch die übliche fabrikmäßige Insulingewinnung
aus Pankreas gewonnen wird, besitzt für gewöhnlich die nötige Reinheit. Eine Reinheit
von 2o bis 23 internationalen Einheiten pro mg ist zu empfehlen. Das Insulin kann
in amorphem oder kristallinem Zustand vorliegen. Die besten Ausbeuten werden erzielt,
wenn das Insulin in
kristalliner' Form vorhanden ist oder war, so
daß der Kristallisationsprozeß gemäß der Erfindung die letzte Stufe im Produktionsprozeß
vor oder in Verbindung mit der Herstellung von Insulinpräparaten darstellt, die
in der Diabetestherapie Verwendung finden.
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Die folgendenAusführungsbeispiele dienen dazu, das erfindungsgemäße
Verfahren näher zu erläutern. Beispiel i o,5 g amorphes Insulin, das aus Rinderpankreas
gewonnen wurde wird in 5o ml o,o2 n-Salzsäure gelöst und anschließend. mit 25 ml
einer wässerigen Jodkaliumlösung, die 27 g Jodkalium pro ioo ml enthält, sowie io
ml eines Zitratpuffers, der ioo/o Zitronensäure als Natriumzitrat und 0,40/a Zink
als Chlorid enthält, versetzt. Die Lösung wird mit Wasser auf ioo ml Gesamtmenge
verdünnt. Es ergibt sich eine Halogenionenkonzentration von etwa 0,43 Mol pro Liter.
Sodann wird der pH-Wert auf 5,7 bis 6 gebracht. Die Kristallisation setzt sofort
ein und ist nach i bis 2 Tagen beendet. Beispiel 2 o,5 g amorphes Insulin, das aus
Schweinepankreas gewonnen wurde, wird in 5o ml 0,o2 n-Salzsäure aufgelöst und nach
Zusatz von io ml@Aceton mit 25 ml einer wässerigen Natriumchloridlösung, die 23
g Na Cl pro ioo ml enthält, sowie io ml des gleichen Zitratpuffers wie im Beispiel
i versetzt. Die Lösung wird mit Wasser auf eine Gesamtmenge von ioo ml verdünnt.
Es resultiert eine Halogenionenkonzentration von etwa i Mol pro Liter. Der pH-Wert
wird auf 5,8 bis 6 gebracht. Die Kristallisation setzt sofort ein und ist im Laufe
von i bis 2 Tagen beendet. Beispiel 3 0,59 Insulinkristalle aus Schweinepankreas
werden in :250m1 i/3 n-Essigsäure gelöst. Dann wird ungefähr 1/41 i/3 n-Ammoniumhydroxyd,
das 6°/o NaCI enthält, hinzugefügt, um den p$ Wert auf etwa 6 zu bringen und wobei
sich eine Halogenionenkonzentration von ungefähr 0,5i Mol je Liter ergibt. Die Kristallisation
ist im Verlauf von 24 Stunden beendet.
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Beispiel 4 ioo mg kristallines Insulin, das aus Rinderpankreas gewonnen
wurde, werden in io ml o, i n-Salzsäure gelöst, wonach ioml einer 0,o50/0 Zink enthaltenden
Zinkchloridlösung hinzugefügt werden. Hierauf werden 2o ml einer wässerigen Calciumchloridlösung,
die 7 g CaC12 auf ioo ml enthält, hinzugefügt und mit io ml Natriumacetatpuffer,
der 6,8 g C H3 C O O Na, 3 H2 O und 2o ml i n-Salzsäure pro ioo ml enthält, versetzt.
Die Halogenionenkonzentration beträgt dann 0,57 Mol je Liter. Schließlich
wind der pH-Wert auf 5,4 bis 5,5 gebracht. Die Kristallisation ist nach 24 Stunden
beendet.
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Beispiel 5 ioo mg kristallines Insulin aus Rinderpankreas werden in
io ml o,oi Salzsäure gelöst, wonach io ml einer 0,050/0 Zink enthaltenden wässerigen
Zinkchloridlösung hinzugefügt werden. Daraufhin werden 2o ml einer 15 g KBr
pro ioo ml enthaltenden wässerigen Bromkaliumlösung und hierauf io ml des im Beispiel
4 erwähnten Natriumacetatpuffers hinzugefügt. Danach wird der pH-Wert auf 5,4 bis
5,5 gebracht. Die Kristallittion ist nach i bis 2 Tagen vollendet. Die alogenionenkonzentration
beträgt während der Kristallisation etwa 0,55 Mol je Liter. Beispiel 6 49
kristallines Insulin aus Rinderpankreas werden in ioo ml einer saueren wässerigen
Zinkchloridlösung gelöst, die 2o mg Zink und 4m1 i n-Salzsäure pro ioo ml enthält.
Danach werden 50 ml einer wässerigen jodkaliumlösung, die 2o g Jodkalium
pro ioo ml .enthält, und außerdem 50 ml eines Natriumacetatpuffers hinzugefügt,
der 2,729 C H3 C O O Na, 3H,0 und 2m1 i n-Na O H pro 5 0 ml.
enthält. Der pH-Wert. wird dann auf 5,4 bis 5,5 gebracht. Die Halogenionenkonzentration
beträgt daraufhin ungefähr 0,32 M01 pro Liter. Die Kristallisation ist nach
i bis 2 Tagen beendet.
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Die nach den öbengenannten Beispielen hergestellten -- Insulinkristalle
fallen als scharfkantige Rhomboeder mit ebenen Kristallflächen an. Sie können durch
Filtrieren oder Zentrifugieren vom Kristallisationsmedium getrennt werden. Noch
anhaftende-Reste des Kristallisationsmediums können durch Waschen, beispielsweise
mit Aceton entfernt werden.