DE69928235T2

DE69928235T2 - Cyclin-abhängige inhibitoren

Info

Publication number: DE69928235T2
Application number: DE69928235T
Authority: DE
Inventors: Roger John Morpeth GRIFFIN; Alan Hilary Blaydon CALVERT; Nicola Jane Rowlands Gill CURTIN; David Richard Hexham NEWELL; Bernard Thomas Golding; Jane Anne Endicott; Martin Edward Mantyla Noble; Francis Thomas Boyle; Philip John Altrincham JEWSBURY
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1998-03-28
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-03-30
Also published as: AU753716B2; WO1999050251A2; WO1999050251A3; EP1066266A1; AU3155199A; EP1066266B1; CA2326357A1; ES2253881T3; JP2002509921A; GB9806739D0; ATE309223T1; DE69928235D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Verbindungen, insbesondere Pyrimidinderivate, die in biologischen Systemen eine Aktivität als Inhibitoren der cyclinabhängigen Kinase (CDK) zeigen und die demgemäß als potenziell nützliche therapeutische Mittel von Interesse sind, die in pharmazeutische Zusammensetzungen oder Formulierungen einbezogen werden können, welche zur Kontrolle bzw. Steuerung oder Inhibierung des Zellwachstums oder der Zellproliferation in Säugern, z.B. im Zusammenhang mit einer Antitumor- oder Krebsbehandlung, verwendet werden.
Cyclinabhängige Kinasen (CDK's) sind eine Familie von Enzymen, die Komplexe mit anderen aktivierenden Proteinen bilden, die als Cycline bekannt sind, um regulatorische Schlüsselfaktoren bereitzustellen, die an der Kontrolle bzw. Steuerung des Wachstums und der Teilung in Tierzellen beteiligt sind. Insbesondere wird die Progression von Tierzellen durch den Zellteilungszyklus (G1-, S-, G2- und M-Phase) durch die aufeinander folgende Bildung, Aktivierung und anschließende Inaktivierung einer Reihe von CDK/Cyclin-Dimerkomplexen reguliert, welche den Durchgang durch Zellzykluskontrollpunkte und Übergänge zwischen aufeinander folgenden Phasen des Zellzyklus kontrollieren bzw. steuern, wobei die CDK's als katalytische Untereinheiten der Komplexe wirken.
Es gibt eine Anzahl verschiedener Cyclinproteine, die wie die verschiedenen CDK's eine relativ entfernt verwandte Familie von CDK-aktivierenden Proteinen bilden. Verschiedene CDK/Cyclin-Komplexe wirken bei verschiedenen Stufen des Zellzyklus mit einer aufeinander folgenden Zunahme und Abnahme der Cyclinexpression während des Zellzyklus, wobei der Cyclinabbau während der M-Phase üblicherweise ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung einer geordneten Zellzyklusprogression ist. Folglich wird angenommen, dass eine Progression von der G1- zur S-Phase in Säugerzellen in erster Linie durch die cyclinabhängigen Kinasen CDK2, CDK3 und CDK4 (und in manchen Zellen möglicherweise auch durch CDK6) zusammen mit mindestens den Cyclinen D und E reguliert wird, wobei die Komplexe von CDK2 und CDK4 (und möglicherweise CDK6) mit Cyclinen des D-Typs insbesondere eine wichtige Rolle bei der Kontrolle bzw. Steuerung der Progression durch den G1- Beschränkungspunkt spielen, während die CDK2/Cyclin E-Komplexe zur Herbeiführung des Übergangs von der G1-Phase in die S-Phase essentiell sind. Sobald der Eintritt in die S-Phase erfolgt ist, wird angenommen, dass eine weitere Progression und ein Eintritt in G2 dann aktivierte Komplexe von CDK2 mit einem anderen Cyclin erfordert, das als Cyclin A bezeichnet wird, d.h. die Komplexe CDK2/Cyclin A. Schließlich sind für den Übergang von der G2-Phase in die M-Phase und die Initiierung der Mitose aktivierte Komplexe der mit CDK1 (auch als Cdc2 bekannt) bezeichneten cyclinabhängigen Kinase mit einem als Cyclin B bezeichneten Cyclin (und auch Komplexe von CDK1 mit Cyclin A) erforderlich.
Im Allgemeinen umfasst die Kontrolle bzw. Steuerung des Zellzyklus und die Aktivität von CDK's eine Reihe von stimulatorischen und inhibitorischen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen, und wenn sie ihre regulatorischen Funktionen ausüben, nutzen die CDK/Cyclin-Komplexe, wenn sie aktiviert werden, ATP als Substrat, um verschiedene andere Substratzellproteine, üblicherweise an Serin- und Threoningruppen davon, zu phosphorylieren. Die Kontrolle bzw. Steuerung des Zellzyklus kann auch Inhibitoren der CDK/Cyclin-Komplexe umfassen, welche die katalytische Funktion dieser Enzyme blockieren, so dass der Zellzyklus zum Stillstand kommt. Bestimmte natürliche Inhibitoren, wie z.B. die inhibitorischen Proteine, die als p16 und p21 bekannt sind, können die Progression des Zellzyklus durch selektives Binden an CDK/Cyclin-Komplexe, um diese zu inaktivieren, blockieren.
Die Kontrolle bzw. Steuerung durch Inhibitoren der CDK-Funktion kann daher einen weiteren Mechanismus zur Kontrolle bzw. Steuerung der Zellzyklusprogression bereitstellen, und dies hat zu Vorschlägen zur Verwendung von CDK-Inhibitoren als antiproliferative therapeutische Mittel, z.B. in der Tumortherapie, geführt, um anomale proliferierende Zellen zielgerichtet anzusteuern und einen Stillstand der Zellzyklusprogression zu bewirken. Dies schien besonders zweckmäßig zu sein, da es bekannt ist, dass schwere Störungen der Zellzyklusprogression oder Unregelmäßigkeiten bei der Zellzyklusprogression häufig in menschlichen Tumorzellen vorkommen, die häufig von einer Überexpression von CDK's und anderen damit zusammenhängenden Proteinen begleitet sind. Auch verglichen mit etablierten cytotoxischen Antitumorarzneistoffen hätte die Verwendung von Inhibitoren der Zellproliferation, die durch CDK's wirken, den Vorteil, dass eine direkte Wechselwirkung mit DNA vermie den wird, wodurch ein vermindertes Risiko einer Sekundärtumorentwicklung erhalten wird.
Die potenziellen therapeutischen Anwendungen und andere mögliche Verwendungen haben demgemäß zu einer Suche nach weiteren chemischen Inhibitoren von CDK's, insbesondere nach selektiven Inhibitoren geführt, die für eine pharmazeutische Verwendung geeignet sind. Die inhibitorische Aktivität und Selektivität ausgewählter CDK/Cyclin-Komplexe wird im Allgemeinen durch Messen der Kinaseaktivität bei der Phosphorylierung des Proteins Histon H1 (einer der Hauptproteinbestandteile von Chromatin, das im Allgemeinen ein gutes CDK-Substrat bereitstellt) in der Gegenwart des vermuteten getesteten Inhibitors getestet. Eine Anzahl von Verbindungen mit potenziell geeigneten CDK-inhibitorischen Eigenschaften, die auf diese Weise identifiziert worden sind, sind in einem Übersichtsartikel mit dem Titel „Chemical Inhibitors of cyclin-dependent kinases" von Laurent Meijer, veröffentlicht in Cell Biology (Band 6), Oktober 1996, beschrieben, dessen Inhalt in diese Beschreibung unter Bezugnahme einbezogen wird. Unter den Verbindungen, die in dem vorstehend genannten Artikel beschrieben werden, ist ein stark wirksames CDK1- und CDK2-inhibierendes Adeninderivat 2-(2-Hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurin mit der Bezeichnung „Olomoucin", und auch ein eng verwandtes Analogon, das Modifizierungen an den Positionen 2, 6 und 9 umfasst, nämlich 6-(Benzylamino)-2(R)-[{1-(hydroxymethyl)propyl}amino]-9-isopropylpurin. Diese letztgenannte Verbindung wird als „Roscovitin" bezeichnet und ist als CDK-Inhibitor noch stärker wirksam als Olomoucin. Die starken, aber selektiven CDK-inhibitorischen Eigenschaften von Olomoucin wurden als erstes in einem Artikel von J. Vesely et al. mit dem Titel „Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine analogues", Eur. J. Biochem. 224, 771–786 (1994) beschrieben, und weitere Studien bezüglich CDK-inhibitorischer Eigenschaften einer Reihe von Purinverbindungen in der Form von Adeninderivaten, einschließlich Olomoucin und Roscovitin, sind in einem Artikel von L. Havlicek et al. mit dem Titel „Cytokinin-Derived Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors: Synthesis and cdc2 Inhibitory Activity of Olomoucine and Related Compounds", J. Med. Chem. (1997) 40, 408–412, beschrieben und werden darin diskutiert. Auch der Inhalt dieser Veröffentlichungen wird unter Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen.
Es wurde gezeigt, dass sich die inhibitorische Aktivität sowohl von Olomoucin als auch von Roscovitin aufgrund der Wirkung dieser Verbindungen als kompetitive Inhibitoren für die ATP-Bindung ergibt. Es sollte beachtet werden, dass mindestens bezüglich Olomoucin berichtet worden ist, dass es einen vollständigen Mangel an inhibitorischer Aktivität bezogen auf viele gewöhnliche, von CDK's verschiedenen Kinasen aufweist. Die Selektivität manifestiert sich ferner durch die Tatsache, dass sowohl Olomoucin als auch Roscovitin die Aktivität von CDK1, CDK2 und CDK5 inhibieren, wobei jedoch gefunden wurde, dass sie gegen CDK4 oder CDK6 nicht aktiv sind.
Insbesondere bei Olomoucin wurde davon ausgegangen, dass es eine Lead-Verbindung zur Unterstützung bei der Identifizierung und Gestaltung weiterer CDK-Inhibitoren auf Purinbasis bereitstellt, und auf der Basis von Struktur/Aktivitätsstudien wurde in dem vorstehend genannten Artikel von Vesely et al. vorgeschlagen, das eine N9-Substitution durch einen hydrophoben Rest, wie z.B. Methyl, 2-Hydroxyethyl oder Isopropyl z.B. zur Bereitstellung einer direkten hydrophoben Wechselwirkung mit der CDK wichtig ist und dass eine Seitenkette an C2 essentiell ist. Entsprechend wurde in dem Artikel von Havlicek et al. neben der Beobachtung, dass bei Purinverbindungen, um eine CDK-inhibitorische Aktivität aufzuweisen, die 1- und die 7-Position, und gegebenenfalls die 3-Position des Purinrings frei bleiben muss, um eine Wasserstoffbrückenbindung zu ermöglichen, auch festgestellt, dass eine polare Seitenkette an der 2-Position essentiell zu sein scheint und dass eine N9-Substitution durch einen hydrophoben Rest für ein positives Binden möglicherweise ebenfalls wichtig ist. Die Positionen 2, 6 und 9 in dem Purinring wurden als diejenigen Positionen identifiziert, die das Binden an CDK1 kontrollieren bzw. steuern.
In dem Übersichtsartikel von Meijer wird auch erwähnt, dass als Ergebnis einer Kristallisation von CDK-Inhibitor-Komplexen und insbesondere von Cokristallisationsstudien mit CDK2 gefunden wurde, dass Inhibitoren wie z.B. Olomoucin und Roscovitin in der ATP-Bindungstasche lokalisiert sind, die sich in der Spalte zwischen dem kleinen und dem großen Lappen des CDK-Proteinmoleküls befinden, und dass die Spezifität möglicherweise durch Abschnitte der Inhibitormoleküle bereitgestellt wird, die mit den Kinasen außerhalb der ATP-Bindungsstellen eine Wechselwirkung eingehen.
Die vorliegende Erfindung wurde aufgrund einer Beobachtung entwickelt, die im Verlauf des Testens verschiedener Guaninderivate bezüglich der Aktivität als Inhibitoren des DNA-Reparaturproteins O⁶-Methylguanin-DNA-methyltransferase (MGMT) gemacht wurde, als in unerwarteter Weise gefunden wurde, dass, obwohl die Verbindung O⁶-Cyclohexylmethylguanin eine sehr geringe Aktivität als MGMT-Inhibitor aufwies, diese dennoch cytotoxisch war und eine sehr hohe inhibitorische Aktivität bezüglich CDK1 (cdc2)/Cyclin B-Komplexen zeigte, die mit derjenigen von Olomoucin vergleichbar war. Dies war insbesondere bezüglich des vorstehend diskutierten Hintergrunds im Hinblick auf Olomoucin überraschend, und zwar deshalb, weil diese Guaninverbindung weder an der 2-NH₂-Position noch an der 9-Position des Purinrings Substituenten aufweist und der Ersatz von 6-NH durch 6-O die Verbindung zu ATP weniger ähnlich machte, von dem angenommen wird, dass es mit Olomoucin zumindest um Bindungsstellen konkurriert.
Nachfolgend wurden andere Guaninderivate identifiziert, die näher mit O⁶-Cyclohexylmethylguanin als mit Verbindungen wie z.B. Olomoucin und Roscovitin verwandt sind, und die eine signifikante CDK-inhibitorische Aktivität zeigen, und kristallographische Studien haben gezeigt, dass Komplexe von CDK2 (zu CDK1 mindestens bezüglich der katalytischen Bindungsstelle homolog) mit Guaninderivaten wie z.B. O⁶-Cyclohexylmethylguanin und O⁶-Cyclohex-1-enylmethylguanin in einer von Komplexen von CDK2 mit Olomoucin verschiedenen Weise aneinander binden.
Dies ist in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht, wobei
1 ein Diagramm ist, das die Art und Weise zeigt, in der Olomoucin an CDK2 bindet,
2 ein entsprechendes Diagramm ist, das die Art und Weise zeigt, in der gefunden wurde, wie die Verbindung O⁶-Cyclohexylmethylguanin an CDK2 bindet, und
3 ein Diagramm ist, das eine Kristallstruktur darstellt, welche die Art und Weise zeigt, in der gefunden wurde, wie die R-enantiomere Form der Verbindung O⁶-(2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methoxy)-guanin an CDK2 bindet.
Während es bei Olomoucin die polare Seitenkette von N2 des Purinrings ist, die sich innerhalb der ATP-Ribose-Bindungstasche des CDK2-Proteins befindet, und der N9-Methylsubstituent in einer separaten Tasche mit hydrophober Spezifität sitzt, wobei N7 und 6-NH an der Wasserstoffbrückenbindung an das Protein beteiligt sind, ist es in dem in der 2 veranschaulichten Bindungsmodus der Cycloalkylring des Substituenten an der 6-Position, der in der ATP-Ribose-Bindungstasche sitzt, während Wasserstoffbrückenbindungen zu N9, N3 und 2-NH ausgebildet sind. Mit anderen Worten: Die Orientierung verglichen mit dem Binden von Olomoucin ist vollständig umgekehrt. Eine entsprechende Situation wird mit dem in der 3 veranschaulichten Bindungsmodus erhalten, bei dem auch die Beteiligung einiger Wassermoleküle gezeigt ist.
Demgemäß ist klar, dass es wahrscheinlich ist, dass die Schlüsse, die bezüglich der Struktur/Aktivitätsbeziehungen in der Adeninreihe von Verbindungen, wie z.B. Olomoucin und Roscovitin, gezogen wurden, nicht mehr für alle Purinderivate, insbesondere Guaninderivate, gilt, und wie es in unserer gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB98/02025 beschrieben ist, wurde eine Reihe anderer Purinverbindungen identifiziert, die eine inhibitorische Aktivität bezüglich mindestens einiger CDK's aufweisen und von denen angenommen wird, dass sie anstelle der in der 1 gezeigten Weise in der in der 2 (oder der 3) gezeigten Weise binden.
Es wurde nunmehr gefunden, dass es auch eine Anzahl von Stickstoff-enthaltenden heterocyclischen Einzelringverbindungen, insbesondere Pyrimidinverbindungen, gibt, die dann, wenn sie mit geeigneten Substituenten ausgestattet sind, wie die vorstehend genannten Purinverbindungen wirken oder diese nachahmen können und eine inhibierende Aktivität bezüglich mindestens einiger CDK-Proteine aufweisen. Wie die Purinverbindungen werden diese Pyrimidinverbindungen für die CDK-inhibierende Aktivität in der 4-Position über eine Seitenkette mit einem gegebenenfalls substituierten 4- bis 8-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring verknüpft sein, von dem angenommen wird, dass er in der ATP-Ribose-Bindungstasche des CDK-Proteins sitzt. Es wird auch gewöhnlich eine Aminogruppe oder teilweise substituierte Aminogruppe an der 6-Position vorliegen, die mit einer Tasche mit hydrophober Spe zifität des CDK-Proteins in einer Weise eine Wechselwirkung eingeht, die zu derjenigen analog ist, wie sie in der 2 oder der 3 bezüglich des Bindens eines CDK-inhibierenden Purins gezeigt ist. Vorzugsweise wird auch an der 2-Position eine Aminogruppe oder substituierte Aminogruppe vorliegen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Zellproliferationsstörungen in Säugern, wie z.B. von Tumoren, bereit, wobei die Zusammensetzungen als Wirkstoff eine CDK-inhibierende Pyrimidinverbindung mit der nachstehend gezeigten Strukturformel I enthält:
bei der in bevorzugten Ausführungsformen
X O, S oder CHR_x ist, wobei R_x H oder C_1-4-Alkyl ist;
D H oder NZ₁Z₂ ist, wobei Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind;
A aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, CH₂(CH₂)_nOH (n = 1 bis 4) und NR_a1R_a2 ausgewählt ist, wobei R_a1 und R_a2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind;
Y ein gegebenenfalls substituierter 4- bis 8-gliedriger carbocyclischer oder heterocyclischer Ring ist oder einen solchen umfasst;
D' H oder NZ₃Z₄ ist, wobei Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind;
E aus H, NO, NO₂, N=N-Ar, wobei Ar gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl ist, NR_e1R_e2 oder NR_e1NR_e2R_e3 (wobei R_e1, R_e2 und R_e3 jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aral kyl sind), C(R_e) = U (wobei R_e Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder substituiertes Alkyl, wie z.B. Hydroxyalkyl, oder unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Aralkyl, wie z.B. Benzyl, ist, und U aus O, NR_e', NOR_e' und NNR_e'R_e'' ausgewählt ist, wobei R_e' und R_e'' jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl oder CONH₂ sind), T, CH₂T, CHT₂ und CT₃, wobei T ein Halogenid I, Br, Cl oder F ist, ausgewählt ist.
Bestimmte Verbindungen innerhalb des Bereichs der vorstehenden Definition sind bereits als solche bekannt, jedoch war bisher deren Vermögen als CDK-Inhibitoren nicht bekannt. Es wird davon ausgegangen, dass es sich bei einigen dieser Verbindungen um neue chemische Verbindungen handelt. Darüber hinaus wurde in einigen Fällen gefunden, dass die CDK-inhibitorische Aktivität eine Selektivität bezüglich verschiedener CDK's aufweist, die sich nicht merklich von derjenigen von Olomoucin unterscheidet. Folglich hat die vorliegende Erfindung eine weitere Klasse von CDK-Inhibitoren identifiziert und den Bereich der Verbindungen, die zur Verwendung als CDK-Inhibitoren zur Verfügung stehen, beträchtlich vergrößert.
Es gibt einen breiten Bereich von Substituenten, von denen es wahrscheinlich ist, dass sie als Y geeignet sind, so lange der Substituent in die ATP-Ribose-Bindungstasche eines CDK-Proteins passt oder darin sitzt und ein Binden in der anstelle in der 1 in der 2 gezeigten allgemeinen Weise ermöglicht. In manchen Fällen kann es bezüglich Y hilfreich sein, wenn es eine Ringstruktur umfasst, die polare Hydroxylsubstituenten oder dergleichen umfasst.
In den meisten Ausführungsformen wird Y ein Cycloalkan oder Cycloalkenring sein, vorzugsweise ein 5- oder 6-gliedriger Ring mit bis zu zwei Doppelbindungen. Ein oder zwei Kohlenstoffatome an dem Ring können jedoch durch Heteroatome oder -gruppen, insbesondere durch O, S, NR' (wobei R' H oder C_1-4-Alkyl ist), oder in einem Cycloalkenring, durch -N= ersetzt sein. Wenn der Ring substituiert ist, wird der Substituent oder jeder Substituent (an jedweder Position) vorzugsweise aus H, C_1-4-Alkyl, OH, C_1-4-Alkoxy, Halogen, CF₃, CN, N₃ und NR_Y1R_Y2 ausgewählt, wobei R_Y1- und R_Y2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind. Darüber hinaus können in dem Fall, bei dem zwei Substituenten an benachbarten Atomen des Rings vorliegen, wie z.B.
diese Substituenten P und Q unter Bildung einer zusätzlichen anellierten Ringstruktur, wie z.B. eines 4-, 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Rings verknüpft sein. Diese zusätzliche Ringstruktur kann z.B. bis zu zwei Heteroatome oder -gruppen, wie z.B. O, S oder NH, enthalten und sie kann auch durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein, wie z.B. (eine) C_1-4-Alkylgruppe oder -gruppen oder eine Phenylgruppe oder substituierte Phenylgruppe. In einigen Ausführungsformen kann Y auch Adamantyl sein.
Beispiele für die Ringstrukturen, die durch Y dargestellt werden, umfassen
worin V und W jeweils unabhängig aus O, S, NR' (R' ist H oder C_1-4-Alkyl) und CH₂ (oder =CH-) ausgewählt sind, und R₁ und R₂ jeweils H oder C_1-4-Alkyl sind.
Wie es vorstehend angegeben worden ist, können diese Ringstrukturen gegebenenfalls Substituenten aufweisen, die gleich oder verschieden sein können und unter anderem aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, -OH, NR_Y1R_Y2 (wobei R_Y1 und R_Y2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind), CF₃, Halogen, N₃, CN, gegebenenfalls substituiertem Aryl (z.B. Phenyl) und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl (z.B. Benzyl) ausgewählt werden können. Wie es bereits angegeben worden ist, kann es bezüglich der Ringstruktur manchmal nützlich sein, dass sie eine Mehrzahl von polaren Substituenten, wie z.B. Hydroxyl, enthält.
Im Allgemeinen enthalten die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen eine effektive CDK-inhibierende nicht-toxische Menge der aktiven Pyrimidinverbindung und werden gemäß beliebiger Verfahren, die in dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind, zur Verabreichung in jedweder zweckmäßigen Art hergestellt. Die Verbindungen können z.B. in einer Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden, in der sie mit mindestens einem anderen Bestandteil gemischt sind, der ein Additiv, einen Träger, ein Verdünnungsmittel oder ein Vehikel bereitstellt, das bzw. der pharmazeutisch verträglich ist.
Es sollte beachtet werden, dass sich dann, wenn in dieser Beschreibung auf Verbindungen der Formel I Bezug genommen wird, diese Bezugnahme auch auf deren pharmazeutisch verträgliche Salze und andere pharmazeutisch verträgliche biologische Vorläufer (Prodrug-Formen) erstreckt, wenn dies relevant ist. Der Begriff „Prodrug" wird in der vorliegenden Beschreibung verwendet, um modifizierte Formen oder Derivate einer pharmakologisch aktiven Verbindung zu bezeichnen, die in vivo biologisch abgebaut wird und nach der Verabreichung, insbesondere nach der oralen oder intravenösen Verabreichung, im Verlauf der therapeutischen Behandlung eines Säugers in die aktive Verbindung umgewandelt wird. Solche Prodrugs werden gewöhnlich aufgrund einer erhöhten Löslichkeit in wässrigen Medien ausgewählt, was bei der Beseitigung von Formulierungsproblemen unterstützt, und in manchen Fällen auch, um eine relativ langsame oder kontrollierte bzw. gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs zu bewirken.
Es sollte auch beachtet werden, dass dann, wenn jedwede der angegebenen Verbindungen in mehr als einer enantiomeren Form und/oder diastereomeren Form vorliegen kann, alle derartigen Formen, deren Gemische, und deren Herstellung und Verwendungen innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass es wahrscheinlich ist, dass die stereochemischen Erwägungen wichtig sind und eine beträchtliche Selektivität vorliegen kann, so dass verschiedene Enantiomere oder Diastereoisomere eine signifikant unterschiedliche inhibitorische Aktivität aufweisen.
Die Erfindung umfasst selbstverständlich auch die Verwendung der angegebenen CDK-inhibierenden Verbindungen zur Herstellung von Medikamenten oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie sie vorstehend angegeben worden sind. Die Erfindung umfasst ferner einige Pyrimidinverbindungen, bei denen es sich um neue chemische Verbindungen handelt, die als Zwischenprodukte bei der Synthese der CDK-inhibierenden Verbindungen geeignet sind.
Folglich stellt ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Pyrimidinverbindung der allgemeinen Strukturformel I
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz und/oder eine Prodrug-Form davon zur Verwendung als aktives therapeutisches Mittel bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung einer Tumorzellenproliferation bereit, dadurch gekennzeichnet, dass in der Strukturformel I
X O, S oder CHR_x ist, wobei R_x H oder C_1-4-Alkyl ist;
D H oder NZ₁Z₂ ist, wobei Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind;
A aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, CH₂(CH₂)_nOH (n = 1 bis 4) und NR_a1R_a2 ausgewählt ist, wobei R_a1 und R_a2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind;
Y ein gegebenenfalls substituierter 5- oder 6-gliedriger Cycloalkan- oder Cycloalkenring mit einer oder zwei Doppelbindung(en) ist;
D' H oder NZ₃Z₄ ist, wobei Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind;
E aus H, NO, NO₂, N=N-Ar, wobei Ar gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl ist, NR_e1R_e2 oder NR_e1NR_e2R_e3 (wobei R_e1, R_e2 und R_e3 jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind), C(R_e) = U (wobei R_e Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder substituiertes Alkyl, wie z.B. Hydroxyalkyl, oder unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Aralkyl, wie z.B. Benzyl, ist, und U aus O, NR_e', NOR_e' und NNR_e'R_e'' ausgewählt ist, wobei R_e' und R_e'' jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl oder CONH₂ sind), T, CH₂T, CHT₂ und CT₃, wobei T ein Halogenid I, Br, Cl oder F ist, ausgewählt ist.
Vorzugsweise wird in Verbindungen gemäß der Strukturformel I, die zur Durchführung der Erfindung verwendet werden, D eine unsubstituierte Aminogruppe -NH₂ und X ein Sauerstoffatom sein.
Der Substituent Y der erfindungsgemäßen Verbindungen kann mit mindestens einem Substituenten substituiert sein, der aus H, C_1-4-Alkoxy, Halogen, CF₃, CN, N₃ und NR_y1R_y2 ausgewählt ist, wobei R_y1 und R_y2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind.
Wenn die Y-Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindungen zwei Substituenten an benachbarten Atomen aufweist, können die Substituenten so verknüpft sein, dass sie eine zusätzliche anellierte carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden.
Obwohl eine Anzahl der CDK-Inhibitorverbindungen als solche bereits bekannt ist, sind jedoch einige der Verbindungen, wie es vorstehend angegeben worden ist, neu und stellen neue chemische Verbindungen dar. Diese Verbindungen als solche sind von dem zweiten Aspekt der Erfindung umfasst.
Beispiele für Verbindungen, die gegenwärtig zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung besonders bevorzugt sind, und zwar entweder direkt oder als Zwischenverbindungen, und welche die am stärksten wirksamen identifizierten CDK-Inhibitoren umfassen, zumindest wenn diese in vitro gegen CDK1 und/oder CDK2 getestet werden, umfassen die folgenden:
2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxy-5-nitrosopyrimidin;
2,5,6-Triamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin;
2,6-Diamino-5-(4'-chlorphenyl)azo-4-cyclohexylmethoxypyrimidin;
2,6-Diamino-4-benzyloxypyrimidin;
2,6-Diamino-4-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin;
2,5,6-Triamino-4-benzyloxypyrimidin;
2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxypyrimidin;
2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxy-5-nitrosopyrimidin;
2-Amino-4-cyclohexylmethyloxy-6-methylaminopyrimidin;
2-Amino-6-benzylamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin und
2,6-Diamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin-5-carbaldehyd.
Biologische Aktivität
Es sind Tests zum Testen der inhibitorischen Aktivität der interessierenden Verbindungen gegen eine Reihe von CDK/Cyclin-Komplexen verfügbar, einschließlich CDK1/Cyclin A, CDK1/Cyclin B, CDK1/Cyclin F, CDK2/Cyclin A, CDK2/Cyclin E, CDK4/Cyclin D, CDK5/35 und CDK6/Cyclin D3, und es ist von besonderem Interesse, die Selektivität einiger der Verbindungen gegen verschiedene CDK's anzugeben.
Testergebnisse, welche die CDK-inhibitorischen Aktivitätswerte zeigen, die für einige der hergestellten Verbindungen gemessen worden sind, sind in der Tabelle 1 am Ende der vorliegenden Beschreibung gezeigt. Wenn die Verbindungen in verschiedenen enantiomorphen Formen vorliegen, wurden die Tests im Allgemeinen mit dem racemischen Gemisch durchgeführt. Abgesehen von den Referenzverbindungen ist mit den aufgeführten Verbindungen eine NU-Referenz- oder -Identifizierungscodenummer angegeben. Die Tabelle 1 umfasst die Verbindungen, die von den hergestellten Verbindungen gegenwärtig am meisten bevorzugt sind, obwohl noch nicht alle vollständig getestet worden sind.
Im Allgemeinen stützen die durchgeführten Studien die Annahme, dass die CDK-inhibitorischen Eigenschaften der getesteten Verbindungen das Vermögen dieser Verbindungen, als effektive Antitumorarzneistoffe zu wirken, wiedergeben, voll und ganz.
Die Inhibierungstests wurden unter Verwendung von Verfahren durchgeführt, die auf denjenigen beruhen, die in dem vorstehend angegebenen Artikel von J. Vesely et al. und in dem Artikel von L. Azzi et al. (1992), Eur. J. Biochem. 203, 353–360 beschrieben sind. Als Beispiel ist ein typisches Protokoll jedoch nachstehend zusammengefasst.
CDK-Testbeispiel
Reagenzien:
Puffer C (enthält 60 mM b-Glycerophosphat, 30 mM Nitrophenylphosphat, 25 mM MOPS pH 7,0, 5 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM MgCl₂ und 0,1 mM Natriumorthovanadat) wird wie folgt hergestellt:
Als erstes werden die vorstehend genannten Bestandteile in etwa 80 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt.
Dann wird 1 ml 10 mM Natriumorthovanadat (1,84 mg/ml – FW = 183,9 RT), Endkonzentration = 0,1 mM, zugesetzt und auf 4°C gekühlt.
Dann werden
zugesetz.
(Alternativ werden 100 mM DTT (15,4 mg/ml) bereitgestellt und in 1,2 ml-Aliquots in einem Gefrierschrank gelagert, aufgetaut und 1 ml wird dem vorstehend beschriebenen Puffer zugesetzt)
Es werden 100 ml bereitgestellt und in 5 ml-Aliquots in einem Gefrierschrank gelagert.
Affinitätsgereinigtes p34 cdc2 (CDK1)/cyclin B von M-Phasen-Seestern (Marthasterias glacialis) in 20% Glycerin wird bei –80°C in einer Kühltruhe gelagert.
100 mM Olomoucin (Kat. # LC-0-3590-M025 Alexis Co. Bingham Nottingham). FW = 298,35, 29,835 mg/ml = 100 mM, 25 ml-Aliquots in einem Gefrierschrank gelagert.
1% Phosphorsäure (58,8 ml 85%ige Phosphorsäure + 4,942 Liter Wasser).
Am Tag des Tests wird folgendes bereitgestellt:
Histon H1 (Typ III-S (Sigma) 4°C) 5 mg/ml in Puffer C.
[³²P]ATP 75 mM: Wird unter Verwendung (eines Mehrfachen) der folgenden Anteile bereitgestellt:
2 ml [³²P]ATP (3000 Ci/mmol PB168 Amersham, in einem Radioaktivitätsgefrierschrank gelagert) + 7,5 ml 1 mM kaltes ATP (–20°C) (0,551 mg/ml – 200 ml-Aliquots in einem Gefrierschrank gelagert) + 90,5 ml Puffer C.
Konz. = 12,5 mM im fertigen Test.
Testverfahren
DMSO liegt in einer Menge von nicht mehr als 1% in dem Testgemisch vor. Inhibitoren werden in einer Menge von 1/10 des Volumens des fertigen Tests und 10× Endkonzentration zugesetzt. DMSO-Vorratslösungen müssen daher auf 10× gewünschte Endkonzentration in ≤ 10% DMSO, ≥ 90% Puffer C verdünnt werden. Vorgeschlagene Konzentrationsbereiche = 0, 1, 10, 100 mM, so dass DMSO-Vorratslösungen von 0, 100, 1000 und 10000 mM in 1/10 Puffer C verdünnt werden, bevor sie dem Test zugesetzt werden.
Herstellung:
Ein Satz von 0,2 ml-Mikroröhrchen zum Testen in einem geeigneten Testgestell wird markiert (z.B. A₀, A₁, A₁₀, A₁₀₀) und ein weiterer Satz von Eppendorfs zur Arzneistoffverdünnung wird markiert.
Phosphocellulosefilter werden mit einem Bleistift markiert (z.B. A₀, A₁, A₁₀, A₁₀₀) und in Längsrichtung gefaltet, so dass ein „geneigtes Dach" entsteht.
Es wird ein Wasserbad mit 30°C bereitgestellt, das ein zweites Gestell für Mikroröhrchen enthält.
Ein Becher, der einen Drahtnetzeinsatz und ein Magnetrührstäbchen unterhalb des Netzeinsatzes zusammen mit 400 ml 1%iger Phosphorsäure enthält, wird auf einen Magnetrührer aufgesetzt.
Reaktionsgemisch:
Alle Reagenzien (mit Ausnahme von DMSO-Vorratslösungen) sollten auf Eis aufbewahrt werden, bis mit dem Test begonnen wird.
Das Gestell mit den Teströhrchen wird auf Eis gesetzt.
In jedes Röhren werden
16 ml Puffer C
1 ml cdc2/Cyclin B-Kinase
5 ml Histon H1
3 ml Inhibitor
eingebracht.
Die Reaktion in jedem Röhrchen wird in 30 Sekunden-Intervallen durch Zugeben von 5 ml [³²P]ATP, Vortexieren und Stellen in ein Gestell im Wasserbad bei 30°C gestartet.
Die Reaktion wird nach 10 min in 30 Sekunden-Intervallen in Röhrchen in der gleichen Reihenfolge durch Entfernen beendet.
25 ml des Reaktionsgemischs werden als Flecken auf einen geeignet markierten Filter aufgebracht, es wird 20 bis 30 s trocknen gelassen und die Filter werden in eine gerührte 1%ige Phosphorsäure überführt.
Eine Blindinkubation wird wie vorstehend durchgeführt, jedoch ohne Histon (stattdessen werden 5 ml Puffer C zugesetzt). Die Blindprobe wird mit 5 ml ATP gewaschen, das dem Filter direkt zugesetzt wird.
Die Filter werden 5 bis 6 Mal jeweils 5 min gewaschen.
Die Filter werden auf einem Papierhandtuch getrocknet.
In Miniszintillationsbehältern wird mit 5 ml Szintillationsmittel gezählt.
Es werden auch 3×-Standards von 5 ml ATP gezählt (375 pmol ATP).
NB. Der Test kann durch Bereitstellen des Reaktionsgemischvorrats wie folgt vereinfacht werden:
(1 Teil cdc2/Cyclin B, 16 Teile Puffer C, 5 Teile Histon H1) × Anzahl der Teströhrchen + 1 und 22 ml werden jedem Teströhrchen zugesetzt, das 3 ml Puffer C ± Inhibitor enthält. Es ist jedoch nach wie vor erforderlich, getrennt davon eine Blind-Testprobe (d.h. ohne Histon) bereitzustellen.
Die folgenden Beispiele und die Beschreibung von Stufen bei Synthesewegen der Herstellung verschiedener Beispiele für interessierende Verbindungen dienen zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, sind jedoch nicht beschränkend aufzufassen. In vielen Fällen ist mit den beschriebenen Verbindungen eine NU-Referenz- oder -Identifizierungscodenummer angegeben.
2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxypyrimidin (NU6034)
(zur Verwendung als Zwischenverbindung)
Cyclohexylmethanol (30 ml) und Natrium (0,76 g, 32 mmol) wurden 1,5 Stunden unter N₂ bei 150°C zusammen erhitzt. 4-Chlor-2,6-diaminopyrimidin (4,32 g, 30 mmol) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 180°C unter N₂ erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck an einer Ölpumpe mit einer Kurzwegdestillationsvorrichtung entfernt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von 10% Methanol in Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt. Das Endprodukt wurde weiter durch eine Umkristallisation aus Methanol gereinigt (4,69 g, 70%), Schmp.: 142°C; (gefunden: C, 59,35; H, 8,21; N, 25,17%, C₁₁H₁₈N₄O erfordert C, 59,45; H, 8,11; N, 25,23%); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 1,03–1,37 (5H, m, C₆H₁₁), 1,79–1,84 (6H, m, C₆H₁₁), 4,00 (2H, d, OCH₂, J = 6,3 Hz), 5,13 (1H, s, C(5)H), 5,96 (2H, br s, NH₂), 6,10 (2H, br s, NH₂); m/z (+EI) 222 (M⁺, 29%), 139 (M⁺-C₆H₁₁, 42), 126 (MH⁺-C₇H₁₃, 100), 110 (MH⁺-C₇H₁₃O, 28), 98 (82).
2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxy-5-nitrosopyrimidin (NU6027)
2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxypyrimidin (0,28 g, 1,26 mmol) wurde in einer warmen Eisessiglösung (30%, 10 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 80°C erhitzt und eine Natriumnitritlösung (0,12 g, 1,72 mmol in 5 ml H₂O) wurde tropfenweise während 1 Stunde zugesetzt, bis mit einem Stärke-Iodid-Papier ein Überschuss an Oxidationsmittel festgestellt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und die violetten Kristalle wurden mittels Filtration gesammelt und sorgfältig mit Wasser gewaschen. Die Titelverbindung wurde durch eine Umkristallisation aus Ethanol gereinigt (0,26 g, 83%), Schmp.: 254°C; (gefunden: C, 52,73; H, 6,59; N, 27,56%, C₁₁H₁₇N₅O₂ erfordert C, 52,59; H, 6,77; N, 27,89%); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 1,09–1,38 (5H, m, C₆H₁₁), 1,73–2,00 (6H, m, C₆H₁₁), 4,39 (2H, d, OCH₂, J = 6,3 Hz), 7,86 (2H, br s, NH₂), 8,08 (1H, br s, NH), 10,19 (1H, br s, NH); m/z (+EI) 251 (M⁺, 25%), 155 (M⁺-C₇H₁₃, 100), 138 (M⁺-C₇H₁₃O, 72), 81 (9).
2,5,6-Triamino-4-cyclohexylmethoxypyrimidin (NU6035)
Einer gerührten Lösung von 2,6-Diamino-5-nitroso-4-cyclohexylmethoxypyrimidin (0,10 g, 0,4 mmol) in Wasser (5 ml) bei 50°C wurde Natriumdithionit (0,16 g, 0,92 mmol) portionsweise während eines Zeitraums von 5 Stunden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit einer wässrigen Ammoniaklösung (2 ml) auf 7 eingestellt und der resultierende feine gelbe Niederschlag wurde mittels Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde durch eine Umkristallisation aus Wasser gereinigt (0,06 g, 60%), Schmp.: 154°C; (gefunden: C, 55,50; H, 7,95; N, 29,34%, C₁₁H₁₉N₅O erfordert C, 55,69; H, 8,02; N, 29,53%); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 1,02–1,39 (5H, m, C₆H₁₁), 1,71–1,89 (6H, m, C₆H₁₁), 3,22 (2H, br s, NH₂), 4,03 (2H, d, OCH₂, J = 6,53 Hz), 5,32 (2H, br s, NH₂), 5,71 (2H, br s, NH₂); m/z (+EI) 237 (M⁺, 84%), 155 (MH⁺-C₇H₁₃, 100), 124 (MH⁺-C₇H₁₃O, 15).
4-Chlorbenzoldiazoniumtetrafluoroborat
(zur Verwendung als Zwischenverbindung)
4-Chloranilin (1,0 g, 7,87 mmol) wurde in 6 M HCl (4 ml) suspendiert und das gerührte Reaktionsgemisch wurde auf 0°C gekühlt. Eine Lösung von Natriumnitrit (0,54 g, 7,87 mmol) in Wasser (1 ml) wurde tropfenweise während 5 min zugegeben und das Gemisch wurde weitere 20 min bei 0°C gerührt. Eiskalte Fluorborsäure (40%, 1,14 ml, 18,11 mmol) wurde in einer Portion zugesetzt und das Gemisch wurde während 12 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Nach dem Abkühlen in einem Eisbad wurde der resultierende Niederschlag mittels Filtration gesammelt und nacheinander mit Wasser, Methanol und Diethylether gewaschen. Die Verbindung wurde durch Ausfällen aus kaltem Aceton gewaschen. δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 8,24 (2H, dd), 8,810 (2H, dd).
2,6-Diamino-5-(4'-chlorphenyl)azo-4-cyclohexylmethoxypyrimidin (NU6037)
Einer gerührten Lösung von 4-Chlorbenzoldiazoniumtetrafluoroborat (0,09 g, 0,68 mmol) in trockenem DMF (5 ml) wurde unter N₂ bei 0°C 2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxypyrimidin (0,15 g, 0,68 mmol) zugesetzt und das gerührte Reaktionsgemisch wurde während 72 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde mit Wasser zerrieben und filtriert. Das gewünschte Produkt wurde nach Umkristallisieren aus Methanol erhalten (0,094 g, 39%), δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 1,14–1,47 (5H, m, C₆H₁₁), 1,81–1,95 (6H, m, C₆H₁₁), 4,31 (2H, d, OCH₂, J = 6,04 Hz), 7,36 (2H, br s, NH₂), 7,62 (2H, d, Ar C(3)H und Ar (C)5, J = 8,7 Hz), 7,85 (2H, d, Ar C(2)H und Ar C(6)H, J = 8,72 Hz), 8,04 (1H, br s, NH).
2,6-Diamino-4-benzyloxypyrimidin (NU6038)
Natrium (0,41 g, 17,8 mmol) wurde Benzylalkohol (15 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre zugesetzt und das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei 150°C erhitzt. 2,6-Diamino-4-chlorpyrimidin (2,16 g, 14,94 mmol) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde weitere 2 Stunden bei 180°C gerührt. Flüchtige Bestandteile wurden unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde mit Dichlormethan:Methanol (9:1) als Elutionsmittel auf Silica chromatographiert, wobei das Titelprodukt als weißer Feststoff erhalten wurde (1,98 g, 62%), ν_max/cm^–1 3347 (NH), 1498 (C₆H₅), 1608 (C₆H₅); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 5,20 (1H, s, C(5)H), 5,32 (2H, s, OCH₂), 6,05 (2H, br s, NH₂), 6,17 (2H, br s, NH₂), 7,41–7,48 (5H, m, C₆H₅); m/z (+EI) 216 (M⁺, 100%), 139 (M⁺-C₆H₅, 33), 91 (94).
2,6-Diamino-4-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin (NU6039)
2,6-Diamino-4-benzyloxypyrimidin (0,5 g, 2,3 mmol) wurde in warmer Essigsäure (30%, 10 ml) gelöst und das Reaktionsgemisch wurde auf 80°C erhitzt. Eine Lösung von Natriumnitrit (0,22 g, 3,19 mmol) in Wasser (5 ml) wurde tropfenweise während 1 Stunde zugesetzt, wobei ein Überschuss an Oxidationsmittel durch ein Stärke-Iodid-Papier festgestellt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und die abgeschiedenen violetten Kristalle wurden gesammelt und mit Wasser gewaschen (0,53 g, 98%), Schmp. (Zersetzung): 209°C; (gefunden: C, 55,32; H, 5,28; N, 26,47%, C₁₁H₁₁N₅O₂·0,1H₂O C, 55,98; H, 4,75; N, 29,69%); ν_max/cm^–1 3408 (NH), 2952 (CH₂), 1610 (C₆H₅), 1518 (NO); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 5,69 (2H, s, OCH₂), 7,44–7,68 (5H, m, C₆H₅), 8,0 (2H, d, NH₂), 8,17 (1H, s, NH), 10,19 (1H, s, NH); m/z (+EI) 245 (M⁺, 25%), 91 (100), 65 (9).
2,5,6-Triamino-4-benzyloxypyrimidin (NU6040)
Einer Suspension von 2,6-Diamino-4-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin (0,3 g, 1,28 mmol) in Wasser (10 ml) bei 50°C wurde Natriumdithionit (0,48 g, 2,76 mmol) portionsweise während 5 Stunden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, erneut auf 50°C erwärmt und eine weitere Menge von Natriumdithionit (0,4 g) wurde zugesetzt. Nach weiteren 12 Stunden Rühren wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gekühlt und die Lösung wurde mit einer wässrigen Ammoniaklösung (0,2 ml) auf pH 7 eingestellt. Der abgeschiedene resultierende feine gelbe Feststoff wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus heißem Wasser umkristallisiert (0,11 g, 35%), Schmp.: 130–135°C; ν_max/cm^–1 3394 (NH₂), 3033 (C₆H₅); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 5,36 (2H, s, OCH₂), 5,40 (2H, s, NH₂), 5,81 (2H, s, NH₂), 7,39–7,56 (5H, m, C₆H₅).
2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxypyrimidin (NU6046)
Einer gerührten Lösung von Natrium (0,4 g, 17,4 mmol) in 1,2,3,6-Tetrahydrobenzylalkohol (20 ml, 0,17 mol) wurde unter Stickstoff bei 120°C 2,6-Diamino-4-chlorpyrimidin (2 g, 13,84 mmol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei 180°C weitere 2 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei Dichlormethan:Methanol (9:1) als Elutionsmittel verwendet wurde. Eine Umkristallisation aus Ethylacetat-Petrolether ergab die Titelverbindung als gelben Feststoff (1,3 g, 43%), Schmp.: 89°C; δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 1,26–2,24 (7H, m, C₆H₇), 4,16 (2H, d, OCH₂, J = 6,56 Hz), 5,14 (1H, s, C(5)H), 5,76 (2H, s, C₂H₂), 5,96 (2H, br s, NH₂), 6,10 (2H, br s, NH₂); m/z (+EI) 220 (M⁺, 27%), 125 (MH⁺-C₇H₁₁, 97), 98 (25).
2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxy-5-nitrosopyrimidin (NU6045)
Eine Lösung von 2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxypyrimidin (0,5 g, 2,27 mmol) in einer 30%igen Essigsäurelösung wurde auf 80°C erwärmt und eine Natri umnitritlösung (0,22 g, 3,19 mmol, in 10 ml H₂O) wurde tropfenweise während 1 Stunde zugesetzt, bis überschüssiges Oxidationsmittel festgestellt wurde (Stärke-Iodid-Papier). Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und die resultierenden violetten Kristalle wurden gesammelt, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet (0,52 g, 92%), Schmp.: 237°C; δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 1,51–2,19 (7H, m, C₆H₇), 4,51 (2H, d, OCH₂, J = 5,66 Hz), 5,82 (2H, br s, C₂H₂), 7,95 (2H, br s, NH₂), 8,15 (1H, br s, NH), 10,21 (1H, br s, NH); m/z (+EI) 249 (M⁺, 22%), 155 (M⁺-C₇H₁₁, 60), 138 (M⁺-C₇H₁₁O, 100), 69 (24).
2-Amino-4-chlor-6-methylaminopyrimidin (NU6042)
(zur Verwendung als Zwischenverbindung)
Ein Gemisch aus 2-Amino-4,6-dichlorpyrimidin (1 g, 6,1 mmol), Methylamin (0,8 ml), Kaliumcarbonat (0,5 g, 3,62 mmol) und wasserfreiem Ethanol (15 ml) wurde unter Rückfluss unter Stickstoff 18 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, filtriert und das Filtrat wurde auf ein Volumen von etwa 2 ml konzentriert, wobei ein cremefarbener Feststoff erhalten wurde (0,82 g, 85%), Schmp.: 152–157°C; ν_max/cm^–1 3442 (NH), 2934 (CH₃), 2549 (NH₂); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 3,48 (3H, s, CH₃), 5,84 (1H, s, C(5)H), 6,53 (2H, br s, NH₂), 7,28 (1H, br s, NH); m/z (+EI) 158 (M⁺, 100%), 123 (M⁺-Cl, 9), 94 (18).
2-Amino-4-cyclohexylmethyloxy-6-methylaminopyrimidin (NU6041)
2-Amino-4-chlor-6-methylaminopyrimidin (0,5 g, 2,25 mmol) wurde einer gerührten Lösung von Natrium (0,062 g, 2,69 mmol) in Cyclohexylmethanol (10 ml) unter N₂ zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei 180°C erhitzt. Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie auf Silica unter Verwendung von Dichlormethan:Methanol (9:1) als Elutionsmittel gereinigt, wobei die Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten wurde (0,03 g, 6%), Schmp.: 128–129°C; ν_max/cm^–1 3452 (NH), 2851 (NCH₃), 1583 (NH₂), 1514 (NH); δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 1,04–1,31, (5H, m, C₆H₁₁), 2,78 (3H, d, NCH₃, J = 4,67 Hz), 4,02 (2H, d, OCH₂), 5,10 (1H, s, C(5)H), 6,00 (2H, br s, NH₂), 6,52 (1H, br d, NH, J = 4,22 Hz); m/z (+EI) 236 (M⁺, 37%), 206 (MH⁺-NHMe, 31), 153 (M⁺-C₆H₁₁, 45), 140 (MH⁺-C₆H₁₁CH₂O, 100).
2-Amino-6-benzylamino-4-chlorpyrimidin
(zur Verwendung als Zwischenverbindung)
Ein Gemisch aus 2-Amino-4,6-dichlorpyrimidin (0,5 g, 3,05 mmol), Benzylamin (0,35 ml, 3,2 mmol), Kaliumcarbonat (0,25 g, 1,81 mmol) und Ethanol (15 ml) wurde 16 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat zerrieben und das weiße Produkt wurde mittels Filtration gesammelt. Eine Konzentrierung des Ethylacetatfiltrats lieferte eine zweite Ausbeute des Produkts. Die vereinigten Feststoffe wurden getrocknet, wobei das gewünschte Pyrimidin erhalten wurde (0,36 g, 50%), Schmp.: 136°C; δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 4,55 (2H, br s, OCH₂), 5,87 (1H, br s, C(5)H), 6,54 (2H, br s, NH₂), 7,35–7,41 (5H, m, C₆H₅), 7,72 (1H, m, NH); m/z (+EI) 234 (M⁺, 85%), 106 (100), 91 (C₆H₅CH₂ ⁺, 51%).
2-Amino-6-benzylamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin
Einer gerührten Lösung von Natrium (0,025 g, 1,09 mmol) in Cyclohexylmethanol (5 ml, 43 mmol) unter Stickstoff bei 100°C wurde 2-Amino-6-benzylamino-4-chlorpyrimidin (0,2 g, 0,86 mmol) zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 180°C gerührt. Nach der Entfernung von Lösungsmitteln wurde der Rückstand in Methanol wieder gelöst, filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie auf Silica unter Verwendung von Petrolether:Ethylacetat (8:2) als Elutionsmittel gereinigt, wobei das Titelprodukt als gelber Feststoff erhalten wurde (0,13 g, 49%), δ_H (200 MHz, d₆-DMSO) 0,96–1,15 (5H, m, C₆H₁₁), 1,23–1,34 (6H, m, C₆H₁₁), 4,03 (2H, br s, OCH₂), 4,51 (2H, d, C₆H₅CH₂, J = 5,31 Hz), 5,12 (1H, s, C(5)H), 6,56 (2H, br s, NH₂), 7,20 (1H, br s, NH), 7,28–7,39 (5H, m, C₆H₅); m/z (+EI) 312 (M⁺, 100%), 229 (M⁺-C₆H₁₁, 45), 216 (MH⁺-C₆H₁₁CH₂, 53), 91 (72).
Im Allgemeinen gibt es eine Anzahl von Wegen zur Synthese erfindungsgemäßer Pyrimidinderivate, die eine CDK-inhibierende Aktivität aufweisen, oder die Zwischen produkte zur Herstellung solcher CDK-inhibierender Verbindungen bereitstellen. Einige der Syntheseschemata, die verwendet werden können und die manchmal zu neuen chemischen Verbindungen führen, sind beispielhaft in der nachstehenden Beschreibung experimenteller Details typischer Stufen verschiedener Syntheseschemata veranschaulicht, die in schematischen Diagrammen am Ende dieser Beschreibung gezeigt sind.
Schema 1
Das Schema 1 veranschaulicht die Herstellung von 2-Amino-4-cyclohexylmethyloxy-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (NU6057) und die Entfernung entweder einer Benzylaminogruppe oder beider Benzylaminogruppen davon, so dass 2-Amino-4-cyclohexylmethoxy-6-(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (NU6056) bzw. 2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxy-5-pyrimidincarbaldehyd (NU6055) erhalten wird.
1.1 Herstellung von 2-Amino-4,6-dichlor-5-pyrimidincarbaldehyd
Phosphoroxychlorid (21,6 ml, 0,236 mol) wurde in einem Eisbad (etwa 5°C) gekühlt, worauf langsam während 15 min trockenes N,N-Dimethylformamid (DMF, 7,0 ml) zugegeben wurden. Wie es bereits beschrieben worden ist, trat kein Niederschlag auf und das Reaktionsgemisch wurde aus dem Eisbad entfernt. Käufliches 2-Amino-4,6-dihydroxypyrimidin (5,6 g, 0,044 mol) wurde in kleinen Portionen während 30 min zugesetzt. Die resultierende Suspension wurde 1 Stunde bei 90°C und dann weitere 5 Stunden bei 105°C erhitzt, wobei eine rotbraune Lösung gebildet wurde, die über Nacht bei 4°C gekühlt wurde. Ein Abdestillieren von 3 bis 4 ml überschüssigem Phosphoroxychlorid bei Atmosphärendruck erzeugte eine viskose Suspension, die in Eiswasser (100 ml) gegossen wurde. Es bildete sich ein Gummi, der sich löste, als sich die Temperatur des Wassers auf 20°C erhöhte. Ammoniumhydroxid wurde tropfenweise zugesetzt, bis die Lösung pH 7 erreichte, und es bildete sich ein gelber Niederschlag, der mittels Filtration gesammelt wurde. Das Produkt wurde aus Ethylacetat umkristallisiert (5,15 g, 0,027 mol, 61%).
1.2 Herstellung von Di-(4-methoxybenzyl)amin
Einer Lösung von 4-Methoxybenzaldehyd (3,0 g, 22 mmol) in trockenem Ethanol (40 ml) wurde 4-Methoxybenzylamin (3,02 g, 22 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde zum Rückfluss erhitzt und das Erhitzen wurde 1,5 Stunden fortgesetzt, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt wurde. Eine DC-Analyse zeigte, dass das Produkt und das Aldehyd-Ausgangsmaterial gemeinsam bei R_f 0,8 (10% MeOH/DCM) eluierten. Es wurde kein Versuch zur Isolierung des Imin-Zwischenprodukts gemacht. Stattdessen wurde das Produkt in Methanol (10 ml) gelöst, dem langsam unter Rühren Natriumborhydrid (0,834 g, 22 mmol) zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch erhitzte sich ohne zusätzliche Wärmezufuhr zum Rückfluss und wurde 1 Stunde gerührt. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab ein blass-gelbes Öl, das mittels Säulenchromatographie (100% EtOAc) weiter gereinigt wurde, wobei ein farbloses Öl erhalten wurde, das sich beim Abkühlen zu einem weißen Feststoff verfestigte (5,31 g, 20,7 mmol, 94%).
1.3 Herstellung von 2-Amino-4-chlor-6-di-(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd
2-Amino-4,6-dichlor-5-pyrimidincarbaldehyd (0,50 g, 2,60 mmol) wurde in trockenem DCM (5 ml) gerührt. Triethylamin (0,263 g, 2,60 mmol) und Di(4-methoxybenzylamin) (0,669 g, 2,60 mmol) wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 1,25 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von weiterem DCM (50 ml) und Extraktion mit gesättigter Natriumchloridlösung (3 × 50 ml) aufgearbeitet. Die organische Schicht wurde mit Wasser (50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft, wobei ein gelber Schaum erhalten wurde (0,957 g, 2,32 mmol, 89,2%).
In der nächsten Stufe (1.4) wird der Chlorsubstituent an der 4-Position des Pyrimidinrings durch eine Cyclohexylmethoxygruppe ersetzt. Zwei alternative Verfahren (Verfahren I und Verfahren II) werden beschrieben.
1.4 Herstellung von 2-Amino-4-cyclohexylmethoxy-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (NU6057)
Verfahren 1
Cyclohexylmethanol (8 ml) wurde mit Natrium (0,14 g, 6,06 mmol) 1 Stunde bei 90°C erhitzt. 2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (0,50 g, 1,212 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 25 min bei der gleichen Temperatur erhitzt. Überschüssiges Cyclohexylmethanol wurde durch eine Kurzwegdestillation unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde auf MgSO₄ aufgebracht. Das getrocknete Produkt-MgSO₄n wurde auf eine Silicasäule aufgebracht, worauf mit 40% EtOAc/Petrolether (40:60) eluiert wurde. Das Produkt eluierte zusammen mit etwas Cyclohexylmethanol, das nicht abgetrennt werden konnte. Dieses Gemisch wurde für die nächste Stufe verwendet.
Verfahren 2
Natriumhydrid (3 Äquivalente, 0,087 g, 3,6 mmol), trockenes Dimethylsulfoxid (3 ml) und Cyclohexylmethanol (5,5 Äquivalente, 0,691 g, 6,1 mmol) wurden 30 min unter Stickstoff gerührt, bis sich eine klare Lösung gebildet hatte. 2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (0,50 g, 1,21 mmol) wurde unter Rühren zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 100°C erhitzt, worauf das Lösungsmittel mit einer Kurzwegdestillation unter vermindertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde auf eine Silicasäule aufgebracht, worauf mit 30% EtO-Ac/Petrolether eluiert wurde. Das Produkt wurde als blass-gelber Feststoff isoliert (0,183 g, 0,37 mmol, 30,6%). Schmp.: 140–141°C.
Anschließend wird bzw. werden eine oder beide der Benzylaminogruppen (die als Schutzgruppen wirken) in der nachstehend beschriebenen Weise entfernt (1.5 und 1.6), wobei NU6056 oder NU6055 gebildet wird.
1.5 Herstellung von 2-Amino-4-cyclohexylmethoxy-6-(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (NU6056)
Das in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Gemisch aus 2-Amino-4-cyclohexylmethoxy-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd und Cyclohexylmethanol wurde 18 Stunden in Trifluoressigsäure (2 ml) gerührt. Überschüssige Trifluoressigsäure wurde entfernt und der Rückstand wurde mit Ethylacetat und Wasser extrahiert (jeweils 50 ml). Der wässrigen Schicht wurde weiteres Ethylacetat zugesetzt und die organischen Komponenten wurden vereinigt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand in Form eines braunen Öls wurde auf eine Silicasäule aufgebracht, worauf mit 20% EtOAc/Petrolether (40:60) eluiert wurde. Es wurde ein blassgelbes Öl erhalten. Die Zugabe und die Entfernung von Acetonitril ergab einen Feststoff, der aus einem Petrolether/Ethylacetat-Gemisch umkristallisiert wurde (0,091 g, 0,34 mmol). Schmp.: 97°C.
1.6 Herstellung von 2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxy-5-pyrimidincarbaldehyd (NU6055)
Das in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Gemisch aus 2-Amino-4-cyclohexylmethoxy-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd und Cyclohexylmethanol wurde 24 Stunden in Trifluoressigsäure (2 ml) bei 65°C gerührt. Es wurde das gleiche Aufarbeitungsverfahren wie vorstehend eingesetzt, wobei das Produkt mittels Säulenchromatographie durch Elution mit 40% EtOAc/Petrolether (40:60) eluiert wurde, wobei ein blass-gelber Feststoff erhalten wurde. Schmp.: 159–160°C.
Schema 2
Dieses Schema veranschaulicht ein geringfügig unterschiedliches Schema, das zur Synthese von 2-Amino-4-cyclohexylmethoxy-6-dibenzylamino-5-pyrimidincarbaldehyd verwendet wird.
2.1 Herstellung von 2-Amino-4-chlor-6-dibenzylamino-5-pyrimidincarbaldehyd
2-Amino-4,6-dichlor-5-pyrimidincarbaldehyd (0,15 g, 0,78 mmol), das gemäß Schema 1 hergestellt worden ist, wurde bei 0°C in trockenem Dichlormethan (3 ml) gerührt. Dibenzylamin (1 Äquivalent, 0,78 mmol, 0,154 g) und Triethylamin (1 Äquivalent, 0,78 mmol, 0,078 g) wurden tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde Raumtemperatur erreichen gelassen und über Nacht gerührt, wobei eine klare Lösung erhalten wurde.
Weiteres Dichlormethan (50 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet und eingedampft, wobei ein gelber Feststoff zurückblieb (0,253 g, 0,72 mmol, 92,3%). Schmp.: 138–142°C.
2.2 Herstellung von 2-Amino-4-cyclohexylmethoxy-6-dibenzylamino-5-pyrimidincarbaldehyd
Cyclohexylmethanol (10 ml) und Natrium (5 Äquivalente, 0,163 g) wurden 1 Stunde bei 90°C umgesetzt. 2-Amino-4-chlor-6-dibenzylamino-5-pyrimidincarbaldehyd (0,5 g, 1,42 mmol) wurde zugesetzt und das Erhitzen wurde 90 min fortgesetzt. Überschüssiger Alkohol wurde durch eine Kurzwegdestillation unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt wurde durch Säulenchromatographie weiter gereinigt. Durch Sichtbarmachen des Alkohols mit einem Schwefelsäurespray (2%) wurde gezeigt, dass das Produkt mit Cyclohexylmethanol verunreinigt war.
Schema 3
Dieses Schema veranschaulicht einen Weg zur Synthese von Pyrimidinderivaten, die in der 5-Position substituierte Aralkyl- oder Aralkengruppen aufweisen.
3.1 2-Amino-4-chlor-6-dibenzylamino-5-(1-hydroxyphenethyl)-pyrimidin
(Verfahren auf der Basis des in J. Org. Chem. 1958, 23, 1783–1784 beschriebenen Verfahrens)
2-Amino-4-chlor-6-dibenzylamino-5-pyrimidincarbaldehyd (0,10 g, 0,28 mmol), der gemäß Schema 2 hergestellt worden ist, wurde bei 0°C in trockenem THF (10 ml) gerührt. Benzylmagnesiumchlorid (1,0 M, 3 Äquivalente, 0,85 mmol, 0,85 ml) wurde tropfenweise zugesetzt, wobei eine gelbe Färbung erhalten wurde, die schnell verschwand. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min gerührt, worauf eine gesättigte Ammoniumchloridlösung (50 ml) und Ethylacetat (50 ml) zugesetzt wurden. Die wässrige Schicht wurde ferner mit Ethylacetat extrahiert und die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt, wobei mit 40% EtOAc/Petrolether (40:60) eluiert wurde, wobei ein blass-gelbes Öl erhalten wurde (0,086 g, 0,19 mmol, 68%).
3.2 Oxidation von 2-Amino-4-chlor-6-dibenzylamino-5-(1-hydroxyethyl)-pyrimidin zur Bildung des entsprechenden 5-Phenethylenderivats
Oxalylchlorid (1,1 Äquivalente, 0,016 g, 0,12 mmol) wurde trockenem DCM (5 ml) in einem mit einem Tropftrichter ausgestatteten Dreihalskolben unter Stickstoff zugesetzt. Der Kolben wurde in einem Trockeneis-Aceton-Bad bei –75 bis –80°C gekühlt. Eine Lösung von DMSO (2,2 Äquivalente, 0,25 mmol, 0,02 g) in trockenem DCM wurde tropfenweise während 5 min zugesetzt und es wurde 10 min gerührt. Eine Lösung von 2-Amino-4-chlor-6-dibenzylamino-5-(1-hydroxyethyl)-pyrimidin (0,05 g, 0,11 mmol) in trockenem DCM (5 ml) wurde tropfenweise während 5 min zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 min stehengelassen. Triethylamin (5 Äquivalente, 0,56 mmol, 0,057 g) wurde tropfenweise während 5 min zugesetzt und das Kühlbad wurde entfernt. Nachdem sich das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt hatte, wurde Wasser (50 ml) zugesetzt und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde mit weiterem DCM (50 ml) gewaschen und die organischen Phasen wurden vereinigt, getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde auf eine Silicasäule aufgebracht, wobei mit 30% EtOAc/Petrolether (40:60) eluiert wurde. Dies ergab das Produkt als gelbes Öl (0,020 g, 0,05 mmol, 45%), wobei ein Teil des Ausgangsmaterials (0,01 g) zurückgewonnen wurde.
Bei beiden vorstehenden Produkten, bei denen es sich um Zwischenverbindungen handelt, kann der Chlorsubstituent an der 4-Position des Pyrimidinrings mit den im Schema 1 beschriebenen Verfahren durch eine Cyclohexylmethoxygruppe ersetzt werden.
Schema 4
Dieses Schema veranschaulicht weitere Beispiele der Synthese von Pyrimidinderivaten, die Dibenzylaminsubstituenten in der 6-Position und Hydroxy- oder Ketosubstituierte Alkyl-, Alken-, Aralkyl- oder Aralkengruppen in der 5-Position aufweisen.
4.1 Herstellung von 2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-(1-hydroxyphenethyl)pyrimidin (R = Ph)
2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (0,20 g, 0,48 mmol) wurde bei 0°C in trockenem THF (5 ml) gerührt. Benzylmagnesiumchlorid (1,0 M, 3 Äquivalente, 1,45 mmol, 1,45 ml) wurde tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min gerührt, worauf eine gesättigte Ammoniumchloridlösung (50 ml) und Ethylacetat (50 ml) zugesetzt wurden. Die wässrige Schicht wurde ferner mit Ethylacetat extrahiert und die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt, wobei mit 40% EtOAc/Petrolether (40:60) eluiert wurde, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde (0,151 g, 0,30 mmol, 62,4%).
4.2 Herstellung von 2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-(1-hydroxyethyl)pyrimidin (R = H)
Es wurde das vorstehende Verfahren mit 2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-pyrimidincarbaldehyd (0,20 g, 0,48 mmol) und 3,0 M Methylmagnesiumbromid (3 Äquivalente, 0,5 ml) durchgeführt. Das Produkt wurde als farbloses Glas erhalten (0,159 g, 0,37 mmol, 77%).
4.3 Oxidation von 2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-(1-hydroxyethyl)pyrimidin (R = H) zur Bildung des entsprechenden 5-Ethenylderivats
Oxalylchlorid (1,1 Äquivalente, 0,039 g, 0,31 mmol) wurde trockenem DCM (5 ml) in einem mit einem Tropftrichter ausgestatteten Dreihalskolben unter Stickstoff zugesetzt. Der Kolben wurde in einem Trockeneis-Chloroform-Bad bei –60°C gekühlt. Eine Lösung von DMSO (2,2 Äquivalente, 0,62 mmol, 0,048 g) in trockenem DCM wurde tropfenweise während 5 min zugesetzt und es wurde 10 min gerührt. Eine Lösung von 2-Amino-4-chlor-6-di(4-methoxybenzyl)amino-5-(1-hydroxyethyl)-pyrimidin (0,12 g, 0,28 mmol) in trockenem DCM (5 ml) wurde tropfenweise während 5 min zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 25 min stehengelassen. Triethylamin (5 Äquivalente, 1,4 mmol, 0,141 g) wurde tropfenweise während 5 min zugesetzt und das Kühlbad wurde entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde während 40 min auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, worauf Wasser (50 ml) zugesetzt und die organische Schicht abgetrennt wurde. Die wässrige Phase wurde mit weiterem DCM (50 ml) gewaschen und die organischen Phasen wurden vereinigt, getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde auf eine Silicasäule aufgebracht, wobei mit 40% EtOAc/Petrolether (40:60) eluiert wurde. Dies ergab ein gelbes Öl (0,031 g, 0,08 mmol, 24,5%).
Auch hier kann der Chlorsubstituent an der 4-Position des Pyrimidinrings mit den im Schema 1 beschriebenen Verfahren durch eine Cyclohexylmethoxygruppe ersetzt werden, um erfindungsgemäße CDK-inhibierende Verbindungen bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung sollte so betrachtet werden, dass sie jedwedes neue Merkmal oder jedwede neue Kombination von Merkmalen, das hier bzw. die hier offenbart ist bzw. sind, umfasst, jedoch umfassen die Hauptaspekte der Erfindung in breiter Form grundsätzlich, jedoch nicht ausschließlich, die folgenden Aspekte:

(i) Neue Verbindungen der Formel (I), wie sie vorstehend definiert worden sind;
(ii) Verbindungen der Formel (I) mit Substituenten, wie sie vorstehend definiert worden sind (einschließlich Prodrug-Formen und Salze davon), zur Therapie oder zur Verwendung in der Medizin und zur Herstellung medizinischer Präparate, die z.B. als CDK-Inhibitoren bei der Behandlung von Krebs oder anderen Zellproliferationsstörungen geeignet sind;
(iii) Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel (I), wie sie vorstehend definiert worden sind, einschließlich jedwede neuen Zwischenverbindungen, die bei der Durchführung dieser Verfahren erzeugt werden;
(iv) Pharmazeutische Zusammensetzungen oder Formulierungen, die eine Verbindung der Formel (I), wie sie vorstehend definiert worden ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger darin umfassen; und
(v) Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung, wie sie vorstehend in (iv) definiert ist, z.B. mit den hier beschriebenen Verfahren.

Schema 1
Schema 2
Schema 3
Schema 4
Tabelle 1
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)

Claims

Verwendung einer Pyrimidinverbindung der allgemeinen Strukturformel I:
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes und/oder einer Prodrug-Form davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren oder anderen Zellproliferationsstörungen, die bezüglich der Inhibierung eines oder mehrerer CDK-Enzyme empfindlich sind, in Säugern, wobei die Pyrimidinverbindung selbst ein effektives unabhängiges aktives Antitumormittel oder einen effektiven unabhängigen aktiven Zellproliferationsinhibitor bereitstellt und dadurch gekennzeichnet ist, dass in der Strukturformel I XO, S oder CHR_x ist, wobei R_x H oder C_1-4-Alkyl ist; D H oder NZ₁Z₂ ist, wobei Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind; A aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, CH₂(CH₂)_nOH(n = 1 bis 4) und NR_a1R_a2 ausgewählt ist, wobei R_a1 und R_a2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind; Y ein gegebenenfalls substituierter 4- bis 8-gliedriger carbocyclischer oder heterocyclischer Ring ist; D' H oder NZ₃Z₄ ist, wobei Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind; E aus H, NO, NO₂, N=N-Ar, wobei Ar gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl ist, NR_e1R_e2 oder NR_e1NR_e2R_e3 (wobei R_e1, R_e2 und R_e3 jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind), C(R_e) = U (wobei R_e Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder substituiertes Alkyl, oder unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Aralkyl ist, und U aus O, NR_e', NOR_e' und N-NR_e'R_e'' ausgewählt ist, wobei R_e' und R_e'' jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl oder CONH₂ sind), T, CH₂T, CHT₂ und CT₃, wobei T ein Halogenid I, Br, Cl oder F ist, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1 einer in Anspruch 1 definierten Pyrimidinverbindung, bei der Y eine Ringstruktur umfasst, die polare Hydroxylsubstituenten umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 einer in Anspruch 1 definierten Pyrimidinverbindung, bei der Y ein Cycloalkan- oder Cycloalkenring ist.
Verwendung nach Anspruch 3 einer in Anspruch 3 definierten Pyrimidinverbindung, bei der Y ein 5- oder 6-gliedriger Cycloalkan- oder Cycloalkenring mit einer oder zwei Doppelbindung(en) ist.
Verwendung nach Anspruch 4 einer in Anspruch 4 definierten Pyrirnidinverbindung, mit der Ausnahme, dass eines oder zwei der Kohlenstoffatome in dem Cycloalkan- oder Cycloalkenring durch Heteroatome oder -gruppen ersetzt ist bzw. sind.
Verwendung nach Anspruch 5 einer in Anspruch 5 definierten Pyrimidinverbindung, bei der die Heteroatome oder -gruppen aus O, S, NR' (wobei R' H oder C_1-4-Alkyl ist) und (in einem Cycloalkenring) -N= ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 1 einer in Anspruch 1 definierten Pyrimidinverbindung, bei der Y ein substituierter 4- bis 8-gliedriger carbocyclischer oder hetero cyclischer Ring ist, bei dem der oder jeder Substituent aus H, C_1-4-Alkyl, OH, C_1-4-Alkoxy, Halogen, CF₃, CN, N₃ und NR_y1R_y2 ausgewählt ist, wobei R_y1 und R_y2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind.
Verwendung nach Anspruch 7 einer in Anspruch 7 definierten Pyrimidinverbindung, bei der zwei der Substituenten an benachbarten Atomen des Rings vorliegen und so verknüpft sind, dass sie eine zusätzliche anellierte carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden.
Verwendung nach Anspruch 1 einer in Anspruch 1 definierten Pyrimidinverbindung, bei der Y eine Ringstruktur umfasst, die durch eine der folgenden Strukturformeln dargestellt ist:
worin V und W jeweils unabhängig aus O, S, NR' (R' ist H oder C_1-4-Alkyl) und CH₂ oder =CH- ausgewählt sind, und R₁ und R₂ jeweils H oder C_1-4-Alkyl sind.
Verwendung nach Anspruch 1 einer in Anspruch 1 definierten Pyrimidinverbindung, bei der D eine unsubstituierte Aminogruppe und X Sauerstoff ist.
Verwendung nach Anspruch 1 einer in einem der vorstehenden Ansprüche definierten Pyrimidinverbindung, bei der jede vorhandene Alkylgruppe, entweder als solche oder als Rest in einer Alkoxygruppe oder einer anderen Gruppe, 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.
Verwendung nach Anspruch 1 einer Pyrimidinverbindung, bei der es sich um eine der folgenden Verbindungen handelt: 2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxy-5-nitrosopyrimidin; 2,5,6-Triamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin; 2,6-Diamino-5-(4'-chlorphenyl)azo-4-cyclohexylmethoxypyrimidin; 2,6-Diamino-4-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin; 2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxypyrimidin; 2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxy-5-nitrosopyrimidin; 2-Amino-4-cyclohexylmethyloxy-6-methylaminopyrimidin; 2-Amino-6-benzylamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin und 2,6-Diamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin-5-carbaldehyd.
Pyrimidinverbindung der allgemeinen Strukturformel I:
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz und/oder eine Prodrug-Form davon zur Verwendung als aktives therapeutisches Mittel bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung einer Tumorzellenproliferation, dadurch gekennzeichnet, dass in der Strukturformel I X O, S oder CHR_x ist, wobei R_x H oder C_1-4-Alkyl ist; D H oder NZ₁Z₂ ist, wobei Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind; A aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, CH₂(CH₂)_nOH (n = 1 bis 4) und NR_a1R_a2 ausgewählt ist, wobei R_a1 und R_a2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind; E aus NO, NO₂, N=N-Ar, wobei Ar gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl ist, NR_e1R_e2 oder NR_e1NR_e2R_e3 (wobei R_e1, R_e2 und R_e3 jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind), C(R_e) = U (wobei R_e Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder substituiertes Alkyl, oder unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Aralkyl ist, und U aus O, NR_e', NOR_e' und N-NR_e'R_e'' ausgewählt ist, wobei R_e' und R_e'' jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl oder CONH₂ sind), T, CH₂T, CHT₂ und CT₃, wobei T ein Halogenid I, Br, Cl oder F ist, ausgewählt ist; Y ein gegebenenfalls substituierter 5- oder 6-gliedriger Cycloalkan- oder Cycloalkenring mit einer oder zwei Doppelbindung(en) ist; D' H oder NZ₃Z₄ ist, wobei Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig N, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind.
Verbindung nach Anspruch 13 zur Verwendung als aktives therapeutisches Mittel bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung einer Tumorzellenproliferation, bei der die oder jede vorhandene Alkylgruppe, entweder als solche oder als Rest in einer Alkoxygruppe oder einer anderen Gruppe, 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.
Verbindung nach Anspruch 13 oder 14 zur Verwendung als aktives therapeutisches Mittel bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung einer Tumorzellenproliferation, bei der Y ein 5- oder 6-gliedriger Cycloalkanring oder Cycloalkenring mit einer oder zwei Doppelbindung(en) ist, der mit polaren Hydroxylsubstituenten substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 13 oder 14 zur Verwendung als aktives therapeutisches Mittel bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung einer Tumorzellenproliferation, bei der Y ein substituierter 5- oder 6-gliedriger Cycloalkan- oder Cycloalkenring mit einer oder zwei Doppelbindung(en) ist, bei dem der oder jeder Substituent aus H, C_1-4-Alkyl, OH, C_1-4-Alkoxy, Halogen, CF₃, CN, N₃ und NR_y1R_y2 ausgewählt ist, wobei R_y1 und R_y2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind.
Verbindung nach Anspruch 16, bei der zwei der Substituenten an benachbarten Atomen des Rings vorliegen und so verknüpft sind, dass sie eine zusätzliche anellierte carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden.
Verbindung nach Anspruch 13 oder 14 zur Verwendung als aktives therapeutisches Mittel bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung einer Tumorzellenproliferatian, bei der D eine unsubstituierte Aminogruppe und X Sauerstoff ist.
Pyrimidinverbindung zur Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Bereitstellung als ein aktives therapeutisches Mittel bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung der Tumorzellenproliferation, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine der folgenden Verbindungen handelt: 2,6-Diamino-4-cyclohexylmethoxy-5-nitrosopyrimidin; 2,5,6-Triamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin; 2,6-Diamino-5-(4'-chlorphenyl)azo-4-cyclohexylmethoxypyrimidin; 2,6-Diamino-4-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin; 2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyloxypyrimidin; 2,6-Diamino-4-cyclohex-3-enylmethyioxy-5-nitrosopyrimidin; 2-Amino-4-cyclohexylmethyloxy-6-methylaminopyrimidin; 2-Amino-6-benzylamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin und 2,6-Diamino-4-cyclohexylmethyloxypyrimidin-5-carbaldehyd.
Pharmazeutische Formulierung oder Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus einer effektiven, Tumorzellenproliferation-inhibierenden Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 13 bis 24 in einer Einheitsdosierungsform besteht, die zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Verabreichung an einen Säuger vorliegt, der einer Antitumorbehandlung bedarf.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren oder anderen Zellproliferationsstörungen in Säugern, wobei der aktive therapeutische Be standteil in der Zusammensetzung eine effektive Antitumor-Menge und CDK-inhibierende Menge einer Pyrimidinverbindung der nachstehenden Strukturformel I:
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz und/oder eine Prodrug-Form der Pyrimidinverbindung umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass in der Strukturformel I X O, S oder ChR_x ist, wobei R_x H oder C_1-4-Alkyl ist; D H oder NZ₁Z₂ ist, wobei Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind; A aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, CH₂(CH₂)_nOH (n = 1 bis 4) und NR_a1R_a2 ausgewählt ist, wobei R_a1 und R_a2 jeweils unabhängig H oder C_1-4-Alkyl sind; Y ein gegebenenfalls substituierter 4- bis 8-gliedriger carbocyclischer oder heterocyclischer Ring ist oder einen solchen umfasst; D' H oder NZ₃Z₄ ist, wobei Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind; E aus NO, NO₂, N=N-Ar, wobei Ar gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl ist, NR_e1R_e2 oder NR_e1NR_e2R_e3 (wobei R_e1, R_e2 und R_e3 jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Aralkyl sind), C(R_e) = U (wobei R_e Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder substituiertes Alkyl, oder unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Aralkyl ist, und U aus O, NR_e', NOR_e' und N-NR_e'R_e'' ausgewählt ist, wobei R_e' und R_e'' jeweils unabhängig H, C_1-4-Alkyl oder CONH₂ sind), T, CH₂T, CHT₂ und CT₃, wobei T ein Halogenid I, Br, Cl oder F ist, ausgewählt ist, wobei der aktive therapeutische Bestandteil mit mindestens einem anderen Bestandteil gemischt ist, der ein kompatibles bzw. einen kompatiblen, pharmazeutisch verträgliches bzw. verträglichen Additiv, Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel bereitstellt.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren oder anderen Zellproliferationsstörungen in Säugern, wobei das Verfahren das Mischen einer effektiven Antitumor-Menge und CDK-inhibierenden Menge einer Pyrimidinverbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche oder einer Prodrug-Form davon mit einem kompatiblen, pharmazeutisch verträglichen Additiv, Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel umfasst.