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Verfahren zur Anreicherung von Vitamin B12
Bei der Gewinnung von Vitamin
Bt2 aus natürlichen Ausgangsmaterialien, z. B. Leberextrakten oder Kulturfiltraten
von Mikroorganismen, liegt die Hauptschwierigkeit darin, daß der Vitamin-Bl2-Gehalt
in diesen Ausgangslösungen außerordentlich gering ist. Es ist also notwendig, Verfahrensschritte
zu finden, die eine möglichst rasche und ergiebige Anreicherung des Wirkstoffes
gestatten.
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Man ist bisher beispielsweise so vorgegangen, daß die Ausgangslösungen
weitgehend konzentriert und dann mit organischen Lösungsmitteln extrahiert wurden.
Um das Verdampfen der großen Flüssigkeitsmengen zu vermeiden, hat man auch schon
versucht, direkt aus den Rohlösungen das Vitamin Bi2 durch Adsorption zu gewinnen.
Man hat dabei bisher mit Aluminiumoxyd, Bentonit, Aluminiumsilicat, Kieselsäure,
Stärke, Kunstharzionenaustauschern (vgl. Ztschr. für Vitamin-Hormon- und Fermentforschung,
I952, I, S. 67; britische Patentschrift 683 254) und insbesondere Kohle als Adsorptionsmittel
gearbeitet, und es mußte das Adsorbat nach dem Auswaschen mehrmals mit größeren
Mengen organischer wäßriger Lösungsmittel eluiert werden.
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Der Reinheitsgrad, der z.B. in diesen Eluaten der Kohleadsorbate
dadurch erreicht wurde, war verhältnismäßig gering, beispielsweise o,I6 y Vitamins12
pro Milligramm (W. G. Jackson, G. B.
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Whitefield, W. H. De Fries, H.A. Nelson und I. S. Evans, J. Amer.
Chem. Soc., 73, 337 (I95I), S.338; O. Schindler und T. Reichstein, Helv. Chim. Acta,
35, 307 (1952), S.3IO;
erwähnen ein graubraunes Pulver mit o,I8
y Vitamin Bi2 pro Milligramm).
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Es wurde nun gefunden, daß man eine weit spezifischere Adsorption
des Vitamin B12 aus Organextrakten oder Kulturfiltraten von Mikroorganismen erreichen
kann, wenn man als Adsorptionsmittel Hydroxylverbindungen von aromatischen Kohlenwasserstoffen
mit kondensierten Benzolkernen benutzt, z. B. Naphthole oder Oxanthracene u. a.,
vorzugsweise a-Naphthol.
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Man geht dabei zweckmäßig so vor, daß man einen Niederschlag der
betreffenden Adsorbentien in der zu adsorbierenden Lösung erzeugt. Das kann dadurch
erreicht werden, daß man eine alkalische Lösung der betreffenden Hydroxylverbindung
zur sauer gestellten, Vitamin Bt2 enthaltenden Lösung unter Rühren zulaufen läßt.
Man kann aber auch eine Lösung in einem geeigneten mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittel benutzen. Dadurch, daß das Adsorbens in der Lösung in fein verteilter
Form zur Ausfällung gebracht wird, erreicht man eine besonders gute Adsorptionswirkung.
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Wie sich gezeigt hat, wird die Adsorption zweckmäßig bei saurer Reaktion,
etwa bei pn I bis 3, durchgeführt. Eine weitere Verbesserung der Adsorptionsausbeute
kann dadurch erreicht werden, daß man itl der zu behandelnden Lösung Salze, z. B.
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Kochsalz, Natriumsulfat u. dgl., auflöst. Die Aufarbeitung der abgetrennten
Adsorbate gestaltet sich besonders einfach, da man nur die Adsorbentien mit geeigneten
organischen Lösungsmitteln in Lösung zu bringen braucht und das Vitamin B12 im Rückstand
erhält.
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Die weitere Reinigung und Verarbeitung z.B. auf kristallisiertes
VitaminBi2 kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen und gestaltet sich deshalb
verhältnismäßig einfach, weil man nach dem vorliegenden Verfahren ein Rohprodukt
erhält, das schon etwa I O/o Vitamin B12 enthält.
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Beispiel I I7 g durch Destillation gereinigtes a-Naphthol werden
in 16,4 ccm Ion-Natronlauge und 55 ccm Wasser gelöst und ergeben ein Gesamtvolumen
von 85 ccm.
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Zur Neutralisation von 1 ccm der alkalischen a-Naphthollösung sind
o,o6i ccm konzentrierter Schwefelsäure erforderlich.
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1 1 aufgeschlossene und vom Mycel befreite Kulturlösung wird unter
starkem Rühren mit 8 ccm konzentrierter Schwefelsäure versetzt und die entstehende
Trübung und Ausflockung durch Absaugen mittels Klärschicht beseitigt. Das pn der
geklärten Lösung, mit Hilfe der Glaselektrode gemessen, beträgt I,8. Die klare Lösung
wird mit 2,3 ccm konzentrierter Schwefelsäure versetzt, und unter Rührung werden
37,5 ccm der alkalischen a-Naphthollösung eingegossen. Es entsteht ein weißer milchiger
Niederschlag, der nach kurzer Zeit eine bräunlichgelbe Farbe annimmt und dabei grobkörniger
wird. Nach 5 Minuten Rühren wird der Niederschlag abgesaugt und mit dem Filtrat
die oben beschriebene Fällung nochmals wiederholt.
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Die nach der zweiten Fällung erhaltene, noch etwas trübe Mutterlauge
wird mittels Klärschicht geklärt.
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Die erhaltenen Niederschläge werden scharf abgesaugt und ausgepreßt,
anschließend vereinigt und zweimal mit je 20 ccm Wasser ausgewaschen.
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Die mit geringen Mengen von a-Naphthol behaftete Klärschicht wird
mit I5 ccm Wasser gewaschen und abgesaugt. Anschließend werden 150 ccm Äther durchgesaugt.
Die vereinigten Niederschläge werden im Scheidetrichter mit dem Äther der Klärschicht
versetzt und mit 50 ccm Wasser, welches vorher die Klärschicht nach der Ätherwaschung
passiert hatte, ausgeschüttelt. Die Emulsion wird durch Zentrifugieren gebrochen,
und die Schichten werden getrennt. Man schüttelt die wäßrige Phase noch zweimal
mit je 15 ccm Äther aus, gibt die beiden Atherphasen zur Hauptäthermenge, schüttelt
die erhaltene ätherische Phase zweimal mit je 15 ccm Wasser aus und vereinigt die
wäßrigen Phasen. Man erhält ein Gesamtvolumen der wäßrigen Endphasen von 75 ccm.
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Vitamin-B12-Gehalt der Ausgangslösung: 2,2 7 pro Kubikzentimeter
= 2,2 mg Gesamtmenge an Vitamin Bl2; Vitamin-B12-Gehalt des Filtrats nach zweimaliger
Fällung: o,580 7 pro Kubikzentimeter = o,58 mg Vitamin Br2; Vitamin-B12-Gehalt der
wäßrigen Endphase: 21,8;' pro Kubikzentimeter = I,63 mg Vitamin B12.
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Trockengewichte in der Kulturlösung, bestimmt durch einstündiges
Trocknen bei IIoO : 30,I mg pro Kubikzentimeter, entsprechend einer Gesamttrockenmasse
von 30,1 g; Trockengewichte in der wäßrigen Endphase, bestimmt durch einstündiges
Trocknen bei 1100 : 2,32 mg pro Kubikzentimeter, entsprechend 0,I75 g Gesamttrockenmasse.
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Der Reinheitsgrad im Ausgangsmaterial beträgt demnach 1: 13650 und
in der Endlösung 1 : 108.
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Beispiel 2 1 1 aufgeschlossene und vom Mycel befreite Kulturlösung
wird mit I50 g wasserfreiem Natriumsulfat versetzt und durch Rühren das Sulfat in
Lösung gebracht. Nach dem Auflösen werden 8 ccm konzentrierte Schwefelsäure eingetragen,
die Lösung wird zentrifugiert und in die klare Lösung nach dem Versetzen mit 4,4
ccm konzentrierter Schwefelsäure 75 ccm der alkalischen a-Naphthollösung unter Rühren
eingegossen.
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Nach 5 Minuten wird der Niederschlag abgesaugt, zweimal mit je 15
ccm Wasser gewaschen, abgenutscht, vom Filter abgehoben und unter Rühren in I50
ccm Aceton, das mit I,5 g Filterhilfsmasse versehen ist, eingetragen; die Fällung
wird abgesaugt, zweimal mit 15 ccm Aceton nachgewaschen, der Niederschlag viermal
mit je 20 ccm Wasser eluiert, und hierauf werden die Eluate vereinigt. Man erhält
ein Gesamtvolumen der wäßrigen Endphase von 75 ccm.
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Vitamin-B12-Gehalt der Ausgangslösung: 1,32 r pro Kubikzentimeter
= 1,32 mg Bt2-Vitamin;
Vitamin-Bi2-Gehalt des Filtrats der Fällung:
o,o6g r pro Kubikzentimeter = o,o6g mg Vitamin Bi2; Vitamin-Bi2-Gehalt der wäßrigen
Endphase: I6 / pro Kubikzentimeter = I,2 mg Vitamin B12.
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Trockengewichte in der Ausgangslösung: 3I mg pro Kubikzentimeter,
entsprechend einer Gesamttrockenmasse von 31 g; Trockengewichte in der wäßrigen
Endphase: 2,5 mg pro Kubikzentimeter, entsprechend einer Gesamttrockenmasse von
0,I87 g.
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Der Reinheitsgrad in der Ausgangslösung beträgt demnach 1 : 23500
und in der Endlösung 1 : 155.