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Verfahren zur Trennung von Gemischen von Aminosäuren Die vorliegende
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von -Gemischen von Aminosäuren, die
gegebenenfalls auch noch Peptide enthalten können, durch chromatographische Adsorption.
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Es ist bekannt, Peptidgümische durch chromatographische Adsorption
unter Verwendung von Bleicherden zu trennen. Bei den bekannten Verfahren werden
die verwendeten, verhältnismäßig hohen Adsorptionssäulen nach Schichten verschiedener
Farbe, die die einzelnen Komponenten enthalten, zerlegt und aus den einzelnen Schichten
die betreffenden Peptide eluiert. Bei der Trennung von Gemischen, die vorzugsweise
Aminosäuren und gegebenenfalls noch Peptide enthalten, führt das bekannte Verfahren
nicht zu besonders zufriedenstellenden Ergebnissen, da sich einzelne Aminosäuren,
wie z. ß: Histidin, nicht ohne weiteres abtrennen lassen.
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Erfindungsgemäß erfolgt die Trennung von Gemischen von Aminosäuren,
die gegebenenfalls auch noch Peptide enthalten können, durch chromatographische
Adsorption an Erden in der Weise, daß Bleicherden oder Aluminiumoxyd in Form niedriger
Adsorptionssäulen verwendet und die adsorbierten Aminosäuren bzw. Peptide durch
fraktionierte Elution unter Verwendung üblicher spezifisch wirkender Lösungsmittel
getrennt «erden.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird gegenüber dem bekannten
Verfahren eine erhebliche Vereinfachung erzielt, denn bei dem bekannten Verfahren
werden verhältnismäßig hohe Adsorptionssäulen angewendet, innerhalb deren durch
Entwicklung mit schwachen Elutionsmitteln zunächst eine Schichtung vorgenommen werden
muß. Bei dem bekannten Verfahren ist man genötigt, die Adsorptionssäulen auszustoßen
und mechanisch in einzelne Schichten zu zerlegen, worauf anschließend die einzelnen
Schichten
getrennt eluiert werden. Um eine Trennung zwischen Aminosäure-
und Peptidgemischen in größerem Maßstab durchzuführen, ist das bekannte Verfahren,
das für wissenschaftliche Zwecke ganz gute Dienste leistet, zu umständlich.
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Da in Mischungen voll Aminosäuren, wie sie bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren verarbeitet werden, die einzelnen Komponenten sich gegenseitig so stark
beeinflussen, daß die unterschiedlichen Merkmale zurücktreten und die Eigenschaften
sehr ähnlich werden, ist es als durchaus überraschend anzusehen, daß man eine befriedigende
Trennung der einzelnen Gemischkomponenten von der Adsorptionssäule- und untereinander
mit spezifisch wirkenden Elutionsmitteln erzielen kann.
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Als spezifisch wirkende, für die fraktionierte Elution in Betracht
kommende Lösungsmittel seien beispielsweise verdünnte Säuren, wie Salz- oder Schwefelsäure,
verdünnte Alkalien, wie Natronlauge, Barytwasser, sowie Pyridinschwefelsäure, Phosphatpufferlösungen
u. dgl. erwähnt.
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Erden, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in
Betracht kommen, sind beispielsweise Bleicherden, wie das unter der Handelsbezeichnung
Floridin in der Natur vorkommende Alutninittmhydrosilicat, das einen tonähnlichen
Charakter hat und einen wechselnden Magnesium- und Eisengehalt aufweist. Je nach
der Korngröße führt es verschiedene Bezeichnungen, wie z. B. Floridin XXF und Floridin
ZNP extra -letzteres ist besonders fein gesiebt -, und diese Bezeichnungen werden
auch in der wissenschaftlichen Literatur verwendet. Auch Aluminiumoxyd kommt für
die erfindungsgemäßen Zwecke in Betracht.
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Diese Adsorptionsmittel finden in Form niedriger Adsorptionssäulen
Anwendung, vorzugsweise auf Fritten mit geringer Höhe und großem Durchmesser. Beispielsweise
sind Fritten, die eine Hölle von 2 cm und einen Durchmesser von etwa 5 cm aufweisen,
geeignet.
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Im folgenden soll die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
all Hand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
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Beispiele i. Trennung eines Gemisches von Dicarbonsäuren und Monoaminosäuren
Das Gemisch von i g Asparaginsä ure und i g Alanin wurde in wenig Wasser gelöst.
Die auf pH ä gebrachte Lösung wurde auf eine Säule von Aluminiumoxyd, das mit n/i-Salzsäure
5 Minuten geschüttelt und (lanach bis zur Freiheit voll Mineralsäure (Prüfung mit
Kongopapier) mit Wasser gewaschen worden war, gebracht (Säulenhöhe = 2 cm, Säulendurchmesser
= 5 cm) und mit Wasser nachgewaschen. Nach je 5 ccin Waschflüssigkeit wurde
i Tropfen des Filtrats entnommen und mit je o, i ccm einer i @j'oigen Ninhydrinlösung
zum Sieden erhitzt. Sobald eine Violettfärbung eintritt, wird nach je 3 ccm so lange
mit i Tropfen des Filtrats die Ninhydrinprobe angestellt, bis die Färbung vollkommen
ausbleibt. Das Filtrat, das das gesamte Alanin enthält, wird im Vakuum zur Trockne
gebracht (Ausbeute ioo0,ö), die Säule finit o.i n-Sclii%-efelsäure eluiert, die
Schwefelsäure mit Bariumhydroxyd entfernt und das Filtrat im Vakuum bei 4o° Badtemperatur
zur Trockne eingedampft. Der Rückstand ist reine Asparaginsäure. Ausbeute an Alani»
i oo 0'0, an Asparaginsäure 9o 0i4 der Theorie.
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Die Trennung von Dicarbonsäuren, z. B. Glutamin- und Asparaginsätire,
von Diaminosäuren, z. B. Arginin, Lysin, Histidin, verläuft genau analog der Trennung
vor. den Monoaminosäuren, ebenso die Trennung von Dicarbonsäurepeptiden von Monoaminosäuren
bziv. deren Peptiden und Diaminosäuren bzw. deren Peptiden.
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2. Trennung eines Gemisches von Diaminosäuren Ein Gemisch von je i
g Arginin. Lysin, Histidin, in wenig Wasser gelöst (pH = ; ). wurde durch eine Säule
von 5009 eines unter der Handelsbezeichnung Flöridin N Y F extra bekannten
A.luminiumhydrosilicats gesaugt und mit Wasser bis zum Verschwinden des Histidins
im Filtrat bzw. bis zum Ausbleiben der Diazo- und der Ninhyarinreaktion gewaschen.
Das Adsorbat enthielt sämtliches Arginin und Lysin. Es wurde mit n/i-Salzsäure quantitativ
eluiert (3 bis 41 n/i-Salzsäure) und das Eluat zur Entfernung der Salzsäure wiederholt
im Vakuum zur Trockne gebracht. Ausbeute an Arginin und Lysin 9501ö. Das Filtrat,
das sämtliches Histidin enthielt, wurde im Vakuum zur Trockne gebracht. Ausbeute
an Histidin 95`o.
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Das Gemisch von Arginin und L#sl, in wenig Wasser gelöst und auf pii
7 gebracht, wurde an einer Säule von 50o g Filtrol-Neutrol adsorbiert. Nach dem
Waschen mit 51 n'16-IL H_ P Ü4 war alles Lys@i,n im Filtrat. Dieses wurde zur Trockne
gebracht und der völlig trockene Rückstand mit heißem Alkohol extraliiert. Die alkoholische
Lösung, die das Lysin in einer Ausbeute voll 950'o enthielt, wurde eingedunstet.
Das Adsorbat wurde mit ti/i-S:alzsäure eluiert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne
gebracht. Ausbeute an Arginin 950,!o.
Aufarbeitung eines Eiweißhydroly
sats Der Eiweißkörper, z. B. Blutkuchen, wurde mit einem überschuß von konzentrierter
Salzsäure to Stunden hydrolysiert, danach im Vakuum mehreremal zur Trockne gebracht,
um den Großteil der Säure zu entfernen, in wenig Wasser aufgenommen und genau neutralisiert.
Diese Lösung wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch eine Säule des unter der
Handelsbezeichnung Floridin XXF extra bekannten Aluminiumhydrosilicats gesaugt,
wobei Arginin und Lysin herausadsorbiert wurden, während Histidin, die Dicarbonsäuren
und die Monoaminosäuren quantitativ ins Filtrat gingen. Mit einer aus dem Aluminiumhydrosilicat
Filtrol-Neutrol bestehenden Säule wurde das Histidin herausadsorbiert und das auf
ein kleines Volumen gebrachte Filtrat nach Adsorption an Aluminiumoxyd von den Dicarbonsäuren
befreit. Die Monoaminosäuren, die in ihre Kupfersalze- übergeführt werden, können
schließlich in dieser Form weiter durch Adsorption an einer Säule aus dem Hydrosilicat
Frankonit aufgeteilt werden.