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Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Tuberkulin
Die Erfindung
betrifft die Herstellung von gereinigtem Tuberkulin. Gegenstand der Erfindung ist
ein vervollkommnetes Verfahren, das es ermöglicht, aus Kulturen von Tuberkelbazillen
praktisch die Gesamtheit der Stoffe, die tuberkulinische Eigenschaften aufweisen,
zu extrahieren.
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Das Verfahren nach der Erfindung unterscheidet sich von den üblichen
Arbeitsweisen grundsätzlich durch die Art der Extraktion der tuberkulinischen Stoffe
sowie die zum Waschen derselben verwendeten Mittel.
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Die Extraktion der tuberkulinischen Stoffe erfolgt aus virulenten
oder nicht virulenten Kulturen von Tuberkelbazillen, menschlichen, Rinder- oder
Vogelstämmen auf einem synthetischen Nährboden, beispielsweise dem nach Sauton oder
nach Long.
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In dem günstigen Zeitpunkt, wie nach 6- bis 8wöchiger Entwicklung
der Kulturen im Heizschrank, werden die Kulturen durch eines der üblichen Mittel
(Filtration, Erhitzung usw.) sterilisiert.
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Gemäß einem Merkmal der Erfindung erfolgt die Extraktion der Tuberkulinstoffe
dadurch, daß diese von einem Niederschlag aus einer geeigneten Säure in statu nascendi
mitgenommen werden, der mit einem pH-Wert von zwischen 2,5 und 3,5 in den Filtraten
der Kultur gebildet wird. Die Säure kann entweder eine organische Säure, wie insbesondere
die Salizylsäure, oder auch eine Mineralsäure, wie insbesondere die Borsäure, sein.
Der Niederschlag der Säure in statu nascendi führt die Gesamtheit der vorhandenen
Tuberkulinstoffe mit sich.
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Das Substrat wird dann in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise
wasserfreiem Azeton, gelöst, welches es auflöst und gleichzeitig die Tuberkulinstoffe
ausfällt.
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Diese werden durch Zentrifugieren abgeschieden und gemäß einem anderen
Mer-kmal der Erfindung durch verschiedene organische Lösungsmittel ausgewaschen,
wodurch es möglich wird, gleichzeitig die inaktiven Stoffe abzuscheiden.
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Nachstehend werden, jedoch keineswegs in beschränkendem Sinne, vier
Ausführungsbeispiele des neuen Verfahrens gegeben, welche sich voneinander lediglich
hinsichtlich der ersten Arbeitsstufe unterscheiden.
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Beispiel I Es wird bei beliebiger Temperatur zwischen o'O und Umgebungstemperatur
gearbeitet. In einem Behälter werden 15 kg salizylsaures Natrium in 2501 eines in
der beschriebenen Weise durch eines der üblichen Mittel sterilisierten Nährbodens,
aus welchem durch Filtration die Mikroorganismen abgeschieden worden sind, aufgelöst.
Dann wird die zum Freimachen der Salizylsäure notwendige Menge Salzsäure zugesetzt,
und zwar so, daß ein pH-Wert zwischen 2,5 und 3,5 eingestellt wird.
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Der Niederschlag, der die wirksamen Stoffe mitreißt, wird durch Filtration
auf einem Buchner-Filter abgeschieden, mit Wasser gewaschen, getrocknet, dann in
wenigstens gol Azeton gelöst und hierdurch die Tuberkulinstoffe ausgefällt.
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Diese werden durch Zentrifugieren abgeschieden, mittels wasserfreien
Azetons unter fünf- bis sechsmaliger Wiederholung gewaschen und schließlich unter
Vakuum getrocknet.
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Das erhaltene Pulver wird in destilliertem Wasser gelöst (kl). Die
Lösung wird durch Io°/oige Sodalösung neutralisiert, um einen pH-Wert zwischen 6,5
und 8 einzustellen, und das Tuberkulin durch 22 1 95U/aigen Alkohols ausgefällt.
Nach fünf- bis sechsmaligem Waschen, zunächst mit Alkohol und dann mit wasserfreiem
Azeton, wird das Präzipitat unter Vakuum getrocknet. Es stellt das für die üblichen
Verwendungszwecke geeignete Tuberkulin dar.
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Beispiel II Es wird bei beliebiger Temperatur zwischen oo und Umgebungstemperatur
gearbeitet, In einem Behälter werden 15 kg des Natriumsalzes der p-Amino-Salizylsäure
in 250 1 eines dadurch übliche Mittel sterilisierten und von den Mikroorganismen
durch Filtration befreiten Nährbodens gelöst.
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Dann wird die zum Freimachen der p-Amino-Salizylsäure notwendige
Menge Salzsäure zugesetzt und hierbei ein pR-Wert zwischen 2,5 und 3,5 eingestellt.
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Der erhaltene Niederschlag, welcher die wirksamen Stoffe enthält,
wird durch Filtration auf einem Buchner-Filter isoliert, mit Wasser gewaschen, getrocknet
und dann in wenigstens gol Azeton gelöst, wobei die Tuberkulinstoffe ausfallen.
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Diese werden durch Zentrifugieren abgeschieden, mit wasserfreiem Azeton
unter fünf- bis sechsmaliger Wiederholung gewaschen und schließlich unter Vakuum
getrocknet.
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Das so hergestellte Pulver wird in 2 1 destilliertem Wasser aufgelöst.
Die Lösung wird durch o°/oige Sodalösung neutralisiert, wobei ein pH-Wert zwischen
6,5 und 8 eingestellt wird, und das Tuberkulin durch 22 1 95e/oa.gen Alkohol ausgefällt.
Nach fünf- bis sechsmaligem Waschen zunächst mit Alkohol und dann mit wasserfreiem
Azeton wird das Präzipitat unter Vakuum getrocknet. Es stellt das für die üblichen
Verwendungszwecke geeignete Tuberkulin dar.
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Beispiel III Es wird bei beliebiger Temperatur zwischen o° und Umgebungstemperatur
gearbeitet. In einem Behälter werden 15 kg des Natriumsalzes der p-Amino-Benzoesäure
in 2501 eines in der beschriebenen Weise durch eines der üblichen Mittel sterilisierten
und von Mikroorganismen durch Filtration befreiten Nährbodens gelöst. Dann wird
die zum Freimachen der p-Amino-Benzoesäure notwendige Menge Salzsäure zugesetzt
und hierbei ein pH-Wert zwischen 2,5 und 3,5 eingestellt.
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Der erhaltene Niederschlag, der die Wirkstoffe enthält, wird durch
Filtration auf einem Buchner-Filter isoliert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und
dann in wenigstens 901 Azeton gelöst, wobei die Tuberkulinstoffe ausfallen. Diese
werden durch Zentrifugieren abgeschieden, mit wasserfreiem Azeton unter fünf- bis
sechsmaliger Wiederholung gewaschen und schließlich unter Vakuum gettocknet.
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Das so hergestellte Pulver wird in 2 1 destilliertem Wasser aufgelöst.
Die- Lösung wird durch o°/o,ige Sodalösung neutralisiert, wobei ein pll-Wert zwischen
6,5 und 8 eingestellt wird, und das Tuberkulin durch 22 1 950/eigem Alkohol ausgefällt.
Nach fünf-.bis sechsmaligem Waschen zunächst mit Alkohol und dann mit wasserfreiem
Azeton wird das Präzipitat im Vakuum getrocknet. Es stellt das für die üblichen
Verwendungszwecke geeignete Tuberkulin dar.
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.BeispiellV Man löst bei einer Raumtemperatur von I8° (bei niedrigeren
Temperaturen wird gesättigtes Natriumborat verwendet) 15 kg Natriumborat in 2501
eines durch übliche Mittel sterilisierten und von Mikroorganismen durch Filtration
befreiten Nährbodens.
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Dann wird die. zum Freimachen der Borsäure notwendige Menge Salzsäure
zugesetzt und hierbei ein pH-Wert zwischen 2,5 und 3,5 eingestellt.
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Der ausgefallene Niederschlag, der die wirksamen Stoffe enthält,
wird durch Filtration auf einem Buchner-Filter abgeschieden, mit Wasser gewaschen
und hierdurch die Tuberkulinstoffe ausgefällt. Diese werden durch Zentrifugieren
abgeschieden, mit wasserfreiem Azeton unter fünf- bis sechsmaliger Wiederholung
gewaschen und schließlich unter Vakuum getrocknet.
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Das erhaltene Pulver wird in destilliertem Wasser gelöst (21). Die
Lösung wird durch Io°/oige Sodalösung neutralisiert, um einen PH Wert zwischen 6,5
und 8 einzustellen, und das Tuberkulin
durch 22 1 950/oigen Alkohol
ausgefällt. Nach fünfbis sechsmaligem Waschen zunächst mit Alkohol und dann mit
wasserfreiem Azeton wird das Präzipitat im Vakuum getrocknet. Es stellt das für
die üblichen Verwendungszwecke geeignete Tuberkulin dar.
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Selbstverständlich ist die Erfindung nicht auf die vorstehend im
einzelnen beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern es sind demgegenüber
zahlreiche Änderungen möglich, ohne von ihrem Grundgedanken abzuweichen.